Metoda genotypowania oparta na PCR w celu rozróżnienia między odmianami dzikimi i ozdobnymi Imperata cylindrica

Podsumowanie

Zapewniamy opłacalny i szybki protokół genotypowania molekularnego, który wykorzystuje specyficzne dla odmiany startery PCR, które celują w różnice w sekwencji DNA w regionie dystansowym chloroplastu trnL-F, aby rozróżnić odmiany Imperata cylindrica (cogongrass), których nie można odróżnić na podstawie samej morfologii. Odmiany te obejmują wpisaną na listę federalną szkodliwy chwast, trawę ogoniastą i blisko spokrewnioną, szeroko rozpowszechnioną odmianę ozdobną, I. cylindrica var. koenigii (japońska trawa krwista).

Streszczenie

Zastosowanie tego protokołu molekularnego dostarcza metody do identyfikacji rewertów JBG i może pomóc w zapobieganiu współwystępowaniu tych odmian i ewentualnej hybrydyzacji. Trawa ogonowa jest obowiązkowym krzyżówką, a po skrzyżowaniu z innym genotypem może wytworzyć żywotne, rozproszone przez wiatr nasiona, które rozprzestrzeniają trawę ogoniastą na duże odległości^5-7. JBG ma nieco inny genotyp niż cogongrass i może być w stanie tworzyć żywotne hybrydy z cogongrass. Co więcej, JBG jest bardziej odporny na zimno i cień niż cogongrass^8-10, a przepływ genów między tymi dwiema odmianami prawdopodobnie wygeneruje hybrydy, które są bardziej agresywne, odporne na cień i odporne na zimno niż dzika trawa ogonowa. Podczas gdy trawa ogoniasta typu dzikiego atakuje obecnie ponad 490 milionów hektarów na całym świecie, w południowo-wschodnich Stanach Zjednoczonych atakuje ponad 500 000 hektarów i jest w stanie zająć większość Stanów Zjednoczonych, ponieważ szybko rozprzestrzenia się na północ ze względu na swoją szeroką niszę i potencjał geograficzny^3,7,11. Potencjał krzyżowania genetycznego jest poważnym problemem dla Federalnego Programu Szkodliwego Tygodnia USDA-APHIS. Obecnie USDA-APHIS zabrania JBG w stanach, w których występują poważne inwazje trawy ogoniastej (np. Floryda, Alabama, Mississippi). Jednak zapobieganie łączeniu się tych dwóch odmian może okazać się trudniejsze, ponieważ cogongrass i JBG rozszerzają swoje dystrybucje. Co więcej, rozmieszczenie rewertu JBG jest obecnie nieznane, a bez możliwości identyfikacji tych odmian na podstawie morfologii, niektóre inwazje trawy ogoniastej mogą być wynikiem rewertów JBG. Niestety, obecne metody identyfikacji molekularnej zazwyczaj opierają się na polimorfizmach AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) i sekwencjonowaniu DNA, które są czasochłonne i kosztowne. Tutaj przedstawiamy pierwszą opłacalną i niezawodną metodę genotypowania molekularnego opartą na PCR, aby dokładnie odróżnić cogongrass od JBG revert.

Protokół

1. Pobieranie i konserwacja próbek

Ta metoda została opracowana i przetestowana przy użyciu świeżych, mrożonych i niedawno wysuszonych tkanek liści.

