Opisano pełną konstrukcję niestandardowego systemu obrazowania konfokalnego z przeskanowaniem w czasie rzeczywistym. System ten, który może być łatwo wykorzystany do mikroskopii i mikroendoskopii w tempie wideo, umożliwia zastosowanie szeregu geometrii obrazowania i aplikacji niedostępnych w standardowych komercyjnych systemach konfokalnych, przy ułamku ich kosztów.
Artykuł metodologiczny
Skaningowa mikroskopia konfokalna w czasie rzeczywistym i mikroendoskopia
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mikroskopia konfokalna stała się nieocenionym narzędziem w biologii i naukach biomedycznych, umożliwiając szybkie, wysokoczułe i wysokorozdzielcze sekcjonowanie optyczne złożonych układów. Mikroskopię konfokalną stosuje się rutynowo na przykład do badania specyficznych celów komórkowych1, monitorowania dynamiki w żywych komórkach2-4 oraz wizualizacji trójwymiarowej ewolucji całych organizmów5,6. Rozszerzenia systemów obrazowania konfokalnego, takie jak mikroendoskopy konfokalne, umożliwiają obrazowanie o wysokiej rozdzielczości in vivo7 i są obecnie wykorzystywane do obrazowania oraz diagnostyki chorób w warunkach klinicznych8,9.
Mikroskopia konfokalna zapewnia rozdzielczość trójwymiarową poprzez tworzenie tzw. „przekrojów optycznych” z wykorzystaniem podstawowej optyki geometrycznej. W standardowym mikroskopie szerokopolowym fluorescencja generowana przez próbkę jest zbierana przez obiektyw i przekazywana bezpośrednio do detektora. Jest to rozwiązanie akceptowalne przy obrazowaniu cienkich próbek, jednak w przypadku próbek grubych obraz staje się rozmyty z powodu fluorescencji generowanej powyżej i poniżej płaszczyzny ogniskowej obiektywu. W przeciwieństwie do tego, mikroskopia konfokalna umożliwia wirtualne sekcjonowanie optyczne próbek, odrzucając światło poza ogniskową, co pozwala na budowanie trójwymiarowych reprezentacji próbek o wysokiej rozdzielczości.
Mikroskopy konfokalne osiągają ten efekt dzięki zastosowaniu przysłony konfokalnej na drodze wiązki detekcyjnej. Fluorescencja zbierana z próbki przez obiektyw jest przekazywana z powrotem przez lustra skanujące i główny lustro dichroiczne, które jest starannie dobrane tak, aby odbijać krótsze długości fal, takie jak laserowa wiązka wzbudzenia, przepuszczając jednocześnie dłuższą emisję fluorescencji przesuniętą w stronę czerwieni (przesunięcie Stokesa). Ten sygnał fluorescencyjny o długiej fali jest następnie przekazywany do pary soczewek po obu stronach otworu (pinhole), który znajduje się w płaszczyźnie dokładnie sprzężonej z płaszczyzną ogniskową soczewki obiektywu. Fotony zebrane z objętości ogniskowej obiektu są kolimowane przez soczewkę obiektywu i ogniskowane przez soczewki konfokalne przez otwór. Fluorescencja generowana powyżej lub poniżej płaszczyzny ogniskowej nie zostanie zatem prawidłowo skolimowana i nie przejdzie przez otwór konfokalny1, co tworzy przekrój optyczny, w którym widoczne jest tylko światło z ogniska mikroskopu (Rys. 1). W ten sposób otwór działa efektywnie jako wirtualna przysłona w płaszczyźnie ogniskowej, ograniczając wykrywaną emisję tylko do jednej, ograniczonej lokalizacji przestrzennej.
Nowoczesne komercyjne mikroskopy konfokalne oferują użytkownikom pełną automatyzację pracy, dzięki czemu procedury obrazowania, które dawniej były złożone, stały się stosunkowo proste i przystępne. Mimo elastyczności i możliwości tych systemów, komercyjne mikroskopy konfokalne nie nadają się do wszystkich zadań obrazowania konfokalnego, takich jak wiele zastosowań w obrazowaniu in vivo. Bez możliwości tworzenia spersonalizowanych systemów obrazowania dostosowanych do konkretnych potrzeb, ważne eksperymenty mogą pozostać poza zasięgiem wielu naukowców.
W niniejszym artykule przedstawiamy szczegółową metodę kompletnej budowy niestandardowego systemu obrazowania konfokalnego o szybkości wideo z podstawowych komponentów. Mikroskop pionowy zostanie zbudowany z wykorzystaniem rezonansowego lustra galwanometrycznego zapewniającego szybką oś skanowania, podczas gdy standardowe lustro galwanometryczne będzie skanować oś wolną. Aby uzyskać precyzyjną wiązkę skanującą w ognisku soczewki obiektywu, lustra te zostaną umieszczone w tzw. płaszczyznach telecentrycznych przy użyciu czterech soczewek przekaźnikowych. Detekcja konfokalna zostanie zrealizowana za pomocą standardowej, dostępnej w sprzedaży lampy fotopowielającej (PMT), a obrazy będą rejestrowane i wyświetlane za pomocą karty przechwytującej Matrox oraz dołączonego oprogramowania.
Protokół
Wybór długości fali lasera, lustra dichroicznego i filtrów optycznych powinien być podyktowany konkretnymi barwnikami wykorzystywanymi w eksperymencie. Na przykład obrazowanie konfokalne próbki barwionej Alexa Fluor 488 najlepiej przeprowadzić przy użyciu lasera 488 nm, dichroicznego lustra długoprzepuszczalnego 500 nm oraz lustra przepustowego o szerokości pasma 30 nm z centrem na 515 nm. Z kolei obrazowanie konfokalne czerwonego barwnika Alexa Fluor 647 wymagałoby innego zestawu komponentów. Mikroskop opisany w tym protokole został skonstruowany w celu wizualizacji każdego barwnika, który silnie absorbuje przy 400 nm i emituje powyżej 450 nm. Wybraliśmy zatem laser wzbudzający 406 nm oraz dichroik długoprzepuszczalny 425 nm do odbijania wiązki lasera. Wzbudzone fluorofory można obrazować selektywnie, dobierając odpowiednie filtry emisyjne. Ważne jest, aby w całym protokole, tam gdzie wskazano, stosować właściwe elementy montażowe optyki; niewłaściwe lub improwizowane mocowania nie zapewnią stabilności ustawienia i mogą stanowić zagrożenie dla bezpieczeństwa.
