Przedstawiono technikę chirurgiczną implantacji dostępnych komercyjnie nadajników telemetrycznych służących do ciągłego pomiaru biopotencjału (jednokanałowe EKG), częstotliwości akcji serca, wewnętrznej temperatury ciała oraz aktywności ruchowej u swobodnie poruszających się myszy. Zaprezentowano również zalecenia i protokoły dotyczące opieki pooperacyjnej i uśmierzania bólu w celu poprawy procesu rekonwalescencji, dobrostanu oraz przeżywalności zwierząt.
Artykuł metodologiczny
Implantacja nadajników radiotelemetrycznych umożliwiających pozyskiwanie danych dotyczących EKG, częstości akcji serca, wewnętrznej temperatury ciała i aktywności u swobodnie poruszających się myszy laboratoryjnych
W tym artykule
Informacja o sprostowaniu
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Podsumowanie
Streszczenie
Mysz laboratoryjna jest gatunkiem zwierzęcia najczęściej wybieranym w większości badań biomedycznych, zarówno w sferze akademickiej, jak i w przemyśle farmaceutycznym. Myszy mają odpowiednie rozmiary i są stosunkowo łatwe w utrzymaniu. Czynniki te, wraz z dostępnością licznych mutantów spontanicznych i indukowanych eksperymentalnie, sprawiają, że myszy laboratoryjne są idealnie przystosowane do szerokiej gamy obszarów badawczych.
W badaniach sercowo-naczyniowych, farmakologicznych i toksykologicznych często wymagany jest dokładny pomiar parametrów związanych z układem krążenia zwierząt laboratoryjnych. Wyznaczanie częstości akcji serca, zmienności rytmu serca oraz czasu trwania odstępów PQ i QT opiera się na zapisach elektrokardiograficznych (EKG). Jednak uzyskanie wiarygodnych krzywych EKG, a także danych fizjologicznych, takich jak wewnętrzna temperatura ciała myszy, może być trudne przy użyciu konwencjonalnych technik pomiarowych, które wymagają podłączenia czujników i przewodów do unieruchomionego, przypiętego lub nawet znieczulonego zwierzęcia. Dane uzyskane w ten sposób należy interpretować z ostrożnością, ponieważ wiadomo, że unieruchomienie i znieczulenie mogą wywierać znaczący wpływ artefaktowy na parametry fizjologiczne1, 2.
Radiotelemetria umożliwia gromadzenie danych z organizmów świadomych i nieutetherowanych. Pomiary mogą być prowadzone nawet u zwierząt poruszających się swobodnie, bez konieczności przebywania badacza w bezpośrednim sąsiedztwie zwierzęcia. Dzięki temu unika się znanych źródeł artefaktów, co zapewnia dokładne i wiarygodne pomiary. Metodologia ta zmniejsza również zmienność międzyosobniczą, co redukuje liczbę wykorzystywanych zwierząt, czyniąc tę technologię najbardziej humanitarną metodą monitorowania parametrów fizjologicznych u zwierząt laboratoryjnych3, 4. Stały postęp w technologii akwizycji danych oraz miniaturyzacja implantów sprawiają, że obecnie możliwe jest ciągłe i w czasie rzeczywistym rejestrowanie parametrów fizjologicznych oraz aktywności lokomotorycznej przez dłuższe okresy, takie jak godziny, dni, a nawet tygodnie3, 5.
W niniejszej pracy opisujemy technikę chirurgiczną implantacji dostępnego komercyjnie nadajnika telemetrycznego, służącego do ciągłych pomiarów temperatury głębokiej ciała, aktywności lokomocyjnej i biopotencjału (tj. jednokanalowego EKG), na podstawie którego można wyznaczyć częstotliwość akcji serca, zmienność rytmu serca oraz odstępy PQ i QT u myszy poruszających się swobodnie, bez przewodów. Przedstawiamy również procedury przedoperacyjne oraz protokoły intensywnej opieki pooperacyjnej i leczenia bólu, które poprawiają rekonwalescencję, dobrostan oraz przeżywalność u implantowanych myszy5, 6.
Protokół
Eksperyment na zwierzętach został zatwierdzony przez Kantonalny Urząd Weterynaryjny (Zurych, Szwajcaria). Warunki utrzymania oraz procedury eksperymentalne były zgodne ze szwajcarskim prawem ochrony zwierząt oraz z Dyrektywą Europejską w sprawie ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych (DYREKTYWA 2010/63/UE PARLAMENTU EUROPEJSKIEGO I RADY z dnia 2 września 2010 r.).
1. Uwagi przedoperacyjne
1.1 Myszy: wymagania dotyczące zakwaterowania, ogólny stan i monitorowanie zdrowia
Zaleca się, aby myszy dostarczone przez dostawców lub przeniesione z zewnętrznych kolonii gryzoni trafiły do pomieszczeń hodowlanych co najmniej dwa tygodnie przed operacją. Okres ten powinien pozwolić zwierzętom na adaptację do nowego środowiska oraz specyficznych dla danej placówki warunków utrzymania. Myszy, jako zwierzęta stadne, powinny być trzymane w kompatybilnych grupach podczas tego okresu adaptacji. W celu monitorowania indywidualnego poziomu spożycia pokarmu i wody, każda mysz jest utrzymywana pojedynczo od 3 dni przed operacją do 10 dni po chirurgicznej implantacji nadajnika. Harmonogram przygotowania myszy z wszczepionymi nadajnikami telemetrycznymi przedstawiono na Rysunku 1. Kluczowe jest, aby zwierzęta przystąpiły do zabiegu w dobrym stanie zdrowia i kondycji. Dlatego przed operacją zwierzęta powinny być monitorowane raz dziennie przez 2-3 dni pod kątem stanu ogólnego (wygląd, postawa, zachowanie spontaniczne) oraz masy ciała, spożycia pokarmu i wody. Dane te są dokumentowane w karcie medycznej (arkusz monitorowania stanu ogólnego i zdrowia, Tabela 1) w celu ustalenia indywidualnych wartości bazowych stanu ogólnego oraz ogólnego zdrowia i dobrostanu. Wszelkie zwierzęta wykazujące objawy choroby lub pogorszony stan ogólny przed operacją powinny zostać wykluczone z eksperymentu.
