Spontaniczne obrazowanie wapnia dla dynamiki specyficznej dla przedziałów w astrocytach

Streszczenie

Źródło: Bannai, H., et al., Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators. J. Vis. Exp. (2019 rok)

Film demonstruje obrazowanie fluorescencyjne w celu obserwacji specyficznej dla przedziałów spontanicznej dynamiki wapnia w astrocytach poprzez sekwencyjne monitorowanie wrażliwych na wapń białek zlokalizowanych na błonie plazmatycznej i retikulum endoplazmatycznym.

Protokół

1. Obrazowanie Ca^{2 +}

1. Rejestrowanie spontanicznej aktywności astrocytów wyrażających Lck-RCaMP2 i OER-GCaMP6f /
   UWAGA: Bez optyki rozdzielającej obraz, sygnały Ca²⁺ na błonie plazmatycznej i wokół retikulum endoplazmatycznego (ER) mogą być monitorowane w tej samej komórce. W tym miejscu opisano sekwencyjny zapis Lck-RCaMP2 (genetycznie kodowany wskaźnik Ca²⁺ ukierunkowany na błonę plazmatyczną) i OER-GCaMP6f (genetycznie kodowany genetycznie wskaźnik Ca²⁺ zewnętrznej retikulum endoplazmatycznego) w tych samych astrocytach. Obiektyw olejowy z aperturą numeryczną większą niż 1,3 jest wysoce zalecany do spontanicznej aktywności Ca²⁺.
   1. Włącz mikroskop, kamerę, źródło światła i komorę grzewczą mikroskopu na co najmniej 30 minut przed nagrywaniem.
   2. Umieścić szkiełko nakrywkowe zawierające komórki transfekowane Lck-RCaMP2 i OER-GCaMP6f w komorze zapisu i dodać 400 μl podłoża do obrazowania. Umieść pokrywę na górze komory.
   3. Wybierz zestaw filtrów dla GCaMP6f i źródła światła (niebieskie światło wzbudzenia, np. 470 – 490 nm; patrz Tabela materiałów). Zlokalizuj astrocyty wykazujące ekspresję OER-GCaMP6f.
   4. Wybierz zestaw filtrów i źródło światła dla RCaMP2 (zielone światło wzbudzenia, np. 510–560 nm; patrz Tabela materiałów) i sprawdź, czy Lck-RCaMP2 ulega ekspresji w tych samych astrocytach. Unikaj długiej ekspozycji na źródło światła, aby zapobiec fotowybielaniu.
   5. Nagrywaj obrazy poklatkowe Lck-RCaMP2 przy 2 Hz przez 2 minuty. Zapisz dane obrazowania na dysku twardym.
   6. Zmień filtr ustawiony na filtr dla GCaMP6f. Nagrywaj zdjęcia poklatkowe OER-GCaMP6f w tym samym polu widzenia przy 2 Hz przez 2 minuty. Zapisz dane na dysku twardym.
   7. Analizuj dane za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
18-mm średnicy okrągłe szkiełka nakrywkowe	Karl Hecht "Assistent"	#41001118	Grubość 1, okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 18 mm; można stosować alternatywne szkiełka nakrywkowe.
Kamera do rejestracji			Dostępne były następujące kamery: chłodzona kamera CCD (np. Hamamatsu Photonics, OECA-ER), kamera EM-CCD (np. Hamamatsu Photonics, ImagEM; Andor, iXon) lub kamera CMOS (np. Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0)
		do analizy obrazu	, takie jak Metamorph (urządzenia molekularne), Image J (NIH) i TI Workbench14 (wykonane na zamówienie)
Nośnik obrazowania i bufor			Użyj optymalnego podłoża lub bufora do eksperymentu. W przypadku stosowania pożywki pożądane jest podłoże bez czerwieni fenolowej w celu zmniejszenia fluorescencji tła. Dodaj 20 mM HEPES, aby utrzymać pH poza inkubatorem dwutlenku węgla.
Odwrócony mikroskop			Taki jak IX73 (Olympus) lub Eclipse TI (Nikon Instech)Zestaw
filtrów mikroskopowych do obrazowania			Odpowiedni filtr do GFP (wzbudzenie, 480 ± 10 nm; emisja, 530 ± 20 nm)
Zestaw filtrów mikroskopowych do obrazowania			Odpowiedni filtr do RFP (wzbudzenie, 535 ± 50 nm; emisja, długi przepust 590 nm)
System			mikroskopu System grzewczy służący do utrzymywania komórek w temperaturze 37°C podczas obrazowania. Aby uniknąć dryftu spowodowanego rozszerzalnością cieplną, zaleca się stosowanie systemów grzewczych obejmujących cały mikroskop (np. Tokai Hit, Thermobox).
Mikroskopowe źródło światła do wzbudzenia			Lampa rtęciowa (100 W), lampa ksenonowa (75 W), system oświetlenia diodą elektroluminescencyjną (LED) (np. CoolLED Ltd., precisExcite; Thorlabs Inc., źródło LED o 4 długościach fali; Lumencor, lekki silnik SPECTRA X). W przypadku bryły rtęci i lampy ksenonowej należy użyć filtra ND, aby zmniejszyć intensywność wzbudzenia.
		obiektywu mikroskopu	Plan-apochromatyczny obiektyw immersyjny z olejkiem o aperturze numerycznej większej niż 1,3 jest wysoce zalecany do rejestrowania spontanicznej aktywności Ca²⁺ w neuronach i astrocytach.
Komora nagraniowa	Elveflow	Ludin Chamber	Ta komora nagraniowa jest przeznaczona do okrągłych szkiełek nakrywkowych o średnicy 18 mm.
Mikroskop stereoskopowy			Służy do preparowania hipokampów. Dostępne są mikroskopy stereoskopowe Olympus SZ60 lub ich odpowiedniki.

obrazu mikroskopowego Oprogramowanie fluorescencyjny GCaMP6f RCaMP2 ogrzewania Soczewka