Ostre i przewlekłe badanie czucia dotykowego po uszkodzeniu rdzenia kręgowego u szczurów

Podsumowanie

Opisujemy dwie metody testowania czucia dotykowego w ostrych lub przewlekłych okresach po urazie rdzenia kręgowego u szczurów. Te zwalidowane procedury pozwalają wykryć rozwój i utrzymywanie się doznań typu allodynii.

Streszczenie

Urazy rdzenia kręgowego (SCI) upośledzają układy sensoryczne, wywołując allodynię^1-8. Aby zidentyfikować komórkowe i molekularne przyczyny allodynii, konieczne jest zastosowanie czułych i wiarygodnych testów sensorycznych w modelach SCI u szczurów. Jednak do niedawna żadne pojedyncze podejście testowe nie zostało zwalidowane dla SCI, przez co w laboratoriach nie wdrożono ustandaryzowanych metod. Dodatkowo dostępne metody testowania nie mogły być stosowane w fazie ostrej lub w przypadku występowania ciężkich zaburzeń motorycznych, co uniemożliwiało badanie rozwoju allodynii indukowanej przez SCI³. Przedstawiamy tutaj dwie zwalidowane metody testowania sensorycznego z użyciem monofilamentów von Frey (VFH), które ilościowo określają zmiany progów czucia dotyku po SCI^4-5. Pierwszym testem jest dobrze ugruntowany test Up-Down, który wykazuje wysoką czułość i swoistość przy różnym stopniu nasilenia SCI w badaniach przewlekłych⁵. Drugim testem jest nowo opracowany test VFH grzbietowy, który może być stosowany w fazie ostrej po SCI w momencie rozwoju allodynii, przed powrotem funkcji motorycznych^4-5. Każdy monofilament VFH wywiera skalibrowaną siłę podczas dotykania skóry tylnej łapy, aż do momentu jego wygięcia. W metodzie up-down na podeszwowym dermatomie L5 stosuje się naprzemiennie filamenty VFH o większej lub mniejszej sile w celu określenia progów odruchu wycofania zginaczy. Stosuje się sukcesywnie coraz większe siły, aż do wystąpienia wycofania, a następnie filamenty VFH o mniejszej sile, aż do ustania wycofania. Próg dotykowy odzwierciedla siłę niezbędną do wywołania wycofania w 50% bodźców. W nowym teście każdy filament VFH jest przykładany do grzbietowego dermatomu L5 łapy, podczas gdy szczur jest podtrzymywany przez badacza. Stymulacja VFH odbywa się w rosnącej kolejności siły, aż do momentu, gdy co najmniej 2 z 3 aplikacji przy danej sile wywołają wycofanie łapy. Progiem czucia dotykowego jest najniższa siła wywołująca wycofanie w 66% przypadków. Opisano procedury aklimatyzacji, testowania i punktacji. Zdefiniowano próby nietypowe wymagające ponownego testowania oraz próby typowe. Wykorzystanie zwierząt zostało zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Stanowego Ohio.

Protokół

1. Testy Von Frey w obrębie podeszwy stopy (góra/dół)

Celem testu jest określenie wrażliwości dotykowej poprzez pomiar siły wymaganej do wywołania wycofania łapy w odpowiedzi na bodziec. Do stymulacji łapy używa się dostępnych w sprzedaży skalibrowanych mononitek Von Frey o zakresie od 4,56 do 6,10. Inne bodźce sensoryczne, takie jak wizualizacja bodźca lub propriocepcja, mogą zaburzać pomiary progu dotykowego, dlatego odpowiedzi oparte na bodźcach wzrokowych lub proprioceptywnych są uznawane za nieważne. Aby zapobiec widoczności mononitki dotykającej skóry, testy przeprowadzamy wyłącznie w czasie, gdy szczur spożywa pokarm. Ten dystraktor poznawczy zapewnia również, że wszystkie szczury są badane przy podobnym bazowym poziomie komfortu. Aby uniknąć odpowiedzi wynikających z bodźców proprioceptywnych, a nie dotykowych, z analizy wykluczamy próby, w których mononitka uniesie lub przesunie łapę.