Po ostatniej kontroli stanu zdrowia lub bezpośrednio przed operacją, w celu ogolenia zwierząt do zabiegu, myszy są krótko znieczulane w małej (8x8x8cm) komorze z pleksiglasu przy użyciu sewofluranu (8%) lub izofluranu (5%) w czystym tlenie (60 mL/min). Ogolenie zwierząt na dzień przed operacją zapobiega pozostawaniu kikutów włosków w polu operacyjnym. Po utracie odruchu wyprostnego mysz jest wyjmowana z komory, a włosy z przedniej części szyi i brzucha są przystrzygane w pozycji grzbietowej; znieczulenie utrzymuje się przez około 5 minut za pomocą maski nosowej z sewofluranem 3-4% lub izofluranem 1,5-3% w czystym tlenie przy przepływie 600 mL/min. Po przystrzyżeniu włosów zwierzęta zostają pozostawione do wybudzenia, a następnie przeniesione z powrotem do klatek domowych.
2. Implantacja
2.1 Środowisko pracy, przygotowanie nadajnika telemetrycznego
W dniu implantacji wszystkie procedury dotyczące przygotowania nadajnika i operacji przeprowadza się na blacie roboczym z dygestorium o przepływie laminarnym, wyposażonym w mikroskop chirurgiczny. Warunki aseptyczne zapewniane są poprzez stosowanie autoklawowanych instrumentów i sterylnych materiałów oraz dezynfekcję blatu roboczego7. Przed implantacją w pierwszej kolejności przygotowuje się nadajniki telemetryczne (ETA-F10, Data Sciences International, St. Paul, MN, USA). Po wyjęciu z jałowego opakowania przewody nadajnika skraca się do długości odpowiedniej dla rozmiaru myszy, której będą implantowane. W większości dorosłych myszy wylęgowych lub inbredowych czerwoną elektrodę można skrócić do około 42 mm, a elektrodę białą/bezbarwną do długości około 5 mm. Rurki izolacyjne usuwa się z dystalnej (czuciowej) części przewodów: z czerwonej elektrody usuwa się około 20 mm rurki, a z białej/bezbarwnej elektrody około 10 mm rurki. Dystalną część każdej elektrody (pozbawioną teraz rurki) formuje się w pętlę, mocując koniec cienkimi szwami jedwabnymi (PERMA-Handseide, 6-0, Ethicon, Norderstedt, Germany). Po przygotowaniu elektrod nadajnik umieszcza się w ciepłej, sterylnej soli fizjologicznej, aby był gotowy do implantacji po znieczuleniu i chirurgicznym przygotowaniu zwierzęcia.
2.2 Znieczulenie
Na 5-10 minut przed indukcją znieczulenia wziewnego, w ramach premedykacji, podskórnie podaje się mieszankę midazolamu (4 mg/kg) i fentanylu (0,04 mg/kg), aby zapewnić sedację i analgezję wyprzedzającą. Ogólną znieczulenie wziewne indukuje się poprzez umieszczenie zwierzęcia w komorze indukcyjnej i wprowadzenie lotnego środka znieczulającego (sevofluran 8% lub isofluran 5% w czystym tlenie 600 ml/min). Gdy zwierzę wykaże utratę odruchu prostowania, przenosi się je na stół roboczy pod laminarną maską przepływową i układa w pozycji grzbietowej na specjalnie zaprojektowanej metalowej płycie wyposażonej w maskę nosową i przewody z aparatury do znieczulenia. Znieczulenie utrzymuje się poprzez oddychanie spontaniczne (sevofluran 3-4% lub isofluran 1,5-3% w czystym tlenie przy przepływie 60 mL/min). Podczas znieczulenia oczy zwierzęcia chroni się maścią (Vitamin A, Baush & Lomb, Steinhausen, Szwajcaria). Podczas leżenia na metalowej płycie zwierzę jest ogrzewane przez powierzchnię stołu roboczego podgrzewaną kąpielą wodną (39°C +/-1).