1. Zidentyfikuj tkanki trawy ogoniastej i/lub JBG z pomocą taksonoma specjalizującego się w identyfikacji gatunków traw. Dzięki jaskrawoczerwonym liściom ozdobny JBG jest łatwy do wizualnego odróżnienia od dzikiej trawy ogoniastej i powrotu JBG; jednak powrót cogongrass i JBG są prawie nie do odróżnienia od siebie. Trawa ogonowa i odwrócony fenotyp JBG mają zielone, dłuższe liście, znacznie większe i dłuższe kłącza oraz większą powierzchnię liści niż JBG¹² (ryc. 1).
2. Świeża tkanka liścia zapewnia najobfitsze i najwyższej jakości DNA i może być pobierana z roślin I. cylindrica uprawianych na polu lub w szklarni. Jeśli ma być użyta świeża tkanka, wyekstrahuj DNA w ciągu 3 godzin od pobrania, aby zapobiec degradacji. W przeciwnym razie przygotuj tkankę do przechowywania, utrzymując ją w chłodnym miejscu i z dala od bezpośredniego światła słonecznego.
3. Aby przechowywać tkanki do ekstrakcji DNA w późniejszym terminie, najbardziej optymalną metodą jest natychmiastowe zamrożenie i przechowywanie tkanki w temperaturze -80°C. Nie pozwól, aby zamrożona tkanka rozmroziła się przed ekstrakcją DNA. Przenieś zamrożoną tkankę do ciekłego azotu przed etapami mielenia ekstrakcji DNA, aby zapobiec rozmrażaniu.
4. Jeśli zamrażarka o temperaturze -80°C nie jest dostępna, natychmiast wysusz chusteczkę. W celu przechowywania w suchym miejscu umieść chusteczkę w papierowej kopercie i przechowuj ją w odwodnionym żelu krzemionkowym lub innych aktywnych środkach osuszających w temperaturze pokojowej. Niewielka ilość krzemionki wskaźnikowej zmieszana z krzemionką niewskazującą zapewni, że krzemionka jest w pełni odwodniona i nadaje się do suszenia tkanki roślinnej.
5. Użyj co najmniej 10 razy więcej żelu krzemionkowego niż świeżej tkanki liścia wagowo. Tkanka roślinna powinna wyschnąć w ciągu 24 godzin. Jakość i ilość DNA jest z czasem obniżana poprzez suche przechowywanie (jak w przypadku okazów zielnikowych).

2. Ekstrakcja DNA

Aby wyodrębnić DNA z tkanki roślinnej, postępuj zgodnie z zestawem DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Walencja, CA; Kat. # 69104 lub 69106) z jedną drobną modyfikacją. Zamiast używać sugerowanej ilości mniej niż 100 mg świeżej tkanki lub mniej niż 20 mg suchej tkanki na każdą kolumnę, zmielić więcej niż 100 mg, a następnie przenieść 100 mg ze świeżej lub zamrożonej tkanki (lub > 20 mg z suchej tkanki) do odpowiednich probówek do ekstrakcji. DNA jądrowe i plastydowe jest ekstrahowane jednocześnie.

1. Przed rozpoczęciem tych procedur sprawdź, czy etanol został dodany do AP3/E i AW.
2. Zmielić >100 mg świeżej lub zamrożonej tkanki liścia (lub >20 mg suchej tkanki liścia) na drobny proszek, używając trzech rund ciekłego azotu z mieleniem w schłodzonym moździerzu i tłuczku. Niewystarczające rozerwanie materiału wyjściowego lub niewystarczająca liza mogą również prowadzić do niższej wydajności DNA. Ostrożnie zmiel tkankę i nie przeciążaj kolumn zbyt dużą ilością tkanki.
3. Przenieść 100 mg zamrożonego proszku ze świeżej lub zamrożonej tkanki (lub 20 mg proszku z suchej tkanki) do 1,5 ml probówki wirówkowej zawierającej 400 μl buforu AP1 i 4 μl RNazy A. Każdą probówkę można umieścić w małym stojaku na wadze, aby monitorować prawidłową wagę tkanki na probówkę.
4. Odwirować lub wstrząsnąć próbkę(i) w celu wymieszania i inkubacji przez 10 minut w temperaturze 65 °C, odwracając probówkę (probówki) 2-3 razy podczas inkubacji.
5. Dodać 130 μl buforu AP2 do każdej próbki. Wymieszać, kilkakrotnie odwracając probówkę (probówki) i inkubować przez 5 minut na lodzie.
6. Odpipetować każdy lizat do osobnej kolumny wirowej QIAshredder Mini i umieścić każdą kolumnę w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml (dostarczonej z zestawem). Odwirować kolumnę(y) przez 2 minuty przy 20 000 x g (~14 000 obr./min) i przenieść każdą frakcję przepływową do nowej probówki (niedostarczonej z zestawem) bez przerywania uformowanych osadów.
7. Dodać 1,5 objętości buforu AP3/E i wymieszać pipetując.
8. Przenieść 650 μl mieszaniny do kolumny wirowej DNeasy Mini w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml. Odwirować kolumnę(y) przez 1 minutę przy 6,000 x g (~8,000 obr./min) i odrzucić przepływ. Powtórzyć ten etap z pozostałą mieszaniną dla każdej próbki.
9. Umieścić kolumnę(y) wirową w nowej probówce (probówkach) o pojemności 2 ml i dodać 500 μl buforu AW na górę każdej kolumny. Odwirować kolumnę(y) przez 1 min przy 6,000 x g (~8,000 obr./min) i odrzucić przepływ.
10. Dodaj kolejne 500 μl buforu AW na górze każdej kolumny. Wirować przez 2 minuty przy 20 000 x g (~14 000 obr./min). Ten etap spowoduje wysuszenie kolumny, usuwając w ten sposób wszelkie pozostałości etanolu zawarte w, które mogą hamować PCR.
11. Przenieść każdą kolumnę wirową do nowej probówki z mikrowirówką o pojemności 1,5 ml. Dodać 100 μl buforu AE do górnej części każdej kolumny w celu elucji i inkubować kolumnę(y) przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odwirować kolumnę(y) przez 1 minutę przy 6,000 x g (~8,000 obr./min) w celu zebrania DNA.
12. Powtórz te etapy elucji jeden raz, eluując DNA do tej samej probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, aby uzyskać 200 μl próbki. Próbki DNA należy przechowywać w temperaturze -20°C do czasu użycia. Stężenia DNA zależą od rodzaju tkanki i warunków przechowywania. Optymalne plony uzyskuje się podczas elucji DNA o łącznej zawartości 200 μl buforu AE; Stężenia można jednak zwiększyć, jeśli objętość elucji zostanie zmniejszona do zaledwie 50 μl.

