Skaningowa mikroskopia konfokalna i mikroendoskopia z częstotliwością wideo

Podsumowanie

Opisana jest kompletna konstrukcja niestandardowego systemu obrazowania konfokalnego w czasie rzeczywistym. System ten, który może być z łatwością stosowany w mikroskopii wideo i mikroendoskopii, pozwala na uzyskanie szeregu geometrii obrazowania i aplikacji niedostępnych przy użyciu standardowych komercyjnych systemów konfokalnych, za ułamek kosztów.

Streszczenie

Mikroskopia konfokalna stała się nieocenionym narzędziem w biologii i naukach biomedycznych, umożliwiając szybkie, bardzo czułe i wysokorozdzielcze optyczne sekcje złożonych systemów. Mikroskopia konfokalna jest rutynowo stosowana, na przykład do badania określonych celów komórkowych¹, monitorowania dynamiki w żywych komórkach^2-4 i wizualizacji trójwymiarowej ewolucji całych organizmów^5,6. Rozszerzenia systemów obrazowania konfokalnego, takie jak mikroendoskopy konfokalne, umożliwiają obrazowanie w wysokiej rozdzielczości in vivo⁷ i są obecnie stosowane do obrazowania i diagnozowania chorób w warunkach klinicznych^8,9.

Mikroskopia konfokalna zapewnia trójwymiarową rozdzielczość, tworząc tak zwane "sekcje optyczne" przy użyciu prostych geometrycznych optyki. W standardowym mikroskopie szerokokątnym fluorescencja generowana z próbki jest zbierana przez soczewkę obiektywową i przekazywana bezpośrednio do detektora. Chociaż jest to dopuszczalne do obrazowania cienkich próbek, grube próbki stają się rozmyte przez fluorescencję generowaną powyżej i poniżej płaszczyzny ogniskowej obiektywu. Z kolei mikroskopia konfokalna umożliwia wirtualne, optyczne cięcie próbek, odrzucanie nieostrego światła w celu zbudowania trójwymiarowych reprezentacji próbek o wysokiej rozdzielczości.

Mikroskopy konfokalne osiągają ten wyczyn dzięki zastosowaniu apertury konfokalnej w ścieżce wiązki detekcyjnej. Fluorescencja pobrana z próbki przez obiektyw jest przekazywana z powrotem przez zwierciadła skanujące i przez główne zwierciadło dichroiczne, lustro starannie dobrane do odbijania krótszych fal, takich jak wiązka wzbudzenia laserowego, podczas przechodzenia przez dłuższą, przesuniętą emisję fluorescencji Stokesa. Ten sygnał fluorescencji o dużej długości fali jest następnie przekazywany do pary soczewek po obu stronach otworka, który jest umieszczony w płaszczyźnie dokładnie sprzężonej z płaszczyzną ogniskową soczewki obiektywu. Fotony zebrane z objętości ogniskowej obiektu są kolimowane przez soczewkę obiektywu i ogniskowane przez soczewki konfokalne przez otwór otworkowy. Fluorescencja generowana powyżej lub poniżej płaszczyzny ogniskowej nie będzie zatem prawidłowo skolimowana i nie przejdzie przez konfokalny otwór¹, tworząc przekrój optyczny, w którym widoczne jest tylko światło z ogniskowania mikroskopu. (Rys. 1). W ten sposób otwór skutecznie działa jak wirtualna apertura w płaszczyźnie ogniskowej, ograniczając wykrytą emisję tylko do jednego ograniczonego miejsca przestrzennego.

Nowoczesne komercyjne mikroskopy konfokalne oferują użytkownikom w pełni zautomatyzowaną obsługę, dzięki czemu wcześniej skomplikowane procedury obrazowania są stosunkowo proste i dostępne. Pomimo elastyczności i mocy tych systemów, komercyjne mikroskopy konfokalne nie nadają się do wszystkich zadań obrazowania konfokalnego, takich jak wiele zastosowań obrazowania in vivo. Bez możliwości tworzenia systemów obrazowania dostosowanych do ich potrzeb, ważne eksperymenty mogą pozostać poza zasięgiem wielu naukowców.

W tym artykule przedstawiamy krok po kroku metodę kompletnej budowy niestandardowego systemu obrazowania konfokalnego z szybkością wideo z podstawowych komponentów. Mikroskop pionowy zostanie zbudowany przy użyciu rezonansowego zwierciadła galwanometrycznego, aby zapewnić szybką oś skanowania, podczas gdy rezonansowe zwierciadło galwanometryczne o standardowej prędkości będzie skanować wolną oś. Aby wytworzyć precyzyjną zeskanowaną wiązkę w ognisku soczewki obiektywu, lustra te zostaną umieszczone w tak zwanych płaszczyznach telecentrycznych za pomocą czterech soczewek przekaźnikowych. Detekcja konfokalna zostanie zrealizowana za pomocą standardowej, gotowej lampy fotopowielacza (PMT), a obrazy będą przechwytywane i wyświetlane za pomocą karty przechwytywania ramek Matrox i dołączonego oprogramowania.

Protokół

Wybór długości fali lasera, zwierciadła dichroicznego i filtrów optycznych powinien być określony na podstawie konkretnych barwników używanych w eksperymencie. Na przykład obrazowanie konfokalne próbki barwionej Alexa Fluor 488 najlepiej wykonać przy użyciu lasera 488 nm, długoprzepustowego lustra dichroicznego 500 nm i lustra pasmowego pasma 30 nm wyśrodkowanego na 515 nm. Natomiast obrazowanie konfokalne czerwonego barwnika Alexa Fluor 647 wymagałoby innego zestawu składników. Mikroskop w tym protokole został zbudowany do wizualizacji każdego barwnika, który silnie absorbuje przy 400 nm i emituje powyżej 450 nm. Dlatego wybraliśmy laser wzbudzający o długości fali 406 nm i dichroiczny dalekiego przepustu 425 nm, który odbija wiązkę laserową. Wzbudzone fluorofory można sobie wybiórczo wyobrazić, dobierając odpowiednie filtry emisyjne. Ważne jest, aby używać odpowiedniego sprzętu do montażu optycznego w całym protokole, jeśli jest to wskazane; Niewłaściwy lub prowizoryczny sprzęt również nie utrzyma wyrównania i może stanowić zagrożenie dla bezpieczeństwa.

