Śledzenie pełzania wewnątrznaczyniowego, migracji transendotelialnej i chemotaksji neutrofili w tkankach za pomocą intravitalnej wideomikroskopii

Podsumowanie

Opisujemy protokół mikroskopii intravitalnej w świetle jasnym do pomiaru dynamicznych oddziaływań między neutrofilami a komórkami śródbłonka podczas rekrutacji neutrofili w odpowiedzi na źródło chemoatraktanta dla neutrofili in vivo. Pełzanie neutrofili wewnątrz naczyniowych, migracja transendotelialna oraz chemotaksja w tkance mięśnia kroczo ścięgnistego myszy są wizualizowane za pomocą fotografii wideo z odstępami czasu i śledzone przy użyciu programu ImageJ.

Streszczenie

Rekrutacja krążących leukocytów z krwiobiegu do zapalnej tkanki jest kluczowym i złożonym procesem stanu zapalnego^1,2. W żylkach poprzecapilarnych zapalnej tkanki leukocyty początkowo wiążą się i toczą po powierzchni luminalnej ściany żylki. Toczące się leukocyty zatrzymują się na śródbłonku i ulegają silnej adhezji w odpowiedzi na chemokiny lub inne chemoatraktanty obecne na powierzchni żylki. Wiele przylegających leukocytów przemieszcza się z pierwotnego miejsca adhezji do miejsca ekstrawazacji w złączach śródbłonka, co jest procesem nazywanym pełzaniem wewnątrzluminalnym³. Po pełzaniu leukocyty przechodzą przez śródbłonek (transmigracja) i migrują w tkance naczyniowej w stronę źródła chemoatraktanta (chemotaksja)⁴. Mikroskopia witalna jest potężnym narzędziem do wizualizacji oddziaływań leukocytów z komórkami śródbłonka in vivo oraz odkrywania komórkowych i molekularnych mechanizmów rekrutacji leukocytów^2,5. W niniejszym raporcie przedstawiamy szczegółowy opis wykorzystania mikroskopii witalnej w polu jasnym do wizualizacji i określenia szczegółowych procesów rekrutacji neutrofili w mięśniu krestrowym myszy w odpowiedzi na gradient chemoatraktanta neutrofili. Aby wywołać rekrutację neutrofili, niewielki fragment żelu agarozowego (rozmiar ~1-mm³) zawierający chemoatraktant neutrofili MIP-2 (CXCL2, chemokina z rodziny CXC) lub WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, syntetyczny analog peptydu bakteryjnego) jest umieszczany na tkance mięśniowej obok obserwowanej żylki poprzecapilarnej. Przy użyciu fotografii wideo z odstępami czasu (time-lapse) oraz oprogramowania komputerowego ImageJ, wizualizowane i śledzone są pełzanie wewnątrzluminalne neutrofili po śródbłonku, migracja transendotelialna neutrofili oraz migracja i chemotaksja w tkance. Protokół ten umożliwia wiarygodną i ilościową analizę wielu parametrów rekrutacji neutrofili, takich jak prędkość pełzania wewnątrzluminalnego, czas transmigracji, czas odrywania się, prędkość migracji, prędkość chemotaksji oraz indeks chemotaksji w tkance. Wykazujemy, że stosując ten protokół, można stabilnie określić te parametry rekrutacji neutrofili i wygodnie śledzić ruch pojedynczych komórek in vivo.