3. Weryfikacja jakości i ilości DNA

1. Przetestuj jakość i ilość wyekstrahowanego DNA przed ustawieniem PCR za pomocą spektrofotometru lub fluorometru i elektroforezy żelowej. Pomoże to zapewnić powodzenie kolejnych kroków.
2. Za pomocą spektrofotometru zbadaj jakość i ilość DNA. Dobra wydajność DNA powinna wynosić od 50 do 150 ng/μl przy proporcjach 260/280 i 230/280 bliskich 2,0. Na przykład rysunek 2 przedstawia dobrej jakości wyniki uzyskane przy użyciu spektrofotometru NanoDrop (ThermoScientific, Wilmington, DE).
3. Przeprowadź elektroforezę przy użyciu standardowego 1% żelu agarozowego. Sprawdź obecność stosunkowo dużych prążków (>10 Kb) bez smug lub z niewielkimi smugami spowodowanymi zanieczyszczeniem RNA (ryc. 3).
4. Jeśli stężenie DNA jest wysokie, rozcieńczyć próbki DNA do 70 ng/μl w celu wykonania kolejnych etapów.

4. Startery PCR

Startery PCR używane w tym protokole są oparte na różnicach sekwencji między regionem dystansowym plastydu trnL-F genotypów cogongrass i JBG. Różnice te występują w postaci SNP (polimorfizmów pojedynczego nukleotydu) i InDels (insercji i delecji), które umożliwiły rozwój starterów specyficznych dla odmiany poprzez lokalizowanie starterów w miejscach unikalnych sekwencji (ryc. 4).

