Artykuł metodologiczny

Wyciszanie genów za pomocą RNAi oraz transgeneza poprzez mikroiniekcję u nekromenicznego nicienienia Pristionchus pacificus

DOI:

10.3791/3270

⸱

16 października 2011

 , 
1Biology Department, California State University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W organizmach modelowych transgeneza pozwala na manipulowanie funkcjami genów, podczas gdy RNAi umożliwia wyciszenie specyficznych transkryptów mRNA 1-2. Celem niniejszego protokołu jest przedstawienie technik niezbędnych do wprowadzenia stabilnie dziedziczonego DNA oraz przejściowego dwuniciowego RNA do nekromenicznego nicienia Pristionchus pacificus na potrzeby badań w dziedzinie biologii ewolucyjnej, rozwojowej i behawioralnej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mimo że coraz bardziej przystępne staje się całkowite sekwencjonowanie genomów nowych organizmów modelowych, dalsze pogłębione analizy funkcji i ekspresji genów za pomocą interferencji RNA oraz stabilnej transgenezy pozostają ograniczone u wielu gatunków ze względu na specyficzną anatomię i biologię komórkową organizmów. Na przykład, poza grupą koronową Caenorhabditis, do której należy Caenorhabditis elegans3, w tym licznie reprezentowanym typie (Nematoda) nie zgłaszano stabilnie transmitowanych linii transgenicznych u gatunków spoza rodzaju Caenorhabditis, z wyjątkiem Strongyloides stercoralis4 i Pristionchus pacificus5. Aby ułatwić rozszerzenie roli P. pacificus w badaniach nad rozwojem, ewolucją i zachowaniem6-7, opisujemy tutaj aktualne metody wykorzystania mikroiniekcji do tworzenia zwierząt transgenicznych oraz wyciszania genów za pomocą RNAi. Podobnie jak gonady C. elegans i większości innych nicieni, gonady P. pacificus są syncytialne i zdolne do włączania DNA oraz RNA do oocytów podczas bezpośredniej mikroiniekcji. W przeciwieństwie do C. elegans, stabilna dziedziczność transgenu i jego ekspresja somatyczna u P. pacificus wymagają jednak dodania własnego DNA genomicznego trawionego endonukleazami komplementarnymi do końców docelowych transgenów i markerów koiniekcji5. Konieczność dodania nośnikowego DNA genomicznego jest podobna do wymogu ekspresji transgenu u Strongyloides stercoralis4 oraz w komórkach linii zarodkowej C. elegans. Nie jest jednak jasne, czy ten specyficzny wymóg stosowania własnego DNA genomicznego zwierzęcia wynika z wysokiej wydajności wyciszania niekompleksowych genów wielokopiowych w somie P. pacificus, czy też z faktu, że macierze pozachromosomalne u P. pacificus wymagają sekwencji genomicznych do prawidłowego montażu kinetochorów podczas mitozy. Wentralna migracja dwuramiennych (didelphicznych) gonad u hermafrodyt dodatkowo utrudnia możliwość iniekcji obu gonad u poszczególnych osobników8. Demonstrujemy również zastosowanie mikroiniekcji do wyciszenia dominującego mutanta (roller, tu92) poprzez wstrzyknięcie dwuniciowego RNA (dsRNA) do gonad w celu uzyskania potomstwa F1 o fenotypie nie-roller. W przeciwieństwie do C. elegans, ale podobnie jak większość innych nicieni, szczep P. pacificus PS312 nie jest podatny na systemową RNAi drogą pokarmową lub przez moczenie, dlatego dsRNA musi być podawane poprzez mikroiniekcję do syncytialnych gonad. W niniejszym badaniu dążymy do opisania procesu mikroiniekcji niezbędnego do transformacji reportera fuzyjnego promotor Ppa-egl-4::GFP oraz wyciszenia dominującego mutanta roller prl-1 (tu92) w formie przejrzystego wizualnie protokołu.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Transgeneza: przygotowanie DNA

