Test aktywacji bazofilów jest potężnym narzędziem do wykrywania alergii zależnych od IgE in vitro. W niniejszej pracy zoptymalizowany protokół testu aktywacji bazofilów został wykorzystany do badania nadwrażliwości na leki. Opisano metodę wydajnej produkcji kowalencyjnych koniugatów lek-białko oraz ich charakterystykę fizykochemiczną.
Artykuł metodologiczny
Test aktywacji bazofili w badaniu mechanizmów zależnych od IgE w nadwrażliwości na leki
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Reakcje nadwrażliwości na niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ), takie jak propifenazon (PP) i diklofenak (DF), mogą przejawiać się jako reakcje alergiczne typu I 1. W praktyce klinicznej diagnostyka nadwrażliwości na leki opiera się głównie na wywiadzie pacjenta, ponieważ testy skórne są niewiarygodne, a doustne próby prowokacyjne niosą ze sobą ryzyko zagrożenia życia pacjenta 2. W konsekwencji trudno jest uzyskać dowody na istnienie leżącego u podłoża patomechanizmu zależnego od IgE.
W niniejszej pracy przedstawiamy metodę in vitro opartą na wykorzystaniu ludzkich bazofili pochodzących od pacjentów z nadwrażliwością na leki, która naśladuje alergiczną reakcję efektorową in vivo. Ponieważ bazofile pacjentów z alergią na leki przenoszą cząsteczki IgE specyficzne dla leku wywołującego reakcję, ulegają one aktywacji w wyniku sieciowania receptorów IgE i uwalniają alergiczne cząsteczki efektorowe. Aktywację bazofili można monitorować poprzez oznaczenie zwiększonej ekspresji powierzchniowej CD63 przy użyciu cytometrii przepływowej 3.
W przypadku leków o niskiej masie cząsteczkowej koniugaty projektuje się w taki sposób, aby umożliwić sieciowanie receptorów IgE na bazofilach. Jak przedstawiono na Rysunku 1, dwa reprezentatywne NLPZ, PP i DF, są kowalencyjnie związane z ludzką albuminą surowiczą (HSA) poprzez grupę karboksylową reagującą z pierwszorzędową grupą aminową reszt lizyny. DF posiada wbudowaną grupę karboksylową i tym samym może być stosowany bezpośrednio 4, natomiast pochodna PP zawierająca grupę karboksylową musiała zostać zsyntetyzowana organochemicznie przed rozpoczęciem badania 1.
Stopień sprzęgania związków o niskiej masie cząsteczkowej z cząsteczką nośnika białkowego oraz ich rozkład przestrzenny są istotne dla zapewnienia sieciowania dwóch cząsteczek receptora IgE. Opisany tutaj protokół wykorzystuje wysokosprawną chromatografię wykluczania (HPSEC) wyposażoną w sekwencyjny system detekcji współczynnika załamania światła (RI) i ultrafioletu (UV) w celu określenia stopnia sprzęgania.
Ponieważ opisana metodologia może być zastosowana w przypadku innych leków, test aktywacji bazofilów (BAT) wykazuje potencjał do wykorzystania w określaniu mechanizmów zależnych od IgE w nadwrażliwości na leki. W niniejszym badaniu, za pomocą BAT, określamy nadwrażliwość na PP jako zależną od IgE, a nadwrażliwość na DF jako niezależną od IgE.
Protokół
1. Przygotowanie koniugatów leków
- Rozpuścić 10 mg DF w 1 ml dH2O w probówce reakcyjnej o pojemności 1,5 ml. W dalszej części procedury użyć 95 μl tego roztworu DF. Aby sprzęgnąć PP z HSA, rozpuścić 30,4 mg pochodnej PP (304 g/mol) w 500 μl 0,3 M wodorotlenku sodu (NaOH).
- Do 95 μl rozpuszczonego DF dodać 430,6 μl dH2O oraz 100 μl 0,5 M buforu z kwasem 2-(N-morfolino)etanosulfonowym (MES) o pH 6,5. Do próbki PP dodać 33,1 μl dH2O oraz 140 μl 2 M buforu MES o pH 2,9.
