Biblioteka Target ID jest opartą na plazmidach, genomową kolekcją klonowanego cDNA, służącą do identyfikacji celów miRNA. W niniejszym materiale prezentujemy sposób jej użycia i zastosowania.
Artykuł metodologiczny
Przesiew genomowy w celu identyfikacji celów miRNA z wykorzystaniem biblioteki MISSION Target ID
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Biblioteka Target ID została zaprojektowana w celu wspierania wykrywania i identyfikacji celów dla mikroRNA (miRNA). Biblioteka Target ID jest plazmidową, genomową biblioteką cDNA, w której klony znajdują się w obszarze 3'UTR poniżej białka fuzyjnego do podwójnej selekcji, kinazy tymidynowej-zeocyny (TKzeo). Pierwsza runda selekcji służy do wyłonienia stabilnych transformantów, po czym następuje wprowadzenie interesującego miRNA, a na koniec selekcja cDNA zawierających cel dla tego miRNA. Wyselekcjonowane cDNA są identyfikowane poprzez sekwencjonowanie (szczegóły oraz schemat działania biblioteki Target ID przedstawiono na rysunku 1-3).
Aby zapewnić szeroki zakres pokrycia ludzkiego transkryptomu, cDNA biblioteki Target ID wygenerowano poprzez priming oligo-dT, wykorzystując pulę całkowitego RNA przygotowaną z wielu ludzkich tkanek i linii komórkowych. Uzyskane cDNA mają wielkość od 0,5 do 4 kb, przy średniej wielkości 1,2 kb, i zostały sklonowane do plazmidu z podwójną selekcją p3΄TKzeo (mapę plazmidu przedstawiono na Rysunku 4). Geny docelowe reprezentowane w bibliotece można znaleźć na stronie internetowej Sigma-Aldrich. Wyniki sekwencjonowania Illumina (Tabela 3) wykazują, że biblioteka obejmuje 16 922 z 21 518 unikalnych genów w UCSC RefGene (79%) lub 14 000 genów z 10 lub więcej odczytami (66%).
Protokół
1. Transfekcja biblioteką Target ID i selekcja stabilnych linii komórkowych
1. Krzywa przeżywalności dla Zeociny
Zeocyny używa się do selekcji stabilnie transfektowanych komórek. Jednak nadmiar zeocyny wywołuje niepożądane odpowiedzi fenotypowe w większości typów komórek. Dlatego należy przeprowadzić analizę krzywej przeżywalności, aby ustalić minimalną dawkę letalną.
- Wysiać 1,6 x 104 komórek do studniek płytki 96-dołkowej w 120 μl pożywki.
- Następnego dnia dodać zeocyn w rosnących stężeniach od 50 μg/ml do 1 mg/ml do odpowiednich studniek.
- Oceniać żywotność co 2 dni.
- Wymieniać pożywkę zawierającą zeocyn co 3 dni. Dla danego typu komórek i eksperymentu należy zastosować minimalne stężenie czynnika selekcyjnego, które powoduje całkowitą śmierć komórek pożądanym czasie. Nasze wyniki wskazują, że optymalne stężenie zeocynu dla komórek A549, HeLa oraz MCF7 wynosi 50 μg/ml.
2. Transfekcja biblioteki za pomocą nukleofekcji i selekcja
- Należy wybrać linię komórkową, która nie wykazuje ekspresji lub wykazuje niski poziom ekspresji badanego miRNA. miRNA zostanie wprowadzone w sekcji B w celu wyboru celu, po uzyskaniu stabilnej ekspresji biblioteki Target ID.
- Hodowla/namnażanie komórek. Uzyskano doskonałe wyniki przy zastosowaniu 2 x 107 liczba komórek na transfekcję biblioteki.
- Trypsynizuj komórki, które osiągnęły >80% konfluencji, a następnie przenieść 2 x 107 komórki do sterylnych probówek z nakrętką o pojemności 15 ml.
- Wirować komórki po trypsynizacji z prędkością 20 x g przez 5 min w celu uzyskania osadu.
- Usunąć medium i przemyć osad komórkowy za pomocą HBSS lub 1X PBS.
- Wirować z prędkością 20 x g przez 5 min, a następnie odessać płuczynkę.