1. Konfiguracja rezonansowego zwierciadła galwanometrycznego i optyki przekaźnikowej
Ważnym pojęciem przy budowie każdego rodzaju skanującego systemu konfokalnego jest telecentryczność. W telecentrycznym układzie optycznym soczewki są od siebie oddalone o sumę ich ogniskowych, tak że powiększenie układu jest definiowane po prostu przez stosunek ogniskowych1. Umożliwia to konstrukcję optycznego układu przekaźnikowego, w którym powiększenia, a tym samym właściwości systemu, są łatwo definiowane poprzez dobór soczewek. Innym ważnym pojęciem są tak zwane „stacjonarne” płaszczyzny optyczne, nazywane również „płaszczyznami przysłony”. Płaszczyzna przysłony to miejsce wzdłuż drogi optycznej, w którym wiązka światła nie ulega żadnemu przesunięciu bocznemu. W tej konstrukcji mikroskopu istnieją trzy ważne płaszczyzny przysłony: pierwsze i drugie lustra skanujące oraz tylna przysłona obiektywu. Aby uzyskać optymalne skanowanie wiązki w płaszczyźnie ogniskowej obiektywu, wiązka wchodząca do tylnej przysłony obiektywu musi być stacjonarna i zmieniać jedynie swój kąt. Aby stworzyć taką stacjonarną płaszczyznę o zmiennym kącie, musimy umieścić pierwsze i drugie lustra skanujące w płaszczyznach sprzężonych i telecentrycznych względem tylnej przysłony obiektywu. Soczewki umieszczone między lustrami a obiektywem służą do przekazywania wiązki skanowanej kątowo między tymi stacjonarnymi płaszczyznami (Fig 2). Lustra skanujące są zamontowane na dwóch galwanometrach skanujących, z których każdy odpowiada za skanowanie danego kierunku płaszczyzny obrazowania (X i Y). Aby uzyskać wymaganą szybkość skanowania linii dla obrazowania w czasie rzeczywistym (video-rate), do skanowania osi X (znanej również jako oś „szybka”) wymagany jest wysokoczęstotliwościowy galwanometr rezonansowy. Galwanometry te wykorzystują czułe obwody sprzężenia zwrotnego w pętli zamkniętej do tworzenia sinusoidalnego wzoru skanowania i są zdolne do pracy przy bardzo wysokich częstotliwościach; w tej konstrukcji wybraliśmy galwanometr 8 kHz.
- Zamocuj kolimator światłowodowy w uchwycie optycznym i wstępnie skieruj wiązkę za pomocą śrub regulacyjnych tak, aby poruszała się w linii prostej zarówno w poziomie, jak i w pionie. Następnie weź irys i umieść go przed kolimatorem światłowodowym, regulując wysokość pionową irysa tak, aby wiązka przechodziła dokładnie przez jego środek. Następnie przesuń irys od kolimatora wzdłuż drogi wiązki i sprawdź, czy wiązka nadal przechodzi przez środek irysa. Jeśli nie, skoryguj pozycję wiązki na irysie za pomocą dwóch śrub regulacyjnych.
- Umieść zamocowane lustro dichroiczne na drodze wiązki tak, aby wiązka lasera znajdowała się mniej więcej w centrum lustra. Przed przytwierdzeniem lustra do stołu, obróć uchwyt lustra, aby odbić wiązkę pod kątem około 90 stopni, i wstępnie wyreguluj odbicie tak, aby wysokość pionowa odbitej wiązki lasera nie ulegała zmianie.
- Umieść zamocowane rezonansowe lustro galwanometryczne na drodze wiązki lasera, dbając o to, aby wiązka lasera znajdowała się dokładnie w poziomym centrum powierzchni lustra. W niniejszym protokole rezonansowe lustro galvo zostało przyklejone żywicą epoksydową bezpośrednio do uchwytu lustra. Obróć uchwyt lustra, aby odbić wiązkę lasera pod kątem 90 stopni. Wstępnie wyreguluj odbicie od lustra, aby zachować tę samą wysokość pionową wiązki lasera.
- Aby skierować dowolny promień światła w danym kierunku, należy z definicji określić dwa punkty w przestrzeni, przez które promień będzie przechodził. Zazwyczaj osiąga się to poprzez umieszczenie dwóch irysów wzdłuż pożądanej ścieżki poziomej i pionowej oraz manipulowanie wiązką lasera tak, aby przechodziła przez środek każdego irysa. Do regulacji wiązki wymagane są cztery stopnie swobody: dwa poziome i dwa pionowe dla każdego irysa. Najbardziej powszechnym i najprostszym sposobem uzyskania tych stopni swobody jest użycie dwóch luster do kierowania, lub „prowadzenia”, wiązki lasera.
Weź dwa irysy i ustaw ich wysokość pionową zgodnie z krokiem 1.1, używając wiązki lasera odbitej od rezonansowego lustra galvo jako punktu odniesienia. Następnie, wykorzystując otwory na śruby w stole optycznym jako pomoc wizualną, przytwierdź oba irysy w linii prostej. - Wyreguluj lustro dichroiczne i rezonansowe lustro galvo, aby skierować wiązkę lasera przez środek obu irysów. Użyj pierwszego lustra na drodze (lustra dichroicznego), aby wycentrować wiązkę na pierwszym irysie, a następnie użyj drugiego lustra na drodze (rezonansowego lustra galvo), aby wycentrować wiązkę na drugim irysie. Iteracyjnie reguluj oba lustra, aż wiązka zostanie wyrównana przez oba irysy, upewniając się przez cały czas, że wiązka lasera odbita od rezonansowego lustra galvo nadal odbija się z przybliżonego centrum lustra. Jeśli wiązka uległa odchyleniu, wyreguluj uchwyt kolimatora światłowodowego i powtórz powyższe kroki iteracyjne.
- Po wycentrowaniu wiązki na obu irysach, umieścimy teraz dwie soczewki przekaźnikowe, które odwzorują naszą pierwszą stacjonarną płaszczyznę telecentryczną (t.j. rezonansowe lustro galvo) na drugiej stacjonarnej płaszczyźnie telecentrycznej (t.j. standardowe lustro galvo). W przypadku tego konkretnego mikroskopu wybrane soczewki w pierwszym przekaźniku mają tę samą ogniskową „f”, zatem odległość między dwoma lustrami w naszym systemie telecentrycznym wynosi po prostu 4f. Aby upewnić się, że soczewki są precyzyjnie wycentrowane na drodze wiązki, zastosuj metodę wyrównywania soczewek. Umieść pierwszą soczewkę na drodze wiązki i obserwuj plamkę wiązki lasera na następnym irysie znajdującym się za soczewką. Następnie wyreguluj wysokość soczewki w pionie tak, aby pionowy środek wiązki znajdował się w centrum irysa. Na koniec skoryguj poziomą pozycję wiązki, aby wycentrować ją na irysie. Przeprowadź tę samą procedurę dla drugiej soczewki.