  1. Dominujący marker współwstrzykiwania: pRL3 [Ppa-prl-1(tu92)]
    Plazmid pRL3 jest dominującym markerem współwstrzykiwania służącym do wizualnej identyfikacji udanych zdarzeń transformacji. Plazmid ten koduje dominujący allel mutantowy (tu92) genu Ppa-prl-1, który jest blisko spokrewniony z genem kolagenu sqt-1 u C. elegans, i przekształca dziki typ sinusoidowego poruszania się w ruchy skręcania zgodnie z ruchem wskazówek zegara wzdłuż osi ciała nicienia1,5. Przekształcone zwierzę jest bardzo podobne do popularnego dominującego markera selekcyjnego rol-6 (su1006) stosowanego u C. elegans przez ostatnie 20 lat.
  2. Docelowy transgen reporterowy: Ppa-egl-4p::gfp
    Gen zainteresowania można powiązać transkrypcyjnie lub translacyjnie z sekwencją kodującą GFP9. W niniejszym badaniu wykorzystano Ppa-egl-4promoter::gfp (egl-4, kinaza białkowa zależna od cGMP), aby sprawdzić, czy fragment o długości 2 kb znajdujący się powyżej miejsca rozpoczęcia translacji może zapewnić ekspresję GFP u P. pacificus PS312. Ten wektor GFP zawiera region kodujący GFP z zmodyfikowanymi
    intronami oraz wielofunkcyjny terminator Ppa-rpl-23 3' UTR5, udostępniony przez Xiaoyue Wang i Ralf J. Sommer (Instytut Maxa Plancka, Tübingen, Niemcy, UE).
  3. DNA genomowe: PS312
    Dodanie genomowego DNA dzikiego typu P. pacificus PS312 jest niezbędne do uzyskania stabilnego dziedziczenia transgenu, szczególnie z transgenicznych zwierząt F1 na ich potomstwo F25. Nie jest jeszcze pewne, czy DNA genomowe tworzy złożone macierze pozachromosomalne z dwoma transgenami (markerem współwstrzykiwania pRL-3 oraz reporterem Ppa-egl-4p::gfp) podobne do tych obserwowanych w stabilnych transgenicznych liniach F2 u C. elegans3. Jednakże wymóg, aby DNA genomowe i transgeny posiadały identyczne lepkie końce, silnie sugeruje tworzenie złożonych macierzy pozachromosomalnych, które komórki gospodarza mogą rozpoznać w celu prawidłowej transmisji DNA (gDNA przygotowane przy użyciu zestawu Sigma G1N10).
  4. Trawienie DNA
    Enzymy restrykcyjne są używane do linearyzacji DNA wektora Ppa-egl-4p::gfp oraz do wytworzenia lepkich końców kompatybilnych z markerem współwstrzykiwania pRL3 i gDNA PS312. Mieszać poprzez delikatne opukiwanie, nie używać vortexa. Inkubować przez jedną godzinę w 37°C.
pRL34 μg
bufor 10x10 μl
PstI (10 U/μl)4 μl
dH2O~
Suma:100 μL
Ppa-egl-4p::gfp4 μg
bufor 10x10 μl
SalI (10 U/μl)4 μl
dH2O~
Suma:100 μl
gDNA PS31210 μg
bufor 10x10 μl
Pst I i Sal I (10 U/μl)8 μl
dH2O~
Suma:100 μl

Tabela 1. Mieszanina do trawienia enzymami restrykcyjnymi.

  1. Wytrącanie i przygotowanie DNA
    1. Do produktu po trawieniu dodać octan sodu w proporcji 1:10 (3 M NaCOOCH3 pH 5.2) oraz 2,5-krotność objętości 100% etanolu; dodać 20 ng/μl glikogenu, aby ułatwić widoczność osadu.
    2. Wirować przy 14 000 rpm przez 15 minut w temperaturze 4°C.
    3. Zlać naddatek, powoli odwracając probówkę wirówkową dnem do góry, a następnie delikatnie stukając nią o ręcznik papierowy, upewniając się, że osad pozostaje stabilny w dolnym rogu probówki i jest wolny od etanolu.
    4. Dodać 1 ml 75% etanolu.
    5. Natychmiast wirować przy 14 000 rpm przez 5 minut w temperaturze 4°C.
    6. Zlać naddatek, powoli odwracając probówkę wirówkową dnem do góry, a następnie delikatnie stukając nią o ręcznik papierowy, upewniając się, że osad pozostaje stabilny w dolnym rogu probówki i jest wolny od etanolu.
    7. Suszyć osad w wirówce próżniowej przy 14 000 rpm przez 5 minut w temperaturze 25-30°C, aż do całkowitego wysuszenia i usunięcia etanolu.
    8. Dodać 30 μl buforu TE lub sterylnej dH2O i pozostawić na noc w temperaturze 4°C przed krótkim wymieszaniem za pomocą wortexa.
    9. Tabela 2 opisuje sposób przygotowania mieszaniny wtryskiwalnej z każdego oczyszczonego DNA.
    10. Przechowywać w temperaturze -20°C. Po rozmrożeniu mieszaniny do wtryskiwania, wirować probówkę przy 14 000 rpm przez 5 minut, aby usunąć cząstki zanieczyszczeń, które mogłyby zapchać igłę wtryskową.
Materiał genetycznyStężenie
Ppa-egl-4p::gfp (SalI)>5 ng/μl (0,1-10 ng/μl)
pRL3 (PstI)>1 ng/μl
gDNA PS312 (PstI + SalI)>60 ng/μl
dH2O~
Suma:30 μl

