Obrazowanie migracji komórek nowotworowych w tkance glejaka za pomocą poklatkowej skaningowej mikroskopii konfokalnej

Streszczenie

Źródło: Parker, J. J., et al. Organtypowy model hodowli plastrów glejaka ludzkiego do badania migracji komórek nowotworowych i specyficznych dla pacjenta skutków leków przeciwinwazyjnych. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film przedstawia obrazowanie wycinków tkanki glejaka wykazujących ekspresję białka zielonej fluorescencji (GFP) za pomocą mikroskopii konfokalnej. Obrazy o wysokiej rozdzielczości są rejestrowane w stałych odstępach czasu w celu śledzenia ruchu i kierunku komórek nowotworowych.

Protokół

Wszystkie procedury związane z pobraniem próbek zostały wykonane zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.

1. Znakowanie komórek nowotworowych za pomocą retrowirusa eksprymującego białko zielonej fluorescencji

UWAGA: Mikroskopia poklatkowa do analizy migracji komórek nowotworowych wymaga stabilnego, długoterminowego znakowania fluorescencyjnego komórek w kulturze plastrowej. Sugeruje się stosowanie retrowirusa, ponieważ selektywnie infekuje on dzielące się komórki, wzbogacając w ten sposób znakowanie fluorescencyjne w populacji komórek nowotworowych, w przeciwieństwie do mikrogleju lub innych typów komórek obecnych w wycinku. Standaryzacja infekcji sugeruje, że miano wirusa wynoszące 10⁴ jtk/μl powoduje wystarczającą ekspresję białka zielonej fluorescencji do śledzenia i analizy migracji komórek. Zwiększone miano wirusa, użycie nieselektywnego wirusa (np. adenowirusa, lentiwirusa) lub inne sposoby znakowania wszystkich komórek mogą uniemożliwić identyfikację wyraźnych granic komórkowych podczas migracji, komplikując w ten sposób analizę. W razie potrzeby można wykorzystać i zoptymalizować alternatywne markery fluorescencyjne.

1. Uzyskaj retrowirusa do infekcji wycinków guza za pomocą standardowych protokołów5,14 lub z dostępnego na rynku źródła. Rozcieńczyć supernatant wirusa, dodając odpowiednią objętość do nieuzupełnionej pożywki neuronalnej, aby uzyskać miano wirusa^10-4 CFU (jednostki tworzące kolonie) / μl.
2. Między 7 - 10 dniami hodowli należy zainfekować interesujące kultury plastrów guza 5 - 10 μL wirusa (10,⁴ CFUs/μL). Umieść wirusa delikatnie kroplami na powierzchni każdego wycinka tkanki. Zmniejszyć objętość dodawanego supernatantu, jeśli plasterek unosi się na powierzchni wkładki. Płytki zawierające kultury warstw należy umieścić z powrotem w inkubatorze.
3. Oceń wycinki pod kątem znakowanych komórek nowotworowych, zaczynając po 24 godzinach od infekcji wirusowej. To opóźnienie czasowe będzie się różnić w zależności od inkorporacji wirusa i kinetyki ekspresji genów fluorescencyjnych. W przypadku zastosowanych tutaj konstruktów wirusowych potrzeba było 72 godzin, aby zaobserwować silny sygnał fluorescencyjny za pomocą standardowego mikroskopu epifluorescencyjnego.
   UWAGA: Rzadko zdarza się, że plasterki wykazują głównie obwodowy rozkład komórek znakowanych wirusem, co może komplikować obrazowanie konfokalne. Aby uniknąć tej komplikacji, spróbuj zmniejszyć grubość plastra i różnice grubości na całym plasterku. Jeśli kultura plastrów ma grubszy obszar w pobliżu środka, może to uniemożliwić odpowiednią penetrację składników odżywczych, ograniczając w ten sposób populację aktywnie dzielących się komórek nowotworowych. Testem jakościowym do badań przesiewowych w kierunku tego powikłania jest dodanie odczynnika barwnika tetrazolowego (tj. MTT (bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazoliowy)) do pożywki do hodowli warstw. Obszary plasterka, które nie zmieniają koloru na niebieski po dodaniu odczynnika, wskazują na brak aktywności metabolicznej i pogorszenie zdrowia plasterka.