2.3 Zabieg chirurgiczny
Skórę przedniej części szyi i obszaru brzucha dezynfekuje się przez 5 minut 70% etanolem, chlorheksydyną lub jodem za pomocą nasączonego patyczka bawełnianego. Od dolnej części klatki piersiowej wzdłuż linii środkowej w stronę brzucha wykonuje się nacięcie skóry o długości od 1 do 1,5 cm. Przewód ujemny (biały/bezkolorowy) jest prowadzony podskórnie z klatki piersiowej do szyi, gdzie wykonuje się niewielkie nacięcie (≤0,5 cm) w kierunku podłużnym. Skórę i tkanki podskórne przygotowuje się tak, aby stworzyć miejsce do utrwalenia pętli drutu elektrody. Pętlę drutu mocuje się pomiędzy mięśniami położonymi po prawej stronie tchawicy, używając dwóch cienkich szwów jedwabnych (PERMA-Handseide, 6-0, Ethicon, Norderstedt, Niemcy). Ranę na szyi zamyka się następnie warstwowo szwami wchłanialnymi (VICRYL 6-0, Ethicon, Norderstedt, Niemcy). Następnie otwiera się ścianę brzucha na wysokości linea alba i umieszcza korpus nadajnika telemetrycznego w jamie brzusznej myszy. Pętlę drutu elektrody dodatniej (czerwonej) przyszywa się do wyrostka mieczowatego szwami jedwabnymi w taki sposób, aby znajdowała się ona pomiędzy wątrobą a przeponą w lewej górnej części jamy brzusznej (Rycina 2). Następnie warstwy mięśniowe obszaru brzucha zamyka się szwami wchłanialnymi (VICRYL 6-0, Ethicon, Norderstedt, Niemcy). Przed ostatecznym zamknięciem ściany brzucha do jamy brzusznej wstrzykuje się mieszaninę sulfadoksyny i trimetoprimu [odpowiednio 30 mg/kg i 6 mg/kg; rozpuszczoną w 1 mL soli fizjologicznej (0,9%) w temperaturze zbliżonej do temperatury ciała (38-39°C)] w celu profilaktyki przeciwinfekcyjnej i wsparcia homeostazy płynów. Na koniec skórę w obszarze brzucha zamyka się zszywkami (Precise, 3 M Health Care, St. Paul, MN, USA) lub wewnątrzskórnymi, ciągłymi szwami wchłanialnymi (VICRYL 6-0, Ethicon, Norderstedt, Niemcy).
3. Opieka pooperacyjna
Po zakończeniu operacji i znieczulenia, w celu uśmierzenia bólu, podskórnie podaje się 0,1 mg/kg buprenorfiny (Temgesic, Essex Chemie AG, Lucerne, Switzerland) oraz 5 mg/kg meloksykamu (Metacam, Boehringer Ingelheim, Basel, Switzerland), a zwierzęta pozostawia się na ciepłej (39°C +/-1) powierzchni stołu operacyjnego do wybudzenia przez około 2 h. Równolegle z leczeniem przeciwbólowym (dwa razy dziennie: buprenorfina 0,1 mg/kg i meloksykam 5 mg/kg), przez 4 dni dwa razy dziennie podskórnie wstrzykuje się terapię wspomagającą składającą się z 300 μL glukozy (5%) i 30 μL soli fizjologicznej (0,9%), ogrzanych do temperatury ciała. W celu dalszego wsparcia rekonwalescencji warto zapewnić zwierzętom dodatkową butelkę z wodą zawierającą 15% roztwór glukozy. Zaleca się, aby w okresie rekonwalescencji trwającym od 4 do 10 dni zwierzęta były utrzymywane w cieple. W naszym przypadku myszy są zatem przetrzymywane w inkubatorze grzewczym (30°C +/- 1). Monitorowanie stanu ogólnego i masy ciała, a także spożycia pokarmu i wody, jest przeprowadzane raz dziennie przez 10 dni po operacji zgodnie z arkuszem monitorowania stanu ogólnego i zdrowia (Tabela 1). Humanitarne punkty końcowe, tzn. uśmiercenie zwierzęcia w celu uniknięcia niepotrzebnych cierpień i bólu w przypadku niezadowalającego postępu rekonwalescencji, realizowane są w następujących warunkach:
- Jeśli zwierzę jest w złym stanie ogólnym, tj. wykazuje znaczną apatię (brak ruchu po dotknięciu/pchnięciu), a powierzchnia jego ciała pozostaje zimna mimo ogrzewania, należy je niezwłocznie poddać eutanazji.
- Jeśli w 4. dniu po implantacji nadajnika zwierzę wykazuje wyraźne objawy apatii, jest niezwykle agresywne lub nie przyjmuje pokarmu, należy je niezwłocznie poddać eutanazji.
- W 8. dniu po implantacji nadajnika u zwierzęcia musi wystąpić wyraźny przyrost masy ciała w porównaniu z poprzednimi dniami pooperacyjnymi. Ponadto zwierzę musi spożyć co najmniej 80% przedoperacyjnej dziennej dawki pokarmu. Jeśli którykolwiek z tych warunków nie zostanie spełniony, zwierzę należy niezwłocznie poddać eutanazji.
W 10. dniu po implantacji zwierzę zostaje przeniesione z powrotem do pomieszczenia dla zwierząt w standardowych warunkach utrzymania. W przypadku użycia zszywek chirurgicznych, należy je usunąć 7–10 dni po operacji; szwów wchłanialnych nie trzeba usuwać. Myszy powinny być utrzymywane w kompatybilnych grupach, aby umożliwić interakcje społeczne i zapobiec negatywnym skutkom długotrwałego indywidualnego utrzymania, które mogą mieć istotny wpływ na wyniki późniejszych eksperymentów8, 9. Przed przeprowadzeniem pierwszego eksperymentu i rozpoczęciem akwizycji danych myszy powinny przejść okres rekonwalescencji trwający co najmniej 4 tygodnie po implantacji transmitera.