Protokół

1. Przygotowanie chemoatraktanta w żelu agarozowym

1. Do stożkowej probówki o pojemności 50 mL odpipetować 10 mL 2×PBS, a następnie ogrzać probówkę, umieszczając ją w zlewce z gorącą wodą.
2. Do drugiej stożkowej probówki o pojemności 50 mL (z lekko poluzowaną zakrętką) odpipetować 10 mL wody destylowanej i dodać 0,4 g agarozy w proszku, a następnie podgrzewać mieszaninę w kuchence mikrofalowej aż do momentu wrzenia (ok. 1 min w kuchence o mocy 700 W).
3. Dodać ogrzany 2×PBS do probówki z roztworem agarozy, wymieszać roztwór poprzez delikatne potrząsanie i utrzymać go w cieple w zlewce z gorącą wodą.
4. Za pomocą mikropipety nanieść roztwór chemoatraktanta (np. 10 µl 0,5 µg chemokiny CXC MIP-2 lub 12 µl 1 mM WKYMVm) do zakrętki probówki Eppendorf o pojemności 1,5 mL zawierającej 3 µl tuszu indyjskiego, a następnie dokładnie wymieszać metodą aspiracji mikropipetą (unikając powstania pęcherzyków powietrza).
5. Odciąć końcówkę końcówki do pipety o pojemności 200 µl i nanieść mikropipetą 110 µl roztworu agarozy (42°C) do zakrętki, po czym bezzwłocznie dokładnie wymieszać inną końcówką do pipety (unikając powstania pęcherzyków powietrza).
6. Przechowywać żel zawierający chemoatraktant w temperaturze +4°C.

2. Przygotowanie mięśnia kremastra do mikroskopii intravitalnej (Rysunek 1)

1. Znieczulić dorosłą samca myszy poprzez podanie dożylnie (i.p.) mieszaniny 10 mg/kg ksylazyny i 200 mg/kg chlorowodorku ketaminy.
2. Wygolić maszynką elektryczną obszar nad prawą żylną zewnętrzną oraz przednią część moszny. Po podaniu znieczulenia należy poświęcić szczególną uwagę i zapewnić odpowiednią opiekę znieczulonej myszy. W celu zapobiegania hipotermii u myszy można zastosować lampę grzewczą. Mysz nie powinna wykazywać odruchu bólowego.
3. Wyciąć nacięcie poziome, odnaleźć i wprowadzić kaniulę do żyły szyjnej, używając rurki PE-10 wypełnionej solą fizjologiczną z heparyną w stężeniu 100 U/mL. Kanulacja żyły szyjnej jest niezbędna do podawania dodatkowych środków znieczulających i leków w razie potrzeby.
4. Uszywać tylne kończyny myszy taśmą pępkową, kładąc mysz na plecach na wykonanej samodzielnie platformie do badania mięśnia opuszkowego (Rysunek 1).
5. Podłączyć platformę do cyrkulatora wody o temperaturze 37°C, aby utrzymać ciepłotę mięśnia opuszkowego i ciała myszy.

Uwaga: Wszystkie procedury od 2.6 do 2.14 muszą być wykonywane bardzo delikatnie⁵.

6. Wykonaj nacięcie skóry moszny, aby odsłonić lewy mięsień zasłonowy. Ostrożnie odseparuj mięsień od powiązkowej tkanki otaczającej.
7. Przepłucz mięsień zasłonowy podgrzanym do 37°C roztworem soli fizjologicznej z buforowaniem wodorowęglanowym (131,9 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 MgSO₄, 20 NaHCO₃, w mM, pH 7,4), używając pompy perystaltycznej.
8. Przymocuj szwem 4−0 dystalny koniec mięśnia zasłonowego, aby unieruchomić go na przezroczystym szklanym postumencie płytki do mięśnia zasłonowego.
9. Wypal mięsień zasłonowy wzdłuż jego osi. Używając szwu 4–0, rozprostuj mięsień i zabezpiecz go wzdłuż krawędzi na postumencie. Oddziel jądro i najądrze od leżącego pod nimi mięśnia i przesuń je do jamy brzusznej.
10. Przepłucz mięsień z prędkością ~0,6 ml/min podgrzanym do 37°C buforem perfuzyjnym i przykryj odsłonięty mięsień szklanym zakryciem o wymiarach 22×22 mm.
11. Umieść płytkę do mięśnia zasłonowego na stole mikroskopu, obejrzyj mięsień pod mikroskopem, znajdź odpowiednią żyłkę poprzewłosową (wybierz żyłkę prostą, nierozgałęzioną, o prawidłowej prędkości ścinania i średnicy w zakresie 25−40 µm) i ustaw kamerę wideo tak, aby żyłka była widoczna w pionowej pozycji po lewej lub prawej stronie monitora TV.
12. Po 30 min równowagi zarejestruj obrazy wideo wybranej żyłki poprzewłosowej przez 5 min jako dane kontrolne bazowe, używając rejestratora wideo.
13. Zatrzymaj perfuzję i usuń zakrycie szklane z mięśnia.
14. Nałóż żel zawierający chemoatraktant o objętości ~1-mm³ na powierzchnię mięśnia zasłonowego w wcześniej wybranym obszarze, 350 µm od obserwowanej żyłki poprzewłosowej i równolegle do niej; nałóż zakrycie szklane, aby utrzymać żel w miejscu, a następnie przepłucz tkankę mięśniową z bardzo małą prędkością (≤10 µl/min), aby umożliwić utworzenie gradientu chemoatraktanta, który jest powoli uwalniany z żelu.
15. Rejestruj obraz wideo przez 90 min po dodaniu żelu zawierającego chemoatraktant. Podczas nagrywania koryguj i utrzymuj ostrość mikroskopu na leukocytach przylegających, pełzających, transmigrujących i wykazujących chemotaksję wewnątrz żyłki oraz w tkance mięśniowej.
16. Po zakończeniu eksperymentu zaimportuj plik wideo do komputera w celu analizy.

