DT40, modelowy system genetyczny kręgowców, stanowi potężne narzędzie do analizy funkcji białek. Opisujemy tutaj prostą metodę umożliwiającą jakościową analizę parametrów wpływających na syntezę DNA podczas fazy S w komórkach DT40 na poziomie pojedynczych cząsteczek.
Artykuł metodologiczny
Wizualizacja replikacji DNA w kręgowym systemie modelowym DT40 z wykorzystaniem techniki włókien DNA
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Utrzymanie stabilności widełek replikacyjnych ma kluczowe znaczenie dla komórek dzielących się w celu zachowania żywotności i zapobiegania chorobom. Procesy te nie tylko zapewniają wierną duplikację genomu w obliczu endogennych i egzogennych uszkodzeń DNA, ale także zapobiegają niestabilności genomicznej, która jest uznanym czynnikiem sprawczym rozwoju nowotworów.
W niniejszej pracy opisujemy prostą i kosztowo efektywną metodę opartą na mikroskopii fluorescencyjnej do wizualizacji replikacji DNA w ptasiej linii komórkowej limfocytów B DT40. Linia ta stanowi potężne narzędzie do badania funkcji białek in vivo za pomocą genetyki odwrotnej w komórkach kręgowców1. Fluorografia włókien DNA w komórkach DT40 pozbawionych konkretnego genu pozwala na wyjaśnienie funkcji produktu tego genu w replikacji DNA i stabilności genomu. Tradycyjne metody analizy dynamiki widełek replikacyjnych w komórkach kręgowców opierają się na pomiarze ogólnego tempa syntezy DNA w populacji komórek poddanych znakowaniu impulsowemu. Jest to podejście ilościowe, które nie pozwala na jakościową analizę parametrów wpływających na syntezę DNA. W przeciwieństwie do tego, tempo przemieszczania się aktywnych widełek można śledzić bezpośrednio, stosując technikę włókien DNA2-4. W tym podejściu nowo syntetyzowane DNA jest znakowane in vivo poprzez wbudowanie nukleotydów halogenowanych (Rys 1A). Następnie pojedyncze włókna są rozciągane na szkiełku przedmiotowym, a znakowane odcinki replikacji DNA są barwione swoistymi przeciwciałami i wizualizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (Rys 1B). Inicjację replikacji, jak i kierunkowość widełek, określa się poprzez sekwencyjne zastosowanie dwóch różnie zmodyfikowanych analogów. Ponadto podejście z podwójnym znakowaniem umożliwia ilościową analizę parametrów wpływających na syntezę DNA podczas fazy S, tj. struktur replikacyjnych, takich jak widełki aktywne i zahamowane, gęstość miejsc inicjacji replikacji, a także terminacje widełek. Ostatecznie, procedurę eksperymentalną można przeprowadzić w ciągu jednego dnia, a wymaga ona jedynie ogólnego wyposażenia laboratoryjnego oraz mikroskopu fluorescencyjnego.
Protokół
Metoda opisana w niniejszym materiale została wykorzystana w następującej publikacji: Schwab et al., EMBO J., 29(4):806-185.
1. Hodowla komórek DT40
Materiały: płodowa surowica bydlęca (FBS), surowica z kurczaka, penicylina/streptomycyna, 2-merkaptoetanol, RPMI
- Przygotować pożywkę do hodowli komórkowej: do pożywki RPMI dodać 7% FBS, 3% surowicy z kurczaka, 1x penicylinę/streptomycynę oraz 10 μM 2-merkaptoetanolu.
- Komórki DT40 hodować w sterylnych kolbach do hodowli komórkowej w temperaturze 38 °C i 5% CO2 w inkubatorze z nawilżaczem. Przesiewać komórki codziennie do gęstości 5 x 105 komórek/ml6.
2. Markowanie in vivo
Materiały: IdU, CldU
- Przygotować roztwory zapasowe analogów nukleotydów: rozpuścić IdU do stężenia 5 mM i CldU do 2,5 mM w pożywce. Krótko podgrzać oba roztwory do 60 °C i mieszać w wortexie aż do całkowitego rozpuszczenia analogów nukleotydów.
