Wizualizacja replikacji DNA w Układzie Modelowym Kręgowców DT40 z wykorzystaniem techniki włókien DNA

Summary

DT40, modelowy system genetyczny kręgowców, dostarcza potężnego narzędzia do analizy funkcji białek. W tym miejscu opisujemy prostą metodę, która pozwala na jakościową analizę parametrów wpływających na syntezę DNA podczas fazy S w komórkach DT40 na poziomie pojedynczej cząsteczki.

Abstract

Utrzymanie stabilności widełek replikacyjnych ma ogromne znaczenie dla podziału komórek, aby zachować żywotność i zapobiec chorobom. Procesy te nie tylko zapewniają wierną duplikację genomu w obliczu endogennych i egzogennych uszkodzeń DNA, ale także zapobiegają niestabilności genomu, która jest uznanym czynnikiem sprawczym w rozwoju nowotworu.

Tutaj opisujemy prostą i opłacalną metodę opartą na mikroskopii fluorescencyjnej do wizualizacji replikacji DNA w linii ptasich komórek B DT40. Ta linia komórkowa stanowi potężne narzędzie do badania funkcji białek in vivo poprzez odwrotną genetykę w komórkach kręgowców¹. Fluorografia włókien DNA w komórkach DT40 pozbawionych specyficznego genu pozwala wyjaśnić funkcję produktu tego genu w replikacji DNA i stabilności genomu. Tradycyjne metody analizy dynamiki widełek replikacyjnych w komórkach kręgowców polegają na pomiarze ogólnego tempa syntezy DNA w populacji komórek znakowanych impulsowo. Jest to podejście ilościowe i nie pozwala na jakościową analizę parametrów wpływających na syntezę DNA. W przeciwieństwie do tego, szybkość ruchu aktywnych widełek można śledzić bezpośrednio przy użyciu techniki włókien DNA^2-4. W tym podejściu powstające DNA jest znakowane in vivo przez włączenie chlorowcowanych nukleotydów (ryc. 1A). Następnie poszczególne włókna są rozciągane na szkiełko mikroskopowe, a znakowane drogi replikacji DNA są barwione specyficznymi przeciwciałami i wizualizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (ryc. 1B). Inicjacja replikacji, jak również kierunkowość widełek jest determinowana przez kolejne użycie dwóch różnie zmodyfikowanych analogów. Co więcej, podejście oparte na podwójnym znakowaniu pozwala na ilościową analizę parametrów, które wpływają na syntezę DNA w fazie S, tj. struktur replikacji, takich jak trwające i zatrzymane widełki, gęstość początkowa replikacji, a także zakończenia widełek. Wreszcie, procedura eksperymentalna może być wykonana w ciągu jednego dnia i wymaga jedynie ogólnego sprzętu laboratoryjnego i mikroskopu fluorescencyjnego.

Protocol

Opisana tutaj metoda została użyta w następującej publikacji: Schwab et al., EMBO J., 29(4):806-18⁵.

1. Hodowla komórkowa DT40

Materiały: Surowica bydlęca płodu (FBS), surowica kurza, penicylina/streptomycyna, 2-merkaptoetanol, RPMI

1. Przygotować pożywkę do hodowli komórkowych: dodać 7% FBS, 3% surowicy kurczaka, 1x penicylinę/streptomycynę i 10 μM 2-merkaptoetanol do pożywki RPMI.
2. Komórki DT40 hoduje się w sterylnych kolbach do hodowli komórkowych w temperaturze 38 °C i 5% CO₂ w wilgotnym inkubatorze. Dziel komórki codziennie na gęstość 5 x 10⁵ komórek/ml⁶.

2. Etykietowanie in vivo

Materiały: IdU, CldU

1. Przygotować roztwory podstawowe analogów nukleotydów: rozpuścić IdU do 5 mM i CldU do 2,5 mM w pożywce. Ogrzewać krótko oba roztwory do temperatury 60 °C i wirować, aż analogi nukleotydów całkowicie się rozpuszczą.
2. Dodaj IdU do końcowego stężenia 25 μM do wykładniczo rosnących komórek DT40 i dobrze wymieszaj zawiesinę komórkową. Inkubować komórki przez 20 minut w temperaturze 38 °C i 5% CO₂ .
3. Po inkubacji z pierwszym znacznikiem dodać CldU do końcowego stężenia 250 μM i traktować komórki zgodnie z opisem w poprzednim kroku.
4. Umyć komórki lodowatym PBS i ponownie zawiesić je w stężeniu 7,5 x 10⁵ komórek/ml w zimnym PBS. Trzymaj oznaczone komórki na lodzie.