3. Śledzenie komórek przy użyciu programu ImageJ

1. Na komputerze wyekstrahuj i przekonwertuj wideo do formatu AVI (np. użyj bezpłatnego oprogramowania bitRipper, aby przekonwertować wideo z płyty DVD do pliku AVI).
2. Użyj oprogramowania do edycji wideo, aby wygenerować film w przyspieszeniu czasowym. Na przykład użyj programu Windows Movie Maker do stworzenia filmu w przyspieszeniu (do 1/512 lub 1/1024 czasu rzeczywistego przy częstotliwości 30 fps) z oryginalnego wideo w czasie rzeczywistym. Przekonwertuj i zapisz nieskompresowany film w przyspieszeniu w formacie DV-AVI.
3. Nagraj obrazy mikrometru kalibracyjnego przy tych samych ustawieniach mikroskopu, zaimportuj obrazy do komputera i otwórz je w programie ImageJ. W programie ImageJ całkowita liczba pikseli wyświetla się w lewym górnym rogu ekranu (np. 720×480 pikseli). Zmierz rozmiar ekranu na obu osiach X i Y (np. 200×150 µm). Na tej podstawie oblicz liczbę pikseli na µm (np. x = 720/200 = 3,6 pikseli/µm oraz y = 480/150 = 3,2 pikseli/µm).
4. Aby zaimportować film, ponownie otwórz program ImageJ, kliknij „File−Import−Using Quicktime Movies Plug-in”, wybierz analizowany film i kliknij „OK” w interfejsie „QT Movie Opener”.
5. Kliknij „Plugins−Manual Tracking”, aby śledzić komórki. Przed rozpoczęciem śledzenia wprowadź odpowiednie informacje w polach na dole. W skrócie:
   1. Interwał czasowy (w sek.) = stopień przyspieszenia/30 (na przykład dla przyspieszenia 1020× będzie to 1020/30 = 34 sek/klatkę).
   2. Kalibracja x/y = pomiar w µm/piksel uzyskany dzięki kalibracji obrazu mikrometru.
   3. Kalibracja z = 0 (ponieważ mięsień kremaster myszy jest niezwykle cienką warstwą tkanki, a pełzanie i migracja komórek w świetle przechodzącym są w przybliżeniu dwuwymiarowe).
   4. Rozmiar kwadratu wyszukiwania do centrowania = 1.
   5. Rozmiar kropki/Szerokość linii/Rozmiar czcionki: można je dostosować w razie potrzeby.
6. Wybierz stabilny i wyraźny punkt jako punkt odniesienia. Punktem odniesienia może być dowolny wyraźny i mały punkt strukturalny, który pozostaje niezmienny i stabilny przez cały eksperyment. Kliknij „Add Track”, aby śledzić punkt odniesienia od pierwszej do ostatniej klatki, a następnie kliknij „End Track”. Dane pojawią się automatycznie w tabeli wyników.
7. Śledź pojedynczo pełzające i migrujące neutrofile: kliknij „Add Track”, aby śledzić komórkę od momentu jej pojawienia się w tkance do momentu zniknięcia w każdej klatce, a następnie kliknij „End Track”, aby zakończyć i zapisać wyniki w programie Microsoft Excel.