- Powtórzyć etap przemywania osadu komórkowego.
- Podgrzej wcześniej płytki 6-dołkowe z 2 ml pełnej pożywki w temperaturze 37 °C.
- Dodaj 2 μg biblioteki identyfikacji celów (nieprzekraczającej 10 μl) na probówkę 0,5 ml dla każdej transfekcji.
- Resuspendować komórki w powyższej probówce 15 ml za pomocą 100 μl roztworu do nukleofekcji Amaxa (specyficznego dla danej linii komórkowej) na 2 x 106 komórek. Na przykład, dla 10 nukleofekcji należy dodać 1 ml odczynnika.
- Do każdej reakcji z osobna dodaj 100 μl komórek do 2 μg plazmidu. Wymieszać za pomocą pipety.
- Przenieś mieszaninę do kuwety Nucleofector.
- Włóż kuwetę do urządzenia Nucleofector i uruchom zoptymalizowany program odpowiedni dla danej linii komórkowej (preferowana wysoka wydajność zamiast przeżywalności komórek).
- Napełnić pipetę transferową uprzednio ogrzanym medium. Pobrać komórki tą samą pipetą i przenieść je na płytkę 6-dołkową. Powtórzyć czynność dla każdej nukleofekcji, po jednej na dołek.
- Przenieść do komory wzrostowej w celu inkubacji przez noc.
- Następnego dnia należy wymienić medium i pozwolić komórkom na regenerację przez 3–5 dni.
- Wymień pożywkę na pożywkę kompletną zawierającą odpowiednie stężenie zeocyny, określone na podstawie analizy krzywej przeżywalności.
- Monitoruj komórki pod kątem selekcji zeocyną (obumieranie komórek).
- Wymieniać pożywkę z zeocyną co 2–3 dni.
- Po osiągnięciu konfluencji w płytce 6-dołkowej, przeprowadzić pasaż, połączyć i namnożyć komórki w większych kolbach.
- Czas trwania ekspansji komórek zależy od użytkownika oraz linii komórkowej, jednak wysoce zaleca się namnażanie komórek opornych na zeocyn w celu przygotowania krioprzzechowań do przyszłych badań przesiewowych (~2–3 tygodnie; zależnie od linii komórkowej).
2. Transfekcja komórek bibliotecznych konstruktem ekspresyjnym miRNA, selekcja stabilnej linii komórkowej oraz wybór celów miRNA
Uwaga: Selekcja zeociną nie jest już wymagana ani wskazana. Narażenie komórek na zeocinę podczas ekspresji miRNA oraz selekcji ganciklowirem (celu) może prowadzić do utraty celów miRNA.
3. Krzywe przeżywalności dla puromycyny, G418 i ganciklowiru
- Wykonaj krzywą przeżywalności (kill curve) dla gancyklowiru w komórkach stabilnie wykazujących ekspresję biblioteki Target ID oraz dla puromycyny lub G418 w komórkach typu dzikiego.
- Wysiej 1,6 x 104 komórek do studni płytki 96-dołkowej z 120 μl świeżej pożywki. Następnego dnia dodaj od 0,1 do 10 μg/ml puromycyny/G418 lub od 2 do 32 μM gancyklowiru do wybranych studni.
- Oceniaj żywotność co 2 dni. Wymieniaj pożywkę zawierającą odczynnik selekcyjny co 3 dni. Dla danego typu komórek i eksperymentu należy zastosować minimalne stężenie odczynnika selekcyjnego, które powoduje całkowitą śmierć komórek* po pożądanym czasie. Nasze wyniki wskazują, że optymalne stężenia to: 0,25 do 1 μg/ml puromycyny dla komórek A549, HeLa i MCF7, 0,3 μg/ml G418 dla komórek MCF7 oraz 8-16 μM gancyklowiru dla komórek A549, HeLa i MCF7.
*Uwaga: W przypadku selekcji gancyklowirem może obserwować się spowolniony wzrost lub brak wzrostu komórek bez całkowitej śmierci komórkowej. Obserwuj komórki przez kilka dni traktowania, aby upewnić się, że nie dzielą się one aktywnie. W takim przypadku czerwień fenolowa w pożywce pozostaje czerwona. Jeśli zaobserwowano zmianę podatności, może być konieczne przeprowadzenie analizy krzywej przeżywalności dla komórek transfekowanych biblioteką Target ID. Należy jednak ustalić to indywidualnie dla każdego typu komórek.