- Dodać IdU do wykładniczo rosnących komórek DT40 do stężenia końcowego 25 μM i dobrze wymieszać zawiesinę komórkową. Inkubować komórki przez 20 minut w temperaturze 38 °C i 5% CO2.
- Po inkubacji z pierwszym znacznikiem dodać CldU do stężenia końcowego 250 μM i postąpić z komórkami zgodnie z opisem w poprzednim kroku.
- Przemyć komórki lodowatym PBS i resuspendować je w zimnym PBS do stężenia 7,5 x 105 komórek/ml. Przechowywać oznakowane komórki na lodzie.
Opisana procedura znakowania jest jedynie sugestią i może zostać zmodyfikowana w celu udzielenia odpowiedzi na konkretne pytania badawcze. Więcej informacji na temat planowania eksperymentu znajduje się w sekcji dyskusji.
3. Lizy komórek i rozprzestrzenianie DNA
Materiały: Przedmioty szkiełka, roztwór do lizy włókien
- Przygotować roztwór do lizy włókien: 50 mM EDTA i 0,5% SDS w 200 mM Tris-HCl, pH 7,5
- Nanieść 2 μl zawiesiny komórkowej na jeden koniec szkiełka przedmiotowego. Suszyć na powietrzu przez 5 minut lub do momentu znacznego zmniejszenia objętości kropli, tak aby nie wyschła całkowicie.
- Nanieść pipetą 7 μl roztworu do lizy na zawiesinę komórkową i delikatnie wymieszać końcówką pipety. Inkubować przez 2 minuty w celu przeprowadzenia lizy komórek.
- Przechylić szkiełka pod kątem 15°, aby umożliwić rozprzestrzenienie się włókien wzdłuż szkiełka.
- Gdy roztwór z włóknami dotrze do dolnej krawędzi szkiełka, ułożyć je poziomo do wyschnięcia na powietrzu. Po wyschnięciu wzdłuż szkiełka powinna być widoczna cienka, nieprzezroczysta linia. W tym momencie należy zaznaczyć ołówkiem początek rozciągniętych włókien, ponieważ po zabarwieniu linia ta nie będzie już widoczna. Zaznaczenie to pomoże później w zlokalizowaniu włókien pod mikroskopem.
4. Barwienie immunofluorescencyjne
Materiały: Metanol, kwas octowy, HCl, 5% BSA w PBS, słoik do barwienia, przeciwciało anty-BrdU (mysie), przeciwciało anty-BrdU (szczurze), owcze przeciwciało anty-mysie Cy3, kozie przeciwciało anty-szczurze Alexa Fluor 488, medium montażowe Vectashield, szkiełka nakrywkowe, lakier do paznokci
- Zanurzyć preparaty w mieszaninie metanolu i kwasu octowego (3:1) w naczyniu do barwienia i inkubować przez 10 minut.
- Przemyć preparaty w destylowanej H2O, a następnie zanurzyć w 2,5 M HCl na 80 minut.
- Przemyć preparaty trzykrotnie w PBS przez 5 minut.
- Wyjąć preparaty z naczynia do barwienia i zebrać nadmiar PBS za pomocą ręcznika papierowego. Położyć preparaty poziomo i nanieść pipetą 5% BSA na każdy z nich. Ostrożnie przykryć preparaty szkiełkiem nakrywkowym, aby równomiernie rozprowadzić BSA na całej powierzchni, i inkubować przez 20 minut.
- Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe w 5% BSA w następujących stężeniach: 1:25 przeciw-BrdU (mysie) oraz 1:40 przeciw-BrdU (szczurze).
- Ostrożnie przesunąć szkiełko nakrywkowe wzdłuż płytki szklanej, aby je usunąć. Nie używać siły, jeśli szkiełko przywarło do preparatu. Preparat można nawodnić w PBS, aż szkiełko nakrywkowe poluzuje się i będzie można je z łatwością zdjąć. Zebrać nadmiar BSA ręcznikiem papierowym i położyć preparaty poziomo. Nanieść pipetą 50 μl roztworu przeciwciał pierwszorzędowych na każdy preparat. Ponownie przykryć szkiełkiem nakrywkowym, aby równomiernie rozprowadzić roztwór przeciwciał na płytce, i inkubować w komorze wilgotnościowej przez 2 godziny.