1. Konfiguracja rezonansowego zwierciadła galwanometrycznego i optyki przekaźnikowej

Ważnym pojęciem w budowaniu jakiegokolwiek systemu skanowania konfokalnego jest telecentryczność. W telecentrycznym układzie optycznym soczewki są oddalone od siebie o sumę ich ogniskowych, tak że powiększenie układu jest po prostu zdefiniowane przez stosunek ogniskowych¹. Umożliwia to zbudowanie optycznego układu przekaźnikowego, w którym powiększenia, a tym samym właściwości systemu, są łatwo definiowane przez wybór soczewek. Innym ważnym pojęciem są tak zwane "stacjonarne" płaszczyzny optyczne, zwane również "płaszczyznami apertury". Płaszczyzna przysłony to położenie wzdłuż ścieżki optycznej, w którym wiązka światła nie podlega żadnemu ruchowi bocznemu. W tej konstrukcji mikroskopu istnieją trzy ważne płaszczyzny apertury: pierwsze i drugie zwierciadło skanujące oraz tylna apertura soczewki obiektywu. Aby uzyskać optymalne skanowanie wiązki w płaszczyźnie ogniskowej obiektywu, wiązka wchodząca do tylnej apertury soczewki obiektywu musi być nieruchoma, zamaszysta tylko pod kątem. Aby stworzyć tę nieruchomą, skośną pod kątem płaszczyznę, musimy umieścić pierwsze i drugie zwierciadło skanujące w sprzężonych, telecentrycznych płaszczyznach z tylną aperturą obiektywu. Soczewki umieszczone między zwierciadłami a soczewką obiektywu służą do przekazywania wiązki skanowanej pod kątem między tymi nieruchomymi płaszczyznami (rys. 2). Lusterka skanujące zamontowane są na dwóch galvo skanujących, z których każde odpowiada za skanowanie w danym kierunku płaszczyzny obrazowania (X i Y). Aby uzyskać wymaganą szybkość skanowania liniowego dla obrazowania z szybkością wideo, do skanowania osi x (znanej również jako oś "szybka") wymagany jest rezonansowy galvo o wysokiej częstotliwości. Te galvo wykorzystują czuły obwód sprzężenia zwrotnego w pętli zamkniętej do tworzenia sinusoidalnego wzorca skanowania i są zdolne do pracy przy bardzo wysokich częstotliwościach; do tej wersji wybraliśmy galvo 8 kHz.

1. Ustaw kolimator światłowodowy w uchwycie optycznym i z grubsza steruj wiązką za pomocą regulacyjnych tak, aby poruszała się w linii prostej zarówno w poziomie, jak i w pionie. Teraz weź tęczówkę i umieść ją przed kolimatorem światłowodowym, regulując pionową wysokość tęczówki tak, aby wiązka przechodziła czysto przez środek tęczówki. Następnie odsuń tęczówkę od kolimatora wzdłuż ścieżki wiązki i obserwuj, czy wiązka nadal przechodzi przez środek tęczówki. Jeśli nie, wyreguluj położenie belki na przysłony za pomocą dwóch regulacyjnych.
2. Umieść zamontowane zwierciadło dichroiczne na ścieżce wiązki tak, aby wiązka lasera znajdowała się mniej więcej w środku lustra. Przed mocowaniem lustra do stołu, obróć uchwyt lustra tak, aby odbijał wiązkę pod kątem około 90 stopni i z grubsza wyreguluj odbicie tak, aby pionowa wysokość odbitej wiązki laserowej nie uległa zmianie.
3. Umieść zamontowane rezonansowe lustro galwanometryczne na ścieżce wiązki laserowej, uważając, aby wiązka laserowa była umieszczona dokładnie w poziomym środku powierzchni lustra. W tym protokole rezonansowe zwierciadło galvo zostało wystawione bezpośrednio na mocowanie lustra. Obróć mocowanie lustra, aby odbić wiązkę lasera pod kątem 90 stopni. Z grubsza dostosuj odbicie od lustra, aby utrzymać tę samą wysokość wiązki laserowej w pionie.
4. Aby skierować dowolny promień światła w danym kierunku, należy z definicji zdefiniować dwa punkty w przestrzeni, przez które promień będzie się przemieszczał. Zwykle osiąga się to poprzez umieszczenie dwóch tęczówek wzdłuż żądanej ścieżki poziomej i pionowej oraz manipulowanie wiązką laserową, aby przeszła przez środek każdej tęczówki. Do regulacji belki wymagane są cztery stopnie swobody; Dwa poziome i pionowe stopnie swobody dla każdej przysłony. Najczęstszym i najprostszym sposobem osiągnięcia tych stopni swobody jest użycie dwóch luster do sterowania lub "chodzenia" wiązki laserowej.
   Weź dwie tęczówki i ustaw ich wysokość w pionie, jak w kroku 1.1, używając wiązki laserowej odbitej od rezonansowego lustra galvo jako odniesienia. Teraz, używając otworów na na płytce stykowej optycznej jako prowadnicy do oka, zaciśnij dwie tęczówki w linii prostej.
5. Wyreguluj lustro dichroiczne i rezonansowe lustro galvo, aby skierować wiązkę laserową przez środek dwóch tęczówek. Użyj pierwszego lustra na ścieżce (zwierciadło dichroiczne), aby wyśrodkować wiązkę na pierwszej tęczówce, a następnie użyj drugiego lustra na ścieżce (rezonansowe lustro galvo), aby wyśrodkować wiązkę na drugiej tęczówce. Iteracyjnie dostosuj te dwa lustra, aż wiązka zostanie wyrównana przez obie tęczówki, upewniając się, że wiązka laserowa odbita od rezonansowego lustra galvo jest nadal odbijana od przybliżonego środka lustra. Jeśli wiązka odchyliła się, wyreguluj mocowanie kolimatora światłowodowego i powtórz powyższe kroki iteracyjne.
6. Z wiązką wyśrodkowaną na obu tęczówkach, umieścimy teraz dwie soczewki przekaźnikowe, które będą obrazować naszą pierwszą stacjonarną, telecentryczną płaszczyznę (tj. rezonansowe zwierciadło galvo) na naszej drugiej stacjonarnej, telecentrycznej płaszczyźnie (tj. zwierciadło galvo o standardowej prędkości). W przypadku tego konkretnego mikroskopu wybrane soczewki w pierwszym przekaźniku mają tę samą ogniskową "f", więc odległość między dwoma zwierciadłami w naszym systemie telecentrycznym wynosi po prostu 4f. Aby upewnić się, że soczewki są dokładnie wyśrodkowane na ścieżce wiązki, użyj sztuczki z wyrównaniem soczewki. Umieść pierwszą soczewkę na ścieżce wiązki i spójrz na plamkę wiązki laserowej na tęczówce, która znajduje się następnie na ścieżce wiązki podążającej za soczewką. Następnie wyreguluj wysokość obiektywu w pionie, tak aby pionowy środek wiązki znajdował się w środku przysłony. Na koniec dostosuj poziomą pozycję belki, aby wyśrodkować wiązkę na przysłony. Wykonaj tę samą procedurę dla drugiej soczewki.