4. Transfekcja miRNA poprzez nukleofekcję i wybór celu
- hodować / namnażać komórki biblioteki Target ID, aby uzyskać 2 x 10^67 komórki, a następnie poddać trypsynizacji, gdy komórki osiągną >80% konfluencji.
- Przenieś 2 x 107 przenieść komórki do sterylnej probówki z nakrętką o pojemności 15 ml i odwirować przy 20 x g przez 5 minut w celu uzyskania osadu.
- Usunąć medium i przemyć pellet komórkowy przy użyciu HBSS lub 1X PBS.
- Wirować przy 20 x g przez 5 min, a następnie odessać płczynę płuczącą.
- Powtórz etap płukania osadu komórkowego.
- Podgrzej wcześniej płytki 6-dołkowe, wlewając do każdego dołka 2 ml pełnego medium w temperaturze 37 °C.
- Dodaj 2 μg plazmidu ekspresyjnego miRNA (nie więcej niż 10 μl) na probówkę o objętości 0,5 ml dla każdej transfekcji. Z sukcesem stosowano plazmidy ekspresyjne microRNA firmy Origene (selekcja neomycyną – G418) lub samodzielnie sklonowane geny miRNA w pBABE-Puro (Plazmid 1764; Addgene). W przypadku tych ostatnich spinka miRNA wraz z fragmentami o długości ok. 20 bp po obu stronach została sklonowana metodą PCR z ludzkiego DNA.
- Resuspenduj komórki w powyższej probówce o pojemności 15 ml za pomocą 100 μl roztworu do nukleofekcji Amaxa (specyficznego dla danego typu komórek) na 2 x 106 komórek. Na przykład: dla 10 nukleofekcji dodać 1 ml odczynnika.
- Dodawać do każdej reakcji po kolei 100 μl komórek do 2 μg plazmidu. Wymieszać za pomocą pipety.
- Przenieś mieszaninę do kuwety Nucleofector.
- Wstaw cuwetę do urządzenia Nucleofector i uruchom zoptymalizowany program odpowiedni dla danej linii komórkowej (preferowana wysoka wydajność kosztem przeżywalności komórek).
- Napełnić pipetę transferową uprzednio ogrzaną pożywką. Pobrać komórki tą samą pipetą i przenieść je na płytkę 6-dołkową. Powtórzyć czynność dla każdej nukleofekcji, po jednej na dołek.
- Przenieść z powrotem do komory wzrostowej w celu inkubacji przez noc.
- Wymień medium i pozwól komórkom na regenerację przez 3-5 dni.
- Wymień pożywkę na pożywkę kompletną zawierającą odpowiednie stężenie puromycyny lub G418, ustalone na podstawie testu krzywej przeżywalności przeprowadzonego przed transfekcją konstruktem miRNA.
- Monitoruj komórki podczas selekcji puromycyną / G418 (obumieranie komórek).
- Wymieniać pożywkę z puromycyną / G418 co 2-3 dni.
- Po osiągnięciu konfluencji w płytce 6-dołkowej, przenieść, połączyć i namnożyć komórki w większych kolbach.
- Czas ekspansji komórek zależy od użytkownika, jednak zdecydowanie zaleca się namnożenie komórek opornych na puromycynę / G418 w celu przygotowania zapasów zamrożonych do przyszłych analiz (ok. 2–3 tygodnie; zależnie od linii komórkowej).
- Wymień pożywkę na pożywkę z odpowiednimi stężeniami gancyklowiru (GCV) oraz puromycyny / G418, ustalonymi na podstawie testu krzywej przeżywalności przeprowadzonego przed transfekcją konstruktem miRNA.
- Monitorować komórki w procesie selekcji (obumieranie komórek, celowanie miRNA i wyciszanie TK-ZEO).
- Namnażać komórki w obecności GCV i puromycyny /G418.
- Wyizoluj genomiczne DNA z komórek wyselekcjonowanych za pomocą GCV.
- Przeprowadzić amplifikację PCR wstawek przy użyciu starterów z zestawu (patrz. Amplifikacja PCR).