A. PROCEDURY AKLIMATYZACJI DLA METODY GÓRA-DÓŁ

1. Podaj płatki owocowe w domowej klatce, aby szczury rozpoznały i zaczęły poszukiwać tej nagrody pokarmowej. Szczury nie muszą być poddawane głodówce na żadnym etapie procesu oswojenia ani testowania.
2. Szczury są gotowe do aklimatyzacji w środowisku i procedurach testowych, gdy zaczną jeść płatki owocowe w domowej klatce. Aklimatyzacja odbywa się podczas co najmniej 4 sesji po 10 minut każda, choć może być wymaganych więcej. Stosuje się dziesięciominutowe sesje, aby szczury nie nasyciły się przed ich zakończeniem.
3. Umieść szczura w komorze testowej wraz z trzema kawałkami płatków owocowych. Podawaj kolejne kawałki płatków po jednym lub dwa w miarę ich zjadania. Podczas trzeciej sesji, gdy szczur je, wykonuj ruchy dłonią pod drucianą podłogą, aby zwierzę przyzwyczaiło się do ruchu pod łapą. Podczas czwartej sesji dotykaj podeszcznej powierzchni łapy monofilamentem 5,18 około raz na minutę, łącznie dziesięć razy. Naiwny szczur nie powinien reagować na ten podprogowy bodziec.
4. Odnotuj liczbę zjedzonych kawałków płatków, częstotliwość oddawania moczu i kału, zachowania typu freezing (zastyganie) oraz grooming (pielęgnację). Zastyganie występuje w dwóch formach: a) szczur kuca nisko przy ziemi, zazwyczaj przy tylnej ścianie lub tyłem do badacza, i pozostaje nieruchomy; b) szczur kuli się w środku klatki i zazwyczaj terkocze zębami. Zachowania zastygania mogą trwać przez długi czas.
5. Oswojony szczur gotowy do testów będzie jadł niemal bez przerwy przez 10 minut. Będzie się swobodnie poruszać po klatce i bardzo szybko szukać płatków owocowych po zjedzeniu ostatniego kawałka. Co istotne, szczur nie przerwie jedzenia ani nie zostanie rozproszony przez ruchy dłoni pod drucianą podłogą lub aplikację monofilamentu do łapy.