2. Ustawienie drugiego zwierciadła skanującego i obracanie mikroskopu

1. Aby znaleźć dokładną pozycję drugiej płaszczyzny telecentrycznej, podłącz galvo rezonansowe do jednostki skanującej i włącz je. Użyj białej wizytówki, aby śledzić wiązkę skanowania przez dwie soczewki. Płaszczyznę telecentryczną znajdziesz w przybliżonej odległości 4f od rezonansowego galvo, gdzie wiązka laserowa będzie wydawała się całkowicie nieruchoma. Zaznacz tę pozycję na płytce stykowej.
2. Ustaw standardowe lustro skanujące galvo dokładnie w tym położeniu płaszczyzny telecentrycznej i wyreguluj wysokość i położenie lustra tak, aby wiązka w płaszczyźnie telecentrycznej uderzała dokładnie w środek lustra skanującego. Bardzo ważne jest, aby włączyć sprzęt sterujący lustrem i ustawić napięcie 0 V na wejściu lustra skanującego, aby lustro ustabilizowało się w pozycji neutralnej podczas tego procesu. Ostrożnie wyreguluj kąt lustra, aby skierować wiązkę w pionie, i delikatnie dokręć lustro na miejscu.
3. Ponieważ budujemy mikroskop pionowy, teraz zamocujemy drugą płytkę stykową pod kątem 90 stopni za pomocą wsporników montażowych 90 stopni. Upewnij się, że podczas tego procesu wyłączyłeś laser i elektronikę skanującą, odłącz światłowód i odłącz lustra skanujące. Aby ułatwić resztę wyrównania, po przykręceniu zamków ostrożnie obróć cały mikroskop tak, aby nowa płytka stykowa leżała teraz płasko. Użyj zacisku, aby przymocować płytkę stykową do powierzchni roboczej. Teraz pozostałą część wcześniej pionowej konfiguracji można łatwo przeprowadzić na płaskiej płytce stykowej.

3. Ustawianie soczewki skanującej, tubusu i obiektywu

Następnie ustawimy drugi zestaw soczewek przekaźnikowych, formalnie nazywany "soczewką skanującą" i "soczewką tuby". Ważne jest, aby dobrać odpowiednią kombinację soczewek, aby uzyskać prawidłowe powiększenie przy ogniskowej obiektywu i zoptymalizować ostateczną rozdzielczość obrazu. Po pierwsze, aby osiągnąć maksymalną aperturę numeryczną (NA) dowolnej soczewki obiektywu, wiązka laserowa uderzająca w tylną część obiektywu musi całkowicie wypełnić tylną aperturę; Tylko wtedy soczewka obiektywu będzie w stanie stworzyć najściślejszą ostrość. Soczewki obiektywowe mają różne rozmiary tylnej przysłony; Wybierz współczynnik powiększenia obiektywu, aby nieznacznie przepełnić tylną przysłonę wybranego obiektywu. Po drugie, aby uzyskać odpowiednie powiększenie, soczewka obiektywu musi być dopasowana do ogniskowej soczewki tubusu, dla której została zaprojektowana. Niestety, różni producenci obiektywów mikroskopowych zdecydowali się na stosowanie różnych ogniskowych soczewek tubusu, dlatego ważne jest, aby zbudować mikroskop z odpowiednią soczewką tubusu dla konkretnej zastosowanej soczewki obiektywu. Co więcej, niektórzy producenci, tacy jak Zeiss, projektują swoje soczewki tubusu tak, aby kompensować specyficzne aberracje chromatyczne dopasowanego obiektywu, tak że użycie niewłaściwej pary soczewek obiektyw-tubus w rzeczywistości wprowadzi nowe aberracje, które w przeciwnym razie nie byłyby obecne. Zazwyczaj preferujemy obiektywy Olympus, ponieważ cała kompensacja chromatyczna jest wykonywana w samym obiektywie, co ułatwia parowanie obiektywu z soczewką tubusu. Chociaż mikroskop będzie nadal działał, jeśli obiektyw i soczewka tubusu nie będą pasować, rzeczywiste powiększenie mikroskopu prawdopodobnie nie będzie pasować do powiększenia podanego na soczewce obiektywu. Dla tej konkretnej konstrukcji mikroskopu optymalny rozmiar tylnej apertury został określony na 4 mm, co wymagało współczynnika powiększenia 1:4 między soczewką skanującą a soczewką tubusu. Do tej niestandardowej budowy mikroskopu użyjemy soczewki skanującej o długości 75 mm i soczewki tubusu o długości 300 mm.