1. Jakość starterów może mieć znaczący wpływ na wyniki PCR. Zamów podkłady w renomowanej firmie. Zamawiamy nasze podkłady w Oblique Bio, Inc. (http://www.obliquebio.com/web/, Huntsville, AL), prosząc tylko o standardowe procedury odsalania.
2. Startery kontroli pozytywnej trnL-F: Ten zestaw starterów wzmacnia plastydowy obszar dystansowy trnL-F większości taksonów traw^11-13 i służy jako dobra kontrola pozytywna (co daje pasmo 890 pz).
   nazwa kolejność trnF(GAA)-F 5'-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3' trnL(5' ekson)-C 5'-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3'
3. Startery do trawy ogonowej typu dzikiego: Ten zestaw podkładów jest specyficzny dla trawy ogonowej i nie wzmacnia regionu trnL-F genotypów JBG. Wynikiem zestawu jest pasmo 595 bp.
   nazwa kolejność trnLF-C-F1 powiedział: 5'-TCCACTTTTTTGAAAAAACAAAGTGCAA-3' trnLF-C-R1 5'-GCCGATACTCTAATAATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
4. Startery JBG i JBG Revert: Ten zestaw starterów jest specyficzny dla genotypu JBG i nie wzmacnia regionu trnL-F trawy ogonowej. Wynikiem zestawu jest pasmo 594 bp.
   nazwa kolejność trnLF-R-F2 5'-CCAAATCCACTTTTTTGAAAAAACAAAAAGTGGTT-3' trnLF-R-R2 5'-CGAGATTCCTTGCCGATACTCTAATAAAA-3'
5. Zawiesić każdy starter w wystarczającej objętości wolnego od nukleaz ddH₂O, aby uzyskać 100 mM roztworów podstawowych, które można przechowywać w temperaturze -20°C przez długi czas.
6. Rozcieńczyć każdy zapas startera do 12 mM przed etapami konfiguracji PCR.

5. Konfiguracja PCR

Ekstrakcje DNA są amplifikowane przy użyciu każdego z powyższych zestawów starterów w reakcjach PCR. Uwzględnij kontrolę pozytywną, aby upewnić się, że wszystkie odczynniki PCR działają dobrze i mogą wygenerować prążek. Uwzględnij kontrolę negatywną, aby upewnić się, że żaden z odczynników nie jest zanieczyszczony niepożądanym DNA. Kontrola ujemna nie zawiera szablonu i powinna skutkować brakiem produkcji pasm

.

1. Przygotuj wszystkie reakcje w cienkościennych probówkach do PCR, aby umożliwić lepszy transfer ciepła między blokiem termocyklera a próbką. Zalecamy używanie dostępnych na rynku końcówek do pipet niezawierających aerozoli, aby uniknąć zanieczyszczenia.
2. Dla każdej wyizolowanej próbki DNA należy przeprowadzić 50 μl reakcji PCR przy użyciu każdego z powyższych zestawów starterów w cienkościennych probówkach PCR o pojemności 0,2 ml, dodając następujące odczynniki na ICE w kolejności podanej poniżej. Jeżeli przygotowywanych jest wiele próbek, należy przygotować koktajl zawierający wszystkie odczynniki z wyjątkiem matrycy DNA, aby ustalić jednolite warunki dla wszystkich reakcji.
   Odczynnik do PCR Używana objętość Końcowe zapieczętowanie Wolne od nukleaz ddH₂O 40,5 μl   Bufor PCR 10X Advantage 2 (Clonetech, Kalifornia) 5,0 μl 10% (v/v) Zaleta UltraPure PCR dNTP Mix (10 mM każdy, Clonetech, Kalifornia) 1,0 μl 0,2 mM Podkład 1 (12μM w ddH₂O) 1,0 μl 0,24 μM Podkład 2 (12μM w ddH₂O) 1,0 μl 0,24 μM Advantage 2 Mieszanka polimerazy (Clonetech, Kalifornia) 0,5 μl 1% (v/v) Ekstrakcja DNA (70 ng/reakcję; w razie potrzeby dostosować objętość ddH₂O) 1,0 μl 1,4 ng/μl   Razem: 50,0 μl  
3. Aby upewnić się, że wszystkie odczynniki PCR działają prawidłowo, ustaw kontrolę pozytywną za pomocą starterów kontroli pozytywnej. Ten zestaw podkładów działa równie dobrze dla cogongrass, JBG, JBG revert i innych traw i daje pasmo o wartości 890 pz.
4. Ustawić kontrolę ujemną przy użyciu tego samego zestawu starterów kontrolnych, co kontrola pozytywna, używając ddH₂O zamiast ekstrakcji DNA. Jeśli wszystkie odczynniki są wolne od zanieczyszczeń DNA, reakcja ta nie spowoduje powstania prążka.
5. Jeśli stężenie DNA jest niskie, do każdej reakcji można dodać więcej DNA, dostosowując ilość DDH₂O bez nukleaz, aby zwiększyć całkowitą objętość reakcji do 50 μl. Nie należy używać więcej niż 5 μl DNA (10% całkowitej objętości) na reakcję, ponieważ ewentualne zanieczyszczenia zawarte w próbkach DNA mogą hamować reakcje PCR.