2. Konfiguracja drugiego lustra skanującego i obrót mikroskopu
- Aby znaleźć dokładną pozycję drugiej płaszczyzny telecentrycznej, podłącz rezonansowy galwanometr do jednostki skanującej i włącz go. Użyj białej wizytówki, aby śledzić wiązkę skanującą przechodzącą przez dwie soczewki. Płaszczyznę telecentryczną znajdziesz w przybliżeniu w odległości 4f od rezonansowego galwanometru, w miejscu, gdzie wiązka lasera będzie wydawać się całkowicie nieruchoma. Zaznacz tę pozycję na płycie optycznej.
- Umieść standardowe lustro skanujące galwanometru dokładnie w lokalizacji tej płaszczyzny telecentrycznej i dostosuj wysokość oraz pozycję lustra tak, aby wiązka w płaszczyźnie telecentrycznej uderzała dokładnie w środek lustra skanującego. Kluczowe jest włączenie sprzętu sterującego lustrem i przyłożenie napięcia 0 V do wejścia lustra skanującego, aby lustro ustabilizowało się w pozycji neutralnej podczas tego procesu. Ostrożnie dostosuj kąt nachylenia lustra, aby skierować wiązkę pionowo, a następnie delikatnie przykręć lustro w tej pozycji.
- Ponieważ budujemy mikroskop prosty, przytwierdzimy teraz drugą płytę optyczną pod kątem 90 stopni, używając kątowych uchwytów montażowych. Podczas tego procesu upewnij się, że laser i elektronika skanująca są wyłączone, a światłowód oraz lustra skanujące są odłączone. Aby ułatwić dalszą kalibrację, po przykręceniu uchwytów ostrożnie obróć cały mikroskop tak, aby nowa płyta optyczna leżała płasko. Użyj zacisku, aby przymocować płytę do powierzchni roboczej. Teraz pozostałe elementy wcześniej pionowej konfiguracji można łatwo złożyć na płaskiej płycie optycznej.
3. Konfiguracja skanowania, tubusa i obiektywów
Następnie ustawimy drugi zestaw soczewek przekaźnikowych, formalnie nazywany „soczewką skanującą” i „soczewką tubusową”. Ważne jest wybranie odpowiedniej kombinacji soczewek, aby uzyskać właściwe powiększenie w ognisku obiektywu i zoptymalizować rozdzielczość końcowego obrazu. Po pierwsze, aby uzyskać maksymalną aperturę numeryczną (NA) danego obiektywu, wiązka laserowa uderzająca w tylną część obiektywu musi całkowicie wypełnić aperturę tylną; tylko wtedy obiektyw będzie w stanie stworzyć najciaśniejszą ogniskową. Obiektywy mają różne rozmiary apertur tylnych; należy dobrać stosunek powiększenia soczewek tak, aby nieco przepełnić aperturę tylną wybranego obiektywu. Po drugie, w celu uzyskania właściwego powiększenia, obiektyw musi być dopasowany do ogniskowej soczewki tubusowej, dla której został zaprojektowany. Niestety, różni producenci obiektywów mikroskopowych zdecydowali się na stosowanie różnych ogniskowych soczewek tubusowych, dlatego ważne jest zbudowanie mikroskopu z odpowiednią soczewką tubusową dla konkretnego zastosowanego obiektywu. Ponadto niektórzy producenci, np. Zeiss, projektują swoje soczewki tubusowe tak, aby kompensowały one specyficzne aberracje chromatyczne dopasowanego obiektywu, tak że użycie niewłaściwej pary obiektyw-soczewka tubusowa w rzeczywistości wprowadzi nowe aberracje, które w przeciwnym razie nie wystąpiłyby. Zazwyczaj preferujemy obiektywy Olympus, ponieważ cała kompensacja chromatyczna odbywa się w samym obiektywie, co ułatwia parowanie obiektywu z soczewką tubusową. Chociaż mikroskop nadal będzie działać, jeśli obiektyw i soczewka tubusowa nie będą do siebie dopasowane, rzeczywiste powiększenie mikroskopu prawdopodobnie nie będzie zgodne z powiększeniem podanym na obiektywie. W przypadku tej konkretnej budowy mikroskopu optymalny rozmiar apertury tylnej określono na 4 mm, co wymaga stosunku powiększenia 1:4 między soczewką skanującą a tubusową. W tej niestandardowej budowie mikroskopu zastosujemy soczewkę skanującą o ogniskowej 75 mm oraz soczewkę tubusową o ogniskowej 300 mm.
- Ponieważ całkowita odległość między drugim lustrem skanującym a ogniskową obiektywu jest duża, ten etap budowy mikroskopu będzie polegał na rozmieszczeniu luster niezbędnych do skierowania wiązki do soczewki obiektywu. Umieść pierwsze duże lustro o średnicy 2” (50 mm) blisko krawędzi płyty optycznej i obróć uchwyt lustra tak, aby odbić wiązkę lasera pod kątem około 90 stopni. Wstępnie dostosuj odbicie od lustra, aby zachować tę samą pionową wysokość wiązki. Umieść drugie lustro 2” przy przeciwległej krawędzi płyty optycznej w orientacji, która kieruje wiązkę w dół pod kątem 90 stopni. Użyj śrub regulacyjnych, aby upewnić się, że pionowa wysokość wiązki nie ulega zmianie. Ustaw dwie przysłony, zgodnie z krokiem 1.4, i wyreguluj oba lustra zgodnie z instrukcją w kroku 1.5, aby wycentrować wiązkę na przysłonach.
- Przy nadal zamontowanych przysłonach, umieść soczewkę skanującą na drodze wiązki i dostosuj jej położenie w poziomie i pionie, aby wycentrować plamkę lasera na pierwszej przysłonie. W odległości 75 mm + 300 mm od soczewki (między dwoma lustrami), ostrożnie umieść dużą soczewkę tubusową 2” i dostosuj jej położenie w poziomie i pionie, aby wycentrować wiązkę na pierwszej przysłonie. W celu utrzymania późniejszego wyrównania warto pozostawić te przysłony na miejscu; w tej aplikacji wizytówka z otworem o odpowiedniej wielkości może zostać przyklejona do statywu i wstawiona na drodze wiązki.
- Po zamontowaniu wszystkich luster i soczewek rozpocznij skanowanie lustrem galwo rezonansowym oraz standardowym lustrem skanującym. W tej konstrukcji standardowe lustro skanujące zostanie ostatecznie zsynchronizowane z częstotliwością skanowania lustra rezonansowego za pomocą specjalnie zbudowanego obwodu sterującego, takiego jak opisany na Rysunku 3; zapewnia to lepszą synchronizację pionową i poziomą. Jednak w celach wyrównania oraz w wielu zastosowaniach obrazowania lustro można łatwo skanować, używając sygnału piłastym z generatora funkcji. Używając wizytówki, zlokalizuj wiązkę lasera w punkcie 300 mm za soczewką tubusową. Choć wiązka skanuje w innych miejscach mikroskopu zarówno w kierunku pionowym, jak i poziomym, w tym miejscu powinna być całkowicie nieruchoma. To tutaj zostanie umieszczona tylna apertura obiektywu. Jeśli pozioma i pionowa płaszczyzna stacjonarna nie pokrywają się w tej samej płaszczyźnie wzdłuż drogi wiązki, ostrożnie poluzuj i przesuń soczewkę tubusową wzdłuż ścieżki optycznej, aby upewnić się, że obie płaszczyzny nachodzą na siebie jak najdokładniej. Ponownie wycentruj położenie pionowe i poziome soczewki tubusowej i mocno ją przytwierdź.