1. Ponieważ całkowita odległość między drugim lustrem skanującym a ogniskiem obiektywu jest duża, ten segment konstrukcji mikroskopu najpierw ułoży lustra potrzebne do skierowania wiązki do soczewki obiektywu. Umieść pierwsze duże lustro o średnicy 2" (50 mm) blisko krawędzi płytki stykowej i obróć mocowanie lustra, aby odbić wiązkę lasera o około 90 stopni. Z grubsza dostosuj odbicie od lustra, aby utrzymać tę samą pionową wysokość wiązki. Umieść drugie 2-calowe lustro na przeciwległej krawędzi płytki stykowej w orientacji, która kieruje wiązkę w dół pod kątem 90 stopni. Użyj regulacyjnych, aby upewnić się, że pionowa wysokość belki nie zmienia się. Ustaw dwie przysłony, jak w kroku 1.4, i wyreguluj dwa lustra zgodnie z instrukcjami w kroku 1.5, aby wyśrodkować wiązkę na przysłonach.
2. Gdy przysłony są nadal na miejscu, umieść soczewkę skanującą na ścieżce wiązki i dostosuj jej położenie poziome i pionowe, aby wyśrodkować plamkę lasera na pierwszej tęczówce. W odległości 75 mm + 300 mm od soczewki (między dwoma lustrami) ostrożnie umieść dużą soczewkę tubusu 2" i dostosuj jej położenie poziome i pionowe, aby wyśrodkować wiązkę na pierwszej przysłony. W celu utrzymania wyrównania w przyszłości warto pozostawić te tęczówki na miejscu; W tym przypadku wizytówkę z otworem o odpowiedniej wielkości można przykleić do stojaka i włożyć w ścieżkę belki.
3. Po umieszczeniu wszystkich luster i soczewek na swoim miejscu rozpocznij skanowanie rezonansowego lustra galvo i standardowego lustra skanującego. W tej wersji standardowe lustro skanujące zostanie ostatecznie zsynchronizowane z szybkością skanowania zwierciadła rezonansowego za pośrednictwem niestandardowego obwodu sterującego, takiego jak ten opisany na rysunku 3; Zapewnia to doskonałą synchronizację pionową i poziomą. Jednak w celu wyrównania i wielu zastosowań obrazowania lustro można łatwo zeskanować za pomocą wzoru piłokształtnego z generatora funkcyjnego. Za pomocą wizytówki zlokalizuj wiązkę laserową w pozycji 300 mm za soczewką tubusu. Chociaż wiązka skanuje w innym miejscu mikroskopu zarówno w kierunku pionowym, jak i poziomym, wiązka powinna być idealnie nieruchoma w pobliżu tego miejsca. W tym miejscu zostanie umieszczony tylny otwór soczewki obiektywu. Jeśli poziome i pionowe płaszczyzny stacjonarne nie pokrywają się w tej samej płaszczyźnie wzdłuż ścieżki wiązki, ostrożnie odkręć i przesuń soczewkę rurki wzdłuż ścieżki optycznej, aby upewnić się, że obie płaszczyzny zachodzą na siebie tak blisko, jak to możliwe. Ponownie wyśrodkuj pionową i poziomą pozycję soczewki tubusu i clamp ją bezpiecznie na miejscu.
4. Umieść soczewkę obiektywu na ścieżce wiązki, upewniając się, że tylna przysłona soczewki obiektywu znajduje się jak najbliżej płaszczyzny stacjonarnej. Prawdziwy tylny otwór obiektywu może nie zawsze znajdować się w fizycznym tylnym otworze obiektywu ze względu na różne wybory projektowe producenta. Dlatego zawsze najlepiej jest skontaktować się z producentem, aby określić rzeczywistą pozycję tylnej apertury.
5. Skonfiguruj stolik próbny, upewniając się, że mocowanie translacyjne, które pozwoli na ruch osi z, może poruszać się w pełnym zakresie bez wpadania na mocowanie obiektywu.