4. Akwizycja danych
Gromadzenie danych rozpoczyna się poprzez dotknięcie zwierzęcia magnesem, co uruchamia nadajnik. Oprogramowanie Dataquest A.R.T. Software (Data Sciences International, St. Paul, MN, USA) koordynuje detekcję, zbieranie, analizę i prezentację graficzną (w formie przebiegów falowych) sygnałów pochodzących od jednego lub większej liczby zwierząt. Program Acquisition zbiera sygnały danych przesyłane do komputera z konwerterów i odbiorników za pośrednictwem macierzy wymiany danych Data Exchange Matrix (Data Sciences International). Program ten może zbierać dane przez określony czas w regularnych odstępach lub próbkować je w sposób ciągły i zapisywać na dysku twardym komputera. Ponieważ zasięg i jakość emitowanego sygnału silnie zależą od składu materiałowego klatki i otaczającego wyposażenia (np. metal vs plastik), zaleca się umieszczenie płyty odbiorczej jak najbliżej zwierzęcia, np. pod klatką zwierząt lub nad obszarem doświadczalnym, np. stołem laboratoryjnym lub bieżnią. Zaleca się sprawdzenie poprawności konfiguracji systemu rejestracji i transmisji danych poprzez przeprowadzenie krótkiego badania pomiarów w czasie rzeczywistym w trybie próbkowania ciągłego. Po zgromadzeniu i zapisaniu danych można je wykreślić, zestawić w listy i przeanalizować pod kątem różnych parametrów przy użyciu programu Analysis. Szczegółowe informacje na temat konfiguracji systemu rejestracji (np. definiowania trybu próbkowania) oraz oprogramowania analitycznego (np. dla parametrów zmienności rytmu serca, odstępu PQ i odstępu QT wyznaczanych z krzywych biopotencjału/EKG) znajdują się w instrukcjach producenta. Cenne wskazówki dotyczące planowania biometrycznego i metod statystycznych przydatnych w telemetrycznym pozyskiwaniu i interpretacji danych opublikowano w innym źródle3.
5. Reprezentatywne wyniki:
Ogólny schemat opisanego postępowania przedstawiono na Rysunku 1. Położenie wszczepionego nadajnika, w tym lokalizacja elektrod służących do pozyskiwania biopotencjałów z serca (EKG jednokanałowe), pokazano na Rysunku 2. Przykłady surowych danych z krótkoterminowych krzywych biopotencjałów (EKG jednokanałowe) oraz długoterminowe zapisy tętna, temperatury wewnętrznej ciała i aktywności lokomocyjnej poszczególnych myszy przedstawiono odpowiednio na Rysunku 3 i Rysunku 4. Rysunek 5 prezentuje przykład opublikowanych danych z pomiarów długoterminowych w grupach myszy po zakończeniu eksperymentu. Na podstawie krzywych biopotencjałów można ustalić kilka innych parametrów. Przykłady prezentacji parametrów zmienności rytmu serca5, odstępu QT i odstępu PQ10, 1 opublikowano w innym opracowaniu.
Tabela 1. Arkusz danych monitorowania stanu ogólnego i zdrowia. Kliknij tutaj, aby pobrać arkusz. Ten szablon ułatwia monitorowanie stanu ogólnego i zdrowia poszczególnych myszy. Przed operacją implantacji należy raz dziennie przez 3 dni przeprowadzić badanie bazowe wyglądu, postawy i spontanicznego zachowania zwierzęcia, a także określić masę ciała oraz spożycie pokarmu i wody. Porównanie pomiarów bazowych z wynikami uzyskiwanymi codziennie przez 10 dni po operacji służy do oceny przebiegu rekonwalescencji pooperacyjnej. Dodatkowo opieka pooperacyjna i leczenie przeciwbólowe są dokładnie dokumentowane w formie historii choroby. Podano instrukcje dotyczące humanitarnych punktów końcowych, aby ułatwić podejmowanie decyzji o tym, czy mysz powinna zostać uśpiona w celu zapobiegania niepotrzebnemu bólowi i cierpieniu, jeśli zwierzę nie spełnia kryteriów szybkiego powrotu do zdrowia po implantacji.
Rycina 1. Harmonogram przygotowania myszy z wszczepionymi nadajnikami telemetrycznymiChronologiczny przebieg procedur związanych z implantacją nadajnika, wskazujący punkty czasowe, w których mysz może zostać wykorzystana do eksperymentów i pozyskiwania danych.
Rycina 2. Radiografia/szkic przedstawiający lokalizację wszczepionego nadajnika telemetrycznego. Korpus nadajnika znajduje się w jamie brzusznej. Przewód dodatni uformowano w pętlę i przymocowano szwami do wyrostka miecza. Przewód ujemny poprowadzono podskórnie z klatki piersiowej do szyi i przymocowano w formie pętli między mięśniami bezpośrednio obok tchawicy. Radiografia została pobrana z poprzedniej publikacji autorów w czasopiśmie Laboratory Animals9.
Rycina 3. Krzywe biopotencjałów. Surowy wydruk krzywych EKG jednowodciowego z myszy świadomej oraz z tego samego zwierzęcia pod narkozą inhalacyjną sewofluranemCzęstość akcji serca jest obliczana automatycznie przez system telemetrii. Sekwencja 3-sekundowa zarejestrowana w znieczuleniu wskazuje na częstość akcji serca wynoszącą 40 uderzeń na minutę. Krzywa zarejestrowana u świadomej myszy wykazuje częstość akcji serca wynoszącą 60 uderzeń na minutę, co mieści się w oczekiwanym zakresie dla aktywności fizycznej o umiarkowanej intensywności, takiej jak pielęgnacja ciała czy jedzenie. Na podstawie krzywych biopotencjałów/EKG jednokanałowego, przy użyciu oprogramowania producenta, można wyznaczyć parametry zmienności rytmu serca, odstępy między uderzeniami oraz odstępy PQ i QT.
