Konstrukcje FSL: prosta metoda modyfikowania powierzchni komórek/wirionów za pomocą szeregu markerów biologicznych bez wpływu na ich żywotność

Podsumowanie

Konstrukcje typu Function-Spacer-Lipid (FSL) pozwalają na modyfikację charakterystyki powierzchni żywych komórek i wirionów bez utraty ich żywotności. Metoda ta wymaga jedynie prostego kontaktu roztworu konstrukcji FSL z komórką lub wirionem, co prowadzi do spontanicznej i stabilnej inkorporacji w powierzchnię.

Streszczenie

Zdolność do modyfikowania/wizualizacji powierzchni biologicznych, a następnie badania zmodyfikowanej komórki/wirionu w szerokim zakresie środowisk in vitro oraz in vivo jest niezbędna do pogłębienia wiedzy na temat funkcji konkretnych cząsteczek lub całego organizmu. Badania nad modyfikacją powierzchni biologicznymi są zazwyczaj ograniczone do inżynierii genetycznej organizmu lub kowalencyjnego przyłączania grup chemicznych do powierzchni komórki^1,2. Jednakże te tradycyjne techniki narażają komórkę na działanie reagentów chemicznych lub wymagają znacznych manipulacji w celu osiągnięcia pożądanego rezultatu, co czyni je uciążliwymi; mogą one również nieumyślnie wpływać na żywotność/funkcjonalność zmodyfikowanej komórki. Konieczna jest zatem prosta metoda bezpiecznego modyfikowania powierzchni komórek.

Niedawno nowa technologia, KODE Technology, wprowadziła szereg nowatorskich konstruktów składających się z trzech komponentów: funkcjonalnej grupy głowowej (F), łącznika (S) oraz ogona lipidowego (L), znanych jako konstrukty funkcja-łącznik-lipid lub FSL3. Łącznik (S) dobiera się tak, aby konstrukty były dyspergowalne w wodzie, a jednocześnie mogły spontanicznie i stabilnie wbudowywać się w błonę.

Do tej pory funkcjonalne części (F) konstruktów FSL obejmowały szereg sacharydów, w tym determinanty związane z grupami krwi, kwasy sialowe, polisacharydy kwasu hialuronowego, fluorofory, biotynę, znaczniki radiacyjne oraz szereg peptydów^3-12. Konstrukty FSL były wykorzystywane do modyfikacji embrionów, plemników, rybek danio-ostroseianek, komórek nabłonkowych/endometrialnych, erytrocytów i wirionów w celu tworzenia systemów kontroli jakości i paneli diagnostycznych, modyfikowania adhezji/interakcji/separacji/immobilizacji komórek, a także do obrazowania komórek/wirionów in vitro i in vivo^3-12.

Proces modyfikowania komórek/wirionów jest ogólny i niezwykle prosty. Najczęstszą procedurą jest inkubacja komórek (w medium wolnym od lipidów) z roztworem konstruktów FSL przez 1-2 godziny w temperaturze 37°C^4-10. Podczas inkubacji konstrukty FSL spontanicznie wbudowują się w błonę, co kończy cały proces. Etap płukania jest opcjonalny. Komórki zmodyfikowane konstruktami FSL nazywa się kodecytami^6-9, natomiast wiriony – kodewirionami¹⁰.

Konstrukcje FSL podawane w formie bezpośrednich infuzji oraz kodecyty/kodewiriony były wykorzystywane w eksperymentalnych modelach zwierzęcych^7,8,10. Wszystkie kodecyty/kodewiriony wydają się zachowywać normalną żywotność i funkcjonalność, zyskując jednocześnie nową funkcję części F^7,8,10,11.

Połączenie zdolności do dyspersji w mediach biokompatybilnych, spontanicznej inkorporacji do błon komórkowych oraz pozornej niskiej toksyczności sprawia, że konstrukty FSL są cennymi narzędziami badawczymi w analizie komórek i wirionów.

