Metoda genotypowania oparta na PCR do rozróżniania odmian dzikich i ozdobnych Imperata cylindrica

Podsumowanie

Przedstawiamy tani i szybki protokół genotypowania molekularnego, który wykorzystuje specyficzne dla odmiany startery PCR celujące w różnice w sekwencji DNA w obrębie regionu spacerowego trnL-F chloroplastu, aby odróżnić odmiany Imperata cylindrica (trawa cogon), których nie można rozpoznać wyłącznie na podstawie morfologii. Odmiany te obejmują wpisaną na listę federalną roślinę inwazyjną, trawę cogon, oraz blisko spokrewnioną, powszechnie występującą odmianę ozdobną, I. cylindrica var. koenigii (trawa japońska).

Streszczenie

Dziki typ I. cylindrica (trawa słoniowa) jest jedną z dziesięciu najgroźniejszych roślin inwazyjnych na świecie, negatywnie wpływającą na zasoby rolnicze i naturalne w 73 krajach w Afryce, Azji, Europie, Nowej Zelandii, Oceanii i obu Amerykach^1-2. Trawa słoniowa tworzy szybko rozprzestrzeniające się, monodominujące zbiorowiska, które wypierają szeroką gamę rodzimych gatunków roślin, a w konsekwencji zagrażają rodzimym zwierzętom, które dla pożywienia i schronienia są zależne od tych gatunków. Co więcej, odmiana ozdobna [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] jest szeroko sprzedawana pod nazwami Imperata cylindrica 'Rubra', Red Baron oraz japońska trawa krwi (JBG). Odmiana ta jest uważana za sterylną i nieinwazyjną oraz pożądana jako roślina ozdobna ze względu na czerwone liście. Jednak w odpowiednich warunkach JBG może wytwarzać żywotne nasiona (Carol Holko, 2009 komunikacja osobista) i może powrócić do zielonej formy inwazyjnej, która często jest nieodróżnialna od trawy słoniowej, ponieważ przejmuje ona charakterystyczne cechy dzikiego typu inwazyjnego⁴ (Rysunek 1). Sprawia to, że identyfikacja morfologiczna jest trudnym zadaniem, nawet dla doświadczonych taksonomów roślin. Powrót JBG do agresywnego zielonego fenotypu nie jest również zjawiskiem rzadkim. Wykorzystując porównania sekwencji regionów kodujących i zmiennych w DNA jądrowym i chloroplastowym, potwierdziliśmy, że JBG powróciła do formy zielonej inwazyjnej w stanach Maryland, Karolina Południowa i Missouri. JBG była sprzedawana i sadzona niemal w każdym stanie kontynentalnych USA, w których nie występuje aktywna infestacja trawy słoniowej. Skala problemu powrotu do formy dzikiej nie jest dobrze zbadana, ponieważ rośliny te pozostają nieudokumentowane i często są niszczone.

Zastosowanie niniejszego protokołu molekularnego zapewnia metodę identyfikacji powrotów JBG i może pomóc zapobiec współwystępowaniu oraz możliwej hybrydyzacji tych odmian. Trawa cogon jest obligatoryjnym zdalnym zapylaczem i po skrzyżowaniu z innym genotypem może wytworzyć zdolne do kiełkowania, roznoszone przez wiatr nasiona, które rozprzestrzeniają tę roślinę na duże odległości^5-7. JBG posiada nieco inny genotyp niż trawa cogon i może być w stanie tworzyć zdolne do przeżycia hybrydy z trawą cogon. Co więcej, JBG jest bardziej tolerancyjna na zimno i cień niż trawa cogon^8-10, a przepływ genów między tymi dwiema odmianami prawdopodobnie doprowadzi do powstania hybryd bardziej agresywnych, tolerujących cień i odpornych na zimno niż trawa cogon typu dzikiego. Podczas gdy trawa cogon typu dzikiego zajmuje obecnie ponad 490 milionów hektarów na całym świecie, w południowo-wschodnich stanach USA zajmuje ona ponad 500 000 hektarów i jest w stanie opanować większość obszaru USA, ponieważ szybko rozprzestrzenia się na północ ze względu na szeroką niszę ekologiczną i potencjał geograficzny^3,7,11. Potencjał krzyżowania genetycznego jest poważnym problemem dla Federal Noxious Weed Program organizacji USDA-APHIS. Obecnie USDA-APHIS zakazuje uprawy JBG w stanach, w których występują poważne inwazje trawy cogon (np. Floryda, Alabama, Missisipi). Jednak zapobieganie łączeniu się tych dwóch odmian może okazać się trudniejsze w miarę rozszerzania się zasięgu występowania trawy cogon i JBG. Co więcej, dystrybucja powrotów JBG jest obecnie nieznana, a bez możliwości identyfikacji tych odmian za pomocą morfologii, niektóre inwazje trawy cogon mogą być wynikiem powrotów JBG. Niestety, obecne molekularne metody identyfikacji opierają się zazwyczaj na AFLP (polimorfizmie długości fragmentów amplifikowanych) i sekwencjonowaniu DNA, z których obie są czasochłonne i kosztowne. Przedstawiamy tutaj pierwszą kosztowo efektywną i niezawodną metodę genotypowania molekularnego opartą na PCR, która pozwala precyzyjnie odróżnić trawę cogon od powrotów JBG.