Rysunek 4. Surowe dane z pomiarów długoterminowych u myszy zdrowych i chorychCzęstośćtętna (bpm), wewnętrzna temperatura ciała (°C) oraz aktywność lokomotoryczna (liczba impulsów) są mierzone, podczas gdy myszy są utrzymywane indywidualnie w klatkach domowych, bez żadnych zakłóceń ze strony człowieka lub procedur eksperymentalnych. Częstość akcji serca jest rejestrowana przez 30 sekund co 5 minut (częstotliwość próbkowania 100 Hz). Temperatura głęboka ciała jest próbkowana przez 10 sekund co 5 minut. Aktywność lokomotoryczna jest rejestrowana w sposób ciągły i zapisywana w interwałach 5-minutowych. Pięciominutowe punkty danych są śledzone przez 6,5 dnia. Pomiary telemetryczne są rejestrowane u trzech myszy o różnym stanie zdrowotnym. Zdrowa mysz wykazuje wyraźny rytm okołodobowy z normalnymi wzrostami wartości fizjologicznych i aktywności lokomotorycznej podczas ciemnej (nocnej) fazy. W przeciwieństwie do tego, po rozległej operacji częstość akcji serca jest zwiększona, szczególnie w fazie dziennej, a aktywność lokomotoryczna jest obniżona. Trzecia mysz cierpiała na przewlekłą chorobę nowotworową – jej rytm okołodobowy częstości akcji serca i temperatury głębokiej ciała wydaje się spłaszczony, a aktywność lokomotoryczna jest zmniejszona. Reprezentatywne dane z pomiarów częstości akcji serca (wartości prawidłowe oraz po rozległej operacji) pochodzą z poprzedniej publikacji autorów w Altex12.
Rysunek 5. Przykład prezentacji wyników długoterminowych pomiarów telemetrycznych po zakończeniu eksperymentu. Rysunek pochodzi z poprzedniej publikacji autorów w czasopiśmie Laboratory Animals1W ramach eksperymentu modelowego przeprowadzono 50-minutową anestezję izofluranem lub sewofluranem. Porównano długofalowy wpływ środków anestetycznych na częstość akcji serca, temperaturę wewnętrzną ciała oraz aktywność lokomotoryczną zwierząt po wybudzeniu. Wykorzystując 16 myszy z implantowanymi nadajnikami, zarejestrowano dane telemetryczne u ośmiu myszy na każdy środek anestetyczny, podczas gdy zwierzęta przebywały w pojedynczych klatkach i mogły swobodnie poruszać się w swoim środowisku. W analizie długofalowych efektów poanestezyjnych uwzględniono fakt, że wartości te znacznie różnią się w ciągu cyklu 24-godzinnego, ponieważ myszy są aktywne głównie w nocy. Dlatego średnie wartości telemetryczne dla każdego zwierzęcia obliczano oddzielnie dla fazy nocnej (12 h ciemności) i dziennej (12 h światła). Normalne wartości dla każdego osobnika ustalono, obliczając średnie z trzech dni poprzedzających anestezyjne. Dla każdego dnia po anestezyjnej średnią z fazy ciemnej i jasnej porównano z normalnymi wartościami osobnika, co pozwoliło uzyskać wartości delta. Zatem wartości delta reprezentują odchylenie od wartości normalnych (ustalonych przed anestezyjną) w odpowiadającym 12-godzinnym przedziale czasu dziennego i nocnego. Słupki reprezentują średnią z ośmiu myszy; wąsy wskazują odchylenie standardowe. Gwiazdki oznaczają istotność przy P ≤0,05 (jednoczynnikowa analiza wariancji w celu porównania średnich grupowych w każdym z czterech dni po anestezyjnej z wartościami normalnymi).
Dyskusja
Radiotelemetria stanowi potężną alternatywę dla konwencjonalnych metod pomiaru parametrów fizjologicznych w badaniach biomedycznych. Wysokiej jakości systemy telemetryczne, składające się z implantowalnych nadajników, odbiorników oraz sprzętu i oprogramowania do akwizycji i analizy danych, są obecnie dostępne komercyjnie, nawet dla tak małych zwierząt jak myszy. Telemetria jest obecnie jedyną dostępną techniką umożliwiającą gromadzenie danych z nieuwięzionych, swobodnie poruszających się myszy. Dzięki zastosowaniu tej metody możliwe jest ciągłe zbieranie danych i/lub gromadzenie ich przez dłuższe okresy od zwierząt przebywających w ich naturalnym środowisku, co minimalizuje stres zwierząt i wynikające z niego artefakty eksperymentalne. Kształt i położenie elektrod zostały zoptymalizowane w celu uzyskania sygnałów nawet podczas gwałtownych ruchów (np. szarpania się, biegania, walki) lub w pozycji wyprostowanej9. W związku z tym możliwe jest uzyskanie dokładnych pomiarów podczas eksperymentów, np. w trakcie znieczulenia, indukcji stresu, biegu na bieżni, eksperymentów behawioralnych, badań nad infekcjami oraz w wielu innych sytuacjach doświadczalnych.
Jednakże, w celu uzyskania wiarygodnych, powtarzalnych i wolnych od artefaktów danych, kluczowe jest wykluczenie wpływów środowiskowych; zwracamy szczególną uwagę na znaczenie standaryzacji warunków. Zaleca się, aby pomieszczenie było odizolowane od szumów elektronicznych i akustycznych, w tym dźwięków ultradźwiękowych, na które myszy są szczególnie wrażliwe. Ponadto podczas przeprowadzania pomiarów nie powinno być dopuszczonych żadnych zakłóceń, takich jak wizyty osób trzecich czy niezwiązane z badaniem procedury eksperymentalne. Aby uniknąć wpływów zakłócających (szczególnie w przypadku pomiarów w klatkach domowych), wszystkie niezbędne zabiegi pielęgnacyjne powinny zostać wykonane w pomieszczeniu przed rozpoczęciem każdego pomiaru. Ponadto kwaterowanie myszy – szczególnie w przypadku użycia samców – w grupach lub indywidualnie może mieć wpływ na wyniki pomiarów i musi być uwzględnione podczas planowania eksperymentów9. Myszy muszą być również zdrowe i wolne od patogenów mysich, ponieważ infekcje utajone lub jawne, a także choroby lub jakiekolwiek inne upośledzenia stanu zdrowia, mogą mieć znaczący wpływ na parametry fizjologiczne i behawior aktywności. W związku z tym myszy powinny w pełni dojść do siebie po implantacji i otrzymać wystarczająco dużo czasu na adaptację do obecności transmitera przed rozpoczęciem jakichkolwiek eksperymentów.