Protokół

Poniższy protokół opisuje ogólną procedurę wprowadzania konstruktów FSL (Rysunek 1) do błon biologicznych. Dla uproszczenia w protokole odniesiono się wyłącznie do komórek (kodecytów) w stężeniu 100%. Jednakże termin komórki można zastąpić wirionami (kodewirionami), organizmami lub strukturami komórkowymi, a ich stężenie w rozcieńczalniku nie ma znaczenia, o ile pozostaje ono stałe pomiędzy testami, kontrolami i eksperymentami. W przypadku erytrocytów objętość skumulowanych krwinek wynosi zazwyczaj 80%, natomiast w przypadku wirionów, embrionów i innych komórek jest ona zazwyczaj mniejsza niż 1%. Metoda ta jest bardzo odporna i pozwoli na otrzymanie zmodyfikowanych błon przy zastosowaniu dowolnego z jej wariantów, jednak wymagana będzie optymalizacja w celu ustandaryzowania stopnia modyfikacji niezbędnego dla konkretnych zastosowań.

1. Przygotowanie konstruktów FSL

1. Aby przygotować roztwór zapasowy konstruktu FSL, należy najpierw zrekonstytuować suchy produkt FSL (Tabela 1), dodając 1,0 mL rozcieńczalnika (lub zgodnie z instrukcją dołączoną do produktu) do fiolki z produktem. Następnie krótko sonikować (30 sekund). W ten sposób zostanie przygotowany roztwór o stężeniu 1 mg/mL, który można podzielić na alikwoty po 100 μL do sterylnych pojemników i przechowywać w temperaturze 2-8°C do jednego tygodnia lub zamrozić na okres do 3 miesięcy.
2. Aby przygotować robocze roztwory konstruktu FSL do insercji, bezpośrednio przed użyciem należy krótko sonikować (30 sekund) roztwór zapasowy w celu homogenizacji miceli. Konstrukt FSL należy rozcieńczyć w buforze (najlepiej nie zawierającym lipidów ani materiałów silnie hydrofobowych) do wymaganego stężenia lub do pożądanego zakresu stężeń.

Uwagi:

1. Konstrukty FSL zazwyczaj wbudowują się w komórki w mediach zawierających lipidy, ale zazwyczaj wymagają nawet 50-krotnie wyższych roboczych stężeń FSL niż w przypadku PBS lub innych mediów wolnych od lipidów.
2. Zakres rozcieńczeń roboczych zależy od zastosowania, czułości metody detekcji, rodzaju konstruktu FSL oraz wymaganego stopnia modyfikacji. Zazwyczaj zakres rozcieńczeń wynosi od 10-500 μg FSL na mL rozcieńczalnika dla węglowodanowych konstruktów FSL oraz 1-100 μg/mL dla innych konstruktów FSL, takich jak fluorofory i biotyna.
3. W przypadku przygotowywania rozcieczalników do wbudowywania zawierających wiele konstruktów FSL, należy po prostu dodać konstrukty do tego samego rozcieczalnika w ich normalnych stężeniach roboczych. Jeśli jeden konstrukt znajduje się w znacznie wyższym stężeniu niż inny, może być wymagana pewna korekta (zwiększenie) stężenia konstruktu o niższym stężeniu. Alternatywnie konstrukty można dodawać sekwencyjnie, najlepiej zaczynając od konstruktu o najwyższym stężeniu, a następnie dodając pozostałe.
4. Stężenia konstruktów FSL powyżej 1000 μg/mL mogą wprowadzić znaczące ilości lipidów do błony komórkowej, co może zmienić kształt komórki lub zwiększyć jej podatność na lizę.
5. Robocze roztwory konstruktów FSL należy przechowywać w temperaturze 2-8°C i zużyć w ciągu kilku dni.
6. Konstrukty FSL można rozcieńczać w wodzie, jednak ich stabilność będzie ograniczona i muszą one zostać zużyte w ciągu kilku godzin. Jeśli ulotka dołączona do opakowania określa wodę jako rozcieczalnik do rekonstytucji, produkt w fiolce będzie zawierał również sole (zgodnie z informacją w ulotce).