- Umieść obiektyw na drodze wiązki, dbając o to, aby tylna apertura obiektywu znajdowała się jak najbliżej płaszczyzny stacjonarnej. Rzeczywista tylna apertura obiektywu może nie zawsze znajdować się przy fizycznym tylnym otworze obiektywu ze względu na różne decyzje projektowe producentów. Dlatego zawsze najlepiej sprawdzić u producenta rzeczywiste położenie tylnej apertury.
- Ustaw stolik z próbką, upewniając się, że uchwyt translacyjny umożliwiający ruch w osi z może poruszać się w pełnym zakresie bez kolizji z uchwytem obiektywu.
4. Konfiguracja i ustawianie otworu konfokalnego (pinhole) oraz detektora
- Odłącz wszystkie zasilacze i światłowody, a następnie obróć zespół mikroskopu tak, aby ponownie spoczywał na płycie optycznej utrzymującej rezonansowe lustro skanujące. Stabilnie przymocuj płytę optyczną za pomocą zacisków, następnie ponownie podłącz światłowód do kolimatora oraz oba galwanometry wraz z ich kablami sterującymi. Podobnie jak wcześniej, ustaw napięcie sterujące galwanometrem skanującym standardowym na 0 V.
- Na stoliku z próbką umieść wizytówkę lub niewielką objętość jasnego barwnika w ognisku obiektywu, zakleszczoną między dwiema szkiełkami nakrywkowymi. Wybór barwnika będzie zależał od wybranego lasera i lustra dichroicznego; w tym przypadku wykorzystamy emisję fluorescencji z białej wizytówki do wyrównania konfokalnego systemu detekcji. Do celów wyrównania przydatne mogą być również kropki kwantowe, ponieważ są jasne i nie ulegają fotobleachingowi. Inne alternatywy to kulki fluorescencyjne i/lub próbki tkanin poddane działaniu wybielaczy optycznych, które również silnie fluorescują. Włącz źródło laserowe i wprowadź próbkę do ogniska mikroskopu za pomocą stolika translacyjnego. Po ustawieniu ostrości fluorescencja generowana przez próbkę powinna być widoczna za lustrem dichroicznym, jak opisano w następnym kroku. Zmaksymalizuj moc lasera, aby fluorescencja była jak najjaśniejsza.
- Używając wizytówki, prześledź emisję fluorescencji z próbki przez soczewkę obiektywu i z powrotem przez system skanujący do lustra dichroicznego. Lustro dichroiczne przepuści emisję fluorescencji, odbijając jednocześnie wiązkę lasera; zlokalizuj ten sygnał fluorescencji po drugiej stronie lustra dichroicznego. Teraz umieść lustro za lustrem dichroicznym i użyj go do odbicia emisji pod kątem 90 stopni. Weź irys, tak jak zrobiono to w kroku 1.1, i użyj go wraz z lustrem, aby skierować wiązkę fluorescencji jak najprościej i najbardziej równolegle do płyty optycznej. Ten krok najlepiej wykonać w przyciemnionym świetle.
- Skonfiguruj jednostkę otworu konfokalnego (pinhole) zgodnie z Rys. 2. Stwierdziliśmy, że zespół mocowań klatkowych filtra przestrzennego z ThorLabs jest idealny do tego zadania. Ważne jest wybranie odpowiedniej wielkości otworu, aby zapewnić optymalną rozdzielczość systemu konfokalnego bez nadmiernej utraty sygnału. Dla tego niestandardowego mikroskopu wybrano otwór o rozmiarze 100 μm. Umieść jednostkę filtra przestrzennego w linii toru wiązki fluorescencji, dbając o to, aby pierwszy uchwyt soczewki skupiającej był wycentrowany na wiązce emisji fluorescencji. Po zamontowaniu w jednostce soczewki o krótkiej ogniskowej (można również użyć obiektywu mikroskopowego), przesuń uchwyt translacyjny w osi z, aż zostanie zaobserwowany wyraźny punkt skupienia na powierzchni otworu. Upewnij się, że cała jednostka jest zorientowana wzdłuż dokładnej linii prostej wyznaczonej przez wiązkę fluorescencji. Przymocuj jednostkę do płyty optycznej.
Emisja z większości próbek jest słaba w porównaniu z poziomem światła otoczenia, nawet w ciemnych pomieszczeniach. Dlatego kluczowe jest zastosowanie odpowiedniego ekranowania/osłon przeciwświetlnych wzdłuż toru emisji, aby chronić przed zanieczyszczeniem światłem rozproszonym. Ponadto wysoki poziom światła otoczenia może przeciążyć i uszkodzić wiele PMT, szczególnie te bez zabezpieczenia prądowego. Dlatego czytelników usilnie zachęca się do stosowania tubusów soczewkowych w celu zamknięcia toru wiązki emisji; odpowiednio ekranowany system, taki jak prezentowany tutaj, jest zdolny do pracy w świetle pokojowym przy minimalnym lub zerowym zanieczyszczeniu światłem rozproszonym. - Teraz, korzystając z pokręteł regulacyjnych stolika translacyjnego, systematycznie przesuwaj otwór konfokalny, aby znaleźć punkt, w którym sygnał fluorescencji przechodzący przez otwór jest maksymalny. Pozycję tę najłatwiej zidentyfikować poprzez iteracyjną regulację dwóch osi w celu przeprowadzenia dwuwymiarowego przeszukiwania powierzchni uchwytu otworu. Po znalezieniu pozycji maksymalizującej sygnał, umieść soczewkę kolimującą na mocowaniu klatkowym za otworem. Zlokalizuj emisję fluorescencji przechodzącą przez jednostkę konfokalną za pomocą wizytówki i przesuwaj soczewkę kolimującą wzdłuż wsporników, aż emitowany sygnał fluorescencji będzie jak najbardziej skolimowany. Po skolimowaniu wiązki należy umieścić odpowiedni filtr w torze wiązki w tubusie soczewkowym.
