Wywoływanie uszkodzenia nerwu strzałkowego u myszy w celu zbadania regeneracji połączeń nerwowo-mięśniowych

Streszczenie

Źródło: Dalkin, W., et al. Metoda uszkodzenia nerwu strzałkowego: wiarygodny test do identyfikacji i testowania czynników naprawiających połączenia nerwowo-mięśniowe. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film przedstawia zabieg chirurgiczny mający na celu wywołanie uszkodzenia nerwu strzałkowego u myszy w celu zbadania regeneracji połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ). Procedura polega na odsłonięciu nerwu strzałkowego, zastosowaniu kontrolowanego nacisku w celu wywołania urazu i upewnieniu się, że epineurium pozostaje nienaruszone, aby wspomóc regenerację aksonów. Z biegiem czasu makrofagi usuwają resztki aksonów, ułatwiając naprawę nerwów i ponowne ustanowienie NMJ.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowanie zwierząt do operacji

1. Znieczulić myszy mieszaniną ketaminy (90 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg) poprzez podskórne wstrzyknięcie pachwinowe za pomocą sterylnej strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml. Roztwór nośnika zawiera mieszaninę 0,9% soli fizjologicznej, 17,4 mg/ml ketaminy i 2,6 mg/ml ksylazyny. Umieść zwierzęta z powrotem w klatkach w oczekiwaniu na działanie leków.
   UWAGA: Jeśli dawka nasycająca nie zapewnia wystarczającego znieczulenia na czas zabiegu, można wstrzyknąć dodatkowe 25% dawki nasycającej.
2. Monitoruj zwierzęta po wstrzyknięciu, aby sprawdzić, czy częstość oddechów jest stabilna i czy poziom pobudzenia jest odpowiedni. Sprawdź poziom pobudzenia za pomocą uszczypnięcia tylnej łapy, które nie powinno wywołać żadnej reakcji, gdy zostanie odpowiednio znieczulone.
   UWAGA: Zwykle zajmuje to 3-5 minut w przypadku młodej dorosłej myszy o średniej wadze od 25 do 30 g. Jeśli zwierzę nadal reaguje na leczenie po 10 minutach od wstrzyknięcia, można wstrzyknąć dodatkowe 25% dawki nasycającej środka znieczulającego.
3. Nałóż wazelinę i lekką maść okulistyczną z olejem mineralnym na oczy zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu. Wyjmij zwierzęta z klatki i umieść je na czystej, płaskiej powierzchni. Ogol żądaną kończynę tylną od stopy do miednicy za pomocą elektrycznego trymera do włosów, odsłaniając tylko boczną stronę kończyny.
4. Nałóż chemiczny środek do usuwania włosów na ogolone miejsce na 1 minutę. Ręcznie usuń włosy za pomocą chusteczek laboratoryjnych. Oczyść depilowany obszar chusteczką laboratoryjną nasączoną etanolem.

2. Procedura chirurgiczna

1. Sterylizuj narzędzia chirurgiczne za pomocą autoklawu lub innej odpowiedniej metody. Oczyścić pole operacyjne i tablicę chirurgiczną 80% etanolem/_H2O. Zdezynfekować pole operacyjne prowidonem. Umieść mysz na tablicy operacyjnej i wyrównaj ją z ograniczeniami kończyn. Utrzymuj docelową kończynę tylną w anatomicznie naturalnej pozycji z lekko wyprostowanym stawem kolanowym bez rotacji wewnętrznej lub zewnętrznej.
2. Umieść zwierzę i deskę pod mikroskopem chirurgicznym. Zorientuj się we właściwym miejscu nacięcia poprzez badanie palpacyjne powierzchownych punktów orientacyjnych, w szczególności kostnego stawu kolanowego i grzbietu między mięśniem piszczelowym przednim a mięśniem brzuchatym łydki.
3. Wykonaj około 3 cm nacięcie przez skórę za pomocą skalpela lub nożyczek sprężynowych, używając ogólnych kleszczy do chwytania. Wykonaj nacięcie prostopadłe do leżącego poniżej przebiegu wspólnego nerwu strzałkowego.
4. Kontynuuj nacięcie przez powięź powierzchowną, odsłaniając mięśnie dwugłowe udowe i obszerne mięśnie boczne. Oddziel te mięśnie, przecinając łączącą powięź głęboką. Cięcie 1-2 cm powinno wystarczyć.
5. Cofnij mięsień dwugłowy uda doogonowo za pomocą mechanicznych zwijaczy, odsłaniając wspólny nerw strzałkowy.
6. Śledź nerw proksymalnie, aż zostanie znalezione jego przecięcie ze ścięgnem bocznej głowy mięśnia brzuchatego łydki.
   Uwaga: Narażenie może wymagać dodatkowej manipulacji cofniętą skórą i mięśniami. To skrzyżowanie jest używane jako stabilny punkt orientacyjny dla uszkodzenia nerwów.
7. Chwyć nerw cienkimi kleszczami, wyrównując końcówki równolegle do bocznej granicy ścięgna brzuchatego łydki. Zmiażdż wspólny nerw strzałkowy, wywierając stały, mocny nacisk przez 5 sekund.
8. Potwierdź pełne zmiażdżenie nerwu poprzez oględziny przez lunetę chirurgiczną. Będzie wyglądał na półprzezroczysty w miejscu urazu. W przypadku używania myszy wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych w aksonach obwodowych, fluorescencja zniknie z miejsca urazu.
9. Usuń retraktory i wyrównaj mięśnie w ich anatomicznych pozycjach. Zamknij miejsce nacięcia jedwabnymi szwami 6-0. Wystarczy 1-3 proste szwy przerywane. Umieść regenerującą się mysz na poduszce grzewczej w czystej klatce.
10. Monitoruj wszystkie zwierzęta przez 2 godziny po operacji, aby sprawdzić oddech i wszelkie niepożądane reakcje na znieczulenie. Początkową dawkę buprenorfiny 0,05-0,10 mg/kg mc. należy podać we wstrzyknięciu podskórnym do pachwiny natychmiast po powrocie do zdrowia po operacji. Podawać 3 dodatkowe dawki co 12 godzin przez następne 48 godzin. Po pełnym wyzdrowieniu zwróć myszy do placówki opieki nad zwierzętami.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ketamina	VetOne	501072
Xylazine	Lloyd Inc.	3437
Buprenorfina	Zoopharm	1Z-73000-150910
Chusteczki Nair	Nair
Kim-wipes	Kimtech	34155
Elektryczna maszynka do golenia	Braintree Scientific	CLP-64800
80% EtOH/H₂O
10% Proviodine
1 ml strzykawka
Nożyczki sprężynowe	Vannas	91500-09
Skalpel nr 15	Kleszcze Braintree Scientific	SSS 15
#5	Dumont	11252-00
6-0 szew jedwabny na igle do odwrotnego cięcia	Szew Express	752B
Poduszka grzewcza dla gryzoni	Braintree Scientific	AP-R-18.5
Alexa 555 sprzężone	sondy molekularne	B35451
Vectashield	Vector Labs	H-1000
Mikroskop stereo zmiennoogniskowy	Olympus	562037192
Mikroskop konfokalny Zeiss 700
Pompa perfuzyjna perystaltyczna o zmiennym przepływie	Fisher Scientific	13-876-3

insulinowa alfa-BTX