2. Wprowadzanie konstruktu(ów) FSL do błon

1. W pierwszej kolejności należy wyprać komórki przeznaczone do modyfikacji FSL, aby usunąć niezwiązane lipidy, stosując wirowanie oraz PBS lub bezlipidowe medium komórkowe jako roztwór do płukania.
2. Należy upakować komórki lub zawiesić je w 100 μL rozcieńczalnika.
3. Równocześnie należy przygotować kontrole, którymi w idealnym przypadku powinny być zarówno komórki niemodyfikowane (inkubowane z PBS zamiast roztworu FSL), jak i/lub komórki zmodyfikowane łagodnym, ale pokrewnym konstruktem FSL.
4. Do komórek należy dodać 100 μL odpowiedniego rozcieńczenia roztworu FSL (zawierającego jeden lub więcej konstruktów FSL) i inkubować przez 1-2 godziny w temperaturze 37°C. Podobny wynik można uzyskać poprzez 6-godzinną inkubację w 25°C lub inkubację nocną (18 godzin) w 4°C – w przypadku stosowania gęstych zawiesin komórkowych zaleca się mieszanie co kilka godzin.
5. Opcjonalnie należy dwukrotnie wyprać komórki za pomocą PBS lub medium, aby usunąć wszelkie wolne konstrukty FSL, a następnie przygotować odpowiednią zawiesinę.

Uwagi:

1. Rozcieńczalnik używany do zawieszenia komórek może być pożywką do hodowli komórkowej, PBS, roztworami do przechowywania komórek itp., jednak najlepiej, aby nie zawierał lipidów (np. płodowej surowicy cielęcej) ani detergentów (np. TWEEN).
2. Można zastosować inne objętości (niż 100 μL), stosunki (niż 1:1 komórki/roztwór FSL) lub inne warunki inkubacji pod względem czasu i temperatury, pod warunkiem zachowania tego samego stosunku, stężenia i objętości w celu uzyskania powtarzalnych wyników.

3. Praca z próbkami i wizualizacja

1. Po zakończeniu procesu modyfikacji FSL kodecyty można przechowywać w temperaturze 4-8°C w mediach wolnych od lipidów lub poddać dalszej analizie.
2. Kodecyty i kodewiriony zazwyczaj zachowują się tak samo jak niemodyfikowane komórki/wiriony i mogą być przetwarzane oraz analizowane w standardowych systemach badawczych (mikroskopia, serologia, cytometria przepływowa itp.). Zazwyczaj nie mają one specjalnych wymagań, z wyjątkiem unikania rozpuszczalników/detergentów/lipidów, które mogłyby spowodować eluowanie konstruktów lipidowych z błon.

Uwagi:

1. Konstrukty pozostaną w błonie nieaktywnych komórek, takich jak erytrocyty, jeżeli będą przechowywane w mediach wolnych od lipidów przez czas życia komórki. W komórkach o aktywnych błonach konstrukty zostaną zinternalizowane i zmetabolizowane w tempie zależnym od aktywności błony komórkowej.
2. Martwe komórki zazwyczaj zawierają wysokie poziomy konstruktów FSL; można to wykorzystać do oddzielenia komórek nieżywotnych od żywotnych.
3. Jeśli kodecyty są przechowywane (lub stosowane in vivo) w mediach/środowiskach zawierających lipidy, takich jak surowica/osocze, konstrukt będzie powoli eluował z błony w ciągu wielu godzin lub dni, w zależności od temperatury oraz stężeń i składu lipidów.