4. Ustawianie i wyrównywanie otworka konfokalnego i detektora

1. Odłącz wszystkie zasilacze i światłowody, a następnie obróć zespół mikroskopu tak, aby ponownie spoczywał na płytce stykowej trzymającej rezonansowe lustro skanujące. Clamp płytkę stykową bezpiecznie na miejscu, a następnie ponownie podłącz światłowód do kolimatora i ponownie podłącz oba galvos i ich sterujące. Tak jak poprzednio, umieść 0 woltów na napięciu sterującym napędzającym standardowe galvo skanujące.
2. Na stoliku z próbką umieść wizytówkę lub niewielką objętość jasnego barwnika w ognisku obiektywu, umieszczoną między dwoma szkiełkami nakrywkowymi. Wybór barwnika będzie zależał od wybranego lasera i dichroiku; W tym przypadku wykorzystamy emisję fluorescencji z białej wizytówki do wyrównania konfokalnego systemu detekcji. Kropki kwantowe mogą być również przydatne do celów wyrównania, ponieważ są jasne i nie wybielają fotoblasz. Inne alternatywy obejmują koraliki fluorescencyjne i/lub próbki tkanin wystawione na działanie rozjaśniacza kolorowego/do prania, które jasno fluoryzują. Włącz źródło lasera i umieść próbkę w ogniskowej mikroskopu za pomocą etapu translacji. Po ustawieniu ostrości fluorescencja wygenerowana z próbki powinna być widoczna za lustrem dichroicznym, jak opisano w następnym kroku. Zmaksymalizuj moc lasera, aby fluorescencja była jak najjaśniejsza.
3. Za pomocą wizytówki prześledź emisję fluorescencji z próbki przez soczewkę obiektywu i z powrotem przez system skanujący do lustra dichroicznego. Lustro dichroiczne będzie transmitować emisję fluorescencji, jednocześnie odbijając wiązkę laserową; Znajdź ten sygnał fluorescencyjny po drugiej stronie lustra dichroicznego. Teraz umieść lustro za lustrem dichroicznym i użyj go do odbicia emisji pod kątem 90 stopni. Weź przysłonę, tak jak to zostało zrobione w kroku 1.1, i użyj jej wraz z lustrem, aby skierować wiązkę fluorescencji tak prosto i równolegle do płytki stykowej, jak to możliwe. Ten krok najlepiej wykonać w słabym świetle.
4. Ustaw konfokalną jednostkę otworkową zgodnie z opisem na rys. 2. Odkryliśmy, że przestrzenny zespół do montażu klatki filtra firmy ThorLabs jest idealny do tego zadania. Ważne jest, aby wybrać odpowiedni rozmiar otworka, aby zapewnić, że system konfokalny osiągnie optymalną rozdzielczość bez poświęcania zbyt dużej ilości sygnału. Dla tego niestandardowego mikroskopu wybrano rozmiar otworka 100 μm. Umieść filtr przestrzenny w jednej linii ze ścieżką wiązki fluorescencji, uważając, aby wyśrodkować pierwsze mocowanie soczewki skupiającej na wiązce emisji fluorescencji. Po zamontowaniu w aparacie obiektywu o krótkiej ogniskowej (można również użyć obiektywu mikroskopowego), przesuń mocowanie z translacją z, aż będzie można zaobserwować wyraźną ostrość na powierzchni otworka. Upewnij się, że całe urządzenie jest zorientowane dokładnie wzdłuż linii prostej wyznaczonej przez wiązkę fluorescencji. Clamp urządzenie do płytki stykowej.
   Emisja z większości próbek jest słaba w porównaniu z poziomem światła otoczenia nawet w ciemnych pomieszczeniach. W związku z tym niezwykle ważne jest, aby wzdłuż ścieżki emisji stosować odpowiednie ekranowanie/przegrodę świetlną w celu ochrony przed zanieczyszczeniem światłem rozproszonym. Co więcej, wysoki poziom światła otoczenia spowoduje przeciążenie i uszkodzenie wielu PMT, szczególnie tych bez zabezpieczenia prądowego. W związku z tym zdecydowanie zaleca się czytelnikom stosowanie tubusów soczewek do zamykania ścieżki wiązki emisyjnej; Odpowiednio ekranowany system, taki jak ten pokazany tutaj, jest w stanie pracować w świetle pomieszczenia przy niewielkim lub zerowym zanieczyszczeniu światłem rozproszonym.
5. Teraz, używając pokręteł regulacyjnych na stoliku translacyjnym, systematycznie przesuwaj otworek konfokalny, aby znaleźć punkt, w którym sygnał fluorescencji przez otwór jest maksymalizowany. Pozycję tę najłatwiej można zidentyfikować poprzez iteracyjną regulację dwóch osi w celu przeprowadzenia wyszukiwania 2D na powierzchni mocowania otworkowego. Po znalezieniu pozycji maksymalizacji sygnału umieść soczewkę kolimacyjną na uchwycie klatki za otworkiem. Znajdź emisję fluorescencji, która przechodzi przez jednostkę konfokalną za pomocą wizytówki i przesuwaj soczewkę kolimacyjną wzdłuż słupków, aż emitowany sygnał fluorescencyjny będzie jak najbardziej skolimowany. Po skolimacji wiązki należy umieścić odpowiedni filtr na ścieżce wiązki w tubusie obiektywu.
6. Skonfiguruj zespół lampy fotopowielacza (PMT). Umieść obiektyw o ogniskowej 50 mm na ścieżce wiązki emisji fluorescencji i znajdź jego ogniskową za pomocą wizytówki. Zaznacz tę pozycję na płytce stykowej. Teraz całkowicie wyłącz laser – jest to ważne, ponieważ rozproszone lub nieosłabione światło lasera może trwale uszkodzić większość PMT. Ustaw PMT tak, aby jego obszar aktywny znajdował się jak najbliżej zaznaczonego punktu ogniskowego. Podłącz zespół PMT do soczewki skupiającej za pomocą regulowanych tubusów soczewek i ostrożnie owiń ciemną taśmą wszystkie odsłonięte ścieżki wiązki biegnące za otworkiem.
7. Włącz laser, ale upewnij się, że jego moc jest bardzo niska, tak aby emisja fluorescencji była ledwo widoczna. Włącz PMT, ostrożnie odczytując jego napięcie na oscyloskopie wraz ze wzrostem napięcia sterującego. PMT generuje sygnał poprzez szereg etapów zwielokrotniania elektronów; Jeśli fotoprąd jest zbyt wysoki w stosunku do padającego poziomu światła, rura może zostać nieodwracalnie uszkodzona. Przekaźniki PMT z obwodem ograniczającym prąd są zatem wysoce zalecane, szczególnie dla użytkowników, którzy wcześniej nie pracowali z takimi detektorami.
   Zwiększ napięcie sterujące PMT, aż na ekranie oscyloskopu będzie widoczny odczyt podobny do skoku i/lub przesunięcie DC; dla większości PMT sygnał ten będzie ujemny w stosunku do masy. Potwierdź, że ten sygnał rzeczywiście powstaje w wyniku fluorescencji, wyłączając zasilanie lasera, aby zaobserwować utratę sygnału.
8. Na koniec iteracyjnie wyrównaj otworek, aby uzyskać maksymalny sygnał na oscyloskopie, najpierw manipulując pozycją z soczewki skupiającej, a następnie dostosowując stopień translacji yz.
9. Sprzęt mikroskopu wideo jest kompletny! Teraz podłącz lustra, niestandardowe tablice kontrolne i komputer, jak pokazano na schemacie na rys. 3. Jak powyżej, zaleca się użycie systemu obrazowania, aby najpierw zobrazować znany wzorzec rozmiaru, aby znaleźć optymalną rozdzielczość mikroskopu i obliczyć stałą piksel-rozdzielczość dla systemu obrazowania. Istnieje wiele standardów rozmiarów, które można zastosować, takich jak białe wizytówki z dobrze znanymi rozmiarami liter, fluorescencyjne lub odblaskowe cele sił powietrznych oraz mikrosfery fluorescencyjne.

5. Przygotowanie systemu do konfokalnej skaningowej mikroendoskopii

W tej konstrukcji używamy spójnego światłowodu obrazu, który składa się z wiązki wielu tysięcy rdzeni światłowodowych; taki układ pozwala na transmisję obrazu przez światłowód i łatwą rekonstrukcję i/lub rozszerzenie na drugim końcu (Rys. 4). Spójna wiązka włókien użyta w konstrukcji tego endoskopu jest polerowana na obu końcach, dzięki czemu jest to tak zwany mikroendoskop "kontaktowy". Ostry obraz zostanie zatem utworzony tylko wtedy, gdy końcówka mikroendoskopu znajdzie się w bliskim kontakcie z obiektem. W tym pseudokonfokalnym układzie skanowanie mikroskopu skupia laser na jednym rdzeniu światłowodu na raz, podczas gdy konfokalny otwór otworkowy zapewnia, że żadne nieostre światło z otaczających światłowodów nie może przejść do detektora. W przypadku różnych zastosowań obrazowania można dodać zestaw soczewek na dystalnej końcówce, aby umożliwić dalekie obrazowanie fluorescencyjne skierowane do przodu. Soczewki mikrooptyczne, a także soczewki z gradientowym indeksem załamania światła (GRIN) można łatwo dostosować do tego celu i można je przymocować do dystalnej końcówki światłowodu za pomocą klejów o jakości optycznej.

1. Aby skonfigurować system obrazowania do mikroendoskopii, ostrożnie wyjmij stolik na próbkę i zastąp go stolikiem do przytrzymywania włókien (ryc. 5). Zanurz jeden koniec wiązki włókien w słabym roztworze barwnika, aby emisja fluorescencji była generowana równomiernie na wszystkich rdzeniach włókien. Włącz system skanowania i wyreguluj uchwyt światłowodu, aby ustawić ostrość na drugim końcu wiązki światłowodów (koniec bliższy lub koniec znajdujący się najbliżej optyki mikroskopu). Najpierw użyj regulacyjnych translacji, aby wyśrodkować światłowód w skanowanym polu. Teraz spójrz na obraz emisji fluorescencji z końcówki światłowodu proksymalnego podczas skanowania. Gdy cała powierzchnia mikroendoskopu znajduje się w płaszczyźnie ogniskowej obiektywu, emisja fluorescencji we wszystkich rdzeniach włókien będzie tak jednolita, jak to tylko możliwe. Użyj pokręteł regulacji kąta, aby wyregulować powierzchnię światłowodu, aby wszystkie rdzenie włókien były równomiernie jasne. Podczas tej regulacji prawdopodobnie konieczne będzie ponowne dostosowanie pozycji translacji, aby ponownie wyśrodkować światłowód w skanowanym polu. Powtarzaj te regulacje, aż cała końcówka włókna będzie prawidłowo ostra.
2. Przed użyciem mikroendoskopu delikatnie wyczyść dystalną końcówkę za pomocą papieru do czyszczenia soczewek lekko zwilżonego metanolem klasy HPLC. Tak jak poprzednio, użyj znanego wzorca rozmiaru, aby zmierzyć i obliczyć rozdzielczość systemu obrazowania mikroendoskopowego.