Opisana procedura etykietowania jest jedynie sugestią i może być modyfikowana w celu odpowiedzi na konkretne pytania. Zapoznaj się z sekcją dyskusji, aby uzyskać więcej informacji na temat projektowania eksperymentalnego.

3. Liza komórek i rozprzestrzenianie się DNA

Materiały: Szkiełka szklane, roztwór do lizy włókien

1. Przygotuj roztwór do lizy włókien: 50 mM EDTA i 0,5% SDS w 200 mM Tris-HCl, pH 7,5
2. Umieścić 2 μl zawiesiny komórek na jednym końcu szkiełka podstawowego. Suszyć na powietrzu przez 5 minut lub do momentu, gdy objętość kropli zostanie znacznie zmniejszona, ale nie sucha.
3. Odmierzyć pipetę 7 μl roztworu do lizy na zawiesinę komórek i delikatnie wymieszać końcówką pipety, aby wymieszać roztwory. Inkubuj przez 2 minuty, aby postępowała liza komórek.
4. Przechyl suwaki do 15°, aby umożliwić rozprowadzenie włókien wzdłuż zjeżdżalni.
5. Gdy roztwór błonnika dotrze do dna szkiełka, umieść go poziomo do wyschnięcia na powietrzu. Po wyschnięciu wzdłuż szkiełka powinna być widoczna cienka, nieprzezroczysta linia. W tym momencie początek rozciągniętych włókien należy zaznaczyć ołówkiem, ponieważ po zabarwieniu linia nie będzie już widoczna. Ten znak pomoże później zlokalizować włókna pod mikroskopem.

4. Barwienie immunofluorescencyjne

Materiały: Metanol, kwas octowy, HCl, 5% BSA w PBS, słoik do barwienia, przeciwciało anty-BrdU (mysie), przeciwciało anty-BrdU (szczura), przeciwciało anty-BrdU (szczura), przeciwciało anty-mysie Cy3 dla owiec, przeciwciało anty-szczurze Alexa Fluor 488, podłoże montażowe Vectashield, szkiełka nakrywkowe, lakier do paznokci

1. Zanurzyć szkiełka w metanolu/kwasie octowym (3:1) w słoiku do barwienia i inkubować przez 10 minut.
2. Umyć szkiełka w destylowanym_H2O, a następnie zanurzyć w 2,5 M HCl na 80 minut.
3. Umyj szkiełka trzy razy w PBS przez 5 minut.
4. Wyjmij szkiełka ze słoika do barwienia i zbierz nadmiar PBS ręcznikiem papierowym. Umieść szkiełka poziomo i odpipetuj 5% BSA na wierzch każdego szkiełka. Delikatnie przykryj szkiełka nakrywkowe, aby równomiernie rozprowadzić BSA na szkiełku i inkubować przez 20 minut.
5. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe w 5% BSA w następujących stężeniach: 1:25 anty-BrdU (mysz) i 1:400 anty-BrdU (szczur).
6. Delikatnie przesuń szkiełko nakrywkowe w dół szkiełka podstawowego, aby je zdjąć. Nie należy stosować siły, jeśli szkiełko nakrywkowe przykleja się do prowadnicy. Szkiełko można ponownie nawodnić w PBS, aż szkiełko nakrywkowe poluzuje się i będzie można je łatwo usunąć. Zbierz nadmiar BSA ręcznikiem papierowym i umieść szkiełka poziomo. Odpipetować 50 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego na każde szkiełko. Przykryj ponownie szkiełkiem nakrywkowym, aby równomiernie rozprowadzić roztwór przeciwciała na szkiełku i inkubować w wilgotnej komorze przez 2 godziny.
7. Po usunięciu szkiełek nakrywkowych umyj je trzykrotnie w PBS przez 5 minut
8. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe w 5% BSA w następujących stężeniach: 1:500 owiec anty-mysich Cy3 i 1:400 kozich anty-szczurów Alexa Fluor 488.
9. Zastosować 50 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych zgodnie z opisem dla przeciwciał pierwszorzędowych. Chroń szkiełka przed światłem i inkubuj przez 1 godzinę.
10. Po usunięciu szkiełek nakrywkowych umyj szkiełka trzy razy w PBS przez 5 minut.
11. Na każde szkiełko nanieść kroplę podłoża montażowego Vectashield i nałożyć szkiełko nakrywkowe. Delikatnie dociśnij szkiełka nakrywkowe i usuń nadmiar płynu wokół nich ręcznikiem papierowym. Uszczelnij szkiełka nakrywkowe przezroczystym lakierem do paznokci i pozostaw do wyschnięcia. Przechowywać szkiełka w temperaturze -20 °C.