- Po zdjęciu szkiełek nakrywkowych przemyć preparaty trzykrotnie w PBS przez 5 minut.
- Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe w 5% BSA w następujących stężeniach: 1:50 owcze przeciw-mysie Cy3 oraz 1:40 kozie przeciw-szczurze Alexa Fluor 48.
- Nanieść 50 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych zgodnie z procedurą opisaną dla przeciwciał pierwszorzędowych. Chronić preparaty przed światłem i inkubować przez 1 godzinę.
- Po zdjęciu szkiełek nakrywkowych przemyć preparaty trzykrotnie w PBS przez 5 minut.
- Nanieść kroplę medium montażowego Vectashield na każdy preparat i przyłożyć szkiełko nakrywkowe. Delikatnie docisnąć szkiełka i usunąć nadmiar płynu z wokół nich za pomocą ręcznika papierowego. Uszczelnić szkiełka bezbarwnym lakierem do paznokci i pozostawić do wyschnięcia. Przechowywać preparaty w temperaturze -20 °C.
5. Akwizycja obrazów
Materiały: mikroskop fluorescencyjny, kamera
Nanieś kroplę olejku imersyjnego na szkiełko w pobliżu znaku ołówkiem i zacznij lokalizować włókna. Zazwyczaj występuje główny pęczek włókien, jednak włókna te są zbyt splątane, co uniemożliwia ich późniejszą analizę. Przesuń się poza główny pęczek, aby znaleźć obszary, w których włókna są wyraźnie oddzielone od siebie (Ryc. 2). Wybieramy zdjęcia przy użyciu tylko jednego kanału kolorystycznego, aby uniknąć błędów systematycznych. Następnie wykonujemy około 10 zdjęć dla każdego punktu czasowego, stężenia lub linii komórkowej. Liczba zdjęć zależy jednak od tego, ile włókien można policzyć na każdym zdjęciu. Przesuwaj się wzdłuż szkiełka, aby wykonać różne zdjęcia, ponieważ jeden obszar szkiełka może nie zapewniać reprezentatywnych długości włókien lub struktur replikacyjnych.
6. Analiza danych
Materiały: Program do analizy obrazów, np. ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/)
Zaimportuj zdjęcia do programu do analizy obrazu. Zmierz długości pęczków włókien i/lub policz różne struktury replikacyjne (Ryc. 3). Należy liczyć tylko włókna, które są wyraźnie widoczne i nie wychodzą poza krawędź zdjęcia. Zazwyczaj mierzymy długość około 10 włókien i liczymy 150-20 struktur replikacyjnych, a poszczególne eksperymenty powtarzamy co najmniej trzy razy.
7. Reprezentatywne wyniki:
Nowo zreplikowany DNA można wizualizować jako linie analogów nukleotydowych znakowanych przeciwciałami. W naszych eksperymentach aktywny widelec replikacyjny jest reprezentowany przez sąsiadujące sygnały czerwone i zielone (Ryc. 3). Protokół podwójnego znakowania pozwala nam również zdefiniować cztery główne klasy struktur replikacyjnych: 1) nowe zdarzenia inicjacji można podzielić na miejsca inicjacji (origins), które zostały aktywowane podczas inkubacji komórek z pierwszym znacznikiem, oraz miejsca inicjacji aktywowane podczas inkubacji z drugim znacznikiem. Te pierwsze składają się z sąsiadujących sygnałów zielony-czerwony-zielony, a te drugie z linii wyłącznie zielonej. 2) zdarzenia terminacji manifestują się jako przylegające sygnały czerwony-zielony-czerwony. 3) rozproszone miejsca inicjacji (interspersed origins) to obszary w genomie z gęsto rozmieszczonymi punktami startu replikacji. Takie miejsca składają się z następujących po sobie sygnałów inicjacji i terminacji. 4) w zależności od projektu eksperymentalnego, zatrzymane lub zapadnięte widelce replikacyjne można zdefiniować albo jako sygnał wyłącznie czerwony7, albo jako linię czerwoną, po której następuje krótki odcinek zielony8,9.
