Indukcja i monitorowanie adoptywnej nadwrażliwości opóźnionej u szczurów

Podsumowanie

Opóźniona nadwrażliwość (DTH) jest reakcją zapalną pośredniczoną przez limfocyty T pamięci efektorowej (TEM) wykazujące ekspresję CCR7. W niniejszym materiale demonstrujemy, jak aktywować swoiste dla antygenu komórki TEM, indukować adopcyjną reakcję DTH u szczurów linii Lewis oraz monitorować odpowiedź zapalną.

Streszczenie

Opóźniona nadwrażliwość (DTH) to reakcja zapalna pośredniczona przez limfocyty T pamięci efektorowej wykazujące ekspresję receptora CCR7, które infiltrują miejsce wstrzyknięcia antygenu, przeciwko któremu układ odpornościowy został uprzednio uwrażliwiony. Reakcja zapalna charakteryzuje się zaczerwienieniem i obrzękiem w miejscu podania antygenu. Jest to wygodny model do określania skuteczności immunosupresantów in vivo. Skórną reakcję DTH można wywołać poprzez adoptywny transfer antygenowo-specyficznych limfocytów T lub poprzez aktywną immunizację antygenem, a następnie wewnątrzskórne podanie tego antygenu w celu wywołania reakcji zapalnej w określonym obszarze skóry. Odpowiedzi DTH można indukować za pomocą różnych antygenów, na przykład owalbuminy, tuberkuliny, toksoidu tężcowego lub hemocyjaniny z małży z rodzaju Keyhole. Takie reakcje można wywołać również przeciwko autoantygenom, na przykład przeciwko białku zasadownemu mieliny (MBP) u szczurów z eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia indukowanym MBP, co stanowi model zwierzęcy stwardnienia rozsianego (1). W niniejszym materiale demonstrujemy, jak wywołać adoptywną reakcję DTH u szczurów linii Lewis. Najpierw stymulujemy in vitro limfocyty T specyficzne dla owalbuminy, a następnie wstrzykujemy te aktywowane komórki do jamny szczurów naiwnych. Po dwudniowym okresie równowagowania komórek in vivo, podajemy szczurom owalbuminę do małżowiny jednego ucha, podczas gdy do drugiego ucha wstrzykujemy sól fizjologiczną. Reakcja zapalna będzie widoczna w czasie od 3 do 72 godzin później; grubość ucha zostanie zmierzona jako wskaźnik nasilenia reakcji DTH.

Protokół

1. Stymulacja limfocytów T specyficznych dla owalbuminy

Spoczynkowe limfocyty T specyficzne dla owalbuminy stymuluje się owalbuminą w obecności napromieniowanych tymocytów szczura Lewis (30 Gy) pełniących rolę komórek prezentujących antygen (APCs), w ośrodku stymulującym (przygotowanym w DMEM + Pen/Strep/L-Glut + NEAA + RPMI Vitamins + 2ME + surowica szczura + owalbumina, w stężeniach końcowych podanych na liście materiałów).

Przygotowanie surowicy szczura

1. Pobieramy surowicę od szczurów poświęcanych jako dawców grasicy.
2. Szczury zostają poddane głębokiej anestezji poprzez inhalację halotanem, a następnie, przy użyciu strzykawek 10 ml i igieł 23 G 1", poprzez perfuzję serca pobierana jest jak największa ilość krwi (5-10 ml na szczura), po czym szczury są bezzwłocznie dekapitowane w celu potwierdzenia śmierci.
3. Pozostawia się krew do skrzepnięcia przez 10 min w temperaturze 37°C, a następnie przez 10 min na lodzie.
4. Skrzep zostaje usunięty, a pozostała ciecz poddana wirowaniu.
5. Surowicę zbiera się, filtruje sterylnie i przechowuje w temperaturze -20°C.

Przygotowanie komórek prezentujących antygen

1. Za pomocą sterylnych narzędzi pobierz grasicę od od decapitated szczura i umieść ją w PBS z penicyliną i streptomycyną (PBS-PS) w temperaturze 0°C.
2. Przenieś grasicę do komory z laminarnym przepływem powietrza, oczyść ją z zakrzepów krwi i innych zanieczyszczeń tkankowych, a następnie pokrój na małe kawałki bezpośrednio do sitka komórkowego (Fisher # 08-771-2) umieszczonego w szalce Petriego o średnicy 10 cm zawierającej 10 ml PBS-PS.
3. Każdy kawałek tkanki przeciśnij przez sitko komórkowe, używając tłoka sterylnej strzykawki 1 ml. Zbierz zawiesinę pojedynczych komórek do probówki 50 ml w temperaturze 0°C.
4. Przepłucz sitko komórkowe dodatkowymi 20-40 ml PBS-PS. Odwiruj zawiesinę z prędkością 1250g, a następnie resuspenduj osad w PBS-PS (5 ml na jedną grasicę) w temperaturze 0°C.
5. Naświetl tę zawiesinę (30 Gy) w irradiatorze gamma i natychmiast przemyj ją dwukrotnie 50 ml PBS-PS.
   