Tabela 2. Mieszanina do wstrzykiwań Ppa-prl-1

2. Interferencja RNA: Synteza dwuniciowego RNA in vitro

  1. Wykorzystaj PCR do amplifikacji genu docelowego. Do amplifikacji fragmentu genomicznego o długości 464 bp (pozycje 3-466) z wektora pRL3 zawierającego allel Ppa-prl-1(tu92) użyto starterów RHL091 5'- agtggatccGAAGGTCCATACGGGAGC-3' (miejsce BamHI) oraz RHL092 5'- tatctgcagGTGAGGAGTACCAGGAGAG-3' (miejsce PstI).
  2. Poddaj produkt PCR trawieniu enzymami BamHI i PstI.
  3. Liguj fragment do wektora do karmienia RNAi pL44402 strawionego enzymami BamHI/PstI.
  4. Transformuj wektor z wstawką do kompetentnych komórek i hoduj je na płytkach z podłożem LB z ampicyliną (50 μg/ml).
  5. Wyselekcjonuj klony z poprawnie wstawionym wektorem za pomocą PCR z użyciem starterów T7.
  6. Wykorzystaj produkt PCR flankowany sekwencjami T7 zawierający gen prl-1 do otrzymania dwuniciowego RNA (dsRNA) przy użyciu zestawu do syntezy RNAi BLOCK-IT (Invitrogen).
  7. Optymalne stężenie dsRNA do iniekcji wynosi >200 ng/μl, do maksymalnie 1 μg/μl.
  8. Przechowuj w temperaturze -20°C. Po rozmrożeniu mieszaniny do iniekcji, odwirowuj probówkę z prędkością 14,000 rpm przez 5 minut, aby usunąć cząsteczki zanieczyszczeń, które mogłyby zapchać igłę do iniekcji.

3. Mikrowstrzykiwanie: Protokół wstrzykiwania transgenów i/lub dsRNA

  1. Igły do iniekcji
    1. Ustaw temperaturę wyciągacza igieł Narishige (model nr: PC-10):
      1. Przekręć dolne pokrętło na pozycję „No.2 Heater”.
      2. Obracaj pokrętłem „No.2 Heater Adj.”, aż panel wskaże 55,0-60,0°C dla igieł o różnych długościach zwężających się końcówek.
    2. Przekręć dolne pokrętło z powrotem na „Step 1” (wyciąganie igły w jednym kroku).
    3. Włóż igłę do komory i upewnij się, że jest stabilnie zamocowana.
    4. Naciśnij przycisk „Start” (czerwony przycisk) i pozwól na wyciągnięcie igły przy użyciu wszystkich obciążników (powinno to stworzyć dwie identyczne igły w przeciwnych kierunkach).
    5. Wyjmij igły z komory i przechowuj je w plastikowej płytce hodowlanej, unieruchamiając je za pomocą plasteliny Play-Doh, aby zapobiec osadzaniu się kurzu na igłach.
  2. Podkładki montażowe
    1. W probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml przygotuj 2% roztwór Noble Agar, dodając 0,02 g Noble Agar do 1 ml H2O. Agar można przechowywać w temperaturze 4°C do roku.
    2. Dokładnie wymieszaj i rozpuść agar w bloku grzewczym ustawionym na >88°C.
    3. Za pomocą mikropipety 1 ml nanieś kroplę płynnego 2% Noble Agar na środek szkiełka przedmiotowego (Fisher, 12-544-F).
    4. Wyrównaj powierzchnię, kładąc kolejne szkiełko przedmiotowe na kropli.
    5. Powtarzaj „Krok z kroplą”, aż powstanie warstwa z pięciu szkiełek.
    6. Zdejmij każde szkiełko, przesuwając je względem siebie.
    7. Wysusz i wypłaszcz podkładki agarowe na szkiełkach w suszarce próżniowej w temperaturze 70°C przez okres od 4 godzin do całej nocy (lub w temperaturze pokojowej przez całą noc).
    8. Przygotuj wiele podkładek do iniekcji i przechowuj je do przyszłego użytku.
  3. Mikroiniekcja do gonad hermafrodytycznych