- Do próbki DF dodać 57,5 μl świeżo przygotowanego roztworu stokowego chlorku N-etylo-N'-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimidu (EDC) rozpuszczonego w dH2O o stężeniu 100 mg/ml, lub 10 μl roztworu EDC do próbki PP. Próbki mieszać na wortexie przez 1 minutę.
- Do każdej próbki dodać 16,9 μl roztworu HSA o stężeniu 118 mg/ml.
- Inkubować próbki przez 2 godziny w temperaturze pokojowej przy wstrząsaniu z prędkością 300 obr./min.
- Próbki DF i PP dializować 3 krotnie przeciwko 2 litrom fosforanowo-buforowanej soli fizjologicznej (PBS) o pH 7,4 przez kilka godzin w każdym cyklu. Wszystkie etapy dializy przeprowadzać w temperaturze 4°C.
- Wirować próbkę przez 10 minut przy 14 000 x g i zebrać nadsącz zawierający DF lub PP sprzężony z HSA.
- Sprawdzić obecność białek w nadsączu, wykonując elektroforezę SDS-PAGE z użyciem żeli 12%. Nałożyć około 12 μg koniugatu HSA do jednego otworu żelu.
2. Wyznaczenie szybkości sprzęgania koniugatów leków (Ryc. 2)
- Do analizy szybkości sprzęgania koniugatów DF i PP metodą HPSEC należy użyć buforu fosforanowego sodu o stężeniu 100 mM i pH 6,5, zawierającego 150 mM NaCl i 0,05% azotku sodu. Należy zastosować kolumnę TSK-Gel-G2000SWXL o wymiarach 7,8 x 300 mm.
- Detekcję sygnałów należy przeprowadzić przy użyciu sprzężonego online systemu detektorów RI i UV.
- Należy przygotować próbkę wzorca HSA o stężeniu 1 mg/ml w dH2O. W celu kalibracji detektora należy wstrzyknąć 50 μl roztworu wzorca HSA.
- Należy obliczyć stałą RI kRI oraz stałą UV kUV dla detektora. Należy zastosować wzory areaRI=kRI*[(dn/dc)HSA*c(HSA)] oraz areaUV=kUV*[(dA/dc)HSA*c(HSA)], przyjmując wartości (dn/dc)HSA=0,185 oraz (dA/dc)HSA=0,5185.
- Należy przygotować wzorce pochodnych DF i PP do analizy HPSEC w taki sposób, aby można było łatwo wstrzyknąć ilości 5, 10 i 30 nmol obu wzorców.
- Należy obliczyć wartości średnie dla (dn/dc)drug i (dA/dc)drug dla obu wzorców. Dla DF wyznaczono wartość (dn/dc) wynoszącą 0,235 ± 0,010 oraz (dA/dc) wynoszącą 39,000 ± 0,493. Dla PP wyznaczono wartość (dn/dc) wynoszącą 0,328 ± 0,016 oraz (dA/dc) wynoszącą 53,155 ± 2,464.
- Należy wstrzyknąć koniugaty leków do układu HPSEC i wyznaczyć pola ich pików RI i UV.
- Stężenie DF, pochodnej PP oraz HSA należy obliczyć poprzez rozwiązanie układu dwóch równań areaRI=kRI*[(dn/dc)drug*c(drug)+(dn/dc)HSA*c(HSA)] oraz areaUV=kUV*[(dA/dc)drug*c(drug)+(dA/dc)HSA*c(HSA)] względem niewiadomych.
3. BAT z wykorzystaniem koniugatów leków
- Przygotować siedem probówek do cytometrii przepływowej i oznakować je w zależności od zawartości: kontrola niebarwiona, kontrola negatywna, kontrola pozytywna oraz konjugaty leku.