Protokół

1. Pobieranie i konserwacja próbek

Metodę tę opracowano i przetestowano z wykorzystaniem świeżych, mrożonych oraz niedawno wysuszonych tkanek liści.

1. Zidentyfikuj tkanki trawy cogongrass i/lub JBG przy pomocy taksonoma specjalizującego się w identyfikacji gatunków traw. Dzięki jaskrawoczerwonym liściom ozdobna odmiana JBG jest łatwa do odróżnienia wizualnie od dzikiego typu cogongrass oraz JBG revert; jednakże cogongrass i JBG revert są niemal nieodróżnialne od siebie. Cogongrass oraz fenotyp JBG revert mają zielone, dłuższe liście, znacznie większe i dłuższe kłącza oraz większą powierzchnię liści niż JBG¹² (Rysunek 1).
2. Świeża tkanka liści dostarcza największej ilości i najwyższej jakości DNA i może być pobrana z roślin I. cylindrica uprawianych w polu lub w szklarni. W przypadku użycia świeżej tkanki, wyizoluj DNA w ciągu 3 godzin od zbioru, aby zapobiec degradacji. W przeciwnym razie przygotuj tkankę do przechowywania, utrzymując ją w chłodzie i poza bezpośrednim działaniem promieni słonecznych.
3. Aby przechowywać tkanki do późniejszej ekstrakcji DNA, najoptymalniejszą metodą jest ich natychmiastowe zamrożenie i przechowywanie w temperaturze -80°C. Nie dopuszczaj do rozmrożenia tkanek przed ekstrakcją DNA. Przed etapem rozcierania podczas ekstrakcji DNA przenieś zamrożoną tkankę do ciekłego azotu, aby zapobiec rozmrożeniu.
4. Jeśli zamrażarka -80°C jest niedostępna, natychmiast wysusz tkankę. W celu przechowywania na sucho umieść tkankę w papierowej kopercie i przechowuj ją w odwadnianym żelu krzemionkowym lub innych aktywnych osuszaczach w temperaturze pokojowej. Niewielka ilość żelu krzemionkowego z indykatorem zmieszana z żelem bez indykatora zapewni, że krzemionka jest w pełni odwodniona i odpowiednia do suszenia tkanek roślinnych.
5. Użyj co najmniej 10-krotnie większej masy żelu krzemionkowego niż masy świeżej tkanki liściowej. Tkanka roślinna powinna wyschnąć w ciągu 24 godzin. Jakość i ilość DNA ulegają zmniejszeniu podczas długotrwałego przechowywania na sucho (podobnie jak w przypadku okazów zielnikowych).

2. Izolacja DNA

Aby wyekstrahować DNA z tkanki roślinnej, należy postępować zgodnie z instrukcją producenta zestawu DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA; Cat# 69104 lub 69106), wprowadzając jedną niewielką modyfikację. Zamiast sugerowanej ilości mniej niż 10 mg świeżej tkanki lub mniej niż 20 mg tkanki wysuszonej na każdą kolumnę, należy rozdrobnić ponad 10 mg, a następnie przenieść 10 mg świeżej lub zamrożonej tkanki (lub > 20 mg tkanki wysuszonej) do odpowiednich probówek do ekstrakcji. DNA jądrowe i plastydowe jest ekstrahowane jednocześnie.