4. Reprezentatywne wyniki:

1. Poniższe reprezentatywne wyniki zależą od zastosowanego konstruktu (Tabela 1), jego stężenia wstawionego oraz względnej czułości i swoistości systemu(ów) detekcji. Generalnie wszystkie konstrukty FSL zostaną wstawione do komórek po 1 godzinie, jednak dla każdej sytuacji należy ustalić optymalne warunki.
2. Konstrukty FSL mogą być wykorzystywane do znakowania powierzchni różnych żywych komórek^3-9,11,14. W przykładach przedstawionych na Rysunku 2 wykorzystano embriony na różnych etapach rozwoju (ponieważ są one kruchymi komórkami), ale można również znakować inne komórki (Rysunek 3) lub wiriony otoczkowe (Rysunek 4). FSL-Fluoresceina umożliwia bezpośrednie znakowanie powierzchni (Rysunki 2-4), natomiast FSL-biotyna i inne konstrukty FSL mogą wymagać zastosowania wtórnego systemu detekcji (zazwyczaj awidyny/przeciwciał/lektyn), aby wykazać ich obecność (Rysunki 5).
3. Markery grup krwi o swoistości ludzkiej lub zwierzęcej mogą być przyłączane do komórek, w tym do erytrocytów^4-9 (Rysunek 6). Ponieważ ilość konstruktu FSL na kodecycie jest kontrolowalna i powtarzalna^4-6, można tworzyć kodecyty do oznaczania ilości przeciwciał (Tabela 2 i Rysunek 6). Rzeczywiste źródło komórek nie jest istotne; mogą one pochodzić od dowolnego gatunku, a nawet z tego samego źródła co przeciwciała, co zapewnia, że jedynym niekompatybilnym antygenem jest ten wprowadzony przez FSL^7,8 (Rysunek 6).

Tabela 2. Reprezentatywne reakcje serologiczne trzech różnych kodecytów erytrocytarnych FSL-A(tri) przebadanych z rozcieńczeniami przeciwciał monoklonalnych anty-A. Roztwór FSL-A(tri) o stężeniu 50 μM po inkubacji z równą objętością erytrocytów grupy O wytworzył komórki silnie dodatnie pod względem antygenu A, które można było wykryć przy rozcieńczeniu przeciwciał monoklonalnych anty-A w stosunku 1:512. Roztwory FSL-A(tri) o stężeniu 5- i 10-krotnie niższym wytworzyły kodecyty o słabszej ekspresji antygenu grupy krwi A.

Rycina 1. Przegląd konstrukcji FSL. Podobnie jak kwiat, konstrukcje FSL składają się z trzech głównych elementów. Głowa funkcjonalna (F) w przypadku konstrukcji FSL może stanowić szereg różnych grup biologicznie czynnych; przekładka (S) jest zaprojektowana tak, aby oddalić F od błony, poprawić rozpuszczalność w wodzie i być nieaktywna w obecności surowicy, natomiast lipid diacylowy umożliwia spontaniczne wbudowywanie się konstrukcji w powierzchnie. (I) FSL-GB3 z epitopem trisacharydowym grupy krwi Gb₃ (lub P^k) Galα4Galβ4Glcβ. (II) FSL-A(tri) z epitopem trisacharydowym grupy krwi A GalNAcα3(Fucα2)Galβ. (III) FSL-Fluoresceina. (IV) FSL-biotyna z pojedynczą grupą F biotyny. Grupy funkcjonalne w strukturach I-III są sprzężone z aktywowaną pochodną adipianu dioleofilofosfatydyloetanolaminy (DOPE), natomiast przekładka w strukturze IV opiera się na adipianie karboksymetyloglicyny.

Rysunek 2. Znakowane fluoresceiną FSL zarodki mysie. Wszystkie obrazy przedstawiają żywe zarodki, które zostały znakowane w stanie nienaruszonej błony przejrzystej (ZP) (tzn. konstrukt FSL przeniknął przez ZP, aby oznakować znajdujący się wewnątrz zarodek). Obrazy I-IV przedstawiają zarodki pozbawione ZP, uwolnione z błony przejrzystej za pomocą kwasowego roztworu Tyrode'a po znakowaniu fluoresceiną FSL. Identyczne barwienie występuje niezależnie od tego, czy zarodki modyfikowano FSL przy nienaruszonej ZP, czy po jej usunięciu. Zarodki znakowano bezpośrednio fluoresceiną FSL metodą 2-godzinną w 37°C w bezzerowym medium hodowlanym, przemywano, a następnie badano pod mikroskopem fluorescencyjnym. (I) Pozbawiony ZP dwukomórkowy zarodek mysi, wykazujący również klasyczne intensywne barwienie ciałek polarnych. (II-III) Pozbawione ZP czterokomórkowy i ośmiokomórkowy zarodek mysi, oba wykazujące cień barwienia komórek znajdujących się poza płaszczyzną ostrości mikroskopu. (IV) Pozbawiony ZP 16-komórkowy zarodek mysi. (V) Zarodki mysie w stadium blastocysty (d4-d5) z nienaruszoną ZP, gdzie zarówno zarodek, jak i błona przejrzysta są znakowane.