Gromadzenie danych za pomocą radiotelemetrii u myszy wymaga wstępnego chirurgicznego wszczepienia nadajnika telemetrycznego. Zabieg ten powinien być wykonywany wyłącznie przez przeszkolony personel z umiejętnościami chirurgicznymi, aby zminimalizować urazy tkanek oraz wynikający z nich ból i stres. Badaczom posiadającym podstawowe lub nawet zaawansowane umiejętności chirurgiczne (mikrochirurgiczne) zaleca się przeprowadzenie pierwszych prób na świeżych zwłokach myszy przy użyciu implantów treningowych (tj. makiet dostarczonych przez producenta), aby opracować procedury i zapoznać się ze specyfiką tego rodzaju operacji. Po takim przeszkoleniu większość badaczy będzie w stanie z sukcesem wszczepić tego typu nadajniki i osiągnie odpowiednią biegłość po kilku implantacjach.
Podczas operacji należy zachować warunki aseptyczne, aby zminimalizować obciążenie mikrobiologiczne i ryzyko infekcji. Występują jednak wątpliwości co do zachowania aseptyki ze względu na specyficzne warunki u myszy, które mogą naruszać sterylność (np. efekt wychłodzenia przy rozległym wygoleniu sierści i dezynfekcji, niepraktyczność stosowania opatrunków chroniących rany). Podczas implantacji należy zastosować profilaktykę przeciwinfekcyjną. Kluczową rolę w uzyskaniu satysfakcjonującego wyniku eksperymentu odgrywa odpowiednio dopasowane leczenie przeciwbólowe, jasno określony plan monitorowania oraz właściwa opieka pooperacyjna.
Ogólnie rzecz biorąc, chirurgiczna implantacja nadajnika telemetrycznego u myszy jest dla zwierzęcia stresująca. W szczególności, jeśli modyfikacja genetyczna w konkretnych liniach myszy wpływa na fenotyp i pogarsza stan ogólny zwierząt, ryzykiem mogą być powikłania w okresie okołoperacyjnym oraz zwiększona śmiertelność po implantacji. Aby uniknąć niepotrzebnego cierpienia, osobniki wykazujące niezadowalającą rekonwalescencję lub przedłużony okres rekonwalescencji powinny zostać wycofane z eksperymentu i uśpione przed osiągnięciem stanu agonalnego. W tym celu opracowano arkusz danych (Tabela 1: arkusz danych monitorowania stanu ogólnego i zdrowia), ułatwiający systematyczne monitorowanie krytycznych objawów i dostarczający wytycznych dotyczących humanitarnych punktów końcowych. W ten sposób proces rekonwalescencji jest dokumentowany w formie dokumentacji medycznej lub dziennika laboratoryjnego, co czyni przeprowadzenie tej metodologii (tj. procedury implantacji i rekonwalescencji pooperacyjnej) przejrzystym dla odpowiednich organów i jednostek ds. dobrostanu zwierząt odpowiedzialnych za eksperymenty na zwierzętach (np. IACUC).
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować firmie Charles River Germany za dostarczenie myszy CD-1. Dziękujemy również Robin Schneider oraz pracownikom centralnego laboratorium biologicznego za pomoc w utrzymaniu myszy. Serdecznie dziękujemy Florze Nicholls za doskonałe wsparcie techniczne oraz profesorowi Kurtowi Burkiemu za udostępnienie zaplecza badawczego i zasobów.
Bibliografia
- Cesarovic, N. Isoflurane and sevoflurane provide equally effective anesthesia in laboratory mice. Lab. Anim. 44, 329-336 (2010).
- Gross, V., Luft, F. C. Exercising restraint in measuring blood pressure in conscious mice. Hypertension. 41, 879-881 (2003).
- Kramer, K., Kinter, L. B. Evaluation and applications of radiotelemetry in small laboratory animals. Physiol. Genomics. 13, 197-205 (2003).
- Kramer, K. Use of telemetry to record electrocardiogram and heart rate in freely moving mice. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 30, 209-215 (1993).
- Arras, M., Rettich, A., Cinelli, P., Kasermann, H. P., Burki, K. Assessment of post-laparotomy pain in laboratory mice by telemetric recording of heart rate and heart rate variability. BMC. Vet. Res. 3, 16-16 (2007).
- Schuler, B., Rettich, A., Vogel, J., Gassmann,, Arras, M. Optimized surgical techniques and postoperative care improve survival rates and permit accurate telemetric recording in exercising mice. BMC. Vet. Res. 5, 28-28 (2009).
- Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon. J. Vis. Exp. (47), e2586-e2586 (2011).
- Rettich, A., Kasermann, H. P., Pelczar, P., Burki, K., Arras, M. The physiological and behavioral impact of sensory contact among unfamiliar adult mice in the laboratory. J. Appl. Anim. Welf. Sci. 9, 277-288 (2006).
- Spani, D., Arras, M., Konig, B., Rulicke, T. Higher heart rate of laboratory mice housed individually vs in pairs. Lab. Anim. 37, 54-62 (2003).
- Zeller, A., Arras, M., Jurd, R., Rudolph, U. Mapping the contribution of beta3-containing GABAA receptors to volatile and intravenous general anesthetic actions. BMC. Pharmacol. 7, 2-2 (2007).
- Zeller, A., Arras, M., Jurd, R., Rudolph, U. Identification of a molecular target mediating the general anesthetic actions of pentobarbital. Mol. Pharmacol. 71, 852-859 (2007).
- Arras, M. Improvement of pain therapy in laboratory mice. Altex. 24, 6-8 (2007).