6. Jazda na rowerze PCR

1. Przeprowadzić amplifikacje PCR w termocyklerze wyposażonym w podgrzewaną pokrywę, stosując następujące parametry cykliczne PCR. Używamy termocyklera Mastercycle pro S (Eppendorf, Hauppauge, NY) ustawionego do pracy w standardowych warunkach narastania temperatury. Każdy wysokiej jakości termocykler powinien działać dobrze.
   cykl Wyżarzanie denaturacyjne polimeryzacja 1 2 min w 95°C   cyfra arabska 30 sekund w 95°C 30 s w 61°C 90 s w 68°C 35 cykli 3   5 min w 68°C Przytrzymaj w temperaturze 4°C, aż próbka zostanie usunięta.
2. Zoptymalizuj warunki PCR (w tym temperaturę wyżarzania startera, czasy wydłużania i liczbę cykli) zgodnie z potrzebami w zależności od jakości DNA, starterów, polimerazy Taq lub rodzaju użytego termocyklera. Zalecamy stosowanie termocyklera z gradientem przy określaniu optymalnych temperatur wyżarzania.
3. Jeśli używany termocykler nie ma podgrzewanej pokrywy, dodaj 1 kroplę oleju mineralnego na wierzch każdej próbki, aby zapobiec parowaniu podczas cyklu PCR.

7. Elektroforeza żelowa produktów PCR

Aby zobrazować wyniki analizy, rozdziel produkty PCR na 1% żelu agarozowym za pomocą standardowej elektroforezy.

1. Połączyć 2 μl standardowego buforu ładującego DNA (zwykle roztwór 5x lub 6x) z 5 μl każdego amplifikowanego produktu PCR.
2. Załadować próbki do 1% żelu agarozowego zawierającego EtBr (bromek etydyny do barwienia DNA) wykonanego za pomocą systemów buforowych TAE lub SB (boran sodu)¹⁶. Używamy 1 μl roztworu podstawowego EtBr o stężeniu 10 mg/ml na 100 ml 1% agarozy (0,1 μg/ml).
3. Uruchom próbki pod napięciem ~120 V, aż czoło barwnika osiągnie 3/4 całkowitej długości żelu.
4. W świetle UV (np. pudełko ze światłem UV o krótkiej fali) należy sprawdzić powstałe pasma, aby zobaczyć, czy odpowiedni fragment został wzmocniony.
5. Udokumentuj żel i powstałe w ten sposób opaski za pomocą dostępnego systemu dokumentacji fotograficznej lub aparatu fotograficznego.

8. Reprezentatywne wyniki

Po wizualizacji produktów PCR, trawa ogonowa ma unikalny wzór pasm w porównaniu do JBG lub odwróconego JBG (Rysunek 5). Dla każdej próbki DNA zestaw starterów kontroli pozytywnej trnL-F powinien skutkować pojedynczym pasmem o wysokiej intensywności przy ~ 890 pz. To sprawdza, czy wszystkie odczynniki PCR działają dobrze. Podobnie, reakcja kontroli ujemnej (bez matrycy) nie powinna zawierać prążków dla żadnego użytego zestawu starterów. Potwierdza to, że żaden z odczynników nie był zanieczyszczony.

Jeśli próbka DNA pochodzi z dzikiej trawy cogongrass, reakcja PCR z użyciem zestawu starterów specyficznych dla cogongrass da wynik pojedynczego pasma przy ~595 pz, podczas gdy startery specyficzne dla JBG nie spowodują braku prążka. Podobnie, jeśli próbka DNA pochodzi z JBG lub odwróconego JBG, reakcja PCR przy użyciu zestawu starterów specyficznych dla JBG spowoduje powstanie pojedynczego prążka przy ~ 594 pz, podczas gdy startery specyficzne dla cogongrass nie spowodują powstania żadnego prążka. Ponieważ JBG i odwrócony JBG mają identyczną sekwencję kwasu nukleinowego, będą miały identyczne wzorce prążków. Jeśli wiele próbek ma być porównywanych na żelu w tym samym czasie, zalecamy umieszczenie wszystkich próbek pochodzących z każdego zestawu starterów obok siebie, co ułatwi skanowanie próbek w celu uzyskania pozytywnych wyników.