1. Przed rozpoczęciem tych procedur należy sprawdzić, czy do buforów AP3/E oraz AW dodano etanol.
2. Rozetrzeć >10 mg świeżej lub zamrożonej tkanki liściastej (lub >20 mg suchej tkanki liściastej) na drobny proszek, stosując trzy cykle chłodzenia ciekłym azotem podczas ucierania w schłodzonym moździerzu z tłuczkiem. Niewystarczająca fragmentacja materiału wyjściowego lub niepełna liza mogą prowadzić do niższej wydajności izolacji DNA. Należy starannie utrzeć tkankę i nie przeciążać kolumn zbyt dużą ilością materiału.
3. Przenieść 10 mg zamrożonego proszku z tkanki świeżej lub zamrożonej (lub 20 mg proszku z tkanki suchej) do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml zawierającej 40 μl buforu AP1 oraz 4 μl RNazy A. Każdą probówkę można umieścić w małym statywie na wadze, aby monitorować prawidłową masę tkanki w każdej probówce.
4. Wymieszać próbkę(i) za pomocą vortexa lub wstrząsania i inkubować przez 10 min w temperaturze 65°C, odwracając probówkę(i) 2-3 razy w trakcie inkubacji.
5. Do każdej próbki dodać 130 μl buforu AP2. Wymieszać, kilkakrotnie odwracając probówkę(i), a następnie inkubować przez 5 min na lodzie.
6. Przenieść każdy lizat pipetą do osobnej kolumny wirnikowej QIAshredder Mini i umieścić każdą kolumnę w probówce zbierającej o pojemności 2 ml (dołączonej do zestawu). Wirować kolumnę(y) przez 2 min przy 20 0 x g (~14 0 rpm) i przenieść każdą frakcję filtratu do nowej probówki (niedostępnej w zestawie), nie naruszając powstałego osadu.
7. Dodać 1,5 objętości buforu AP3/E i wymieszać poprzez pipetowanie.
8. Przenieść 650 μl mieszaniny do kolumny wirnikowej DNeasy Mini w probówce zbierającej o pojemności 2 ml. Wirować kolumnę(y) przez 1 min przy 6 0 x g (~8 0 rpm) i odrzucić filtrat. Powtórzyć ten krok z pozostałą częścią mieszaniny dla każdej próbki.
9. Umieścić kolumnę(y) wirnikową(e) w nowej probówce zbierającej o pojemności 2 ml i dodać 50 μl buforu AW na górze każdej kolumny. Wirować kolumnę(y) przez 1 min przy 6 00 x g (~8 00 rpm) i odrzucić filtrat.
10. Dodać kolejne 50 μl buforu AW na górze każdej kolumny. Wirować przez 2 min przy 20 0 x g (~14 00 rpm). Krok ten pozwoli osuszyć kolumnę, usuwając resztki etanolu zawartego w buforach, który mógłby hamować reakcję PCR.
11. Przenieść każdą kolumnę wirnikową do nowej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. W celu elucji dodać 10 μl buforu AE na górę każdej kolumny i inkubować kolumnę(y) przez 5 min w temperaturze pokojowej. Wirować kolumnę(y) przez 1 min przy 6 00 x g (~8 00 rpm), aby zebrać DNA.
12. Powtórzyć te kroki elucji raz, eluując DNA do tej samej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml, aby uzyskać 20 μl próbki. Próbki DNA przechowywać w temperaturze -20°C do czasu użycia. Stężenia DNA zależą od rodzaju tkanki i warunków przechowywania. Optymalną wydajność uzyskuje się, eluując DNA łączną objętością 20 μl buforu AE; jednak stężenia można zwiększyć, zmniejszając objętość elucji nawet do 50 μl.

3. Weryfikacja jakości i ilości DNA

1. Przed przygotowaniem do reakcji PCR należy sprawdzić jakość i ilość wyekstrahowanego DNA za pomocą spektrofotometru lub fluorometru oraz elektroforezy żelowej. Pozwoli to zapewnić powodzenie kolejnych etapów.
2. Za pomocą spektrofotometru należy ocenić jakość i ilość DNA. Dobra wydajność DNA powinna wynosić od 50 do 150 ng/μl, przy stosunkach 260/280 oraz 230/280 bliskich 2,0. Przykładem wyników o dobrej jakości uzyskanych za pomocą spektrofotometru NanoDrop (ThermoScientific, Wilmington, DE) jest Rysunek 2.
3. Należy przeprowadzić elektroforezę z wykorzystaniem standardowego 1% żelu agarozowego. Należy zweryfikować obecność stosunkowo dużych prążków (>10 Kb) przy braku lub niewielkim rozmazaniu wynikającym z kontaminacji RNA (Rysunek 3).
4. W przypadku wysokiego stężenia DNA, próbki DNA należy rozcieńczyć do 70 ng/μl przed kolejnymi etapami.