- Do probówek przeznaczonych dla kontroli niebarwionej i negatywnej pipetować 50 μl buforu do stymulacji B-CCR-STB (Flow2 CAST, Bühlmann Laboratories, Schönenbuch, CH). Jako kontrolę pozytywną zastosować 50 μl roztworu anty-FcεRI dostarczonego w zestawie Flow2 CAST. Do probówek przeznaczonych dla konjugatów leku dodać odpowiednie ilości roztworu konjugatu, tworząc szereg rozcieńczeń 1:10 od 0,02 do 20 μg/ml konjugatu DF i konjugatu PP (stężenia końcowe w objętości testu 200 μl). Eksperymenty miareczkowania należy przeprowadzić w celu ustalenia stężenia optymalnej aktywacji bazofilów dla każdej próbki pacjenta.
- Do każdej probówki dodać 100 μl buforu do stymulacji oraz 50 μl krwi pełnej pacjenta pobranej do EDTA. Próbki dokładnie wymieszać.
- Do każdej probówki pipetować 20 μl odczynnika barwiącego Flow2 CAST zawierającego przeciwciała anty-CCR3 znakowane fykoerytryną (PE) oraz przeciwciała anty-CD63 znakowane izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) i ponownie wymieszać. Nie dodawać odczynnika barwiącego do próbki niebarwionej!
- Próbki inkubować przez 45 minut w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C.
- Przerwać reakcję, inkubując na lodzie przez 5 minut.
- Zlizować erytrocyty, dodając 2,0 ml odczynnika lityzującego Flow2 CAST do każdej probówki i delikatnie mieszając na wstrząsarze vortex. Próbki inkubować w ciemności przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
- Próbki wirować przez 5 minut przy 500 x g i ostrożnie odlać nadsącz.
- Resuspenderować komórki w 500 μl buforu do płukania Flow2 CAST i przechowywać na lodzie do czasu analizy cytometrycznej.
- Dostosować ustawienia napięcia cytometru przepływowego dla rozproszenia światła w przód i pod kątem (FSC, SSC) podczas akwizycji próbki niebarwionej.
- Z wykresem SSC-FSC wyznaczyć bramkę dla komórek zidentyfikowanych jako limfocyty i przenieść je na wykres SSC-PE. Bazofile są identyfikowane za pomocą przeciwciała anty-CCR3 znakowanego PE jako CCR3hi SSClo, a następnie należy wyznaczyć dla nich bramkę na wykresie FITC-PE. Przeciwciało anty-CD63 wykrywające aktywowane bazofile jest znakowane FITC.
- Ustawić punkt odcięcia (cut-off) na maksymalnie 2,5% bazofilów jako CD63hi w kontroli negatywnej. Próbkę uznaje się za pozytywną pod kątem aktywacji bazofilów, jeśli >5% bazofilów to CD63hi, a średni indeks fluorescencji (MFI) próbki podzielony przez MFI kontroli negatywnej przekracza 2 (Rysunek 3).
4. Reprezentatywne wyniki:
Niniejszy eksperyment ocenia BAT jako pomocne narzędzie do wykrywania nadwrażliwości na leki zależnej od IgE. Konjugaty białkowe NLP są wykorzystywane do aktywacji bazofilów. Za pomocą HPSEC z detekcją RI i UV określono stan agregacji, stopień sprzęgania oraz efektywną wydajność konjugatów. Jak pokazuje Rysunek 4, 43,5% konjugatów DF pozostało w formie monomerycznej przy stopniu sprzęgania wynoszącym 5,0 DF/HSA. Dla agregatów określono stopień sprzęgania równy 9,5. Wykazano, że konjugat propypifenazonu składa się w 68,5% z monomerów o stopniu sprzęgania 21,2. Stopień sprzęgania agregatów wyniósł 27,9. Łącznie określony stopień sprzęgania dla konjugatów DF wyniósł 7,6 DF, a dla konjugatów PP 23,2.