B. PROCEDURY TESTOWE DLA PODEJŚCIA GÓRA-DÓŁ

1. Szczury wydają wokalizacje stresowe, które wykraczają poza ludzki zakres słyszenia. Szczury oczekujące na badanie powinny być przetrzymywane w osobnym pomieszczeniu, aby nie słyszały tych wokalizacji.
2. Szczury z urazem rdzenia kręgowego, które nadają się do testowania metodą von Frey Hair (VFH) w schemacie góra-dół, muszą wykazywać zdolność do obciążania kończyn. Kończyn, które nie są w stanie podtrzymać szczura, nie można wiarygodnie testować, ponieważ aplikacja monofilamentów powoduje przesunięcie łapy przed zgięciem włókna.
3. Umieść szczura w komorze testowej wraz z 2 lub 3 kawałkami owocowych płatków zbożowych. Szczury muszą jeść podczas każdej aplikacji VFH.
4. Rzuć kostką, aby określić, od której kończyny tylnej (HL) rozpocząć badanie. Liczby parzyste oznaczają prawą łapę, a nieparzyste lewą.
5. Rozpocznij sesję testową od monofilamentu 5.18. Reakcje wycofania mogą wystąpić w zakresie od 4.56 do 6.10 u szczurów zdrowych oraz z urazem rdzenia kręgowego (SCI), a monofilament 5.18 znajduje się w środku tego zakresu.
6. Nie aplikuj monofilamentu, gdy szczur zamiera w bezruchu (freezing), kuca lub nie je. Jeśli badacz poczeka, warunki te czasem ustąpią i badanie będzie można wznowić. Jeśli szczur wykazuje takie zachowania, a całkowity czas przebywania w aparaturze wynosi 20 minut, przerwij badanie i powtórz je od początku następnego dnia. Nie wyjmuj szczura, gdy wykazuje te zachowania, ponieważ może to zwiększyć ich częstotliwość. Poczekaj, aż szczur przerwie te wzorce zachowań, zanim go dotkniesz, aby uniknąć ich utrwalania.
7. Dotknij monofilamentem skórnego obszaru plantarnego L5 tylnej łapy, pomiędzy poduszkami stopy, aż do jego zgięcia (patrz Rycina 1A). Ta płynna, stabilna aplikacja powinna trwać około jednej sekundy, po czym należy odsunąć monofilament od skóry. Unikaj dotykania jakiejkolwiek części poduszek stopy, ponieważ czułość skóry w tych obszarach jest znacznie niższa. Takie pojedyncze dotknięcie stanowi jedną próbę.
8. Reakcja pozytywna występuje, gdy szczur szybko unosi łapę, odsuwając ją od monofilamentu. Wycofanie musi zostać zainicjowane do momentu usunięcia monofilamentu, aby potwierdzić, że reakcja jest powiązana z aplikacją monofilamentu.
9. Obserwuj zwierzę pod kątem innych oznak świadomości dotyku monofilamentu, takich jak wokalizacja, patrzenie w dół, w tył lub na badaną łapę, lizanie łapy, przedłużone wycofanie łapy lub drgania uszu. Odnotuj je w arkuszu danych. Gdy zachowania te występują wraz z wycofaniem łapy, stanowi to dowód na nadkręgowe postrzeganie bodźca.
10. W przypadku reakcji pozytywnej zastosuj następny, niższy monofilament. W przypadku braku reakcji (negatywnej) przejdź do następnego, wyższego monofilamentu. Zachowaj 30 sekund przerwy między każdą aplikacją monofilamentu, aby receptory sensoryczne wróciły do bazowej częstotliwości wyładowań przed ponownym testowaniem (w celu zapobiegania adaptacji).
11. Kontynuuj aplikację wyższych lub niższych monofilamentów do tylnej łapy w zależności od reakcji pozytywnych lub negatywnych, aż uzyskasz 10 prób. Następnie powtórz procedurę na drugiej tylnej łapie (patrz przykładowy arkusz danych).
12. Najwyższy monofilament VFH, który można przetestować bez wprowadzania bodźców proprioceptywnych i unoszenia łapy, to 6.10. Monofilamenty VFH 6.45 i większe nie powinny być stosowane, ponieważ łapa unosi się przed zgięciem monofilamentu. Jeśli przy 6.10 nie wystąpi reakcja, w następnej próbie ponownie zastosuj 6.10.
13. Reakcję należy unieważnić, a próbę powtórzyć, jeśli podczas aplikacji bodźca lub wycofywania łapy wystąpi jedna z poniższych sytuacji:
    1. Szczur nie je w sposób ciągły.
    2. Szczur odsuwa się od bodźca VFH przed zgięciem monofilamentu, co uniemożliwia określenie siły, która wywoła reakcję wycofania.
    3. Łapa zostaje uniesiona przez VFH (przed lub po zgięciu VFH), co dostarcza stymulacji proprioceptywnej oprócz dotykowej.
14. Sesię testową dla obu kończyn tylnych można zazwyczaj ukończyć w czasie krótszym niż 15 minut.

C. PRZETWARZANIE DANYCH DLA PODEJŚCIA OD GÓRY DO DOŁU (UP-DOWN)

1. Udany test obejmuje 10 następujących po sobie prób dla każdej łapy.
2. Wartość progu dotykowego to najcieńszy monofilament, który wywołuje wycofanie łapy w ≥50% prób, pod warunkiem, że zastosowano 3 lub więcej prezentacji monofilamentu (patrz. przykładowy arkusz danych, progi są zakreślone okręgiem).
3. Monofilament, dla którego przeprowadzono tylko 2 próby w sumie, nie jest wybierany jako próg, nawet jeśli jedna próba była pozytywna, a druga negatywna. Wielokrotne prezentacje bodźca są lepszymi wskaźnikami wzorca reakcji na daną siłę.
4. Jeśli żaden monofilament nie wywołuje reakcji pozytywnych w co najmniej 50% testów, szczurowi przypisuje się wartość 6,45. Oznacza to, że szczur nie wykrył najwyższego testowalnego monofilamentu o wartości 6,10 ponad poziom przypadkowy. Wartość 6,45 jest nadawana, ponieważ reprezentuje ona kolejną wartość wyższą niż testowany zakres monofilamentów.
5. Wartość progu dla prawej i lewej łapy należy przeliczyć na siłę wyrażoną w gramach. Wartości siły w gramach zostaną dostarczone przez dostawcę włókien von Frey. W przypadku danych z urazów obustronnych, wartości progowe siły w gramach dla obu łap można uśrednić, aby uzyskać pojedynczy wynik.