2. Poklatkowe skanowanie laserowe pojedynczym fotonem Konfokalne obrazowanie migracji komórek nowotworowych

UWAGA: Po udanej transdukcji i potwierdzeniu zdrowia hodowli, komórki można obrazować w warunkach kontrolnych, a następnie przez równy okres obrazowania w warunkach leczenia. Korzystając z tego protokołu, komórki zostały pomyślnie zobrazowane i śledzone przez 12 godzin w każdym stanie. Jednak krótsze lub dłuższe okresy obrazowania i manipulacji środowiskowej mogą być również pouczające.

1. Ładowanie mikroskopu
   1. Przed obrazowaniem umieść 1 ml świeżego podłoża w plasterkach w naczyniu ze szklanym dnem.
   2. Pozwól, aby pożywka w naczyniu ze szklanym dnem zrównoważyła się w inkubatorze przez 15 minut.
      UWAGA: W tym momencie rozpuszczalne środki znakujące, takie jak fluorescencyjnie sprzężone lektyny (tj. izolektyna IB4 do znakowania mikrogleju) lub skrzyżowane z ligandem kropki kwantowe, można dodać do pożywki do hodowli warstwowej w celu identyfikacji subpopulacji komórkowych podczas obrazowania.
   3. Przenieś wkładkę, która ma być zobrazowana, do naczynia ze szklanym dnem za pomocą sterylnych kleszczy w okapie z przepływem laminarnym. Przetransportuj naczynie do stolika mikroskopowego.
   4. Utrzymuj kultury plastrów w temperaturze 37 °C i 5% atmosferze_CO2 w szczelnie zamkniętym inkubatorze pod mikroskopem. Stosować sterylne nawilżanie_H2Ow komorze inkubacyjnej, jeśli jest dostępne, aby zapobiec nadmiernemu parowaniu pożywki (szczególnie ważne w przypadku dłuższych eksperymentów obrazowych).
   5. Wykorzystaj mikroskop konfokalny z dużym odległością roboczą, 10-krotnym obiektywem powietrznym i wzbudzeniem laserowym dla pojedynczych fotonów i/lub wielu fotonów. nuta: Upewnij się, że soczewka obiektywu mikroskopu zapewnia odpowiednią odległość roboczą. Ze względu na dodatkową wysokość od inkubatora ze stopniem, naczynia ze szklanym dnem i wkładki do hodowli tkankowej, kluczowe znaczenie mają cele związane z dużą odległością roboczą.
   6. Zabezpiecz szklaną płytę dolną, zdejmij plastikową pokrywę szalki Petriego i przykryj membraną przepuszczającą gaz.
2. Akwizycja obrazu
   1. Użyj mikroskopu, aby wizualnie sprawdzić wycinek i zlokalizować odpowiednie pole o odpowiedniej gęstości fluorescencyjnie znakowanych komórek nowotworowych między krawędzią plastra a środkiem. Unikaj pól obrazowania na krawędzi wycinka, ze względu na zwiększoną podatność na przesunięcia tkanek podczas obrazowania. W celu ograniczenia tego przesunięcia można zastosować harfy do krojenia tkanek.
   2. Użyj oprogramowania do obrazowania w trybie analizy wielowymiarowej, aby ustawić pierwszą (dolną) i ostatnią (górną) granicę stosu Z, tak aby wszystkie pozycje, które mają być zobrazowane, zawierały widoczny fluorescencyjny sygnał komórkowy. Obrazowanie przez 150 - 200 μm wycinka, ze stałym krokiem Z wynoszącym 10 μm, zapewniło odpowiednią rozdzielczość do śledzenia ścieżek komórek (można ją dostosować do indywidualnych potrzeb obrazowania).
   3. Jeśli mikroskop jest wyposażony w stolik z napędem silnikowym, upewnij się, że na każdą akwizycję Z-stack jest odpowiedni czas. Ustaw odstęp czasu między akwizycjami tak, aby był równy czasowi skanowania na pozycję x liczbie pozycji do zobrazowania (tj. zobrazowane obszary guza).