Różnice morfologiczne między rewertami JBG i JBG są dość oczywiste (np. czerwony kolor liści i mniejszy wzrost JBG vs. zielone zabarwienie, większy wzrost i agresywny wzrost rewertu JBG), więc chociaż wyniki PCR będą takie same, odmiany JBG są łatwe do odróżnienia za pomocą morfologii roślin.

Rysunek 1. Porównanie uprawianych w szklarniach Imperata cylindrica var. koenigii (japońska trawa krwista), Reverted I. cylindrica var. koenigii (JBG Revert) i I. cylindrica (dzika trawa ogoniasta).

Rysunek 2. Przykład próbek DNA zweryfikowanych za pomocą spektrofotometru NanoDrop. Należy pamiętać, że niezależnie od użytego spektrofotometru, stosunek 260/280 powinien być bliski 1,8, a stosunek 260/230 powinien być bliski 2,0.

Rysunek 3. Próbki DNA weryfikowane za pomocą standardowej elektroforezy żelowej na 1% żelu agarozowym. Do analizy wielkości wykorzystano komercyjny marker DNA. Tor #4 jest przykładem niskiej jakości próbki DNA, wykazującej rozmazywanie i pewne zanieczyszczenie RNA.

Rysunek 4. Wyrównanie sekwencji regionów trnL-F Imperata cylindrica var. koenigii (japońska trawa krwista), Reverted I. cylindrica var. koenigii (JBG Revert) i I. cylindrica (dzika trawa ogoniasta). Pionowe czarne strzałki wskazują różnice w sekwencjach wynikające z SNP i InDels. Poziome zielone strzałki wskazują pozycje starterów z trawy ogonowej typu dzikiego stosowanych do PCR specyficznego dla trawy ogonowej. Poziome czerwone strzałki wskazują pozycje starterów JBG i JBG Revert używanych do PCR specyficznego dla JBG. Proszę kliknij tutaj aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Reprezentatywny wynik elektroforezy żelowej produktów PCR pochodzących z trawy ogonowej, próbek DNA JBG i JBG odwracanych w połączeniu ze starterami specyficznymi dla trawy ogonowej i JBG, a także kontrolą dodatnią trnL-F i kontrolą ujemną bez matrycy.

Dyskusja

Amerykański przemysł szkółkarski i krajobrazowy rozwija się dzięki uprawie i sprzedaży egzotycznych i nowatorskich gatunków roślin. To, w połączeniu z rosnącą globalizacją handlu, zwiększa szanse, że inwazyjny gatunek rośliny wejdzie, zadomowi się i rozprzestrzeni w USA. Zdolność do federalnego regulowania takich roślin opiera się na informacjach, które często nie są dostępne, w tym na potencjale stania się inwazyjnymi, prawidłowej taksonomii i genetycznej odrębności od rodzimych i naturalizowanych taksonów. Ponieważ nasza wiedza na temat roślin inwazyjnych jest często ograniczona, importowane rośliny o ukrytych cechach inwazyjnych zostały dobrowolnie wprowadzone tylko po to, aby później dowiedzieć się, że atakują nasze zasoby rolnicze i naturalne. Protokół ten ma na celu rozwiązanie takich problemów związanych z odmianami I. cylindrica poprzez zapewnienie pierwszej uproszczonej metody molekularnej, która może dokładnie odróżnić dziką trawę ogoniastą od odwróconej formy jej ozdobnego odpowiednika JBG.