Rysunek 3. FSL-Fluoresceina i danio pręgowany¹⁴. (I) Mikroangiografia larwy danio pręgowanego w 52 hpf (godziny po zapłodnieniu), po bezpośrednim wstrzyknięciu FSL-Fluoresceiny do krwiobiegu. Układ naczyniowy danio pręgowanego jest zabarwiony. (II) Heterogeniczne komórki tkanki nerkowej danio pręgowanego (ZK kodecyty) z FSL-Fluoresceiną zostały stworzone ex vivo, a następnie mikroiniekcyjne podano do krwiobiegu biorcy danio pręgowanego w 52 hpf. Obserwacje in vivo ZK kodecytów przeprowadzono 2 godziny po iniekcji, obrazując naczynia krwionośne w świetle fluorescencyjnym za pomocą mikroskopii time-lapse. Przedstawiono pojedynczą klatkę wideo z dużymi, wolno poruszającymi się lub nieruchomymi komórkami (oznaczonymi pomarańczowymi strzałkami) oraz komórkami szybko poruszającymi się (rozmyte obrazy z powodu ruchu – oznaczone zielonymi strzałkami). Znakowanie umożliwia obserwację in vivo w czasie rzeczywistym zachowania i biodystrybucji ZK kodecytów. (III) Pobranie doustne FSL-Fluoresceiny osiągnięto poprzez zanurzenie embrionów danio pręgowanego w pożywce zawierającej FSL-Fluoresceinę przez maksymalnie 5 dni. Płukanie zrealizowano poprzez przeniesienie embrionów do pożywki niezawierającej konstruktów FSL (wymagane jest co najmniej 6 godzin, ale proces ten może trwać kilka dni). (IIIa) Mikroskopia w polu jasnym danio pręgowanego traktowanego FSL-Fluoresceiną, odpowiadająca sąsiedniemu obrazowi fluorescencyjnemu (IIIb). Fluorescencja była zlokalizowana preferencyjnie w przewodzie pokarmowym. Nie zaobserwowano zabarwienia w nieleczonych embrionach kontrolnych (IVa i IVb).

Rycina 4. Znakowanie wirionów¹⁰ VSV i H1N1 fluoresceiną FSL. (I) Wirus zapalenia pęcherzykowego jamy ustnej (VSV) został bezpośrednio znakowany 10 μg/ml fluoresceiny FSL przez 2 h w 37°C, a następnie utrwalony 4% paraformaldehydem i poddany cytometrii przepływowej. Po znakowaniu FSL nie było konieczne oczyszczanie kodewirionu VSV. (II) Cytometria przepływowa komórek jąder świni zainfekowanych kodewirionami ludzkiego wirusa A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1) znakowanymi fluoresceiną FSL. Komórki niezainfekowane są reprezentowane przez czarną linię, natomiast fuzja kodewirionu H1N1 z komórkami ST skutkuje powstaniem komórki fluorescencyjnej (czerwona linia).