Przedruki i uprawnienia
Sprostowanie
Formal Correction: Erratum: Implantation of Radiotelemetry Transmitters Yielding Data on ECG, Heart Rate, Core Body Temperature and Activity in Free-moving Laboratory Mice
Posted by JoVE Editors on 10/09/2016. Citeable Link.
Corrections in the Protocol and Discussion sections have been made to: Implantation of Radiotelemetry Transmitters Yielding Data on ECG, Heart Rate, Core Body Temperature and Activity in Free-moving Laboratory Mice
Step 1.2 in the Protocol has been updated from:
1.2 Hair clipping at one day prior to surgery
The day prior to implantation, in order to shave the animals for surgery, mice are anesthetized briefly in a small (8x8x8cm) Perspex chamber using sevoflurane (8%) or isoflurane (5%) in pure oxygen (600 mL/min). After loss of the righting reflex, the mouse is taken out of the chamber and the anterior neck and abdominal hair is clipped with the animal lying in dorsal recumbence; anesthesia is maintained for approximately 5 minutes with a nose mask with sevoflurane 3-4% or isoflurane 1.5-3% in pure oxygen at a flow rate of 600 mL/min. After clipping the hair, the animals are allowed to awaken and are then brought back to their home cage.
to:
After the last health check or directly prior surgery, in order to shave the animals for surgery, mice are anesthetized briefly in a small (8x8x8cm) Perspex chamber using sevoflurane (8%) or isoflurane (5%) in pure oxygen (600 mL/min). Shaving the animals one day before surgery prevents hair stubbles in the operating field. After loss of the righting reflex, the mouse is taken out of the chamber and the anterior neck and abdominal hair is clipped with the animal lying in dorsal recumbence; anesthesia is maintained for approximately 5 minutes with a nose mask with sevoflurane 3-4% or isoflurane 1.5-3% in pure oxygen at a flow rate of 600 mL/min. After clipping the hair, the animals are allowed to awaken and are then brought back to their home cage.
Step 2.3 in the Protocol has been updated from:
2.3 Surgery
The skin of the anterior neck and abdominal region is disinfected with 70% ethanol. A 1- to 1.5-cm-long incision in the skin is made from the lower thorax along the midline to the abdomen. The negative (white/colourless) lead is tunnelled subcutaneously from the thorax to the neck, where a small incision (≤0.5 cm) is made in the longitudinal direction. The skin and underlying tissues are prepared to make space for the fixation of the wire loop of the electrode. The wire loop is fixed between the muscles located to the right of the trachea, using two thin silk sutures (PERMA-Handseide, 6-0, Ethicon, Norderstedt, Germany). The wound in the neck is then closed with absorbable sutures (VICRYL 6-0, Ethicon, Norderstedt, Germany) in layers. The abdominal wall is then opened at the linea alba and the body of the telemetric transmitter is placed into the abdominal cavity of the mouse. The wire loop of the positive (red) electrode is sutured to the xiphoid process with silk sutures in such a way that it lies between the liver and the diaphragm in the left upper abdominal region (Figure 2). Then, the muscle layers of the abdominal region are closed with absorbable sutures (VICRYL 6-0, Ethicon, Norderstedt, Germany). Before finally closing the abdominal wall, a mixture of Sulfadoxin and Trimethoprim [(30 mg/kg and 6 mg/kg, respectively; dissolved in 1 mL of saline (0.9%) and at approximately body temperature (38-39°C)] is injected into the abdominal cavity for the purposes of anti-infective prophylaxis and to support fluid homeostasis. Finally, the skin of the abdominal region is restored with staples (Precise, 3 M Health Care, St. Paul, MN, USA).
to:
2.3 Surgery
The skin of the anterior neck and abdominal region is disinfected for 5 minutes with 70% ethanol, chlorhexidine or iodine using a soaked cotton swab. A 1- to 1.5-cm-long incision in the skin is made from the lower thorax along the midline to the abdomen. The negative (white/colourless) lead is tunnelled subcutaneously from the thorax to the neck, where a small incision (≤0.5 cm) is made in the longitudinal direction. The skin and underlying tissues are prepared to make space for the fixation of the wire loop of the electrode. The wire loop is fixed between the muscles located to the right of the trachea, using two thin silk sutures (PERMA-Handseide, 6-0, Ethicon, Norderstedt, Germany). The wound in the neck is then closed with absorbable sutures (VICRYL 6-0, Ethicon, Norderstedt, Germany) in layers. The abdominal wall is then opened at the linea alba and the body of the telemetric transmitter is placed into the abdominal cavity of the mouse. The wire loop of the positive (red) electrode is sutured to the xiphoid process with silk sutures in such a way that it lies between the liver and the diaphragm in the left upper abdominal region (Figure 2). Then, the muscle layers of the abdominal region are closed with absorbable sutures (VICRYL 6-0, Ethicon, Norderstedt, Germany). Before finally closing the abdominal wall, a mixture of Sulfadoxin and Trimethoprim [(30 mg/kg and 6 mg/kg, respectively; dissolved in 1 mL of saline (0.9%) and at approximately body temperature (38-39°C)] is injected into the abdominal cavity for the purposes of anti-infective prophylaxis and to support fluid homeostasis. Finally, the skin of the abdominal region is restored with staples (Precise, 3 M Health Care, St. Paul, MN, USA) or intracutaneous, running, absorbable sutures (VICRYL 6-0, Ethicon, Norderstedt, Germany).