5. Akwizycja obrazu

Materiały: mikroskop fluorescencyjny, kamera

Umieść kroplę olejku immersyjnego na szkiełku w pobliżu znaku ołówka i zacznij lokalizować włókna. Zazwyczaj istnieje główna wiązka włókien, ale włókna te są zbyt splątane i nie można ich później przeanalizować. Odsuń się od głównej wiązki, aby znaleźć obszary, w których włókna są wyraźnie oddzielone od siebie (rys. 2). Wybieraliśmy zdjęcia tylko przy użyciu jednego kanału kolorów, aby uniknąć stronniczości. Następnie robiliśmy około 10 zdjęć każdego punktu czasowego, stężenia lub linii komórkowej. Jednak liczba obrazków zależy od tego, ile włókien można policzyć na każdym obrazku. Poruszaj się wzdłuż szkiełka, aby zrobić różne zdjęcia, ponieważ jeden obszar szkiełka może nie zapewniać reprezentatywnych długości włókien lub struktur replikacji.

6. Analiza danych

Materiały: Program do analizy obrazów, np. ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/)

Importuj zdjęcia do programu do analizy obrazów. Zmierz długości odcinków włókien i/lub policz różne struktury replikacji (rys. 3). Licz tylko te włókna, które są wyraźnie widoczne i nie wystają poza krawędź obrazu. Zazwyczaj mierzymy długość około 100 włókien i liczymy 150-200 struktur replikacyjnych i powtarzamy poszczególne eksperymenty co najmniej trzy razy.

7. Reprezentatywne wyniki:

Nowo zreplikowane DNA można wizualizować jako linie analogów nukleotydów znakowanych przeciwciałami. W naszych eksperymentach trwające rozwidlenie jest reprezentowane jako sąsiednie sygnały czerwone i zielone (ryc. 3). Protokół podwójnego etykietowania pozwala nam również zdefiniować cztery główne klasy struktur replikacji: 1) nowe zdarzenia inicjacji można podzielić na początki, które zostały uruchomione, gdy komórki były inkubowane z pierwszą etykietą, oraz początki, które zostały uruchomione podczas inkubacji z drugą etykietą. Pierwsza z nich składa się z sąsiadujących ze sobą sygnałów zielono-czerwono-zielonych, a druga tylko z zielonej linii. 2) Zdarzenia zakończenia manifestują się jako sąsiadujące sygnały czerwony-zielony-czerwony. 3) Pochodzenie przeplatane to miejsca w genomie o blisko rozmieszczonym pochodzeniu. Takie witryny składają się z następujących po sobie sygnałów początkowych i końcowych. 4) W zależności od projektu eksperymentalnego, zablokowane/zapadnięte widły mogą być zdefiniowane jako czerwony sygnał⁷ lub czerwona linia, po której następuje krótki zielony odcinek^8,9.

Korzystając z opisanych tutaj warunków, komórki DT40 typu dzikiego mają średnią prędkość rozwidlenia 0,4 μm/min. Możemy wykryć około 63% trwających widełek, 10% początków, 16% zablokowanych widelców (tylko czerwone odcinki), 8% zakończeń i 3% przeplatanych włókien.

Rysunek 1. (A) Lewa strona kreskówki przedstawia pierwszy etap procedury znakowania DNA: dodanie IdU do wykładniczo rosnących komórek DT40 powoduje, że analog nukleotydu jest łatwo włączony do nowo zsyntetyzowanych wiodących i opóźnionych nici DNA. Można to uwidocznić za pomocą specyficznego przeciwciała i pojawi się jako czerwona linia, gdy będzie oglądana pod mikroskopem. Następnie tę samą procedurę powtarza się z CldU, jak pokazano po prawej stronie rysunku. Po inkubacji z drugim analogiem nukleotydu, aktywny widelec będzie widoczny jako przylegający czerwono-zielony trakt. Średnia długość włókna jest proporcjonalna do czasu inkubacji analogów nukleotydów. (B) DNA z lizowanych komórek DT40 jest rozciągane grawitacyjnie na szkiełko mikroskopowe, a włączone analogi nukleotydów są wizualizowane za pomocą specyficznych przeciwciał i mikroskopii fluorescencyjnej.

Rysunek 2. Reprezentatywny obraz fluorescencyjny pokazuje włókna z komórek DT40 typu dzikiego, które są następnie znakowane IdU i CldU przez 20 minut każde. Większość włókien jest dobrze oddzielona od siebie, dzięki czemu można je łatwo analizować. Biały słupek reprezentuje 10 μm.