Stosując warunki opisane w niniejszym opracowaniu, komórki DT40 typu dzikiego wykazują średnią prędkość widelca replikacyjnego wynoszącą 0,4 μm/min. Możemy wykryć około 63% aktywnych widelców, 10% miejsc inicjacji (originów), 16% zatrzymanych widelców (odcinki tylko czerwone), 8% terminacji oraz 3% przeplatających się włókien.
Rysunek 1. (A) Lewa strona schematu przedstawia pierwszy etap procedury znakowania DNA: dodanie IdU do komórek DT40 w fazie wzrostu wykładniczego powoduje łatwe wbudowanie analogu nukleotydowego w nowo syntetyzowane nici wiodącą i opóźnioną. Można to zwizualizować przy użyciu specyficznego przeciwciała, co pod mikroskopem objawi się jako czerwona linia. Następnie tę samą procedurę powtarza się z użyciem CldU, co pokazano po prawej stronie rysunku. Po inkubacji z drugim analogiem nukleotydowym aktywny widelec replikacyjny będzie widoczny jako przyległy odcinek czerwono-zielony. Średnia długość włókna jest proporcjonalna do czasu inkubacji z analogami nukleotydowymi. (B) DNA z lizowanych komórek DT40 zostaje rozciągnięte pod wpływem grawitacji na preparacie mikroskopowym, a wbudowane analogi nukleotydowe są wizualizowane za pomocą specyficznych przeciwciał i mikroskopii fluorescencyjnej.
Rysunek 2. Reprezentatywny obraz fluorescencyjny przedstawia włókna z komórek DT40 typu dzikiego, które następnie znakowano IdU i CldU przez 20 minut każde. Większość włókien jest wyraźnie oddzielona od siebie, co pozwala na ich łatwą analizę. Biały pasek oznacza 10 μm.
Rycina 3. Technika podwójnego znakowania włókien pozwala na rozróżnienie różnych struktur replikacyjnych: 1 – aktywnie replikujące się widelce, 2 – nowe miejsca replikacji DNA (aktywacja nowych początków), 3 – terminacje widelców (dwa zbiegające się widelce), 4 – przeplatane włókna (miejsca blisko położonych początków) oraz 5 – zatrzymane widelce (sygnał wyłącznie czerwony).
Dyskusja
Opisujemy metodę pozwalającą na ilościową analizę parametrów wpływających na syntezę DNA podczas fazy S na poziomie pojedynczej cząsteczki. W ciągu ostatnich dziesięciu lat opracowano różne wersje techniki fluorografii włókien DNA w celu wizualizacji ruchu pojedynczych widełek replikacyjnych w żywych komórkach. Krytycznym parametrem we wszystkich tych technikach jest procedura stosowana w celu uzyskania jak najlepszego rozciągnięcia DNA na powierzchniach szklanych, co zapewnia dobrze odseparowane włókna DNA. Kluczowym krokiem do osiągnięcia tego celu jest czas inkubacji zawiesiny komórkowej na szkiełku mikroskopowym, a także czas lizy. Parametry te zależą od temperatury i przepływu powietrza w konkretnym laboratorium i powinny zostać określone empirycznie. Część praktyczna eksperymentu z włóknami DNA jest zazwyczaj realizowana w ciągu jednego dnia. Jednak późniejsza akwizycja obrazów i ich analiza są bardziej czasochłonne i wymagają praktyki.
Protokół znakowania można dostosować do rozwiązania różnych problemów naukowych: zastosowanie czynnika zakłócającego replikację podczas drugiego etapu znakowania (pulsacyjnego) pozwala monitorować elongację lub zatrzymanie widełek w odpowiedzi na stres replikacyjny. W tym scenariuszu pierwsza etykieta nie musi być wypłukiwana, ponieważ drugi nukleotyd jest dodawany w nadmiarze. Alternatywnie, leki hamujące replikację można stosować w połączeniu lub bezpośrednio po dodaniu pierwszej etykiety. Wymaga to usunięcia pierwszej etykiety oraz leku przed zastosowaniem drugiego analogu nukleotydu. Procedura ta pozwala określić znaczenie różnych czynników naprawy DNA dla stabilności i regeneracji widełek replikacyjnych w warunkach stresu replikacyjnego (tzn. zatrzymania i/lub zapadnięcia się widełek). Warto zaznaczyć, że bardziej szczegółową analizę detali programu replikacji DNA można przeprowadzić przy użyciu alternatywnych podejść łączących rozciąganie DNA (DNA combing) i fluorescencyjną hybrydyzację in situ (FISH). Jest to jednak technicznie trudniejsze i wymaga kosztownego sprzętu.