Rysunek 5. Komórki znakowane FSL-biotyną i ich późniejsza wizualizacja za pomocą znakowanej awidyny^7,8. Wszystkie komórki zostały najpierw znakowane FSL-biotyną przez 1 h w 37°C, przemyte, a następnie poddane reakcji z awidyną znakowaną fluorophorem, przemyte i zamontowane na mokro do mikroskopii fluorescencyjnej. (I) Złożony obraz konfokalny blastocysty zarodka mysiego. (II) Centralny przekrój konfokalny zarodka z poprzedniego obrazu. (III) Żywe, ruchome plemniki ludzkie – rozmycie wynika z ich ruchu. (IV) Utrwalone (4% paraformaldehydu po insercji) plemniki ludzkie. (V) Erytrocyt ludzki. (VI) Utrwalona (4% paraformaldehydu przed insercją) ludzka linia raka endometrium RL95. (VII) Nieutrwalona ludzka linia raka endometrium RL95. (VIII) Biotynowe kodecyty RBC zaobserwowane w próbce krwi pobranej 2 godziny po dożylnej infuzji kodecytów, gdzie (VIIIa) przedstawia pole widzenia w mikroskopii świetlnej, a (VIIIb) to to samo pole widzenia w fluorescencji, identyfikujące dwa kodecyty obecne w polu widzenia. Obliczenie stosunku kodecytów do nieznakowanych komórek może służyć jako wskaźnik przeżywalności. (IX) Żywe ludzkie biotynowe kodecyty endometrium wizualizowane poprzez wiązanie z kuleczkami awidynyl化した.

Rysunek 6. Węglowodany FSL do dodawania markerów grup krwi w celu profilowania serologicznego. (I) Ludzkie erytrocyty-kodecyty Galili zostały utworzone z ustalonym stężeniem FSL-Galili (500 μg/mL) i przetestowane przeciwko rozcieńczeniom ludzkiej surowicy. W ludzkich erytrocytach naturalnie nie występuje ksenoantygen Galili. Takie kodecyty mogą być wykorzystane do ilościowego oznaczenia poziomu przeciwciał w surowicy. W tym przykładzie ustalono, że dawca ma miano anty-Galili wynoszące 1:32. (II) Poprzez tworzenie kodecytów z malejącymi poziomami FSL („miana antygenów”), można określić optymalny poziom antygenu do wykrywania przeciwciał (w tym przykładzie Le^a). Komórki mogą być tworzone tak, aby dawały wynik dodatni tylko wtedy, gdy poziom przeciwciał przekracza określone miano. Poziom antygenu FSL wymagany do uzyskania wyniku dodatniego zależy od jakości i poziomu wykrywanych przeciwciał. W przypadku antygenów węglowodanowych, roztwór FSL o stężeniu 100 μg/mL zazwyczaj skutkuje silną reakcją dodatnią. (III) Ludzkie erytrocyty grupy O zostały zmodyfikowane tak, aby posiadały określony poziom antygenu A (standardowe kodecyty A), i wykorzystane do dokładnego i powtarzalnego ilościowego oznaczenia anty-A w ludzkiej surowicy. W tym przykładzie miano anty-A w badanej surowicy grupy O wynosi 1:32, a kodecyty zostały przygotowane z własnych erytrocytów dawcy. (IV) Antygeny grup krwi A i B wprowadzane jednocześnie do jednej próbki ludzkich erytrocytów grupy O są wykorzystywane do tworzenia kodecytów A_weakB_weak. Kodecyty te mogą być stosowane do kontroli jakości układu ABO. Wynik ten przedstawia analizę specjalnie sformułowanego kodecytu A_weakB_weak przetestowanego przeciwko odczynnikom anty-A i anty-B, co daje oczekiwane słabe reakcje.

Dyskusja

Modyfikowanie komórek i wirionów za pomocą konstruktów FSL jest bardzo prostą i niezawodną techniką^3-11. Aby opisać i odróżnić komórki oraz wiriony zmodyfikowane konstruktami FSL od tych niemodyfikowanych, określa się je odpowiednio mianem kodecytów i kodewirionów^6-10, jednak tylko wtedy, gdy można wykazać obecność wprowadzonej grupy funkcyjnej na ich błonie. W przypadku tworzenia kodecytów z różnych stężeń konstruktów FSL, można je określać według stężenia roztworu konstruktu FSL użytego do ich wytworzenia, np. kodecyty A 15 μg/mL, a w przypadku użycia więcej niż jednego FSL – terminem łączonym, np. kodecyty A+biotyna^7,8. Przy porównywaniu różnych komórek zaleca się uwzględnienie typu komórki w opisie, np. biotinowe kodecyty erytrocytów lub biotinowe kodecyty endometrium^7,8.