Rysunek 3. Technika podwójnego znakowania włókien pozwala na rozróżnienie różnych struktur replikacji; 1 - aktywnie replikujące się widelce, 2 - nowe miejsca replikacji DNA (wypalanie nowego pochodzenia), 3 - zakończenia widełek (dwa zbieżne widełki), 4 - przeplatane włókna (miejsca o blisko położonym pochodzeniu) i 5 - zatrzymane widełki (sygnał tylko czerwony).

Discussion

Opisujemy metodę, która pozwala na ilościową analizę parametrów wpływających na syntezę DNA podczas fazy S na poziomie pojedynczej cząsteczki. W ciągu ostatnich dziesięciu lat opracowano różne wersje techniki fluorografii włókien DNA w celu wizualizacji ruchu poszczególnych widełek replikacyjnych w żywych komórkach. Krytycznym parametrem we wszystkich tych technikach jest procedura stosowana w celu uzyskania najlepszego możliwego rozciągnięcia DNA na szklanych powierzchniach zapewniających dobrze oddzielone włókna DNA. Kluczowym krokiem do osiągnięcia tego celu jest czas inkubacji zawiesiny komórek na szkiełku mikroskopowym, a także czas lizy. Parametry te zależą od temperatury i przepływu powietrza w danym laboratorium i powinny być określone empirycznie. Praktyczna część eksperymentu z włóknami DNA jest zwykle realizowana w ciągu jednego dnia. Jednak późniejsze pozyskiwanie i analiza obrazu jest bardziej czasochłonne i wymaga praktyki.

Protokół etykietowania można dostosować do różnych problemów naukowych: użycie środka, który zakłóca replikację podczas drugiego impulsu, etykietowanie monitoruje wydłużenie/zatrzymanie wideł w odpowiedzi na stres replikacyjny. W tym scenariuszu pierwsza etykieta nie musi być wypłukiwana, ponieważ drugi nukleotyd jest dodawany w nadmiarze. Alternatywnie, leki utrudniające replikację mogą być stosowane w połączeniu lub tuż po dodaniu pierwszej etykiety. Wymaga to usunięcia pierwszej etykiety i leku przed zastosowaniem drugiego analogu nukleotydu. Procedura ta pozwala określić znaczenie różnych czynników naprawy DNA dla stabilności/odzyskiwania widełek replikacyjnych w warunkach stresu replikacyjnego (tj. zatrzymanie się widelca i/lub zapadnięcie się). Warto zauważyć, że bardziej szczegółowa analiza szczegółów programu replikacji DNA może być przeprowadzona przy użyciu alternatywnych podejść łączących czesanie DNA i fluorescencyjną hybrydyzację in situ. Jest to jednak trudniejsze technicznie i wymaga drogiego sprzętu.

Zdolność do jakościowej i ilościowej analizy szczegółów replikacji DNA stanowi niezbędne narzędzie do badania defektów w samej replikacji DNA, a także szlaków, które tłumią niestabilność genomu związaną z widełkami replikacyjnymi. Niewątpliwie test ten pomoże rzucić światło na mechanizmy naprawy DNA za pośrednictwem replikacji, które pozwalają normalnym komórkom reagować/przystosowywać się do zmian środowiskowych, a także w jaki sposób komórki rakowe wykorzystują te mechanizmy, aby oprzeć się toksyczności leków ukierunkowanych na widełki replikacyjne.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Złoto w surowicy płodowej bydła (FBS)	PAA Laboratories	A15-151
Surowica kurczaka	Sigma-Aldrich	C5405
Penicylina/Streptomycyna	PAA Laboratories	P11-010
RPMI 1640	GIBCO, firmy Life Technologies	21875
5-jodo-2'-deoksyurydyna (IdU)	Sigma-Aldrich	I7125
5-Chloro-2'-deoksy-urydyna (CldU)	Sigma-Aldrich	C6891
Szkiełka mikroskopowe SuperFrost	VWR international	631-0910
Szkiełka nakrywkowe No1	Scientific Laboratory Supplies LTD	MIC3234
Vectashield podłoże montażowe	H-1000 Vector lab	H-1000
Przeciwciało anty-BrdU (mysz)	BD Biosciences	347580
Przeciwciało anty-BrdU (szczur)	Abcam	ab6326
owca anty-mysie Cy3	Sigma-Aldrich	C2181
kozie przeciwciało anty-szczurze Alexa Fluor 488	Invitrogen	A110060