BAT wykonany z użyciem koniugatów w zoptymalizowanych warunkach (stężenie koniugatów, czas stymulacji) pozwolił na zbadanie reakcji zależnych od IgE w nadwrażliwości na NLPZ. Jak pokazano na Rysunku 5, tylko koniugat PP był w stanie wywołać aktywację bazofili, co uwidoczniono poprzez zwiększoną ekspresję CD63 na powierzchni: aktywowanych zostało 20,6% bazofili, co charakteryzowało się przesunięciem logarytmicznym intensywności fluorescencji. MFI wzrosło 4,9-krotnie, z 386 (kontrola negatywna) do 1893. W przeciwieństwie do tego, przy użyciu koniugatu DF aktywowanych zostało tylko 3,1% bazofili, co znajdowało się poniżej wartości odcięcia 5%. Ponadto MFI wzrosło jedynie 1,1-krotnie (limit 2,0), z 197 (kontrola negatywna) do 210. O poprawności testu decydują: (i) <5% aktywacji bazofili w kontroli negatywnej, (ii) przesunięcie logarytmiczne intensywności fluorescencji subpopulacji bazofili oraz (iii) >50% aktywowanych bazofili (kontrola pozytywna).
Rysunek 1. Sprzęganie pochodnych DF i PP z HSA. Po rozpuszczeniu leków dodaje się wodę, bufor MES oraz EDC (odczynnik sprzęgający). Próbki są mieszane w wortexie przez 1 minutę, po czym do roztworów leków pipetuje się HSA. W ciągu 2 godzin wstrząsania w temperaturze pokojowej leki wiążą się kowalencyjnie z HSA. W wyniku procesu mogą powstać monomery oraz agregaty.
Rycina 2. Obliczanie stopni sprzężenia. W pierwszej kolejności stałe kRI oraz kUV wyznaczane są. W związku z tym do systemu HPSEC wstrzykuje się standard HSA o znanym stężeniu. Dla HSA przyjęto wartości (dn/dc) oraz (dA/dc) wynoszące odpowiednio 0,185 i 0,518. 5Powierzchnie pików są wykorzystywane do obliczenia stałych. Po drugie, dla każdego leku wstrzykuje się trzy wzorce w celu wyznaczenia powierzchni RI i UV specyficznych dla leku i stężenia. Ponieważ kRI oraz kUV po wyznaczeniu stałych w poprzednich krokach, można obliczyć pochodne specyficzne dla leku (dn/dc) oraz (dA/dc). W trzecim etapie konjugaty lek-HSA są wstrzykiwane do układu HPSEC. Uzyskane powierzchnie pików są wykorzystywane do obliczenia stężeń leku i HSA w poszczególnych pikach poprzez rozwiązanie układu dwóch równań z dwiema niewiadomymi.
Rysunek 3. Bramkowanie bazofilów. Komórki zidentyfikowane jako limfocyty są bramkowane w oparciu o rozproszenie boczne względem rozproszenia przedniego (wykres SSC-FSC). Bazofile są identyfikowane jako populacja CCR3hi SSClo spośród bramkowanych limfocytów (wykres SSC-CCR3-PE). Bazofile są analizowane pod kątem aktywacji (CD63hi) na wykresie CD63-FITC-CCR3-PE. Kontrola negatywna służy do ustalenia punktu odcięcia, aby maksymalnie 2,5% bazofilów pozostało w populacji CD63hi.
Rysunek 4. Wyznaczone stopnie sprzężenia koniugatów leku. Sygnały RI i UV wykazują dwa piki reprezentujące agregaty (eluujące przy niskiej objętości retencji) oraz monomery (eluujące przy wysokiej objętości retencji) koniugatów lek-HSA. Przedstawiono procentową zawartość monomerów i agregatów (wyznaczoną na podstawie sygnałów RI) oraz ich stopnie sprzężenia (n=1).
Rycina 5. Test aktywacji bazofilów. Wyniki próbek aktywowanych koniugatami leków, kontroli negatywnych oraz kontroli pozytywnych przedstawiono na wykresach CD63-FITC-CCR3-PE (n=1).