Choć proces insercji jest bardzo wydajny, a sama insercja (choć z różną szybkością) zachodzi w szerokim zakresie temperatur od 4 - 37°C w czasie od kilku minut do kilku godzin, uzyskanie powtarzalnych wyników wymaga ścisłej kontroli czasu kontaktu, temperatury, stężenia FSL (w tym składu rozcieńczalnika), a w mniejszym stopniu stężenia komórek. Do tej pory wszystkie konstrukty FSL mogły być wykorzystywane do modyfikacji komórek tą samą techniką^4-11, jednak przewiduje się, że określone warunki będą bardziej korzystne dla przebiegu prac i/lub optymalnych wymagań dotyczących postępowania z modyfikowanymi komórkami/wirionami. Dokładne stężenie FSL niezbędne do osiągnięcia pożądanego efektu musi zostać określone przez użytkownika⁴. Uzyskane w ten sposób zmodyfikowane konstruktami FSL komórki/wiriony można zazwyczaj stosować w systemach biologicznych lub analitycznych w taki sam sposób, jak niemodyfikowane komórki/wiriony^4-11. Ponieważ konstrukty FSL będą powoli wymywać się z zmodyfikowanych powierzchni w kontakcie z roztworami lipidów^7,8 lub będą zużywane przez aktywne komórki¹¹, kwestie te należy uwzględnić w odniesieniu do poziomu sygnału lub aktywności otrzymywanej w czasie. Kodecyty można utrwalać (np. glutaraldehydem/formaliną) po insercji, pod warunkiem, że utrwalacz nie zawiera rozpuszczalników wymywających lipidy, a grupa funkcyjna jest kompatybilna z utrwalaczem. Alternatywnie można modyfikować konstruktami FSL komórki uprzednio utrwalone.

Oprócz modyfikacji powierzchni komórek i wirionów, konstrukty FSL mogą być również wprowadzane bezpośrednio do krwiobiegu zwierząt laboratoryjnych, powodując modyfikację komórek krążących in vivo⁷ oraz hamując działanie wirusów¹², toksyn¹² i przeciwciał⁷. Konstrukty FLS stosowano także do dekorowania liposomów oraz do nanoszenia na powierzchnie papierowe¹³, gdzie ulegają immobilizacji, a następnie mogą być wykorzystywane w testach diagnostycznych.

Zdolność do łatwego modyfikowania żywych komórek coraz szerszym zakresem konstruktów FSL powinna okazać się użytecznym narzędziem badawczym i rozwojowym w badaniach nad biologią powierzchni komórki.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Nazwa Sigma	Firma	Numer produktu Sigma	Konstrukt (nazwa KODE Biotech)
FSL-A(tri)	Sigma-Aldrich	F9307	FSL-A(GALNa3[Fa2]GALb)-SA1-L1
FSL-B(tri)	Sigma-Aldrich	F9557	FSL-B(GALa3[Fa2]GALb)-SA1-L1
FSL-GB3	Sigma-Aldrich	F9807	FSL-GB3(GALa4GALb4GLCb)-SA1-L1
FSL-Lea(tri)	Sigma-Aldrich	F9682	FSL-LEA(GALb3[Fa4]GLCNb)-SA1-L1
FSL-biotin	Sigma-Aldrich	F9182	FSL-CONJ(1Biotin)-SC2-L1
FSL-Galili	Sigma-Aldrich	F9432	FSL-GALILI(GALa3GALb4GLCNb)-SA1-L1
FSL-Fluorescein	Sigma-Aldrich	F1058	FSL-FLRO4(fluorescein)-SA2-L1
Tabela 1.