- Skonfiguruj zespół fotopowielacza (PMT). Umieść soczewkę o ogniskowej 50 mm w torze wiązki emisji fluorescencji i znajdź jej punkt ogniskowania za pomocą wizytówki. Zaznacz tę pozycję na płycie optycznej. Teraz całkowicie wyłącz laser – jest to ważne, ponieważ rozproszone lub nieosłabione światło lasera może trwale uszkodzić większość PMT. Ustaw PMT tak, aby jego obszar aktywny znajdował się jak najbliżej zaznaczonego punktu ogniskowania. Połącz zespół PMT z soczewką skupiającą za pomocą regulowanych tubusów soczewkowych i starannie owiń ciemną taśmą wszystkie odsłonięte tory wiązki za otworem.
- Włącz laser, ale upewnij się, że jego moc jest ekstremalnie niska, tak aby emisja fluorescencji była ledwo widoczna. Włącz PMT, uważnie odczytując jego napięcie na oscyloskopie w miarę zwiększania napięcia sterującego. PMT generuje sygnał poprzez serię stopni mnożenia elektronów; jeśli prąd fotoelektryczny jest zbyt wysoki dla danego poziomu światła padającego, lampa może zostać nieodwracalnie uszkodzona. Z tego powodu wysoce zaleca się stosowanie PMT z układami ograniczającymi prąd, szczególnie dla użytkowników, którzy nie pracowali wcześniej z takimi detektorami.
Zwiększaj napięcie sterujące PMT, aż na ekranie oscyloskopu pojawi się odczyt w postaci piku i/lub przesunięcie DC; dla większości PMT sygnał ten będzie ujemny względem masy. Potwierdź, że sygnał ten rzeczywiście pochodzi z fluorescencji, wyłączając moc lasera i obserwując zanik sygnału. - Na koniec iteracyjnie wyrównaj otwór dla maksymalnego sygnału na oscyloskopie, manipulując najpierw pozycją z soczewki skupiającej, a następnie regulując stolik translacyjny yz.
- Sprzęt mikroskopu o szybkości wideo jest gotowy! Teraz podłącz lustra, niestandardowe płyty sterujące i komputer zgodnie ze schematem na Rys. 3. Jak wspomniano wyżej, zaleca się użycie systemu obrazowania do wstępnej wizualizacji wzorca o znanej wielkości, aby znaleźć optymalną rozdzielczość mikroskopu i obliczyć stałą piksel-rozdzielczość dla systemu obrazowania. Można użyć wielu wzorców wielkości, takich jak białe wizytówki z literami o znanych rozmiarach, fluorescencyjne lub refleksyjne tarcze lotnicze oraz fluorescencyjne mikrosfery.
5. Przygotowanie systemu do konfokalnej skaningowej mikroendoskopii
W tej konstrukcji wykorzystujemy spójny światłowód obrazowy, który składa się z wiązki wielu tysięcy rdzeni światłowodowych; taki układ pozwala na przesłanie obrazu przez światłowód oraz jego łatwą rekonstrukcję i/lub powiększenie na drugim końcu (Rys. 4). Spójna wiązka światłowodowa użyta do budowy tego endoskopu jest polerowana na obu końcach, co czyni go tak zwanym mikroendoskopem w „trybie kontaktowym”. Obraz w ostrości zostanie zatem utworzony tylko wtedy, gdy końcówka mikroendoskopu zostanie doprowadzona do bezpośredniego kontaktu z obiektem. W tej pseudokonfokalnej konfiguracji skanowanie mikroskopu skupia laser na jednym rdzeniu światłowodowym naraz, podczas gdy otwór konfokalny (pinhole) zapewnia, że światło poza ogniskiem z sąsiednich włókien nie przedostaje się do detektora. W zależności od zastosowania obrazowania, na końcówce dystalnej można dodać zestaw soczewek, aby umożliwić fluorescencyjne obrazowanie dalekiego zasięgu skierowane do przodu. Do tego celu można łatwo dostosować soczewki mikrooptyczne, a także soczewki z gradientowym współczynnikiem załamania (GRIN), które można przymocować do dystalnej końcówki światłowodu za pomocą klejów optycznych.
- Aby przygotować system obrazowania do mikroendoskopii, ostrożnie wyjmij stoleik z próbką i zastąp go uchwytem do włókien (Ryc. 5). Zanurz jeden koniec wiązki włókien w słabym roztworze barwnika, aby emisja fluorescencji była jednorodna we wszystkich rdzeniach włókien. Włącz system skanowania i wyreguluj uchwyt włókna, aby ustawić w ostrości drugi koniec wiązki włókien (koniec proksymalny, czyli koniec znajdujący się najbliżej optyki mikroskopu). Najpierw, za pomocą śrub regulacyjnych przesuwu, wycentruj włókno w polu skanowania. Następnie, podczas skanowania, obserwuj obraz emisji fluorescencji z proksymalnego końca włókna. Gdy cała powierzchnia mikroendoskopu znajdzie się w płaszczyźnie ogniskowej obiektywu, emisja fluorescencji we wszystkich rdzeniach włókien będzie jak najbardziej jednorodna. Użyj pokręteł regulacji kąta, aby ustawić czoło włókna tak, aby wszystkie rdzenie włókien świeciły równomiernie. Podczas tej regulacji prawdopodobnie konieczne będzie ponowne skorygowanie pozycji przesuwu, aby ponownie wycentrować włókno w polu skanowania. Powtarzaj te regulacje, aż cały koniec włókna zostanie prawidłowo ustawiony w ostrości.
- Przed użyciem mikroendoskopu delikatnie oczyść koniec dystalny za pomocą papieru do czyszczenia soczewek lekko zwilżonego metanolem klasy HPLC. Podobnie jak wcześniej, użyj standardu o znanej wielkości, aby zmierzyć i obliczyć rozdzielczość systemu obrazowania mikroendoskopu.
6. Reprezentatywne wyniki:
Rysunek 6 przedstawia przykład gotowego pionowego konfokalnego mikroskopu skaningowego skonfigurowanego do mikroendoskopii. Wiązki lasera i emisji zostały narysowane w celu ułatwienia orientacji. Uchwyt włókna utrzymuje włókno obrazujące na miejscu podczas pracy w trybie mikroendoskopii. Uchwyt ten można łatwo zastąpić stolikiem translacyjnym xy lub xyz, aby wykorzystać urządzenie jako platformę pionowego mikroskopu. Do tego zastosowania dobrze nadają się elementy firmy ThorLabs PT3 (translacja XYZ) lub dwa ułożone jeden na drugim stoliki PT1 (translacja XY), wraz z kątownikiem, takim jak element ThorLabs AP90.
Do generowania obrazów z sygnału wejściowego wykorzystana została karta przechwytywania obrazu w czasie rzeczywistym. Rycina 7 przedstawia reprezentatywny obraz testowy małej litery „m” wydrukowanej na białej wizytówce, wykonany za pomocą mikroskopowego systemu skanowania w czasie rzeczywistym. Wybielony biały papier zawiera fluorofory, które są wzbudzane światłem UV i niebieskim, co skutkuje jasnym tłem za ciemną literą „m”. Do zebrania tej emisji fluorescencyjnej wybrano filtr emisyjny z centrem na 515 nm. Można zauważyć niewielkie zniekształcenie obrazu, szczególnie w pobliżu bocznych krawędzi kadru. Zniekształcenie to wynika z sinusoidalnego wzorca skanowania lustra galwo o częstotliwości 8kHz i zostanie szczegółowo omówione poniżej.