Dyskusja
BAT jest dobrze ugruntowaną, choć nie stosowaną jeszcze rutynowo metodą diagnostyki chorób alergicznych zależnych od IgE 6,7. W przypadku nadwrażliwości na leki jej stosowalność jest jednak ograniczona, ponieważ związki o niskiej masie cząsteczkowej nie są w stanie sieciować receptorów IgE, co jest warunkiem koniecznym dla aktywacji bazofilów 8. Dlatego leki poddawane badaniu muszą zostać kowalencyjnie sprzężone z odpowiednimi białkami nośnikowymi (np. HSA). Co istotne, stopień sprzężenia (t.j. liczba cząsteczek leku na białko nośnikowe) musi być kontrolowany, aby zagwarantować aktywność immunologiczną (t.j. sieciowanie receptorów IgE) koniugatów. Teoretycznie dwa hapteny na jedną cząsteczkę nośnika powinny być wystarczające do sieciowania receptorów IgE, a wykazano, że już pięć cząsteczek DF na HSA wywołuje uwalnianie mediatorów w teście komórkowym4. Ustalono, że oba koniugaty, PP-HSA i DF-HSA, charakteryzują się wystarczająco wysokim stopniem sprzężenia (HPSEC) i są immunologicznie aktywne, co czyni je odpowiednimi odczynnikami do zastosowania w BAT. Kolejną kwestią może być rola metabolitów leku, ponieważ to metabolit, a nie lek macierzysty, może wywoływać reakcję nadwrażliwości. W przypadku DF możliwość ta została wcześniej szczegółowo oceniona z wykorzystaniem pięciu głównych metabolitów fazy I i jednego wariantu wiązania4. Ważnymi czynnikami w opanowaniu opisanej techniki są jakość próbki krwi (<12 godzin od pobrania krwi, liczba wykrytych bazofilów >500) oraz optymalizacja warunków stymulacji (czas, dawka). Ponadto należy zidentyfikować tzw. non-responders, którzy nie reagują nawet na kontrolę pozytywną (przeciwciało skierowane przeciwko receptorowi IgE). Dlatego kryteria walidacji muszą obejmować przeciwciało anty-FcεRI jako kontrolę pozytywną. Istotną zaletą stosowania koniugatów leków jest fakt, że wydają się one nietoksyczne w przeciwieństwie do czystych leków, co wykazano dla koniugatu DF-HSA poprzez kostymulację przeciwciałem anty-FcεRI w BAT4. Czyste DF wykazuje natomiast działanie cytotoksyczne w stężeniu 1.25 mg/ml, co powoduje problemy z interpretacją wyników BAT9. Ogólnie zaleca się badanie potencjalnej cytotoksyczności dla każdego nowo otrzymanego koniugatu leku.
W niniejszej pracy wykazaliśmy potencjał koniugatu PP-HSA zastosowanego w teście BAT do wykrywania nadwrażliwości zależnej od IgE. W przeciwieństwie do tego, nadwrażliwość na DF nie jest związana z IgE, co potwierdza brak aktywacji bazofilów w odpowiedzi na koniugat DF-HSA. Co istotne, w przypadku niepewności co do mechanizmu zależnego od IgE, koniugaty muszą zostać poddane ocenie aktywności immunologicznej w systemach testowych opartych na komórkach in vitro, co wykazano w przypadku DF4.
Wykorzystując opisany układ koniugowania leków o niskiej masie cząsteczkowej kowalencyjnie do odpowiednich białkowych cząsteczek nośników, można badać udział mechanizmu zależnego od IgE w licznych reakcjach nadwrażliwości na leki, w tym na antybiotyki, inne NLPZ, środki kontrastowe, leki rozluźniające mięśnie, środki znieczulające itp. W związku z tym BAT może stanowić uzupełnienie istniejących metod diagnostycznych (testy skórne, doustne próby prowokacyjne).
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była finansowana z grantu P18820-B13 Austriackiego Funduszu Badań Naukowych (FWF).