figure-protocol-1
Rysunek 1. Schematyczny rysunek anatomii P. pacificus. Przezroczyste komórki z jądrami to żeńskie komórki rozrodcze (oocyty), a szara zacieniona część to jelito. Przedstawiono tylko jeden dystalny przedni gonad, należy jednak zwrócić uwagę, że dwa gonady dystalne krzyżują się grzbietowo w okolicy środka ciała.

figure-protocol-2
Rysunek 2. Obrazy z procesu mikroiniekcji. (A) Końcówka igły do iniekcji znajduje się w ogniskowej, przy prawej krawędzi wyciągniętego fragmentu kapilary. Poprzez lekkie dotknięcie końcówki igły tej krawędzi, końcówka powinna zostać przełamana, zachowując jednocześnie ostry wierzchołek. (B) Igła zostaje wprowadzona do górnego gonadonu tuż nad zakrzywieniem jelita podczas pierwszej iniekcji. (C) Igła zostaje wprowadzona do dolnego gonadonu tuż poniżej zakrzywienia jelita podczas drugiej iniekcji.

    1. Upewnij się, że kontrast oraz ustawienia ścinania DIC są optymalne do obserwacji gonad obojnaków.
    2. Napełnij dociąganą igłę kapilarną 1,0-2,0 μl mieszaniny do iniekcji.
    3. Umieść igłę w manipulatorze do mikroiniekcji; manometry zbiornika z azotem powinny być ustawione na optymalne warunki (10-20 psi przez 0,5-1 s).
    4. Załam końcówkę igły, lekko dotykając jej krawędzi cienkiej kapilary umieszczonej na szkiełku (rycina 2A).
      1. Szkiełko do załamywania igieł: najcieńsza część dociąganej kapilary umieszczona na szkiełku przedmiotowym w kropli oleju.
    5. Po załamaniu igły można ją pozostawić w pozycji spoczynkowej podczas przenoszenia nicienia na podkładkę (P. pacificus ma 5-minutowe okno czasowe na iniekcję przed wyschnięciem i śmiercią).
    6. Korzystając z płytki pełnej nicieni w stadium J4-młodych dorosłych, wlej wystarczającą ilość oleju parafinowego (ciężkiego), aby zakryć wszystkie nicienie na trawniku bakterii OP50.
    7. Pobierz nicienia i umieść go na podkładce do iniekcji.
    8. Umieść szkiełko z nicieniem pod mikroskopem; ustaw gonadę nicienia w kierunku igły, a wulwę w kierunku przeciwnym do igły (rycina 2B, 2C).
    9. Opuść igłę do pozycji widocznej w polu widzenia mikroskopu.
    10. Ustaw górną gonadę i igłę w tej samej płaszczyźnie ogniskowania (rycina 2B).
    11. Delikatnie nakłuj nicienia i wtłocz mieszaninę do iniekcji; rozsuwanie się oocytów w kierunku końca dystalnego świadczy o udanej iniekcji (Aby zoptymalizować dostarczanie transgenu lub dsRNA, bezpośrednio po iniekcji powinna być widoczna fala ekspansji w gonadzie, która trwa aż do zbliżenia się do końca dystalnego).
    12. Przestaw igłę, aby wykonać iniekcję do dolnej gonady i powtórz zabieg; jednak ze względu na to, że ta gonada znajduje się pod jelitem, rozprzestrzenianie się oocytów nie będzie widoczne i jest zatem trudniejsze do osiągnięcia (rycina 2C).
    13. Normalny wygląd nicienia po zabiegu świadczy o udanej iniekcji; nie powinno być żadnych uszkodzonych gonad (wystających z wulwy lub pękniętych wewnątrz jamy ciała).
    14. Przywróć igłę do pozycji spoczynkowej.
    15. Przygotuj się do odzyskania nicienia.
    16. Dodaj kroplę (0,5 μl) buforu M9 na podkładkę, na której znajduje się wstrzyknięty nicień.
    17. Używając pędzelka z bakteriami OP50, dotknij nicienia; powinien on przywrzeć do bakterii. Nie używamy pipet ustnych.
    18. Przenieś nicienia na płytkę z naniesionymi kropelkami 50 μl bakterii OP50; na takich płytkach można odzyskać 2-4 nicienie.
  2. Przechowywanie po iniekcji i przesiewanie pod kątem transgenezy
    1. Przechowuj wstrzyknięte nicienie (P0) w temperaturze 20°C przez ok. 4 dni, aby złożyły jaja i wyrosło pokolenie F1.
    2. Czwartego dnia przesiewaj nicienie pod kątem wybranego fenotypu (Aby przesiewać pod kątem transgenezy, szukaj zwierząt typu roller wykazujących dominantni marker Ppa-prl-1).
    3. Przenieś pojedyncze, niezależne osobniki F1 z obserwowanym fenotypem na nową zasiałą płytkę i przechowuj w 25°C; temperatura ta sprzyja tworzeniu stabilnych linii z pokolenia F1.
    4. Wyizoluj pojedyncze osobniki F2 z niezależnych linii F1. Pojedyncze linie F2 mają podobne wskaźniki transmisji transgenu. Często otrzymujemy >15 linii F2 na jedno przekształcone zwierzę F1.
    5. Przechowuj kolejne pokolenia w 25°C.
    6. Wskaźnik transmisji typu roller zazwyczaj pozostaje stały po pokoleniu F4, dlatego w tym momencie konieczne jest określenie poziomu ekspresji docelowego transgenu (Ppa-egl-4p::gfp) dla każdej poszczególnej linii. Ekspresja GFP może nie korelować ze stopniem penetracji dominantniego fenotypu roller.
  3. Przechowywanie po iniekcji i przesiewanie pod kątem fenotypów RNAi
    1. Przechowuj wstrzyknięte nicienie (P0) w temperaturze 20°C przez ok. 4 dni, aby złożyły jaja i wyrosło pokolenie F1.
    2. Czwartego dnia przesiewaj nicienie F1 pod kątem wybranego fenotypu (Aby przesiewać pod kątem fenotypu wyciszenia RNAi, szukaj penetrujących fenotypów, które mogą być związane z utratą aktywności docelowego genu, w naszym przypadku utratą fenotypu Ppa-prl-1).
    3. Z naszego doświadczenia wynika, że fenotyp wyciszenia non-roller jest tracony w >97% osobników F2.