Rysunek 1. Schemat przedstawiający zasadę działania mikroskopu konfokalnego. Promienie pochodzące z ogniska obiektywu są przekazywane z powrotem przez system i ogniskowane przez otwór konfokalny (czerwony). Promienie pochodzące powyżej (niebieski) lub poniżej (zielony) ogniska obiektywu nie opuszczają obiektywu w sposób kolimowany, w związku z czym nie są efektywnie przenoszone przez otwór konfokalny.
Rysunek 2. Schemat przedstawiający wszystkie drogi światła w systemie skanowania wiązki. Lustra skanujące znajdują się w płaszczyznach telecentrycznych względem stacjonarnej płaszczyzny tylnej apertury obiektywu. Pary soczewek pomiędzy płaszczyznami stacjonarnymi pełnią funkcję przekaźników skanowanych wiązek. Pierwsze dwie soczewki przekaźnikowe mają równe ogniskowe, tworząc teleskop 1:1. Druga para soczewek, formalnie znana jako soczewka skanująca i soczewka tubusowa, nie musi mieć równych ogniskowych i często służy jako teleskop rozszerzający wiązkę, aby zapewnić przepełnienie tylnej apertury obiektywu. Światło emitowane z próbki wraca przez system skanujący i przechodzi przez lustro dichroiczne. Soczewka krótkiej ogniskowej skupia światło emisji w otworze konfokalnym (pinhole), które następnie jest kolimowane przez soczewkę. Ostatnia soczewka skupia przefiltrowaną konfokalnie emisję na fotopowielacz. Kliknij tutaj, aby wyświetlić obraz w pełnym rozmiarze.
Rycina 3. (a) Schemat blokowy układu elektroniki skanującej. Ogólnym sygnałem referencyjnym i bazą czasową mikroskopu jest wyjście TTL „sync” rezonansowego lustra galwanometrycznego osi szybkiej, które generuje impuls TTL na końcu każdej skanowanej linii (t. j., gdy galwanometr zakończy cykl skanowania). Dostarcza to sygnał H-sync do karty przechwytywania obrazu. Wyjście synchronizacji galwanometru jest również połączone z płytką sterującą V-sync, która stopniowo zwiększa napięcie wyjściowe w odpowiedzi na każdy impuls H-sync, aby wygenerować przebieg piłokształtny sterujący wolną osią skanowania. Po zeskanowaniu wszystkich linii płytka V-sync resetuje przebieg piłokształtny i generuje impuls TTL, który służy jako sygnał V-sync dla karty przechwytywania obrazu. Ostatnim sygnałem wejściowym do karty przechwytywania obrazu jest sygnał analogowy z lampy fotopowielającej (należy pamiętać, że wiele PMT generuje ujemne napięcie wyjściowe; należy odpowiednio zaprojektować układ i dobrać sprzęt). Obrazy o częstotliwości odświeżania wideo są generowane i wyświetlane w oprogramowaniu karty przechwytywania obrazu Matrox. (b) Przykład układu sterującego. W tej konstrukcji napięcie każdego impulsu H-Sync jest „dodawane”/integrowane w integratorze na wzmacniaczu operacyjnym w celu wygenerowania rampy przebiegu piłokształtnego; impulsy są jednocześnie zliczane w stopniu licznika TTL. Po osiągnięciu żądanej liczby linii (t. j., gdy skan rastrowy zostanie zakończony), licznik generuje aktywny niski impuls „przeniesienia” (carry out), który steruje triggerem Schmitta w celu wygenerowania impulsu resetującego dla integratora. Powoduje to zresetowanie zarówno licznika, jak i integratora na wzmacniaczu operacyjnym, przygotowując obwód do kolejnego cyklu. Odpowiedni dobór komponentów sprawia, że obwód ten znajduje szerokie zastosowanie dla różnych rozmiarów rastrów. Jest to tylko jedna z realizacji; możliwe są liczne inne implementacje, które mogą być preferowane w określonych okolicznościach. Ponadto obwód ten został zaprojektowany do pracy z kartami przechwytującymi obraz Matrox, które automatycznie wykrywają i korygują fazę obrazu. W przypadku zastosowania obwodu z innymi kartami przechwytującymi może być wymagany układ korekcji fazy lub odpowiednie oprogramowanie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić pełnowymiarową wersję tego obrazu.
Rycina 4. Transmisja obrazu przez wiązkę włókien koherentnych. Na tym schemacie soczewki po obu stronach wiązki służą do skalowania obrazu rzutowanego na wejście wiązki włókien, a także do powiększenia obrazu na wyjściu wiązki włókien.
Rysunek 5. Przykład wiązki światłowodowej zamontowanej w uchwycie 5-osiowym. Mały blok aluminiowy o średnicy 1” został wywiercony tak, aby można było w nim umieścić wiązkę światłowodów obrazujących. W celu zapewnienia stabilności światłowód został przyklejony żywicą epoksydową wewnątrz bloku aluminiowego zarówno u góry, jak i u dołu bloku.
Rysunek 6. Obraz kompletnego systemu mikroskopowego z podłączonym mikroendoskopem. Aby lepiej zwizualizować drogi światła, tor wiązki wzbudzającej zaznaczono kolorem niebieskim, natomiast tor wiązki emisyjnej za lustrem dichroicznym przedstawiono linią czerwoną.
Rycina 7. Przykładowy obraz wygenerowany przez system konfokalnej mikroskopii skanującej o szybkości wideo. Ciemna mała litera „m” widoczna jest na jasnym fluorescencyjnym tle białej wizytówki.
Dyskusja
Ten system obrazowania w czasie rzeczywistym wykorzystuje rezonansowe lustro galwanometryczne pracujące z częstotliwością około 8 kHz. Lustra rezonansowe mogą generować znaczny hałas podczas pracy z pełną mocą, a ich wysoka częstotliwość może być uciążliwa lub nawet niebezpieczna przy dłuższym czasie ekspozycji. Chociaż nie pokazano tego w niniejszym materiale, zaleca się osłonienie rezonansowego lustra galwanometrycznego przezroczystą obudową w celu znacznego zmniejszenia poziomu hałasu systemu i/lub stosowanie odpowiednich środków ochrony słuchu, takich jak zatyczki do uszu.