4. Primery do PCR

Startery PCR użyte w tym protokole opierają się na różnicach w sekwencji regionu odstępnika trnL-F plastyd między genotypami trawy cogon i JBG. Różnice te występują w formie SNP (polimorfizmów pojedynczego nukleotydu) oraz InDel (insercji i delecji), co pozwoliło na opracowanie starterów specyficznych dla danej odmiany poprzez ich zlokalizowanie w miejscach unikalnych sekwencji (Rysunek 4).

1. Jakość starterów może mieć istotny wpływ na wyniki PCR. Zamawiaj startery w renomowanej firmie. My zamawiamy startery w Oblique Bio, Inc. (http://www.obliquebio.com/web/, Huntsville, AL), prosząc jedynie o standardowe procedury odsolenia.
2. Startery kontroli pozytywnej trnL-F: Ten zestaw starterów amplifikuje region odstępkowy plastydialny trnL-F większości taksonów traw^11-13 i służy jako dobra kontrola pozytywna (powodując powstanie prążka o długości 890 bp).
   

   Nazwa	Sekwencja
   trnF(GAA)-F	5'-ATTTGAACTGGTGACGAG-3'
   trnL(5' exon)-C	5'-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3'

3. Startery dla dzikiego typu cogongrass: Ten zestaw starterów jest specyficzny dla cogongrass i nie amplifikuje regionu trnL-F genotypów JBG. Zestaw ten pozwala uzyskać prążek o długości 595 bp.
   

   Nazwa	Sekwencja
   trnLF-C-F1	5'-TCCACTTTTGAAAAAACAAGTGCAA-3'
   trnLF-C-R1	5'-GCCGATACTCTAATAAATAAAAAAAAAAAAGAAAT-3 '

4. Startery JBG i JBG Revert: Ten zestaw starterów jest specyficzny dla genotypu JBG i nie amplifikuje regionu trnL-F cogongrass. Zestaw ten pozwala uzyskać prążek o długości 594 bp.
   

   Nazwa	Sekwencja
   trnLF-R-F2	5'-CCAAATCCACTTTTGAAAAAACAAGTGGTT-3'
   trnLF-R-R2	5'-CGAGATTCCTTGCCGATACTCTAATAAAA-3'

5. Rozpuść każdy starter w odpowiedniej objętości wolnej od nukleaz ddH₂O, aby uzyskać roztwory zapasowe o stężeniu 10 mM, które można przechowywać długoterminowo w temperaturze -20°C.
6. Przed przystąpieniem do etapów przygotowania PCR rozcieńcz każdy roztwór zapasowy starterów do stężenia 12 mM.

5. Przygotowanie reakcji PCR

Ekstrakty DNA są amplifikowane przy użyciu każdego z powyższych zestawów starterów w reakcjach PCR. Należy uwzględnić kontrolę dodatnią, aby upewnić się, że wszystkie odczynniki do PCR działają prawidłowo i mogą wytworzyć prążek. Należy uwzględnić kontrolę ujemną, aby upewnić się, że żaden z odczynników nie jest zanieczyszczony niepożądanym DNA. Kontrola ujemna nie zawiera matrycy i nie powinna skutkować powstaniem prążka.

1. Przygotuj wszystkie reakcje w cienkościennych probówkach PCR, aby zapewnić lepszy transfer ciepła między blokiem termocyklera a próbką. Zaleca się stosowanie dostępnych w sprzedaży końcówek do pipet z filtrem antyaerozolowym, aby uniknąć kontaminacji.
2. Dla każdej wyizolowanej próbki DNA przygotuj reakcje PCR o objętości 50 μl, używając każdego z powyższych zestawów starterów w cienkościennych probówkach PCR o pojemności 0,2 ml, dodając następujące odczynniki na lodzie w poniższej kolejności. W przypadku przygotowywania wielu próbek, sporządź mieszaninę (cocktail) zawierającą wszystkie odczynniki z wyjątkiem matrycy DNA, aby zapewnić jednorodne warunki dla wszystkich reakcji.
   