2. Badanie grzbietowe metodą Von Frey

Celem niniejszego testu jest określenie czułości dotykowej u szczurów z tak dużymi zaburzeniami kontroli motorycznej, że nie można ich badać przy użyciu typowych metod VFH powierzchni podeszwowej. Test ten określa, jaka siła nacisku jest potrzebna do wywołania reakcji awersyjnej. Aby uniknąć odpowiedzi na bodźce proprioceptywne, nie uwzględniamy prób, w których łapa zostaje poruszona przez VFH podczas aplikacji. Dodatkowo pomijamy próby, w których VFH ześlizguje się lub przesuwa po grzbietowej powierzchni stopy.

A. PROCEDURY AKLIMATYZACJI DO TESTU VON FREYA NA GRZBIECIE

1. Łagodnie oswajano szczury podczas czterech sesji po 10 minut każda przed badaniami wyjściowymi oraz urazem rdzenia kręgowego.
2. Luźno owiń szczura małym ręcznikiem w taki sposób, aby tylna część ciała pozostała odsłonięta, jak pokazano poniżej (Rycina 1B). Umieścić szczura nad stołem tak, aby tylne łapy lekko opierały się o jego powierzchnię. W przypadku każdego szczura stosować ten sam, dopasowany, ale nie zbyt ciasny chwyt. Oparcie przedramienia o krawędź stołu może pomóc w zmniejszeniu zmienności między osobnikami.
3. Oswojony szczur przygotowany do testu nie będzie stawiał oporu podczas trzymania go w ręczniku przez kilka kolejnych minut; może się jednak zdarzyć, że podczas badania obu tylnych łap konieczne będzie ponowne owinięcie zwierzęcia 1 lub 2 razy.

B. PROCEDURY TESTOWE DLA TESTU VON FREYA NA GRZBIECIE

1. Rzuć kostką, aby określić, od której kończyny tylnej rozpocząć badanie. Liczby parzyste oznaczają prawą łapę, a nieparzyste lewą.
2. Luźno owiń szczura ręcznikiem, pozostawiając odsłoniętą tylną część ciała.
3. Bodziec dotykowy podaje się dopiero wtedy, gdy szczur jest spokojny i nieruchomy przez co najmniej 10 sekund.
4. Zaczynając od VFH 4.56, przyłóż monofilament prostopadle do powierzchni grzbietowej między pierwszą a drugą kością śródstopia, około 1 cm proksymalnie od stawu (Rysunek 1C). Przyłóż monofilament gładkim, jednostajnym ruchem w odstępie jednej sekundy, aż się ugnie, a następnie go usuń. Takie pojedyncze dotknięcie stanowi jedną próbę.
5. Reakcja pozytywna występuje, gdy szczur szybko odsunie łapę od bodźca. Kierunek ruchu jest często tylny lub zewnętrzny przed zgięciem kończyny tylnej. Odruch wycofania musi zostać zapoczątkowany w momencie usuwania monofilamentu, aby potwierdzić, że reakcja jest związana z jego przykładaniem.
6. Przykładaj monofilament 4.56 jeszcze dwa razy, zachowując co najmniej 30 sekund odstępu między aplikacjami, aby zapobiec zjawisku „wind-up” (kumulacji sensorycznej) i pozwolić receptorom sensorycznym powrócić do bazowego poziomu pobudzenia przed ponownym badaniem (aby zapobiec adaptacji).
7. Test bodźca należy powtórzyć, jeśli VFH ześlizgnie się i lekko otrze o skórę, co sprawi, że przyłożenie siły będzie przypominało bardziej musknięcie lub przesunięcie niż punktowy kontakt.
8. Jeśli wystąpi mniej niż 2 (tj. 1 lub 0) reakcji pozytywnych na monofilament 4.56, kolejny większy VFH stosuje się 3 razy w ten sam sposób.
9. W ten sposób stosuje się progresywnie większe VFH od 4.56 do 5.8, aż do uzyskania dwóch lub więcej reakcji pozytywnych lub do osiągnięcia największego VFH.
10. Próg wycofania łapy to najniższy VFH, który wywołuje co najmniej 2 reakcje pozytywne w 3 próbach.
11. Powtórz procedurę na drugiej łapie.
12. Sesja badawcza dla obu tylnych łap zazwyczaj może zostać ukończona w ciągu 15 minut.