4. Reprezentatywne wyniki:

1. Wynik transgenezy

SesjaWstrzyknięty P0F1 Rolery% transgenicznych F2Średnia % transmitancji po F2
1602(linia 1) 0%
(linia 2) 13%		ND
13%±10
2401*(linia 3) 0%ND
34000%ND
4401(linia 4) 0%NA
52000%Brak danych
6401(linia 5) 26%22%±10

* samiec roller, który nie skrzyżował; NA: Nie dotyczy

Tabela 3. Wyniki po wstrzyknięciu PS312 z Ppa-egl-4p::gfp (trawiony Sal I), pRL3(roller) (trawiony Pst I) oraz gDNA PS312 (trawiony PstI i SalI).

figure-protocol-3
Rycina 3. (A) typ dziki (B, C) stabilna linia transgeniczna F4 pRL3; Ppa-egl-4p::gfp wykazująca ekspresję GFP w neuronach głowy.

2. Wynik interferencji RNA

figure-protocol-4
Rysunek 4. Mutanty prl-1 po wstrzyknięciu RNA wykazują całkowite zniesienie ruchu typu „toczenia” (rolling). (A) Mutat tu92 z funkcją wzmocnioną (gain-of-function) genu prl-1, wykazujący fenotyp „roller”. (B) Mutant prl-1 z „zniesioną ekspresją” wykazuje prawidłową postawę i lokomocję typu dzikiego. (C) Wstrzyknięty mutant prl-1 (dół) posiada również dłuższe ciało niż mutant prl-1 (góra). (D) Dłuższe ciało wstrzykniętego mutanta prl-1 (dół) jest również dłuższe niż w przypadku szczepu dzikiego PS312 (góra). Fenotyp dłuższego ciała zaobserwowano również podczas wyciszania RNAi rol-5 (sqt-1) w C. elegans N2 (dane niepokaźane).

 zwinięteniezwinięte
A prl-1 dsRNA (200 ng/μl)1321
B prl-1 dsRNA (1000 ng/μl)916
kontrola202