Oświadczenie etyczne:
Badanie zostało zatwierdzone (PLUS_Ethik_090514) przez Komisję Etyczną ds. Eksperymentów z Udziałem Ludzi i/lub Zwierząt na Uniwersytecie w Salzburgu, zgodnie z Deklaracją Helsińską w rewizji z 1983 roku, a wszyscy uczestniczący pacjenci wyrazili pisemną świadomą zgodę.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy | Sigma-Aldrich | M3671 | - |
| Kolumna TSK Gel -G2000SWXL 7,8 x 300 mm | Tosoh Corp. | 08540 | - |
| BD FACSCanto II | BD Biosciences | 338962 | - |
| Wirówka nakładkowa | Sigma-Aldrich | - | - |
| Sód diclofenak | Sigma-Aldrich | D6899 | - |
| EDTA-Vacutainer | BD Biosciences | 368589 | - |
| Zestaw Flow2 CAST | Bühlmann Laboratories | FK-CCR | Od 14 czerwca 2011 r. zestaw Flow2 CAST nazywa się Flow CAST |
| System HPLC HP1100 | Hewlett-Packard | - | - |
| Albumina surowicy ludzkiej | Sigma-Aldrich | A9511 | - |
| Wirówka laboratoryjna | Eppendorf | - | - |
| Wodorochlorek N-etylo-N’-(3-dimetyloaminopropyl)karbodiimidu (EDC) | Sigma-Aldrich | E6383 | - |
| Tabletki PBS | AppliChem | A9199 | - |
| Pochodna propifenazonu | Uniwersytet w Salzburgu | - | - |
| Mieszadło z wytrząsaniem | Eppendorf | - | - |
| Azydek sodu | Sigma-Aldrich | S8032 | - |
| Chlorek sodu (NaCl) | Sigma-Aldrich | S1679 | - |
| Wodorowęglan sodu | Sigma-Aldrich | 90421C | - |
| Wodorotlenek sodu | Sigma-Aldrich | S5881 | - |
| Fosforan sodu | Sigma-Aldrich | 342483 | - |
| Trójstrefowy układ detektorów | Viscotek | TDA302 | - |
| Osobisty BioVortex V-1 plus | Peqlab | 90-V-1 | - |
| Kąpiel wodna 1012 | GFL | 1012 | - |
Bibliografia
- Himly, M. IgE-mediated immediate-type hypersensitivity to the pyrazolone drug propyphenazone. J Allergy Clin Immunol. 111, 882-888 (2003).
- Demoly, P., Pichler, W., Pirmohamed, M., Romano, A. Important questions in Allergy: 1--drug allergy/hypersensitivity. Allergy. 63, 616-619 (2008).
- Ebo, D. G., Hagendorens, M. M., Bridts, C. H., Schuerwegh, A. J., Clerck, L. S., Stevens, W. J. Flow cytometric analysis of in vitro activated basophils, specific IgE and skin tests in the diagnosis of pollen-associated food allergy. Cytometry Part B (Clinical Cytometry). 64B, (2005).
- Harrer, A. Diclofenac hypersensitivity: antibody responses to the parent drug and relevant metabolites. PLoS One. 5, e13707-e13707 (2010).
- Wen, J., Arakawa, T., Philo, J. S. Size-exclusion chromatography with on-line light-scattering, absorbance, and refractive index detectors for studying proteins and their interactions. Anal Biochem. 240, 155-166 (1996).
- De Weck, A. L., Sanz, M. L., Gamboa, P. M., Aberer, W., Bienvenu, J., Blanca, M., Demoly, P., Ebo, D. G., Mayorga, L., Monneret, G., Sainte Laudy, J. Diagnostic tests based on human basophils: more potentials and perspectives than pitfalls. II. Technical issues. J Investig Allergol Clin Immunol. 18, 143-155 (2008).
- Ebo, D. G. Flow-assisted allergy diagnosis: current applications and future perspectives. Allergy. 61, 1028-1039 (2006).
- Poulsen, L. K., Quan, S., Kragh, C., Platzer, M. H., Skov, P. S. The basophil granulocyte in allergic reactions: experimental models and their use for the identification of drugs with effects or side effects on basophils. Curr Med Chem - Anti-inflammatory & Anti-Allergy Agents. 3, 167-180 (2004).
- Sanz, M. L., Gamboa, P., de Weck, A. L. A new combined test with flowcytometric basophil activation and determination of sulfidoleukotrienes is useful for in vitro diagnosis of hypersensitivity to aspirin and other nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Int Arch Allergy Immunol. 136, 58-72 (2005).
Przedruki i uprawnienia