3. Reprezentatywne wyniki

Pomyślny test objawi się natychmiastowym, szybkim wycofaniem tylnej łapy w odpowiedzi na prostopadle przyłożony impuls VFH w obszarze środkowej części podeszwy (Rycina 1A) lub powierzchnia grzbietowa pomiędzy 1^{Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia.} oraz 2^nd kość śródstopia 1 cm od stawu (Rysunek 1C). Reakcje te są sumowane w celu wyznaczenia progu dotykowego dla każdej tylnej łapy. Progi dotykowe uzyskane podczas testów VFH grzbietowych w ostrym stadium SCI wykazały doskonałą zgodność z progami VFH podeszwowymi wyznaczonymi w stadium przewlekłym (Rysunek 2). Spadki progów dotykowych uzyskane w testach podeszwowych lub grzbietowych występują w przypadku stopniowania uszkodzenia rdzenia kręgowego (SCI) (Rycina 3^3,5). Nadwrażliwość ta objawia się już 7 dni po SCI i utrzymuje się przez cały czas trwania eksperymentu^3-4,6Podczas gdy szereg stopni ciężkości urazów rdzenia kręgowego (SCI) nie wpływa na progi czucia dotykowego łapy, obniżenie tych progów występuje przy cięższych urazach SCI (Rysunek 3). Co istotne, rozwój allodynii poniżej poziomu uszkodzenia jest odpowiedzią typu „wszystko albo nic”, która występuje w przypadku utraty więcej niż 60% istoty białej w centrum zmiany. (Rysunek 4³).

Progi dotykowe mogą ulegać obniżeniu, co prowadzi do sztucznych reakcji na niskie siły VFH. Istnieją co najmniej dwa warunki, które mogą spowodować obniżenie progu – szybkie przykładanie VFH do skóry w sposób kłujący lub zbyt krótki czas oczekiwania pomiędzy aplikacjami bodźca. Aby mieć pewność, że progi dotykowe są autentyczne, należy dbać o to, by każdy VFH stosować z podobną, niską prędkością podejścia, a odstęp międzybodźcowy musi wynosić co najmniej 30 s. Wykazaliśmy również, że zachowania żerowe ograniczają obniżanie się progów⁵.

Rysunek 1. Schemat i zdjęcie przedstawiające miejsce stymulacji włosem von Freya podczas testów w obrębie podeszwy oraz grzbietu łapy (VFH). A) W przypadku testów VFH w obrębie podeszwy, włos von Freya powinien być przykładany prostopadle do środkowej części podeszwy tylnej łapy, około 1 cm za paliczkiem środkowym (zgodnie z czerwonym polem na schemacie powierzchni podeszwowej tylnej łapy), z wolną, stałą prędkością, aż do momentu jego ugięcia. B i C) W technice VFH w obrębie grzbietu łapy szczur jest luźno owinięty ręcznikiem chirurgicznym, jak pokazano na zdjęciu. Włos VFH jest przykładany do powierzchni grzbietowej łapy pomiędzy pierwszą a drugą kością śródstopia, około 1 cm proksymalnie od stawu.