4. Analiza parametrów rekrutacji neutrofilów

1. Otwórz plik z wynikami w programie Microsoft Excel i przeanalizuj dane (uwzględniając w analizie zmiany punktu odniesienia).
2. Pełzanie wewnątrzświatłowe
   1. Dystans pełzania: całkowita odległość, jaką komórka pokonuje w świetle naczynia od początkowego miejsca adhezji do optymalnego miejsca transmigracji (µm).
   2. Prędkość pełzania: dystans pełzania/czas (µm/min).
3. Migracja transendotelialna
   1. Czas transmigracji: czas od momentu rozpoczęcia transmigracji komórki przez endotelium do momentu, gdy całe ciało komórki znajduje się tuż poza żyłką i żadna część ciała komórki nie jest widoczna w świetle naczynia (min lub sec).
   2. Czas odrywania: czas od momentu, gdy całe ciało komórki znajduje się tuż poza żyłką (bezpośrednio po transmigracji), do punktu czasowego, w którym komórka traci kontakt z żyłką (cofnięcie ogonka) (min lub sec).
4. Chemotaksja w tkance
   1. Dystans migracji: suma odległości, jaką komórka pokonuje od punktu startowego do punktu końcowego migracji w tkance (µm).
   2. Prędkość migracji: dystans migracji w tkance/czas (µm/min).
   3. Dystans chemotaksji: suma odległości, jaką komórka migruje wzdłuż osi x w tkance (µm).
   4. Prędkość chemotaksji: dystans chemotaksji/czas (µm/min).
   5. Indeks chemotaksji: stosunek dystansu chemotaksji do dystansu migracji w tkance.

5. Reprezentatywne wyniki:

Choć mikroskopia wewnątrzżyciowa w jasnym polu jest stosowana do badania interakcji leukocytów z komórkami śródbłonka i nie musi ograniczać się wyłącznie do neutrofili, potwierdziliśmy w badaniach histologicznych, że ponad 95% zrekrutowanych komórek w mięśniach kremaster traktowanych chemoatraktantami dla neutrofili stanowiły rzeczywiście neutrofile. W niniejszym raporcie, z wykorzystaniem selektywnych chemoatraktantów dla neutrofili, przedstawiamy procedury śledzenia rekrutacji neutrofili in vivo. W szczególności opisujemy protokół śledzenia wewnątrznaczyniowego pełzania neutrofili, ich migracji transendotelialnej oraz chemotaksji w tkance mięśnia kremaster u znieczulonych myszy przy użyciu wideo-mikroskopii wewnątrzżyciowej (time-lapse) i programu ImageJ. Zawierający chemoatraktant żel agarozowy nałożony na mięsień kremaster powoli uwalnia substancję, co pozwala na wytworzenie gradientu chemoatraktanta w tkance. Chemoatraktant dla neutrofili indukuje interakcje neutrofili z komórkami śródbłonka w żylnych splotach pocapilarnych mięśnia kremaster u myszy. Cały eksperyment jest wizualizowany za pomocą pionowego mikroskopu wewnątrzżyciowego w jasnym polu, z obrazem z kolorowej kamery wideo rzutowanym na monitor TV i rejestrowanym przez rejestrator wideo. Określiliśmy wewnątrznaczyniowe pełzanie neutrofili, migrację transendotelialną oraz migrację i chemotaksję w tkance mięśniowej w odpowiedzi na chemoatraktanty dla neutrofili MIP-2 i WKYMVm przygotowane w żelu agarozowym (Rycina 2). Stwierdzono, że MIP-2 (w stężeniu 0,5 µM) i WKYMVm (w stężeniu 0,1 mM) wywoływały wewnątrznaczyniowe pełzanie neutrofili z podobną prędkością, migrację transendotelialną i odrywanie się od żylaka w porównywalnym czasie, a także migrację i chemotaksję neutrofili w tkance mięśniowej z niemal taką samą prędkością i podobnymi indeksami chemotaksji neutrofili (P > 0,05, test Student t).