      UWAGA: Do jednoczesnego wzbudzenia zielonych i czerwonych fluoroforów należy użyć dwuliniowego programu laserowego skanowania liniowego, z jednoczesnym wzbudzeniem 488 nm i 633 nm. Wybrana długość fali wzbudzenia laserowego będzie się różnić w zależności od ekspresji poszczególnych białek fluorescencyjnych.
   4. Utrzymuj jednolitą moc lasera i konfokalne ustawienia otworków między obrazowanymi obszarami guza. Wykorzystaj najniższe ustawienie mocy lasera potrzebne do wyraźnego rozgraniczenia ciał komórek nowotworowych i procesów w celu ograniczenia fototoksyczności. Konkretne jednostki parametrów obrazowania (tj. moc i ustawienia otworka konfokalnego) będą się różnić w zależności od specyfikacji mikroskopu i źródła laserowego.
   5. Skompensuj potencjalne parowanie mediów, dodając 2-3 stopnie "buforowe" stosu Z w płaszczyznach ogniskowych posuwających się w kierunku celu. To skutecznie zapobiega opuszczaniu przez tkankę zakresu akwizycji stosu Z w płaszczyźnie pionowej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM High Glucose	Invitrogen (Gibco)	11960-044
Neurobasal-A Medium, bez czerwieni fenolowej	Invitrogen (Gibco)	12349-015
B-27 Suplement (50X), bez surowicy	Invitrogen (Gibco)	17504-044
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)	Invitrogen (Gibco)	15140-122
Suplement GlutaMAX	Invitrogen (Gibco)	35050-061
L-Glutamina (200 mM)	Invitrogen (Gibco)	25030-081
HEPES (1 M)	Invitrogen (Gibco)	15630-080
Nystatyna Zawiesina	Sigma-Aldrich	N1638-20ML	10 000 jednostek/ml w DPBS, przetwarzana aseptycznie, BioReagent, odpowiedni do hodowli komórkowych
UltraPure Niskotopniejąca agaroza	Invitrogen (Gibco)	16520-050	Topi się w 65,5 C, Pozostaje płynny w 37 C i szybko twardnieje poniżej 25 C.
Izolektyna GS-IB4 firmy Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 Conjugate	Thermo Fisher (sondy molekularne)	I32450	Stosowany w podłożach do oznaczania mikrogleju/makrofagów
pRetroX-IRES-ZsGreen1 Wektor	Clonetech	632520
Retro-X Koncentrator	Clonetech	31455	Żywica wiążąca do nieultrawirowania stężenie supernatantów wirusowych
pVSG-G Wektor	Clonetech	631530	część Retro-X Universal Retroviral Expression System
GP2-293 Wirusowe komórki pakujące	Clonetech	631530	część Retro-X Universal Retroviral Expression System
Klej cyjanoakrylowy (Super Glue)	Sigma-Aldrich	Z105899	średniej lepkości
(kwadrat - S22)	Polysciences, Inc.	18646A-1	Formy do osadzania próbek guza
Mikroszpatułki ze stali nierdzewnej	Fisher Scientific	S50823	Przyrząd do zginania 45 stopni na szyjce ostrza łyżki
Zakrzywione kleszcze preparacyjne Fisherbrand	Fisher Scientific	08-875
Żyletka z pojedynczą krawędzią (amerykańskie maszynki do golenia)	Fisher Scientific	17-989-001	Krawędź ostrza ma grubość 0,009 cala. Zaciśnięta osłona z krawędzią jest zdejmowana przed załadowaniem na wibratome.
Leica VT1000 S Vibratome	Leica Biosystems	VT1000 S
Hydrofilowa wkładka do hodowli komórkowych z PTFE	EMD Milipore	PICM0RG50	30 mm, hydrofilowy PTFE, 0,4 μm wielkość porów
35 mm Naczynia ze szklanym dnem	MatTek	P35G-1.5-20-C	Rękaw o średnicy szkła 20mm. Grubość szkła nakrywkowego 1,5
Mikoskop konfokalny LSM 510	Zeiss	LSM 510	10x (c-Apochromat NA 0,45)
Inkubator PECON Stagetop	PeCON Germany	(Wycofany)	Inkubator PM 2000 RBT to kompaktowy produkt przeznaczony do użytku z mikroskopami Zeiss.

Forma do zatapiania Peel-A-Way o Obiektyw powietrzny