   Odczynnik do PCR	Zużyta objętość	Stężenie końcowe
   Nukleaza-free ddH2O	40,5 μl
   10X Advantage 2 PCR Buffer (Clonetech, CA)	5,0 μl	10% (v/v)
   Advantage UltraPure PCR dNTP Mix (10 mM każdego, Clonetech, CA)	1,0 μl	0,2 mM
   Starter 1 (12μM w ddH2O)	1,0 μl	0,24 μM
   Starter 2 (12μM w ddH2O)	1,0 μl	0,24 μM
   Advantage 2 Polymerase Mix (Clonetech, CA)	0,5 μl	1% (v/v)
   Ekstrakt DNA (70 ng/reakcję; dostosować objętość ddH2O w razie potrzeby)	1,0 μl	1,4 ng/μl
   	Suma: 50,0 μl

3. Aby upewnić się, że wszystkie odczynniki do PCR działają prawidłowo, przygotuj kontrolę pozytywną, używając starterów kontroli pozytywnej. Ten zestaw starterów działa równie dobrze dla cogongrass, JBG, JBG revert oraz innych traw i spowoduje powstanie prążka o długości 890 bp.
4. Przygotuj kontrolę negatywną, używając tego samego zestawu starterów kontrolnych co w kontroli pozytywnej, stosując ddH₂O zamiast ekstraktu DNA. Jeśli wszystkie odczynniki są wolne od kontaminacji DNA, w tej reakcji nie powstanie żaden prążek.
5. Jeśli stężenie DNA jest niskie, do każdej reakcji można dodać więcej DNA, dostosowując ilość użytej wody nukleaza-free ddH₂O tak, aby całkowita objętość reakcji wynosiła 50 μl. Nie należy używać więcej niż 5 μl DNA (10% objętości całkowitej) na jedną reakcję, ponieważ ewentualne zanieczyszczenia zawarte w próbkach DNA mogą hamować reakcje PCR.

6. Cykle PCR

1. Przeprowadź amplifikacje PCR w termocyklerze wyposażonym w grzaną pokrywę, stosując następujące parametry cykli PCR. W badaniu wykorzystano termocykler Mastercycle pro S (Eppendorf, Hauppauge, NY) ustawiony na standardowe warunki zmiany temperatury. Każdy wysokiej jakości termocykler powinien zapewnić prawidłowy przebieg reakcji.
   

   Cykl	Denaturacja i przyłączanie	Polimeryzacja
   1	2 min w temp. 95°C
   2	30 s w temp. 95°C	30 s w temp. 61°C 90 s w temp. 68°C 35 cykli
   3		5 min w temp. 68°C
   Przetrzymać w 4°C do momentu usunięcia próbki

2. Zoptymalizuj warunki PCR (w tym temperaturę przyłączania starterów, czasy elongacji oraz liczbę cykli) w zależności od jakości DNA, starterów, polimerazy Taq lub rodzaju zastosowanego termocyklera. W celu wyznaczenia optymalnych temperatur przyłączania zalecamy użycie termocyklera z funkcją gradientu.
3. Jeśli używany termocykler nie posiada podgrzewanej pokrywy, do każdego naczynia z próbką należy dodać 1 kroplę oleju mineralnego, aby zapobiec odparowywaniu podczas cykli PCR.

7. Elektroforeza żelowa produktów PCR

Aby zwizualizować wyniki analizy, należy rozdzielić produkty PCR na żelu agarozowym o stężeniu 1% przy użyciu standardowej elektroforezy.

1. Połączyć 2 μl standardowego buforu do nakładania DNA (zazwyczaj roztwór 5x lub 6x) z 5 μl każdego z amplifikowanych produktów PCR.
2. NaNieść próbki na żel agarozowy 1% zawierający EtBr (bromek etydyny do barwienia DNA), przygotowany z wykorzystaniem układów buforowych TAE lub SB (boran sodu)¹⁶. Stosujemy 1 μl roztworu stokowego EtBr o stężeniu 10 mg/ml na 10 ml 1% agarozy (0,1 μg/ml).
3. Elektroforezę przeprowadzić przy napięciu ~120V, aż czoło barwnika osiągnie ¾ całkowitej długości żelu.
4. Pod wpływem światła UV (np. w komorze UV do krótkich fal), sprawdzić powstałe prążki, aby zweryfikować, czy amplifikowano odpowiedni fragment.
5. Udokumentować żel oraz powstałe prążki, korzystając z dostępnego systemu fotodokumentacji lub aparatu fotograficznego.

8. Reprezentatywne wyniki

Po wizualizacji produktów PCR trawa cogon wykazuje unikalny wzór prążków w porównaniu z JBG lub powróconym JBG (Rysunek 5). Dla każdej próbki DNA zestaw primerów kontroli pozytywnej trnL-F powinien dać pojedynczy prążek o wysokiej intensywności przy ~890 bp. Potwierdza to prawidłowe działanie wszystkich odczynników do PCR. Podobnie, reakcja kontroli negatywnej (bez matrycy) nie powinna zawierać prążków dla żadnego z użytych zestawów primerów. Potwierdza to brak kontaminacji odczynników.