- Klonować do wektora TOPOTA (Invitrogen) w celu standardnego sekwencjonowania lub przekazać produkt PCR do głębokiego sekwencjonowania.
3. Amplifikacja wybranych wstawek biblioteki metodą PCR i ich sekwencjonowanie
Uwaga: Niniejszą procedurę przeprowadza się w celu amplifikacji metodą PCR celów biblioteki, które przetrwały selekcję gancyklowirem.
5. Zbierz komórki wyselekcjonowane gancyklowirem w celu przygotowania chromosomalnego DNA, używając zestawu GenElute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit (numer katalogowy G1N10) lub odpowiednika. Zalecamy przygotowanie DNA z rodzimej linii komórkowej, która nie zawiera Target ID Library, aby służyła ona jako kontrola negatywna do porównania z DNA z komórek wyselekcjonowanych pod kątem celu w reakcji PCR.
- Przeprowadź amplifikację PCR DNA genomowego z użyciem Primera Amplifikacyjnego 1 i Primera Amplifikacyjnego 2. Pomyślną amplifikację uzyskano przy użyciu JumpStart REDTaq ReadyMix Reaction Mix - for PCR (Numer katalogowy P0982). W przypadku zastosowania innej polimerazy może być konieczna optymalizacja warunków. Przykładowy schemat PCR znajduje się w Tabeli 1, a warunki cykli PCR w Tabeli 2.
- Rozdziel 2-5 μl produktu PCR na żelu agarozowym 1%. Oczekiwanym produktem powinno być rozmycie (smear) z widocznymi prążkami DNA. Porównaj wynik z kontrolnym produktem PCR DNA genomowego z komórek bez biblioteki Target ID Library.
- Przejdź do klonowania i/lub głębokiego sekwencjonowania produktu PCR. Jeśli nie zaobserwowano produktu amplifikacji lub jest on identyczny z kontrolnym DNA, zoptymalizuj warunki amplifikacji PCR (np. stężenie primerów, temperaturę przyłączania oraz liczbę cykli).
6. Klonowanie i sekwencjonowanie
Uwaga: Zdecydowanie zalecamy klonowanie produktów PCR, a następnie przeprowadzenie standardnego sekwencjonowania co najmniej 96 klonów z użyciem starterów do amplifikacji dostarczonych w zestawie. Procedura ta była pomyślnie realizowana z wykorzystaniem kultur nocnych w płytkach 96-dołkowych oraz systemów oczyszczania plazmidów. Nawet w przypadku chęci zastosowania sekwencjonowania głębokiego, wstępne wyniki z klonowania i sekwencjonowania standardowego mogą służyć jako kontrola jakości w celu ustalenia, czy dodatkowy koszt sekwencjonowania głębokiego jest uzasadniony.
- Postępuj zgodnie z protokołem producenta zestawu do klonowania TA w celu sklonowania produktów amplifikacji PCR (opisanych powyżej).
- Przeprowadź transformację klonów do kompetentnych komórek bakteryjnych i inkubuj je przez noc na podłożu zawierającym antybiotyk w celu selekcji.
- Wyizoluj i hoduj pojedyncze kolonie w kulturze płynnej zawierającej odpowiedni antybiotyk.
- Oczyść plazmidowe DNA. 6.5. Przeprowadź reakcje sekwencjonowania z użyciem starterów amplifikacyjnych.