Rezonansowe lustro galwanometryczne skanuje w sposób sinusoidalny. Jednak karty przechwytywania obrazu odczytują sygnał przy założeniu całkowicie liniowej prędkości przeskanowania zarówno w kierunku poziomym, jak i pionowym. Ponieważ skanowanie sinusoidalne zwalnia na krawędziach skanu, wzdłuż szybkiej (poziomej) osi obrazu mogą wystąpić artefakty kompresji obrazu. Jednym ze sposobów zminimalizowania tego problemu jest celowe ustawienie zakresu skanowania rezonansowego lustra galwanometrycznego na wartość znacznie większą niż średnica soczewki przekaźnikowej. W ten sposób tylko niemal liniowy centralny zakres sinusoidalnego wzoru skanowania będzie przechodził przez próbkę, co zminimalizuje zniekształcenia obrazu. Innym podejściem jest postprocesowanie zebranych obrazów w celu linearyzacji szybkiej osi. Można to osiągnąć poprzez obrazowanie znanego wzoru fluorescencyjnego (np. siatki) i wykorzystanie znanych wymiarów wzoru do stworzenia skryptu przetwarzającego, który usunie zniekształcenia z zebranych obrazów.
Ten konkretny system skanowania został zaprojektowany do obrazowania in vivo, które często wymaga mikroskopu o szybkości wideo w orientacji pionowej. W eksperymentach z obrazowaniem komórkowym częściej stosuje się mikroskopy odwrócone. Przedstawiona tutaj konstrukcja może zostać łatwo zmodyfikowana w celu zbudowania takiego mikroskopu odwróconego; wymagany jest jedynie obrót końcowego lustra o średnicy 2”. Zamiast orientować lustro tak, aby kierowało wiązkę skanującą w dół, można je skierować w górę. Umieszczenie obiektywu w tej samej odległości od lustra wraz ze stolikiem obiektowym umożliwiłoby obrazowanie w geometrii odwróconej. Jeśli system obrazowania jest budowany wyłącznie do obrazowania mikroendoskopowego, nie ma potrzeby pionowego „składania” konstrukcji mikroskopu. Zamiast tego cały system skanowania można zbudować na pojedynczej poziomej płycie optycznej, z obiektywem zorientowanym równolegle do stołu optycznego.
Należy zauważyć, że mikroskop w tej wersji wykorzystuje stałą konfigurację otworu w przysłonie (pinhole); choć zapewnia to maksymalną prostotę konstrukcji i łatwość kalibracji, użytkownicy pragnący bardziej wszechstronnego systemu mogą rozważyć zastosowanie otworu o regulowanej średnicy, jaki spotyka się w większości komercyjnych mikroskopów konfokalnych. Dzięki możliwości dostosowania wielkości otworu w przysłonie w celu skompensowania próbek o różnej intensywności emisji, użytkownik może lepiej zoptymalizować kompromis między siłą sygnału a rozdzielczością dla danej próbki.
Wybór włókna obrazującego do mikroskopu jest istotny. Zalecamy stosowanie włókien obrazujących firmy Sumitomo ze względu na niewielkie odstępy między rdzeniami włókien oraz niską względną autofluorescencję. Stwierdzono, że włókna obrazujące produkowane przez firmę Fujikura charakteryzują się wysokim poziomem autofluorescencji10, co może przykryć słabe sygnały fluorescencyjne z próbki i ograniczyć ostateczną czułość mikroendoskopu. Włókna produkowane przez Sumitomo, takie jak 8-30N zastosowane w tej konkretnej konfiguracji, wykazują znacznie niższy poziom autofluorescencji niż ich odpowiedniki od Fujikury. Choć wiązki włókien typu leeched mogą wydawać się atrakcyjne w mikroendoskopii, ich konstrukcja zazwyczaj zakłada zbyt duże odstępy między poszczególnymi rdzeniami włókien, co oznacza, że rdzenie te próbkują obiekty zbyt rzadko, pomijając istotne obszary potencjalnego zainteresowania.
Na koniec należy zauważyć, że choć opisany tutaj mikroskop będzie przydatny w szerokim zakresie zastosowań in vitro oraz in vivo i może zostać zbudowany za ułamek kosztów pełnowartościowego systemu komercyjnego, nie posiada on takich funkcji jak detekcja światła przechodzącego, okular do obserwacji czy tor wiązki dla niekonfokalnej epifluorescencji szerokopolowej. Chociaż możliwe jest zbudowanie od podstaw systemu z takimi funkcjami, czytelnicy potrzebujący takiego rozwiązania mogą rozważyć modyfikację istniejącego systemu komercyjnego w celu zaspokojenia swoich potrzeb, zamiast rozpoczynać budowę całkowicie nowego urządzenia.
Oświadczenia
Produkcja tego filmu została sponsorowana przez Thorlabs, Inc.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować firmie ThorLabs za wsparcie tego projektu. AJN pragnie podziękować za wsparcie w ramach stypendium doktoranckiego NSF.
Praca ta została częściowo sfinansowana przez National Institutes of Health w ramach programu NIH Director's New Innovator Award, grant numer 1 DP2 OD007096-01. Informacje na temat programu New Innovator Award znajdują się pod adresem http://nihroadmap.nih.gov/newinnovator/. Autorzy chcieliby podziękować Tomowi Hayesowi za możliwość korzystania z laboratorium Harvard Electronics.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| filtr pasmowy 515 nm | Chroma Technology Corp. | HQ515/50M | 46 FWHM |
| Soczewka achromatyczna dublet, średnica 25,4 mm x ogniskowa 50 mm, powłoka MgF2 | Edmund Scientific | NT49-766 | |
| Soczewka achromatyczna (dublet) o średnicy 25,4 mm i ogniskowej 76,2 mm, powłoka MgF2 | Edmund Scientific | NT49-768 | |
| Soczewka achromatyczna (dublet), średnica 25,4 mm x ogniskowa 88,9 mm, powłoka MgF2 | Edmund Scientific | NT49-769 | |
| Soczewka achromatyczna (dublet) o średnicy 50 mm i ogniskowej 300 mm, powłoka MgF2 | Edmund Scientific | NT45-179 | |
| Wysokoczęstotliwościowy skaner optyczny 8 kHz R | Electro-Optical Products Corporation (EOPC) | SC-30 | 8 kHz |