Jeśli próbka DNA pochodzi z dzikiego typu cogongrass, reakcja PCR z zastosowaniem zestawu starterów specyficznych dla cogongrass spowoduje powstanie pojedynczego prążka o wielkości ~595 bp, podczas gdy startery specyficzne dla JBG nie wykażą żadnego prążka. Analogicznie, jeśli próbka DNA pochodzi z JBG lub z powrotnego JBG, reakcja PCR z zastosowaniem zestawu starterów specyficznych dla JBG spowoduje powstanie pojedynczego prążka o wielkości ~594 bp, podczas gdy startery specyficzne dla cogongrass nie wykażą żadnego prążka. Ponieważ JBG i powrotny JBG mają identyczną sekwencję kwasów nukleinowych, będą one wykazywać identyczne wzory prążkowania. W przypadku porównywania wielu próbek na żelu w tym samym czasie zaleca się prowadzenie wszystkich próbek pochodzących z każdego zestawu starterów obok siebie, co ułatwia skanowanie próbek w poszukiwaniu wyników pozytywnych.

Różnice morfologiczne między JBG a rewersami JBG są dość oczywiste (np. czerwony kolor liści i mniejszy wzrost JBG w porównaniu do zielonego zabarwienia, większego wzrostu i agresywnego rozwoju rewersu JBG), zatem choć wyniki PCR będą identyczne, odmiany JBG są łatwe do odróżnienia na podstawie morfologii roślin.

Rysunek 1. Porównanie roślin uprawianych w szklarniach Imperata cylindrica wariancja koenigii (japońska trawa krwawiąca), powrócona I. cylindrica wariacja koenigii (JBG Revert) i *I. cylindrica* (Dziki typ trawy cogon).

Rysunek 2. Przykład próbek DNA zweryfikowanych za pomocą spektrofotometru NanoDrop. Należy pamiętać, że niezależnie od zastosowanego spektrofotometru, stosunek 260/280 powinien wynosić blisko 1,8, a stosunek 260/230 blisko 2,0.

Rysunek 3. Próbki DNA zweryfikowano za pomocą standardowej elektroforezy żelowej na żelu agarozowym o stężeniu 1%. Do analizy wielkości zastosowano komercyjny marker DNA. Ścieżka nr 4 stanowi przykład próbki DNA o niskiej jakości, wykazującej rozmazanie (smearing) oraz pewien stopień zanieczyszczenia RNA.

Rycina 4. Dopasowania sekwencji trnL-F obszary Imperata cylindrica wariant. koenigii (japońska trawa krwawa), powrócona *I. cylindrica* wariant. koenigii (JBG Revert) oraz I. cylindrica (Dzika trawa cogon). Pionowe czarne strzałki wskazują różnice w sekwencjach wynikające z polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP) oraz insercji i delecji (InDel). Poziome zielone strzałki wskazują pozycje starterów dla dzikiej trawy cogon, użytych do specyficznej dla trawy cogon reakcji PCR. Poziome czerwone strzałki wskazują pozycje starterów JBG oraz JBG Revert, użytych do specyficznej dla JBG reakcji PCR. kliknij tutaj aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 5. Reprezentatywny wynik elektroforezy żelowej produktów PCR uzyskanych z próbek DNA trawy cogongrass, JBG oraz powrotnej JBG z zastosowaniem starterów specyficznych dla cogongrass i JBG, a także trnL-F kontrolą pozytywną oraz kontrolą negatywną bez matrycy.

Dyskusja

Amerykański przemysł szkółkarski i ogrodniczy opiera się na uprawie i sprzedaży egzotycznych i nowych gatunków roślin. To, w połączeniu z rosnącą globalizacją handlu, zwiększa prawdopodobieństwo, że inwazyjny gatunek rośliny przedostanie się do USA, zakorzeni się i rozprzestrzeni. Możliwość federalnej regulacji takich roślin zależy od informacji, które często nie są dostępne, w tym od potencjału do stania się inwazyjnym, poprawnej taksonomii oraz odrębności genetycznej od taksonów rodzimych i znaturalizowanych. Ponieważ nasza wiedza na temat roślin inwazyjnych jest często ograniczona, importowano rośliny o ukrytych cechach inwazyjnych, aby dopiero później odkryć, że niszczą one nasze zasoby rolnicze i naturalne. Niniejszy protokół ma na celu rozwiązanie takich problemów związanych z odmianami I. cylindrica poprzez przedstawienie pierwszej uproszczonej metody molekularnej, która pozwala precyzyjnie odróżnić dziką formę trawy cogon od formy powrotnej jej ozdobnego odpowiednika JBG.