Rycina 2. Progi sensoryczne dla włókien von Freya na grzbiecie korelują ze standardowymi pomiarami VFH na podeszwie stopy. (n-4; współczynnik Pearsona = 0,503, p) < 0,01, r2 = 0,67). Linie przerywane przedstawiają próg odcięcia dla odczuwania allodynii z zastosowaniem technik grzbietowej VFH lub podeszwowej VFH i wskazują, że progi allodyniczne w 7. dniu po SCI, wyznaczone testem grzbietowej VFH, pozwalają przewidzieć chroniczną allodynię poniżej poziomu uszkodzenia, określoną metodami podeszwowej VFH.

Rysunek 3. Wczesne progi sensoryczne włókien von Frey w obszarze grzbietowym pozwalają przewidzieć alodyjną i niealodyjną wrażliwość dotykową przy różnych stopniach nasilenia urazu w późniejszych punktach czasowych. Porównywalne progi sensoryczne odnotowano pomiędzy pomiarami VFH w obszarze grzbietowym w 7. dniu po SCI a pomiarami VFH w obszarze podeszwowym w 28. dniu po SCI. Wyjątkowa podobieństwo wystąpiło w szerokim zakresie SCI, przy czym istotną alodynię odnotowano w przypadku umiarkowanego i ciężkiego SCI (p<0,05 1,1 mm przemieszczenia w porównaniu ze wszystkimi pozostałymi grupami).

Rycina 4. Procent szczurów wykazujących allodynię tylnych łap w 6. tygodniu po urazie w grupach poddanych laminektomii (bez SCI) oraz w grupach z SCI. Allodynię zaobserwowano wyłącznie u szczurów z umiarkowanym lub ciężkim SCI (przesunięcia rdzenia o 0,9, 1,1, 1,25, 1,3 mm przy użyciu urządzenia OSU ESCID), podczas gdy szczury z łagodnym SCI (przesunięcia rdzenia o 0,3, 0,5, 0,7 mm) wykazywały prawidłowe reakcje na stymulację dotykową. Dołączono reprezentatywne koronalne przekroje rdzenia kręgowego z centrum uszkodzenia, barwione na mielinę, dla laminektomii (kontrola bez urazu) oraz dla łagodnych (przesunięcie 0,5 mm), umiarkowanych (przesunięcie 1,1 mm) i ciężkich (przesunięcie 1,3 mm) stłuczeń rdzenia kręgowego, aby ukazać stopień zachowania aksonów powiązany z tą nadwrażliwością. (Pasek skali = 0,5 mm).

Rycina 5. Przykładowy arkusz danych dla testu von Frey (metoda up-down). Dla każdej próby zapisuje się wartość włosa oraz wynik (pozytywny lub negatywny). Odnotowuje się również oznaki świadomości nadrdzeniowej podczas badania. Na koniec testu zlicza się odpowiedzi dla każdej wartości włosa. Wybrana wartość progowa dla przykładowych danych została zakreślona w kółko.

Dyskusja

Przedstawione tutaj metody testowania VFH reprezentują dwa paradygmaty badawcze, które są czułe i wiarygodne w zastosowaniu w szczurzych modelach SCI. Co istotne, test VFH grzbietowy został opracowany do oceny powrotu czucia dotykowego w tylnych łapach bezpośrednio po SCI w odcinku piersiowym kręgosłupa, gdy szczury nie są w stanie stać na tylnych kończynach. Ten paradygmat badawczy może być również stosowany, gdy szczury odzyskają zdolność do podtrzymywania ciężaru ciała, a także w przypadku kończyn tylnych po SCI w odc...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Monofilamenty Semmesa-Weinsteina	Stoelting Co.	58011
Klatka hodowlana dla ryb	Dowolny dostawca		Otwór wywiercony z boku do podawania płatków
Podwyższona siatka druciana (oczka 1/4" X 1/4")	Sklep z narzędziami
Frotka do stabilizacji klatki hodowlanej dla ryb	Dowolny dostawca
Słodzone płatki śniadaniowe	Sklep spożywczy
Chirurgiczny ręcznik Huck 16"x 23"	Sklep z artykułami medycznymi