| Sterownik AGC | Electro-Optical Products Corporation (EOPC) | ACG:8K | |
| Moduł fotoczuły H7422-PA | Hamamatsu Corp. | H7422-PA | Zalecane ograniczenie prądu |
| Zasilacz M9012 | Hamamatsu Corp. | M9012 | Do użytku z H7422-PA |
| Obiektyw HC PL APO CS | Leica Microsystems | 11506284 | 10x/0,40 |
| Karta przechwytująca Solios eA/XA Framegrabber | Matrox | Solios eA/XA | wymagane oprogramowanie MIL; –Zalecane połączenia M |
| Zasilacz 12 V | Meanwell | LPV-100-12 | +12 V, 8,5 A |
| obiektyw mikroskopowy 5x | Newport Corp. | M-5X | NA 0,10, ogniskowa 25,4 mm |
| Koherentne światłowody obrazujące | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | 8-30N | |
| 1/4"Zestaw śrub z łbem stożkowym -20 i elementów montażowych | Thorlabs Inc. | HW-KIT2 | |
| 100 μzamontowany otwór kombinacyjny (pinhole) | Thorlabs Inc. | P100S | Idealne do budowy filtrów przestrzennych |
| Zacisk do kostki klatkowej 30 mm | Thorlabs Inc. | B6C | |
| Klatka systemowa 30 mm, kostka 4-drożna | Thorlabs Inc. | C4W | |
| 406 nm, 5 mW, kod pin B, dioda laserowa z dopasowanym światłowodem jednomodowym (SM), FC/PC | Thorlabs Inc. | LPS-406-FC | Produkt wycofany z oferty; zastąpiony przez LP405-SF10 |
| Klej epoksydowy 5-minutowy, 1 uncja | Thorlabs Inc. | G14250 | |
| 6-osiowy kinematyczny uchwyt optyczny | Thorlabs Inc. | K6X | |
| Zestaw śrub imbusowych 8-32 i elementów montażowych | Thorlabs Inc. | HW-KIT1 | |
| Zestaw śrub imbusowych i elementów montażowych 8-32 | Thorlabs Inc. | HW-KIT3 | |
| Adapter z zewnętrznym gwintem RMS i wewnętrznym gwintem SM1 | Thorlabs Inc. | SM1A4 | |
| Regulowany kolimator FC/PC i FC/APC, f = 2,0 mm, ARC: 400-600 nm | Thorlabs Inc. | CFC-2X-A | f = 2,0 mm |
| Regulowany adapter kolimatora światłowodowego, z gwintem SM1 | Thorlabs Inc. | AD9.5F | |
| Aluminiowa płyta montażowa, 12" x 18" x 1/2" | Thorlabs Inc. | MB1218 | 1/4"-20 Gwintowany |
| Laboratoryjny kontroler diody laserowej/TEC | Thorlabs Inc. | ITC4001 | 1 A/96 W |
| Lustro dichroiczne długoprzepustowe DMLP 425 nm | Thorlabs Inc. | DMLP425 | |
| Mocowanie kinematyczne dla 1" Optyka | Thorlabs Inc. | KM100 | |
| Uchwyt LD/TEC do diod laserowych z wyprowadzeniem światłowodowym firmy ThorLabs | Thorlabs Inc. | LM9LP | |
| Mocowanie soczewki dla optyki 18 mm | Thorlabs Inc. | LMR18 | W zestawie znajduje się jeden pierścień zabezpieczający |
| Mocowania obiektywów dla 2" Optyka | Thorlabs Inc. | LMR2S | Z gwintowaniem wewnętrznym i zewnętrznym; pierścień zabezpieczający w zestawie |
| Pręt montażowy klatki z serii Mini, 6" Długość 4 mm, ilość: 1 | Thorlabs Inc. | SR6 | |
| 1.0" Słupek podstawowy, gwint 8-32, 1 szt." Długi | Thorlabs Inc. | RS1P8E | |
| 1" Przedłużenie słupa wsporczego, długość=0,5 | Thorlabs Inc. | RS05 | |
| 1" Przedłużenie słupka wsporczego, długość=0,75" | Thorlabs Inc. | RS075 | |
| 1" Chronione lustro srebrne, grubość 3,2 mm | Thorlabs Inc. | ME1-P01 | |
| 1" Obrotowy regulowany element ogniskujący SM1, L = 1" | Thorlabs Inc. | SM1V10 | |
| 2" Chronione lustro srebrne, grubość 3,2 mm | Thorlabs Inc. | ME2-P01 | |
| P100S - 100 μzamontowana blendna (pinhole) | Thorlabs Inc. | P100S | |
| Polaris Low Drift 1" Kinematyczny uchwyt lustra | Thorlabs Inc. | POLARIS-K1 | Niski dryft |
| Tuba soczewkowa SM1, L = 1" | Thorlabs Inc. | SM1L-10 | Dołączono jeden pierścień zabezpieczający |
| Gwintowana płytka klatki SM1 o rozmiarze 30 mm, 0,35" Gruby | Thorlabs Inc. | CP02 | |
| Adapter gwintowy komponentów optycznych SM1 na M25 | Thorlabs Inc. | SM1A24 | Zewnętrzne gwinty SM1 i wewnętrzne gwinty M25,5x0,5 |
| System galwanometryczny o małej średnicy wiązki | Thorlabs Inc. | GVSM001 | |
| Mały widelec zaciskowy | Thorlabs Inc. | CF125 | 1/25" gniazdo z fazowaniem, uniwersalne |
| System filtra przestrzennego | Thorlabs Inc. | KT310 | Otwór typu pinhole sprzedawany oddzielnie |
| Uchwyt z chłodzeniem termoelektrycznym dla 5,6 &lasery 9 mm | Thorlabs Inc. | TCLDM9 | |
| Uchwyt pionowy do płyt eksperymentalnych | Thorlabs Inc. | VB01 | Każdy |
| Plan-Apochromat | Carl Zeiss, Inc. | 1101-957 | 20x/0,75 NA |
Bibliografia
- Pawley, J. B. Handbook of biological confocal microscopy. , Springer Verlag. 985-985 (2006).
- Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. Studying protein dynamics in living cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2, 444-456 (2001).
- Klonis, N., Rug, M., Harper, I., Wickham, M., Cowman, A., Tilley, L. Fluorescence photobleaching analysis for the study of cellular dynamics. European Biophysics Journal. 31, 36-51 (2002).
- Stephens, D. J. Light Microscopy Techniques for Live Cell Imaging. Science. 300, 82-86 (2003).
- McMahon, A., Supatto, W., Fraser, S. E., Stathopoulos, A. Dynamic Analyses of Drosophila Gastrulation Provide Insights into Collective Cell Migration. Science. 322, 1546-1550 (2008).
- Wallingford, J. B. Dishevelled controls cell polarity during Xenopus gastrulation. Nature. 405, 81-85 (2000).
- Laemmel, E. Fibered Confocal Fluorescence Microscopy (Cell-viZio) Facilitates Extended Imaging in the Field of Microcirculation. Journal of Vascular Research. 41, 400-411 (2004).
- Moussata, D. The confocal laser endomicroscopy. Acta Endoscopica. 39, 448-451 (2010).
- Dunbar, K., Canto, M. Confocal endomicroscopy. Current Opinion in Gastroenterology. 24, 631-637 (2008).
- Udovich, J. A. Spectral background and transmission characteristics of fiber optic imaging bundles. Applied optics. 47, 4560-4568 (2008).
Przedruki i uprawnienia