W celu opracowania tego protokołu, w czerwcu 2008 r. zebrano dziką trawę ogoniastą z naturalizowanych populacji w Pond Creek Forestry Unit w hrabstwie Santa Rosa w pobliżu Jay na Florydzie. W czerwcu 2008 r. JBG został zakupiony w komercyjnej szkółce (Bluebird Nursery, Inc.), a także z kolekcji właściciela domu w Columbia, MO. W czerwcu 2008 r. uzyskano rewerty JBG z dziedzińca Muzeum Geologicznego Campbell na Uniwersytecie Clemson, SC; z University Park w Riverdale w stanie Massachusetts w czerwcu 2009 r.; oraz z podwórka właściciela domu w Columbia, MO w 2009 r. (zidentyfikowane przez Lelanda Cseke). Wszystkie rośliny były hodowane w szklarni znajdującej się na Uniwersytecie Alabamy w Huntsville (Huntsville, AL).

Sekwencjonowanie genetyczne DNA pobranego z tych roślin obejmowało dogłębne porównania 9 niezależnych regionów DNA powszechnie używanych do oznaczania roślin kodami kreskowymi². We wszystkich przypadkach sekwencje JBG były w 100% zgodne z sekwencjami rewertu JBG, co pomogło zweryfikować, czy JBG rzeczywiście powraca do zielonej, inwazyjnej formy. Tylko jądrowe regiony ITS i chloroplasty trnL-F mają różnice, które można wykorzystać do genetycznego rozróżnienia między cogongrass a JBG. Region ITS ma w sumie 3 SNP (polimorfizmy pojedynczego nukleotydu) między cogongrass a JBG, podczas gdy region trnL-F ma 2 SNP i 2 InDels (insercje i delecje). Te różnice genetyczne pozwoliły na opracowanie specyficznych dla odmiany starterów PCR, które mogą odróżnić kogonia typu dzikiego od rewertów JBG. Najbardziej wiarygodne wyniki uzyskano w przypadku starterów pochodzących z regionu plastydu trnL-F . Tak więc protokół ten opiera się na różnicach sekwencji między regionami trnL-F genomu chloroplastowego trawy ogonowej, JBG i odwróconego JBG (ryc. 4).

Aby pomóc w generowaniu starterów, które są bardziej specyficzne dla badanych odmian i aby uniknąć wyników fałszywie dodatnich od blisko spokrewnionych gatunków, wszystkie znane sekwencje trnL-F odmian I. cylindrica porównano z sekwencjami trnL-F z pokrewnych gatunków traw (43 niezależne sekwencje z 29 gatunków, np. Cymbopogon citratus, Sorghastrum incompletum, Coix lacryma-jobi, Miscanthus sinensis, Saccharum officinarum, Sorgo halepense). Chociaż zbadaliśmy specyficzne dla odmiany sekwencje starterów w 29 gatunkach traw, specyfika starterów specyficznych dla odmiany nie została kompleksowo zbadana pod kątem ich zdolności do amplifikacji DNA z większości innych gatunków traw. W związku z tym tkanka użyta do ekstrakcji DNA powinna być dokładnie zidentyfikowana jako I. cylindrica przed rozpoczęciem tego protokołu. Jeśli trawy nie można zidentyfikować ani jako trawy ogonowej, ani jako JBG, sugerujemy sekwencjonowanie produktu PCR, aby upewnić się, że sekwencje są dokładnie zgodne z trawą ogoniastą lub JBG. Obecnie najdokładniejszą metodą weryfikacji tożsamości danego okazu trawy jest przeprowadzenie PCR zarówno na regionach trnL-F , jak i ITS, a następnie weryfikacja sekwencji produktów PCR i porównanie sekwencji ze znanymi sekwencjami z dokładnie zidentyfikowanych taksonów. DNA można amplifikować za pomocą starterów kontrolnych wyszczególnionych w tym protokole (dla regionu trnL-F ) lub innych starterów dostępnych w innych publikacjach^13-15. Sekwencjonowanie jest znacznie bardziej pracochłonne i kosztowne niż korzystanie z naszej uproszczonej procedury.