6. Reprezentatywne wyniki:

Rysunek 6 pokazuje przykład gotowego pionowego konfokalnego mikroskopu skaningowego skonfigurowanego do mikroendoskopii. Wiązki laserowe i emisyjne zostały narysowane jako przewodnik do oka. Uchwyt światłowodowy utrzymuje światłowód na miejscu podczas operacji mikroendoskopii. Ten uchwyt światłowodowy można łatwo zastąpić stolikiem translacyjnym xy lub xyz do użytku jako pionowa platforma mikroskopowa. Części ThorLabs PT3 (translacja XYZ) lub dwa piętrowe stopnie PT1 (translacja XY) dobrze sprawdzają się w tym zastosowaniu, wraz z nawiasem kątowym, takim jak część ThorLabs AP90.

Karta przechwytywania klatek wideo służy do generowania obrazów z sygnału przychodzącego. Rysunek 7 przedstawia reprezentatywny obraz testowy wykonany małą literą "m" wydrukowaną na białej wizytówce przy użyciu systemu skanowania mikroskopem wideo. Bielony biały papier zawiera fluorofory, które są wzbudzane przez promieniowanie UV i niebieskie światło, co skutkuje jasnym tłem za ciemną literą "m". Do zebrania tej emisji fluorescencyjnej wybrano filtr emisyjny wyśrodkowany na długości fali 515 nm. Można zaobserwować niewielkie zniekształcenie obrazu, szczególnie w pobliżu bocznych krawędzi ramki obrazu. Zniekształcenia te wynikają z sinusoidalnego wzorca skanowania zwierciadła gavlo 8kHz i zostaną szczegółowo omówione poniżej.

Rysunek 1. Schemat przedstawiający zasadę działania mikroskopu konfokalnego. Promienie pochodzące ze skupienia obiektywu są przekazywane z powrotem przez system i skupiane przez konfokalny otwór otworkowy (czerwony). Promienie pochodzące albo powyżej (niebieski), albo poniżej (zielony) ogniska obiektywu, nie wychodzą ze skolimowanego obiektywu, a zatem nie są efektywnie przenoszone przez konfokalny otwór.

Rysunek 2. Schemat przedstawiający wszystkie drogi światła przez system skanowania wiązki. Lusterka skanujące znajdują się w płaszczyznach telecentrycznych ze stacjonarną płaszczyzną tylnej przysłony obiektywu. Pary soczewek pomiędzy nieruchomymi płaszczyznami działają w celu przekazywania zeskanowanych wiązek. Pierwsze dwie soczewki przekaźnikowe mają równe ogniskowe, tworząc teleskop 1:1. Druga para soczewek, znana formalnie jako soczewka skanująca i soczewka tubusu, nie musi mieć jednakowej ogniskowej i często służy jako teleskop rozszerzający wiązkę, aby zapewnić przepełnienie tylnej apertury obiektywu. Światło emitowane przez próbkę przemieszcza się z powrotem przez system skanujący i przechodzi przez zwierciadło dichroiczne. Soczewka o krótkiej ogniskowej skupia światło emisyjne przez konfokalny otwór, który jest następnie kolimowany przez soczewkę. Ostatnia soczewka skupia emisję z filtrem konfokalnym na lampie fotopowielacza. Kliknij tutaj, aby zobaczyć pełnowymiarową wersję tego obrazu.

Rysunek 3. (a) Schemat poglądowy konfiguracji elektroniki skanującej. Ogólnym sygnałem odniesienia i podstawą czasową mikroskopu jest "zsynchronizowany" sygnał wyjściowy TTL zwierciadła rezonansowego galvo o szybkiej osi, które generuje impuls TTL na końcu każdej zeskanowanej linii (tj. gdy galvo zakończyło cykl skanowania). Dostarcza to sygnał H-sync do karty framegrabbera. Wyjście synchronizacji galvo jest również podłączone do płyty sterującej V-sync, która stopniowo zwiększa napięcie wyjściowe w odpowiedzi na każdy impuls synchronizacji poziomej, aby wygenerować przebieg piłokształtny, który napędza wolną oś skanowania. Po zeskanowaniu wszystkich linii, płyta V-sync resetuje przebieg piłokształtny i generuje impuls TTL, który służy jako sygnał synchronizacji pionowej framegrabbera. Ostatnim wejściem do karty framegrabber jest sygnał analogowy z lampy fotopowielacza (Zauważ, że wiele PMT generuje ujemne napięcie wyjściowe; pamiętaj, aby zaprojektować swój obwód i odpowiednio dobrać sprzęt). Obrazy z szybkością wideo są generowane i wyświetlane w oprogramowaniu do przechwytywania ramek Matrox. b) Przykładowy obwód sterowania. W tej konstrukcji napięcie każdego impulsu H-Sync jest "dodawane"/integrowane w integratorze wzmacniacza operacyjnego w celu wygenerowania rampy przebiegów piłokształtnych; impulsy są zliczane jednocześnie na stopniu licznika TTL. Po osiągnięciu żądanej liczby linii (tj. po zakończeniu skanowania rastrowego) licznik generuje impuls "przeprowadzania" aktywny-niski, który napędza wyzwalacz Schmitta w celu wygenerowania impulsu resetującego dla integratora. Powoduje to zresetowanie zarówno licznika, jak i integratora wzmacniacza operacyjnego, przygotowując obwód do następnego cyklu. Odpowiedni dobór komponentów sprawia, że obwód ten ma szerokie zastosowanie w różnych rozmiarach rastrów. Jest to tylko jedna implementacja; Możliwe są liczne inne implementacje, które w pewnych okolicznościach mogą być preferowane. Ponadto obwód ten jest przeznaczony do użytku z kartami framegrabber Matrox, które automatycznie wykrywają i korygują fazę obrazu. Jeśli obwód ma być używany z innymi framegrabberami, może być wymagany obwód korekcji fazy lub oprogramowanie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć pełnowymiarową wersję tego obrazu.