- Zidentyfikuj geny docelowe poprzez dopasowanie sekwencji metodą BLAST do transkryptomu człowieka (dla znanych transkryptów) oraz genomu człowieka (dla nowych transkryptów).*
*Rozwiązywanie problemów z klonowaniem: jeśli wysoka liczba wstawek w sekwencjonowaniu okazuje się sekwencją plazmidu, należy zoptymalizować warunki klonowania/sekwencjonowania w następujący sposób:
- Jakość i ilość produktu amplifikacji PCR (insertu)
- Reakcja ligacji
- Przygotowanie plazmidu (jakość i ilość)
- Warunki reakcji sekwencjonowania
4. Reprezentatywne wyniki
Przesiewanie biblioteki w celu identyfikacji celów miR-373
Aby ocenić skuteczność biblioteki Mission Target ID, wybrano cele miR-373 z komórek linii MCF-7 wykazujących ekspresję biblioteki. Wybrano linię MCF-7, ponieważ wykazuje ona niewielką lub niewykrywalną ekspresję miR-373 (dane nieprzedstawione). miR-373 wybrano ze względu na jego znaczenie biologiczne. Ekspresja miR-373 promuje inwazję i przerzuty nowotworowe w linii MCF-7, która normalnie nie jest linią przerzutową[2]. Ponadto ortologi miR-373 z mysiej grupy miR-290 biorą udział w utrzymaniu mysich embrionalnych komórek macierzystych[3], a członek rodziny miR-373, miR-372, promuje przeprogramowanie fibroblastów do indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych[4]. Na koniec wykorzystano nukleazy z palcem cynkowym do wstawienia konstruktu ekspresyjnego promotor PGK-miR-373 do miejsca AAVS1 w komórkach MCF-7 i wygenerowano listę potencjalnych celów miR-373 za pomocą analizy mikromacierzy RNA (dane nieprzedstawione).
Bibliotekę Target ID przetransformowano do komórek MCF-7, a następnie wyselekcjonowano i namnożono stabilną populację komórek w pożywce zawierającej zeocynę. Otrzymane komórki (biblioteka MCF-7) poddano stabilnej transfekcji konstruktem ekspresyjnym miR-373 i wyselekcjonowano w pożywce zawierającej gancyklowir, aby wzbogacić populację o komórki ekspresujące cele miR-373. Zaobserwowano, że komórki kontrolne ujemne z biblioteki MCF-7 (bez miR-373) nie odrywały się i nie przybierały okrągłego kształtu, co jest charakterystyczne dla martwych komórek. Jednakże zaprzestały one wzrostu, co łatwo było wykryć, ponieważ pożywka zawierająca czerwień fenolową nie zmieniła barwy na pomarańczowo-żółtą, co obserwowano w przypadku komórek ekspresujących miR-373 (Ryc. 5). Komórki namnożono w pożywce zawierającej gancyklowir, a sekwencje docelowe wyizolowano za pomocą PCR, wykorzystując primery flankujące wstawki cDNA biblioteki Target ID oraz DNA przygotowane z przeżywających komórek. Produkty PCR zsekwencjonowano metodą Illumina.
Jak pokazano w Tabeli 4, otrzymano 17 740 719 odczytów cDNA, które przypisano do 1 076 unikalnych genów. Spośród tych unikalnych genów 2 898 wykryto z liczbą powyżej 40 odczytów, w związku z czym uznano je za wiarygodne wyniki. Pozyskanie 13 106 469 odczytów wektora było przewidywalne, ponieważ primery PCR użyte do amplifikacji insertów cDNA znajdują się w odległości 40 i 30 zasad od miejsca insercji. W związku z tym oczekiwano, że większość wynikowych sekwencji będzie pochodzić z wektora, w przeciwieństwie do bardziej tradycyjnego głębokiego sekwencjonowania materiału genomowego. Czternaście procent nie przypisano ani do wektora, ani do cDNA, ale wykazano dopasowanie do nienadmiarowej bazy danych nukleotydów NCBI (tj. trafienie NR), a jedynie 1% nie posiadało insertu cDNA.
Wstępne porównanie wykazało, że 10 z unikalnych genów zidentyfikowanych za pomocą biblioteki Target ID Library znajduje się również na liście wcześniej zidentyfikowanych celów miR-373 w bazie TarBase (Tabela 5). Te 10 celów miR-373 zostało wcześniej zidentyfikowanych za pomocą mikromacierzy z wykorzystaniem RNA z komórek HeLa przejściowo transfektowanych syntetycznym mimikiem miR-373[5]. Ponadto wykryliśmy obniżoną ekspresję tych samych 10 genów w komórkach MCF-7 wykazujących ekspresję miR-373 z miejsca AAVS1 (dane nie przedstawiono). Zatem te 10 genów prawdopodobnie stanowi potwierdzone cele miR-373. Trwają prace nad charakterystyką listy potencjalnych celów oraz próbami eksperymentalnej walidacji wybranych wyników za pomocą RT-qPCR, Western blot oraz testu reporterowego z lucyferazą.