   Uwaga: Najlepszymi dawcami grasicy są młode dorosłe szczury w wieku 5-7 tygodni. Można stosować szczury do 10 tygodnia, jednak liczba komórek z czasem maleje. Płeć nie ma znaczenia, choć zdarza się twierdzić, że samce są lepszymi dawcami grasicy. My zawsze stosujemy samice, ponieważ wszystkie nasze zwierzęta są kwaterowane w tym samym pomieszczeniu, a nie chcemy trzymać samców i samic razem.
   

Stymulacja

1. Jednorazowo przemyj limfocyty T, a następnie je policz.
2. Policz komórki prezentujące antygen (APC).
3. W 10 cm szalce Petriego zawierającej 10 ml medium stymulującego wymieszaj 3 x 10⁶ limfocytów T specyficznych dla owalbuminy z 150 x 10⁶ APC.
4. Inkubuj przez 48 godzin w temperaturze 37°C.

2. Adopcyjny transfer limfocytów T specyficznych dla owalbuminy

1. Jako biorców wykorzystujemy samice szczurów w wieku 7-10 tygodni.
2. Należy policzyć limfocyty T; powinny być duże i okrągłe. Komórki prezentujące antygen będą martwe.
3. Limfocyty T należy odwirować, a następnie resuspender w PBS w stężeniu 10 x 10⁶ cells/ml.
4. Wstrzyknąć 1 ml drogą doszpikową, używając strzykawek 3 ml i igieł 23 G 1".

3. Wywołanie reakcji poprzez podanie antygenu do ucha

1. Dwa dni po transferze adopcyjnym wstrzyknij 20 μl roztworu owalbuminy o stężeniu 1 mg/ml (= antygen właściwy) do jednego ucha oraz sól fizjologiczną (lub antygen niewłaściwy) do drugiego ucha. NIE filtruj roztworu antygenu, ponieważ może to doprowadzić do utraty agregatów wzmacniających reakcję zapalną.
   
   Uwaga: Szczury powinny być poddane znieczuleniu, aby uniknąć ich ruchów. Jeśli jesteś praworęczny, przytrzymaj ucho między lewym kciukiem a palcem wskazującym, tak aby palec wskazujący znajdował się wewnątrz ucha, a szczur był zwrócony w Twoją stronę.
   
   
2. Wstrzyknij roztwór w małżowinę uszną, używając igieł 27G ½". Staraj się wstrzykiwać preparat wszystkim szczurom dokładnie w tym samym miejscu.

4. Pomiar DTH

1. Ucho zacznie czerwienieć i puchnąć, co będzie oznaką stanu zapalnego. Zmierz grubość każdego ucha za pomocą mikrometru z zapadką (na przykład model PK-0505 firmy Mitutoyo).
2. Wykonaj 5-6 pomiarów dla każdego ucha w każdym punkcie czasowym i oblicz średnią.
3. Maksymalny obrzęk powinien wystąpić między 24 a 72 godzinami.

Dyskusja

Wyzwanie antygenowe można przeprowadzić również w innych miejscach, na przykład w skórze pleców (2). Uważamy jednak, że wykorzystanie małżowiny usznej, jak pokazano w tym filmie, pozwala na najdokładniejszy pomiar reakcji DTH.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM	GIBCO, by Life Technologies	12430-062	500ml
Pirowinian sodu	Sigma-Aldrich	S8636	stężenie końcowe 1 mM, w pożywce do stymulacji
Penicylina – Streptomycyna – L-Glutamina	Cambrex/BioWhittaker	17-718R	odpowiednio 100 u/ml - 100 μg/ml - 4 mM, stężenie końcowe, w pożywce do stymulacji
Niezbędne aminokwasy nieistotne	Sigma-Aldrich	R7131	NEAA, stężenie końcowe 1%, w pożywce do stymulacji
Witaminy RPMI	Sigma-Aldrich	R7256	stężenie końcowe 1%, w pożywce do stymulacji
beta-merkapto–etanol	Sigma-Aldrich	M6250	2ME, stężenie końcowe 50 μM, w pożywce do stymulacji
Syngeniczne serum szczura			stężenie końcowe 1%. Patrz wyjaśnienie w protokole.
Owalbumina	Sigma-Aldrich	A5503	stężenie końcowe 10 μg/ml, w pożywce do stymulacji.