Zdolność do jakościowej i ilościowej analizy szczegółów replikacji DNA stanowi niezbędne narzędzie do badania defektów samej replikacji DNA, a także szlaków hamujących niestabilność genomową związaną z widełkami replikacyjnymi. Bez wątpienia test ten pomoże w dalszym wyjaśnianiu mechanizmów naprawy DNA zapośredniczonej przez replikację, które pozwalają normalnym komórkom reagować i adaptować się do zmian środowiskowych, a także tego, w jaki sposób komórki nowotworowe wykorzystują te mechanizmy, aby oprzeć się toksyczności leków celujących w widełki replikacyjne.
Oświadczenia
Nie zgłoszono konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy dr T. Helleday oraz dr E. Petermann za pomoc w zastosowaniu techniki światłowodowej, a także członkom laboratorium za pomocne dyskusje. WN jest wspierany przez Senior International Research Fellowship z Association for International Cancer Research oraz grant z Komitetu Badań Naukowych (N301 165935).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Płodowa surowica bydlęca gold (FBS) | PAA Laboratories | A15-151 | |
| Surowica kurza | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| Penicylina/Streptomycyna | PAA Laboratories | P11-010 | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 21875 | |
| 5-jodo-2’-deoksyurydyna (IdU) | Sigma-Aldrich | I7125 | |
| 5-chloro-2’-deoksyurydyna (CldU) | Sigma-Aldrich | C6891 | |
| Lamelki do mikroskopu SuperFrost | VWR international | 631-0910 | |
| Kryszalki nr 1 | Scientific Laboratory Supplies LTD | MIC3234 | |
| Medium montażowe Vectashield | H-1000 Vector lab | H-1000 | |
| Przeciwciało anty-BrdU (mysie) | BD Biosciences | 347580 | |
| Przeciwciało anty-BrdU (szczurze) | Abcam | ab6326 | |
| owcze anty-mysie Cy3 | Sigma-Aldrich | C2181 | |
| kozie anty-szczurze przeciwciało Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A110060 |
Bibliografia
- Caldwell, R. B., Fiedler, P., Schoetz, U., Buerstedde, J. M. Gene function analysis using the chicken B-cell line DT40. Methods. Mol. Biol. 408, 193-210 (2007).
- Petes, T. D., Williamson, D. H. Fiber autoradiography of replicating yeast DNA. Exp. Cell. Res. 95, 103-110 (1975).
- Takeuchi, F. Altered frequency of initiation sites of DNA replication in Werner's syndrome cells. Hum. Genet. 60, 365-368 (1982).
- Jackson, D. A., Pombo, A. Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells. J. Cell. Biol. 140, 1285-1295 (1998).
- Schwab, R. A., Blackford, A. N., Niedzwiedz, W. ATR activation and replication fork restart are defective in FANCM-deficient cells. EMBO. J. 29, 806-818 (2010).
- Saribasak, H., Arakawa, H. Basic cell culture conditions. Subcell. Biochem. 40, 345-346 (2006).
- Conti, C., Seiler, J. A., Pommier, Y. The mammalian DNA replication elongation checkpoint: implication of Chk1 and relationship with origin firing as determined by single DNA molecule and single cell analyses. Cell. Cycle. 6, 2760-2767 (2007).
- Petermann, E., Orta, M. L., Issaeva, N., Schultz, N., Helleday, T. Hydroxyurea-stalled replication forks become progressively inactivated and require two different RAD51-mediated pathways for restart and repair. Mol. Cell. 37, 492-502 (2010).
- Edmunds, C. E., Simpson, L. J., Sale, J. E. PCNA ubiquitination and REV1 define temporally distinct mechanisms for controlling translesion synthesis in the avian cell line DT40. Mol. Cell. 30, 519-529 (2008).
Przedruki i uprawnienia