Rysunek 4. Transmisja obrazu poprzez spójną wiązkę włókien. Na tym schemacie soczewki po obu stronach wiązki są na miejscu, aby skalować zarówno obraz rzutowany na wejście wiązki światłowodowej, jak i rozszerzać obraz na wyjściu wiązki światłowodów.

Rysunek 5. Przykład wiązki światłowodu zamontowanej w uchwycie 5-osiowym. Mały aluminiowy blok o średnicy 1 cala został wywiercony, aby można było włożyć wiązkę światłowodu obrazu. Włókno zostało epoksydowane wewnątrz aluminiowego bloku zarówno na górze, jak i na dole bloku, aby zapewnić stabilność.

Rysunek 6. Obraz kompletnego systemu mikroskopowego z dołączonym mikroendoskopem. Aby lepiej zobrazować ścieżki światła, ścieżka wiązki wzbudzenia jest narysowana na niebiesko, natomiast ścieżka wiązki emisyjnej za zwierciadłem dichroicznym jest narysowana jako czerwona linia.

Rysunek 7. Przykładowy obraz wygenerowany przez system konfokalnej mikroskopii skaningowej z szybkością wideo. Ciemna mała litera "m" pojawia się na jasnym fluorescencyjnym tle białej wizytówki.

Dyskusja

Ten system obrazowania z szybkością wideo wykorzystuje rezonansowe zwierciadło galwanometryczne pracujące z częstotliwością około 8 kHz. Lustra rezonansowe mogą być dość głośne, gdy pracują z pełną mocą, a ich wysoki ton może być uciążliwy, a nawet niebezpieczny przy wystarczających czasach ekspozycji. Chociaż nie zostało to tutaj pokazane, zaleca się osłonięcie rezonansowego lustra galwanometrycznego w przezroczystej obudowie, aby znacznie zmniejszyć głośność systemu i/lub noszenie odpowiedniego sprzętu ochronnego słuchu, takiego jak zatyczki do uszu.

Rezonansowe zwierciadło galwanometryczne skanuje w sinusoidalnym wzorze. Jednak karty przechwytywania ramek odczytują sygnał, zakładając całkowicie liniową szybkość przemiatania zarówno w kierunku poziomym, jak i pionowym. Ponieważ przemiatanie sinusoidalne zwalnia na krawędziach skanu, artefakty kompresji obrazu można zaobserwować wzdłuż szybkiej (poziomej) osi obrazu. Jednym ze sposobów zminimalizowania tego problemu jest celowe zwiększenie zakresu skanowania rezonansowego lustra galvo znacznie większego niż średnica soczewki przekaźnika. W ten sposób tylko prawie liniowe centralne przemiatanie sinusoidalnego wzorca skanowania będzie przebiegać przez próbkę, minimalizując zniekształcenia obrazu. Innym podejściem byłoby przetwarzanie po zebranych obrazach w celu linearyzacji szybkiej osi. Można to osiągnąć, obrazując znany wzór fluorescencyjny (taki jak siatka) i używając znanych wymiarów wzoru do utworzenia skryptu przetwarzania, który usuwa zniekształcenia zebranych obrazów.

Ten konkretny system skanowania został zaprojektowany z myślą o obrazowaniu in vivo , które często wymaga pionowo zorientowanego mikroskopu wideo. Do eksperymentów z obrazowaniem komórkowym częściej stosuje się mikroskopy odwrócone. Prezentowany tutaj projekt można łatwo zmienić, aby zbudować taki odwrócony mikroskop; Wszystko, co jest wymagane, to obrócenie końcowego lustra o średnicy 2". Zamiast ustawiać lustro tak, aby kierować wiązkę skanowania w dół, lustro może skierować wiązkę w górę. Umieszczenie soczewki obiektywu w tej samej odległości od lustra wraz ze stolikiem na próbkę pozwoliłoby na obrazowanie w odwróconej geometrii. Jeśli system obrazowania jest budowany wyłącznie do obrazowania mikroendoskopowego, nie ma powodu, aby w ogóle "składać" konstrukcję mikroskopu w pionie. Zamiast tego cały system skanowania można zbudować na jednej poziomej płytce stykowej z soczewką obiektywu skierowaną równolegle do stołu optycznego.

Zwróć uwagę, że mikroskop w tej wersji wykorzystuje stałą konfigurację otworkową; Chociaż zapewnia to największą prostotę budowy i łatwość ustawiania, użytkownicy pragnący bardziej wszechstronnego systemu mogą rozważyć zastosowanie zmiennego otworu otworkowego, jaki można znaleźć w większości komercyjnych mikroskopów konfokalnych. Umożliwiając użytkownikowi dostosowanie rozmiaru otworu w celu skompensowania próbek o różnej intensywności emisji, pozwala to użytkownikowi lepiej zoptymalizować kompromis między siłą sygnału a rozdzielczością dla danej próbki.

Ważny jest wybór włókna obrazu wybranego do mikroskopu. Zalecamy stosowanie koherentnych włókien obrazowych Sumitomo ze względu na ich bliskie odstępy między rdzeniami włókien i niską względną autofluorescencję. Stwierdzono, że włókna obrazu produkowane przez Fujikurę zawierają duże ilości autofluorescencji¹⁰, która może przytłaczać słabe sygnały fluorescencyjne z próbki i ograniczać ostateczną czułość mikroendoskopu. Włókna produkowane przez Sumitomo, takie jak 8-30N użyte w tej konkretnej konfiguracji, mają znacznie niższy poziom autofluorescencji niż ich odpowiedniki Fujikura. Podczas gdy wiązki włókien z pijawkami mogą być uważane za atrakcyjne dla mikroendoskopii, ich konstrukcja zazwyczaj umieszcza poszczególne rdzenie włókien zbyt daleko od siebie, co oznacza, że rdzenie włókien rzadko próbkują obiekty, pomijając znaczne obszary potencjalnego zainteresowania.