Tabela 4. Podsumowanie iniekcji dsRNA Ppa-prl-1. (A) [dsRNA] = 200 ng/μl; (B) [dsRNA] = 1000 ng/μl. P = 0,0019 i 0,041 według dokładnego testu Fishera, obustronnego, odpowiednio dla iniekcji 200 i 1000 ng/μl.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

P. pacificus populacje występują w ścisłej asocjacji z różnymi gatunkami chrząszczy z rodziny scarabaeidae na całym świecie i stanowią modelowy organizm z grupy nicieni, będący formą pośrednią między nicieniami wolnożyjącymi a pasożytniczymi. Siła *P. pacificus* jako wyłaniający się organizm modelowy, opiera się na integracji map genetycznych i fizycznych, co umożliwia mapowanie pozycyjne mutantów wyizolowanych w ramach bezstronnych forwardowych przesiewów genetycznych (t. j. nie tylko dla genó...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy są bardzo wdzięczni RJ Sommer oraz X Wang za pomoc przy mikroiniekcji, a także anonimowym recenzentom za wnikliwe uwagi. Praca ta jest finansowana z grantu NIH SC2GM089602.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikroskop do mikroiniekcji DMI3000Leica MicrosystemsDMI3000
Manipulator mikroinjektora (napęd bezpośredni)Tritech Research, Inc.Przegub kulowy Narashige BC-3
Wyciągacz do igiełTritech Research, Inc.Narashige PC-10
Mikroinjektor™ W pełni cyfrowy system wielociśnieniowyTritech Research, Inc.Narashige MINJ-D
GeneElute™Zestaw do minipreparatyki genomowego DNA ssaków Sigma-AldrichG1N70
zestaw pJet Cloning JetFermentasK1231
Zestaw GeneJET plasmid Miniprep kitFermentasK0502
Oczyszczanie DNA &Koncentrator™Zymo Research Corp.D4005
BLOCK-IT™ RNAi TOPO® zestaw do transkrypcjiInvitrogenK3500-01 & K3650-01
Difco™Agar NobleFisher ScientificDF0142-15-2
Szkiełko nakrywkowe do mikroskopu (grubość 1,5 - 0,16 do 0,19 mm; rozmiar: 50 x 45 mm)Fisher Scientific12-554-F
Kapilary szklane (filamenty)A-M Systems615000
Olej parafinowy (ciężki)Fisher ScientificO122-1
KH2PO4 Fisher ScientificP386-500
Na2HPO4Fisher ScientificAC20651-5000
NaClFisher ScientificBP3581
MgSO₄4Fisher ScientificM80-500

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  2. Ahringer, J. Reverse Genetics. Wormbook. , (2006).
  3. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
  4. Junio, A. J., Li, X., Massery, H. C., Nolan, T. J., Lamitina, S. T., Sundaram, M. V., Lok, J. B. Strongyloides stercoralis: cell- and tissue-specific transgene expression and co-transformation with vector constructs incorporating a common multifunctional 3' UTR. Exp. Parasitology. 118, 253-265 (2008).
  5. Schlager, B., Wang, X., Braach, G., Sommer, R. J. Molecular cloning of a dominant roller mutant and establishment of DNA-mediated transformation in the nematode Pristionchus pacificus. Genesis. 47, 300-304 (2009).
  6. Hong, R. L., Sommer, R. J. Pristionchus pacificus: a well-rounded nematode. Bioessays. 28, 651-659 (2006).
  7. Hong, R. L., Sommer, R. J. Chemoattraction in Pristionchus nematodes and implications for insect recognition. Curr. Biol. 16, 2359-2365 (2006).
  8. Rudel, D., Riebesell, M., Sommer, R. J. Gonadogenesis in Pristionchus pacificus and organ evolution: development, adult morphology and cell-cell interactions in the hermaphrodite gonad. Dev. Biol. 277, 200-221 (2005).
  9. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 11, 802-805 (1994).
  10. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis. J. Vis. Exp. (47), e2293-e2293 (2011).
  11. Evans, T. C. Transformation and Microinjection. Wormbook. , (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wyciszanie gen w za pomoc RNAitechnika mikroiniekcjiprotok transgenezydwuniciowe RNAprzygotowanie DNA genomicznegomikroskopia fluorescencyjnainiekcja w gonadyprzesiewanie pokolenia F1stabilne dziedziczenie transgenu

Powiązane artykuły