Jakość starterów używanych do PCR ma kluczowe znaczenie dla powodzenia procedury. Podstawy do tej procedury udostępniliśmy w firmie Oblique Bio, Inc. (http://www.obliquebio.com/web/, Huntsville, AL). Zaletą zamawiania starterów w Oblique Bio jest to, że przechowują one dużą liczbę podwielokrotności każdego startera z identycznej serii produkcyjnej próbek, co startery, których użyliśmy do optymalizacji w naszym laboratorium. W związku z tym startery nie tylko mają tę samą sekwencję, ale pochodzą z dokładnie tej samej partii produkcyjnej, która została użyta w tym protokole. Stosowanie starterów z tej samej partii może pomóc w uniknięciu zewnętrznych zmiennych w procedurze, które mogą wynikać z różnic w jakości starterów PCR. Podobnie, podczas gdy inne polimerazy Taq powinny działać dobrze w przypadku PCR, jakość użytej polimerazy Taq będzie miała wpływ na jakość wyników PCR. Aby umożliwić lepszą spójność odczynników PCR, zoptymalizowaliśmy protokół przy użyciu odczynników firmy Clontech. Polimeraza Advantage 2 (Clontech, Mountain View, CA, Cat# 639201 lub 639202) jest mieszaniną wytrzymałej, gorącej polimerazy Taq i enzymu do korekty odczytu, która pomaga zapewnić wysoką specyficzność i dokładniejsze amplifikacje.

Ponieważ protokół ten opiera się na chloroplastowym DNA, które jest dziedziczone matczyno u traw, zdarzenia hybrydyzacji między genotypami cogongrass i JBG mogą nie zostać uchwycone za pomocą naszej procedury identyfikacji molekularnej. W przypadkach, w których podejrzewa się hipprydyzację, zalecamy użycie regionów jądrowych, które są dziedziczone od obojga rodziców. Najczęściej stosowanym nieplastydowym regionem zmiennym, który należy uwzględnić w genotypowaniu roślin, jest jądrowy rybosomalny region ITS^13-15,17. Obecnie czynimy postępy w kierunku multipleksacji amplifikacji regionu chloroplastu trnL-F z amplifikacją jądrowego regionu ITS w tej samej probówce PCR. Multipleksowanie plastydu z regionami jądrowego DNA potencjalnie pozwoliłoby obejść ograniczenia związane z używaniem któregokolwiek z nich osobno; Takie metody wymagają jednak optymalizacji i dodatkowej oceny w celu określenia wykonalności w poszczególnych przypadkach. Zastosowanie ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) i nowszych technologii, takich jak latarnie molekularne (fluorescencyjne sondy starterowe), są również oceniane jako bezpieczne i dokładne metody genotypowania roślin.

Przedstawiony tutaj protokół zapewnia szybkie i niezawodne podejście do odróżnienia powrotu JBG od powrotu dziko żyjącej trawy ogoniastej. Zachęcamy użytkowników tego protokołu do skontaktowania się z nami w celu przedstawienia wyników uzyskanych w wyniku korzystania z tego protokołu. Takie udostępnione informacje pomogą w dostarczeniu informacji na temat dystrybucji rewertów JBG. Pomoże to również organom regulacyjnym w USDA w podejmowaniu świadomych decyzji dotyczących działań, które mogą być konieczne w celu obejścia rozprzestrzeniania się i potencjalnej hybrydyzacji wysoce inwazyjnych odmian trawy ogonowej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DNeasy Plant Mini Kit	Qiagen	69104 lub 69106	Każdy renomowany zestaw genomowego DNA roślinnego, który daje dobrej jakości DNA, powinien dobrze sprawdzać się w tych procedurach.
trnF(GAA)-F	Oblique Bio, Inc.	3-0578	Przednią kontrolną kontrolę pozytywną
starter trnL(5' ekson)-C	Oblique Bio, Inc.	3-0579	Podkład do odwróconej kontroli pozytywnej
trnLF-C-F1	Oblique Bio, Inc.	3-0864	Przednie podkłady do trawy ogoniastej typu dzikiego
trnLF-C-R1	Oblique Bio, Inc.	3-0865	Odwrócony podkład do trawy ogoniastej typu dzikiego
trnLF-R-F2	Oblique Bio, Inc.	3-0866	Forward JBG i JBG revert primer
trnLF-R-R2	Oblique Bio, Inc.	3-0867	Odwrócony podkład JBG i JBG
Advantage UltraPure PCR dNTP Mix	Clontech Laboratories	639125
Advantage 2 Polymerase	Clontech Laboratories	639201 lub 639202	Dobra korekta, polimeraza Taq na gorąco