Do opracowania niniejszego protokołu w czerwcu 2008 roku pobrano cogongrass typu dzikiego z populacji znaturalizowanych w jednostce leśnej Pond Creek w hrabstwie Santa Rosa w pobliżu Jay, FL. JBG pozyskano w czerwcu 2008 roku z komercyjnej szkółki (Bluebird Nursery, Inc.) oraz z kolekcji prywatnej w Columbia, MO. Rewersanty JBG pobrano w czerwcu 2008 roku z dziedzińca Muzeum Geologicznego Campbella na Uniwersytecie Clemson, SC; w czerwcu 2009 roku z University Park w Riverdale, MA; oraz w 2009 roku z przedogródka prywatnego właściciela w Columbia, MO (zidentyfikowane przez Lelanda Cseke). Wszystkie rośliny utrzymywano w szklarni znajdującej się na Uniwersytecie Alabamy w Huntsville (Huntsville, AL).

Sekwencjonowanie genetyczne DNA pobranego z tych roślin obejmowało szczegółowe porównania 9 niezależnych regionów DNA powszechnie stosowanych do kodowania kreskowego roślin². We wszystkich przypadkach sekwencje JBG były w 100% zgodne z sekwencjami powrotnych form JBG, co pomogło potwierdzić, że JBG rzeczywiście powraca do zielonej, inwazyjnej formy. Jedynie jądrowe regiony ITS oraz chloroplastowe regiony trnL-F wykazują różnice, które mogą być wykorzystane do genetycznego rozróżnienia między cogongrass a JBG. Region ITS posiada łącznie 3 SNP (polimorfizmy pojedynczego nukleotydu) pomiędzy cogongrass a JBG, natomiast region trnL-F posiada 2 SNP oraz 2 InDel (insercje i delecje). Różnice genetyczne te pozwoliły na opracowanie specyficznych dla danej odmiany starterów PCR, które umożliwiają rozróżnienie między cogongrass typu dzikiego a powrotnymi formami JBG. Najbardziej wiarygodne wyniki uzyskano przy użyciu starterów pochodnych z plastydowego regionu trnL-F. Zatem niniejszy protokół opiera się na różnicach w sekwencjach regionów trnL-F genomu chloroplastowego cogongrass, JBG oraz powrotnego JBG (Rycina 4).

Aby pomóc w zaprojektowaniu starterów o większej specyficzności względem analizowanych odmian oraz uniknąć wyników fałszywie dodatnich pochodzących od blisko spokrewnionych gatunków, wszystkie znane sekwencje trnL-F odmian I. cylindrica porównano z sekwencjami trnL-F pokrewnych gatunków traw (43 niezależne sekwencje z 29 gatunków, np., Cymbopogon citratus, Sorghastrum incompletum, Coix lacryma-jobi, Miscanthus sinensis, Saccharum officinarum, Sorghum halepense). Chociaż przeanalizowano sekwencje starterów specyficznych dla odmian w obrębie 29 gatunków traw, specyficzność tych starterów nie została kompleksowo zbadana pod kątem zdolności do amplifikacji DNA z większości pozostałych gatunków traw. W związku z tym tkanka wykorzystywana do ekstrakcji DNA powinna zostać starannie zidentyfikowana jako I. cylindrica przed rozpoczęciem niniejszego protokołu. Jeśli trawy nie można jednoznacznie zidentyfikować jako cogongrass lub JBG, sugerujemy sekwencjonowanie produktu PCR, aby upewnić się, że sekwencje dokładnie odpowiadają cogongrass lub JBG. Obecnie najdokładniejszą metodą weryfikacji tożsamości danego okazu trawy jest przeprowadzenie PCR dla regionów trnL-F oraz ITS, a następnie weryfikacja sekwencji produktów PCR i porównanie ich z sekwencjami znanymi dla dokładnie zidentyfikowanych taksonów. DNA można amplifikować za pomocą starterów kontrolnych opisanych w niniejszym protokole (dla regionu trnL-F) lub innych starterów dostępnych w innych publikacjach^13-15. Sekwencjonowanie jest znacznie bardziej pracochłonne i kosztowne niż zastosowanie naszej uproszczonej procedury.