Rycina 1. Schemat pracy dla biblioteki identyfikacji celów. Sekcje A-C: odnośniki do sekcji w Procedurze. Każdy krok został zilustrowany i szczegółowo opisany w Ryc. 2 i 3.
Rycina 2. Transfekcja i selekcja zeocyną. Biblioteka identyfikatorów celów (Target ID Library) to pula plazmidów (A), do których po białku fuzyjnym kinazy tymidynowej i zeocyny (TKzeo; Ryc. 4) w obrębie 3′-UTR wstawiono ludzkie cDNA. Komórki są transfekowane biblioteką Target ID Library (B) i pozostawiono do regeneracji na 3–5 dni. Konstrukty mogą zintegrować się z genomem w tym okresie regeneracji (C), a następnie wyeksponować zakodowany transkrypty (D). Po rekonwalescencji komórki poddaje się działaniu zeocyny (E). Komórki wykazujące ekspresję białka fuzyjnego TKzeo z konstruktów Target ID stabilnie zintegrowanych z genomem przeżywają selekcję zeocyną (F). Komórki nietransfekowane giną (G). Ponadto wszystkie komórki zawierające konstrukt będący celem dla endogennego miRNA lub jakiegokolwiek innego czynnika ekspresowanego w komórce, który hamuje ekspresję TKzeo z konstruktu Target ID, ulegną śmierci (H).
Rysunek 3. transfekcja miRNA i selekcja gancyklowirem. Komórki zawierające bibliotekę Target ID (tj. komórki wyselekcjonowane zeocinem) są transfekowane selekcjonowalnym konstruktem ekspresyjnym mikroRNA (A). Podczas regeneracji konstrukt ekspresyjny miRNA może ulec integracji (B) i wyeksponować marker selekcyjny zakodowany w konstrukcie miRNA. Po selekcji pod kątem stabilnej integracji (C) i ekspansji komórek, komórki poddaje się działaniu gancyklowiru (D). Komórki produkujące kinazę tymidynową (TK) w obecności gancyklowiru (tj. komórki wykazujące ekspresję konstruktów TKzeo, które nie zostały wyciszone przez miRNA) ulegną śmierci (E) Z drugiej strony, komórki zawierające konstrukty biblioteki z miejscami docelowymi dla miRNA nie będą produkować TK, a w konsekwencji przeżyją selekcję gancyklowirem (F). Przeżyłe komórki można hodować, wyizolować gDNA, a następnie poddać amplifikacji PCR cDNA zawierający miejsca wiązania miRNA, wykorzystując primery Target ID Amplification. Produkty PCR można poddać sekwencjonowaniu i dopasować do ludzkiego genomu w celu identyfikacji celów miRNA.
Rycina 4. Mapa plazmidu i lokalizacja starterów amplifikacyjnych. Sfi I są miejscami klonowania cDNA.
Sekwencje starterów
Starter do amplifikacji MISSION Target ID Primer 1
5΄ ACGACGTGACCCTGTTCATC 3΄
Starter amplifikacyjny do identyfikacji celu MISSION 2
5΄ TAAAACGACGGCCAGTGAAT 3΄
Rysunek 5. Wpływ gancyklowiru na wzrost komórek. Płytki 24-dołkowe zasiano dwiemaście tysiącami komórek MCF-7 lub komórkami MCF-7 zawierającymi bibliotekę Target ID Library. Po dwudziestu czterech godzinach medium zastąpiono medium zawierającym 0, 8 lub 16 μM gancyklowir. Po 15 dniach wykonano fotografię płytki (6 górnych studni), następnie studnie przemyto buforem HBSS i zabarwiono roztworem barwiącym Brilliant Blue R (B6529) (6 dolnych studni). Należy zauważyć, że gancyklowir nie wywiera wpływu na komórki MCF-7 bez biblioteki, ponieważ nie wykazują one ekspresji kinazy tymydynowej (TK). Z kolei komórki MCF-7 z biblioteką wykazują ekspresję TK, lecz nie zostają całkowicie wyeliminowane przez gancyklowir przy stężeniu 8 lub 16 μM, co potwierdza pobieranie Brilliant Blue przez żywe komórki. Jednakże komórki Library przestają rosnąć w obecności gancyklowiru, o czym świadczy kolor barwnika czerwieni fenolowej w ich pożywce. Komórki z zahamowanym wzrostem nie zakwaszają pożywki, w związku z czym jej kolor pozostaje czerwony, zamiast zmienić się na pomarańczowo-żółty.