Step 3 in the Protocol has been updated from:
3. Post-operative care
After completion of surgery and anesthesia, 0.1 mg/kg of buprenorphine (Temgesic, Essex Chemie AG, Lucerne, Switzerland) and 5 mg/kg of meloxicam (Metacam, Boehringer Ingelheim, Basel, Switzerland) is administered subcutaneously for pain treatment, and the animals are left on the warm (39°C +/-1) surface of the work bench to recover for approximately 2h. Together with pain relief (twice daily: buprenorphine, 0.1 mg/kg and meloxicam 5 mg/kg), supportive therapy consisting of 300 μL glucose (5%) and 300 μL saline (0.9%) warmed to body temperature, is applied subcutaneously twice daily for 4 days. For further recovery support, it is worthwhile providing the animals with an additional drinking bottle containing 15% glucose solution During the recovery period of 4-10 days, it is recommended that the animals are kept warm. Therefore, in our case, the mice are housed in a warming cabinet (30°C +/- 1). Monitoring of general condition and body weight, as well as food and water consumption, is performed once daily according to the general condition and health monitoring data sheet (Table 1) for 10 days post-operatively. Humane endpoints, i.e. the sacrifice of an animal to avoid unnecessary suffering and pain if progression of recovery is unsatisfactory, are realised under the following conditions:
i. If in poor general condition, i.e. the animal is substantially apathetic (no movement after being touched/pushed) and its body surface feels cold despite warming, the animal should be euthanatized immediately
ii. If, on day 4 after transmitter implantation, the animal shows clear signs of apathy, is extremely aggressive or does not show any food intake, it should be euthanatized immediately.
iii. On day 8 after transmitter implantation, the animal has to display a clear increase in body weight in comparison to the preceding post-operative days. Moreover, it has to consume at least 80% of the pre-operative daily food intake. If one of these conditions is not met, the animal should be euthanatized immediately.
At 10 days after implantation, the animal is transferred back to the animal room under standard housing conditions. Mice should be housed in compatible groups to allow social interaction and to prevent the adverse effects of long-term individual housing, which can have substantial impacts on the read-out of subsequent experiments8, 9. Mice should have a period of at least 4 weeks convalescence after transmitter implantation before the first experiment is conducted and data acquisition begins.
to:
After completion of surgery and anesthesia, 0.1 mg/kg of buprenorphine (Temgesic, Essex Chemie AG, Lucerne, Switzerland) and 5 mg/kg of meloxicam (Metacam, Boehringer Ingelheim, Basel, Switzerland) is administered subcutaneously for pain treatment, and the animals are left on the warm (39°C +/-1) surface of the work bench to recover for approximately 2h. Together with pain relief (twice daily: buprenorphine, 0.1 mg/kg and meloxicam 5 mg/kg), supportive therapy consisting of 300 μL glucose (5%) and 300 μL saline (0.9%) warmed to body temperature, is injected subcutaneously twice daily for 4 days. For further recovery support, it is worthwhile providing the animals with an additional drinking bottle containing 15% glucose solution During the recovery period of 4-10 days, it is recommended that the animals are kept warm. Therefore, in our case, the mice are housed in a warming cabinet (30°C +/- 1). Monitoring of general condition and body weight, as well as food and water consumption, is performed once daily according to the general condition and health monitoring data sheet (Table 1) for 10 days post-operatively. Humane endpoints, i.e. the sacrifice of an animal to avoid unnecessary suffering and pain if progression of recovery is unsatisfactory, are realised under the following conditions:
i. If in poor general condition, i.e. the animal is substantially apathetic (no movement after being touched/pushed) and its body surface feels cold despite warming, the animal should be euthanatized immediately
ii. If, on day 4 after transmitter implantation, the animal shows clear signs of apathy, is extremely aggressive or does not show any food intake, it should be euthanatized immediately.
iii. On day 8 after transmitter implantation, the animal has to display a clear increase in body weight in comparison to the preceding post-operative days. Moreover, it has to consume at least 80% of the pre-operative daily food intake. If one of these conditions is not met, the animal should be euthanatized immediately.
At 10 days after implantation, the animal is transferred back to the animal room under standard housing conditions. In case staples have been used, these should be removed 7-10 days after surgery; absorbable sutures have not to be removed. Mice should be housed in compatible groups to allow social interaction and to prevent the adverse effects of long-term individual housing, which can have substantial impacts on the read-out of subsequent experiments8, 9. Mice should have a period of at least 4 weeks convalescence after transmitter implantation before the first experiment is conducted and data acquisition begins.
The 4th paragraph in the Discussion has been updated from:
Aseptic conditions should be maintained during surgery to keep the microbiological burden and the risk of infections low. However, complete sterility cannot be provided because of some specific, sterility conflicting conditions in mice (e.g., cooling effect of extensive hair clipping and disinfection, impracticality of bandages to protect the wounds). Thus, anti-infective prophylaxis is administered during the implantation. Well tailored analgesic treatment and a clearly defined monitoring plan as well as adequate post-operative care play a crucial role in the satisfactory outcome of the experiment.
to:
Aseptic conditions should be maintained during surgery to keep the microbiological burden and the risk of infections low. However, if there are doubts that asepsis was breached because of some specific, sterility conflicting conditions in mice (e.g., cooling effect of extensive hair clipping and disinfection, impracticality of bandages to protect the wounds). Anti-infective prophylaxis should be administered during the implantation. Well-tailored analgesic treatment and a clearly defined monitoring plan as well as adequate post-operative care play a crucial role in the satisfactory outcome of the experiment.
Tagi
Implantacja nadajnika radiotelemetrycznegomonitorowanie cz stotliwo ci akcji serca EKGpomiar wewn trznej temperatury cia aledzenie aktywno ci lokomotorycznejchirurgiczna procedura u myszyprotok opieki pooperacyjnejtelemetryczna akwizycja danychmodel wolno poruszaj cej si myszyrejestracja parametr w fizjologicznychtechnika bada biomedycznych