Jakość starterów wykorzystywanych w reakcji PCR ma krytyczne znaczenie dla powodzenia procedury. Startery do niniejszej procedury zostały udostępnione przez firmę Oblique Bio, Inc. (http://www.obliquebio.com/web/, Huntsville, AL). Przewagą zamawiania starterów w Oblique Bio jest to, że firma ta przechowuje dużą liczbę alikwotów każdego startera z tej samej serii produkcyjnej, co startery użyte przez nas do optymalizacji w naszym laboratorium. W rezultacie startery mają nie tylko tę samą sekwencję, ale pochodzą z dokładnie tej samej partii produkcyjnej, która została wykorzystana w tym protokole. Stosowanie starterów z tej samej partii pozwala uniknąć dodatkowych zmiennych w procedurze, które mogą wynikać z różnic w jakości starterów do PCR. Podobnie, choć inne polimerazy Taq powinny sprawdzić się w PCR, jakość użytej polimerazy Taq wpłynie na jakość wyników PCR. Aby zapewnić lepszą spójność odczynników do PCR, zoptymalizowaliśmy protokół, korzystając z odczynników firmy Clontech. Polimeraza Advantage 2 (Clontech, Mountain View, CA, nr kat. 639201 lub 639202) jest mieszaniną wydajnej polimerazy Taq typu hot-start oraz enzymu korygującego (proof-reading), co pomaga zapewnić wysoką specyficzność i bardziej precyzyjne amplifikacje.

Ponieważ protokół ten opiera się na DNA chloroplastowym, które u traw jest dziedziczone w linii żeńskiej, zdarzenia hybrydyzacji między genotypami cogongrass i JBG mogą nie zostać wykryte za pomocą naszej procedury identyfikacji molekularnej. W przypadkach, gdy podejrzewa się hybrydyzację, zalecamy zastosowanie regionów jądrowych, które są dziedziczone od obojga rodziców. Najczęściej stosowanym zmiennym regionem nieplastydowym rozważanym w genotypowaniu roślin jest jądrowy region ITS rybosomalny^13-15,17. Obecnie pracujemy nad wprowadzeniem multipleksowania amplifikacji regionu chloroplastowego trnL-F wraz z regionem jądrowym ITS w jednej probówce PCR. Multipleksowanie regionów DNA plastydowego i jądrowego mogłoby potencjalnie obejść ograniczenia wynikające ze stosowania każdego z nich z osobna; jednak takie metody wymagają optymalizacji i dodatkowej oceny w celu określenia ich wykonalności w każdym konkretnym przypadku. Oceniane są również zastosowania ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) oraz nowszych technologii, takich jak sondy molekularne (fluorescencyjne sondy starterowe), jako niezawodne i dokładne metody genotypowania roślin.

Przedstawiony tutaj protokół zapewnia szybkie i niezawodne podejście do odróżnienia rewerty JBG od dzikiego typu trawy cogon. Zachęcamy użytkowników tego protokołu do kontaktu z nami w celu zgłoszenia wyników uzyskanych dzięki jego zastosowaniu. Tak udostępnione dane pomogą w określeniu rozprzestrzenienia się rewerty JBG. Pomoże to również organom regulacyjnym USDA w podejmowaniu świadomych decyzji dotyczących działań, które mogą być konieczne, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się i potencjalnej hybrydyzacji wysoce inwazyjnych odmian trawy cogon.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DNeasy Plant Mini Kit	Qiagen	69104 lub 69106	Wszelki renomowany zestaw do izolacji genomowego DNA roślin, który pozwala na uzyskanie DNA dobrej jakości, powinien być odpowiedni do tych procedur.
trnF(GAA)-F	Oblique Bio, Inc.	3-0578	Forwardowy starter kontroli pozytywnej
trnL(5’ exon)-C	Oblique Bio, Inc.	3-0579	Reverse'owy starter kontroli pozytywnej
trnLF-C-F1	Oblique Bio, Inc.	3-0864	Forwardowy starter dla dzikiego typu cogongrass
trnLF-C-R1	Oblique Bio, Inc.	3-0865	Reverse'owy starter dla dzikiego typu cogongrass
trnLF-R-F2	Oblique Bio, Inc.	3-0866	Forwardowy starter dla JBG i rewerty JBG
trnLF-R-R2	Oblique Bio, Inc.	3-0867	Reverse'owy starter dla JBG i rewerty JBG
Advantage UltraPure PCR dNTP Mix	Clontech Laboratories	639125
Advantage 2 Polymerase	Clontech Laboratories	639201 lub 639202	Wysokiej jakości polimeraza Taq typu hot-start z aktywnością korekcyjną (proof-reading)