Rysunek 1. Schematyczny rysunek systemu mikroskopii intravitalnej. Mięsień kremaster myszy jest wyeksponowany na przezroczystym podstawku platformy do mięśnia kremaster na stoliku mikroskopu i przepłukiwany ogrzanym do 37°C roztworem soli fizjologicznej z buforem wodorowęglanowym. Mikroskop pionowy jest połączony z kolorową kamerą wideo CCD do intravitalnej mikroskopii w polu jasnym. Do portu mikroskopu podłączona jest również monochromatyczna, głęboko chłodzona cyfrowa kamera CCD do intravitalnej mikroskopii fluorescencyjnej, z której obrazy są bezpośrednio przetwarzane przez komputer.

Rysunek 2. Parametry rekrutacji neutrofili w mikroskopii intravitalnej w polu jasnym. Rekrutacja neutrofili została wywołana poprzez stopniowe uwalnianie chemoatraktantów dla neutrofili MIP-2 lub WKYMVm z preparatu żelu agarowego umieszczonego w odległości 350 µm od żyły kaptarnej. Dane z wideonagrań poklatkowych analizowano za pomocą programu ImageJ po przetworzeniu nagrania wideo z eksperymentu w czasie rzeczywistym. Czas pełzania neutrofili w świetle naczynia (A), czas transmigracji i czas odrywania się (B), prędkość migracji oraz prędkość chemotaksji w tkance (C), a także indeks chemotaksji w mięśniu kremaster (D) określono po podaniu żelu agarowego z MIP-2 lub WKYMVm na mięsień kremaster u myszy C57BL/6 (n = 3, liczba śledzonych komórek = 22 (w A i B) oraz 27 (w C i D) odpowiednio dla MIP-2, oraz = 26 (w A i B) i 44 (w C i D) odpowiednio dla WKYMVm).

Dyskusja

Mikroskopia witalna jest niezbędnym narzędziem do odkrywania komórkowych i molekularnych mechanizmów rekrutacji leukocytów podczas stanu zapalnego. Ilościowa wizualizacja służąca do określenia oddziaływań między leukocytami a komórkami śródbłonka w mikrokrążeniu tkanek półprzezroczystych, takich jak mięsień krezmastyczny i krezka, pozostaje złotym standardem zastosowania tej techniki^1,5. Konwencjonalna mikroskopia witalna w polu jasnym posiada wiele unikalnych cech technicznych, a mechanizmy rekrutacji ujawnio...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Przewód polietylenowy, PE10	Becton Dickinson	427401	I.D. 0.28mm × O.D. 0.61mm
Tusz indyjski	Speedball Art	Super Black	100% pigmentu sadzy, bez barwników
Kauteryzator	Aaron Medical	AA03
Ksylazyna	Bayer HealthCare, Bayer Inc.	DIN 02169592
Chlorowodorek ketaminy	Bioniche Animal Health Canada, Inc.	DIN 01989529
Mysi rekombinowany MIP-2	R&D Systems	452-M2
WKYMVm	Phoenix Pharmaceuticals, Inc.	072-12
Agaroza	Invitrogen	15510-027	Ultrapure
Heparyna	Sigma	H-3393
Mikroskop pionowy	Olympus	BX61WI
Kolorowa kamera wideo 3CCD	SONY	DXC-990
Rejestrator wideo HD-DVD	LG Electronics Inc.	RH398H-M
Monitor TV	LG Electronics Inc.	22LG30
Cyrkulator wody	Thermo Scientific	HAAKE DC10
Pompa perystaltyczna	Gilson; Pharmacia	Gilson MINIPULS 3; Pharmacia P-3
Podkładka do mięśnia dźwigacza jądra	University of Saskatchewan		Własnej konstrukcji