Na koniec należy zauważyć, że chociaż opisany tutaj mikroskop będzie przydatny w różnych zastosowaniach in vitro i in vivo i może być stworzony za ułamek kosztów w pełni funkcjonalnego systemu komercyjnego, nie ma on takich funkcji, jak detekcja światła przechodzącego, okular do oglądania lub ścieżka wiązki do niekonfokalnej epifluorescencji szerokokątnej. Chociaż możliwe jest zbudowanie systemu z tymi funkcjami od podstaw, czytelnicy pragnący takiego systemu mogą chcieć zmodyfikować istniejący system komercyjny, aby spełnić swoje potrzeby, zamiast inicjować zupełnie nową kompilację.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Filtr pasmowo-przepustowy 515 nm	Chroma Technology Corp.	HQ515/50M	46 FWHM
Achromatyczny obiektyw dubletowy o średnicy 25,4 mm x 50 mm FL, powłoka MgF2	Scientific	NT49-766
Achromatyczny obiektyw dubletowy o średnicy 25,4 mm x 76,2 mm FL, powłoka MgF2	Edmund Scientific	NT49-768
Achromatyczny obiektyw podwójny o średnicy 25,4 mm x 88,9 mm FL, powłoka MgF2	Edmund Scientific	NT49-769
Achromatyczny obiektyw dubletowy o średnicy 50 mm x 300 mm FL, MgF2 Powłoka	Edmund Scientific	NT45-179
8 kHz R Skaner optyczny wysokiej częstotliwości	Electro-Optical Products Corporation (EOPC)	SC-30	8 kHz
AGC Driver	Electro-Optical Products Corporation (EOPC)	ACG: 8K
H7422-PA Moduł fotosensora	Hamamatsu Corp.	H7422-PA	Zalecane ograniczenie prądu
Zasilacz M9012	Hamamatsu Corp.	M9012	Do użytku z H7422-PA
HC PL APO CS Obiektyw	Leica Microsystems	11506284	10x/0.40
Solios eA/XA Framegrabber Card	Matrox	Solios eA/XA	MIL; – M interkonekty zalecane
Zasilacz 12V	Meanwell	LPV-100-12+	12V, 8.5A
5x Mikroskop Obiektyw Obiektyw	Newport Corp.	M-5X	0.10 NA, 25.4 mm Ogniskowa
Spójny obraz Fiber	Sumitomo Bakelite Co., Ltd.	8-30N
1/4"-20 Śruba z walcowym i zestaw osprzętu	Thorlabs Inc.	HW-KIT2
100 μ m Zamontowane	Thorlabs Otworkowe Inc.	P100S	Idealny do budowy filtrów przestrzennych
30 mm Cage Cube Clamp	Thorlabs Inc.	B6C
30 mm System Klatka Sześcienna, 4-kierunkowa	Thorlabs Inc.	C4W
406 nm, 5 mW, kod PIN B, dioda laserowa z pigtailem światłowodowym SM, FC / PC	Thorlabs Inc.	LPS-406-FC	Produkt przestarzały; zastąpiony przez LP405-SF10
5-minutowa żywica epoksydowa, 1 uncja	Thorlabs Inc.	G14250
6-osiowy kinematyczny montaż optyczny	Thorlabs Inc.	K6X
8-32 Zestaw z walcowym i osprzętu	Thorlabs Inc.	HW-KIT1
8-32 Zestaw dociskowych i osprzętu	Thorlabs Inc.	HW-KIT3
z zewnętrznymi gwintami RMS i wewnętrznymi gwintami SM1	Thorlabs Inc.	SM1A4
Regulowany kolimator FC/PC i FC/APC, f = 2,0 mm, ARC: 400-600 nm	Thorlabs Inc.	CFC-2X-A	f = 2,0 mm
Regulowany adapter kolimatora światłowodowego, SM1 Gwintowany	Thorlabs Inc.	AD9.5F
Aluminiowa płyta stykowa, 12 "x 18" x 1/2"	Thorlabs Inc.	MB1218	1/4"-20 Gwintowana laboratoryjna
dioda laserowa / kontroler TEC	Thorlabs Inc.	ITC4001	1 A/96 W
DMLP 425 nm Long-Pass Dichroic Mirror	Thorlabs Inc.
Montaż kinematyczny do optyki 1"	Thorlabs Inc.	Uchwyt KM100
LD/TEC do światłowodowych diod laserowych ThorLabs	Thorlabs Inc.	Mocowanie obiektywu LM9LP
do optyki 18 mm	Thorlabs Inc.	LMR18	Jeden pierścień ustalający w zestawie
Mocowania obiektywów do optyki 2"	Thorlabs Inc.	LMR2S	Z gwintem wewnętrznym i zewnętrznym; w komplecie pierścień ustalający
Pręt montażowy klatki serii Mini, 6" długości, 4 mm, ilość 1	Thorlabs Inc.	SR6
1.0" Słupek cokołu, 8-32 krany, 1" Long	Thorlabs Inc.	RS1P8E
1" Przedłużenie słupka słupka, długość = 0,5	Thorlabs Inc.	RS05
1" Przedłużenie słupka słupka, długość = 0,75 "	Thorlabs Inc.	RS075
1-calowe chronione srebrne lustro, grubość 3,2 mm	Thorlabs Inc.	ME1-P01
1" SM1 Obrotowy regulowany element ostrości, L = 1"	Thorlabs Inc.	SM1V10
2-calowe chronione srebrne lustro, grubość 3,2 mm	Thorlabs Inc.	ME2-P01
P100S - 100 μ m Zamontowane	Thorlabs Otworkowe Inc.	P100S
Polaris Low Drift 1" Kinematic Mirror Mount	Thorlabs Inc.	Tubus obiektywu POLARIS-K1	SM1 o niskim dryfcie
, L = 1 "	Thorlabs Inc.	SM1L-10	Jeden pierścień ustalający w zestawie
SM1 Gwintowana płyta klatki 30 mm, grubość 0,35 cala	Thorlabs Inc.	CP02
SM1 do M25 Adapter do gwintowania elementów optycznych	Thorlabs Inc.	SM1A24	Zewnętrzne gwinty SM1 i wewnętrzne gwinty M25,5x0,5
małej średnicy wiązki Galvo System	Thorlabs Inc.
Mały widelec zaciskowy	Thorlabs Inc.	CF125	1/25" z pogłębieniem krzyżowym, uniwersalny
system filtrów przestrzennych	Thorlabs Inc.	KT310	Otworek sprzedawany oddzielnie
Uchwyt chłodzony TE-Cooled do laserów 5,6 i 9 mm	Thorlabs Inc.	TCLDM9
Wspornik pionowy do płytek stykowych	Thorlabs Inc.	VB01	Każdy
planapochromat	Carl Zeiss, Inc.	1101-957	20x/0,75 brak danych