| Odczynnik | Objętość / reakcja |
| Jumpstart REDTaq ReadyMix Reaction mix | 10 μl |
| Starter amplifikacyjny 1 (25 μM) | 0,2 μl |
| Starter amplifikacyjny 2 (25 μM) | 0,2 μl |
| Genomiczne DNA | 50-20 ng |
| Woda klasy molekularnej | do 20 μl |
Tabela 1.
| Krok | Temp. | Czas | Cykle |
| Denaturacja wstępna | 95 °C | 5 min. | 1 |
| Denaturacja | 95 °C | 30 sec. | 40 cykli |
| Przyłączanie* | 62 °C | 30 sec. | |
| Ekstencja | 68 °C | 2 min. | |
| Ekstensja końcowa | 68 °C | 5 min. | 1 |
| Przechowywanie | 4 °C | Przechowywanie |
Tabela 2.
*Temperatury przyłączania mogą się różnić, jednak najlepsze produkty amplifikacji zaobserwowaliśmy przy temperaturach przyłączania w zakresie od 53 do 64 °C.
Tabela 3. Zawartość biblioteki Target ID na podstawie sekwencjonowania Illumina.
Tabela 4. Cele miR-373 wybrane metodą sekwencjonowania Illumina.
Tabela 5. 10 celów wcześniej zidentyfikowanych za pomocą mikromaciern RNA.
Dyskusja
mikroRNA to RNA o długości 20-24 nukleotydów, które regulują ekspresję genów potranskrypcyjnie poprzez hamowanie translacji mRNA, a często także poprzez destabilizację docelowego mRNA (przegląd w [6]). Pojedyncze miRNA może regulować kilkaset cząsteczek mRNA, kontrolując w ten sposób odpowiedź komórki na sygnały rozwojowe i środowiskowe. Identyfikacja i walidacja docelowych mRNA jest niezbędna do określenia roli i funkcji miRNA w tych szlakach. Identyfikacja celów nie jest jednak prosta, ponieważ u zwierząt miRNA i ich miejsca docelowe nie są w pełni komplementarne. Region „seed” (ziarna), obejmujący zasady od 2 do 7 od końca 5′ miRNA, jest zazwyczaj komplementarny do jego celów. Istnieje jednak wiele wyjątków od reguły seed, a parowanie zasad w dalszej części sekwencji może kompensować niedoskonałe dopasowanie regionu seed. Opracowano szereg algorytmów komputerowych do przewidywania celów miRNA w oparciu o dopasowanie seed i kompensację downstream, strukturę i pozycję celu, konserwację sekwencji oraz różne inne parametry zaobserwowane dla eksperymentalnie zwalidowanych celów (przegląd w [7]). Chociaż przewidywania in silico są wygodne i pozwalają zidentyfikować wiele prawidłowych celów miRNA, większość przewidzianych genów nie przechodzi testów walidacji eksperymentalnej, a wiele rzeczywistych celów nie zostaje przewidzianych. Co więcej, ponieważ algorytmy komputerowe opierają się na wcześniej określonych cechach celów, nie pozwalają one na odkrycie celów odbiegających od tego, co jest już znane.
Liczne systemy eksperymentalne zostały z powodzeniem wykorzystane do identyfikacji lub odkrywania funkcjonalnych celów miRNA w żywych komórkach. Te globalne metody przesiewowe obejmują mikromacierze i sekwencjonowanie RNA, ko-immunoprecypitację RNA (RIP) oraz znakowanie stabilnymi izotopami aminokwasów w hodowli komórkowej (SILAC), która jest metodą proteomiczną (przegląd w [7]). Każda z metod ma swoje zalety i wady. Ponieważ celowanie miRNA często destabilizuje mRNA i prowadzi do jego degradacji, spadek lub wzrost poziomu mRNA po wprowadzeniu odpowiednio mimika lub inhibitora miRNA może pozwolić na identyfikację celów miRNA. Ten spadek lub wzrost poziomu mRNA jest łatwo wykrywany za pomocą mikromacierzy lub głębokiego sekwencjonowania. Choć metody detekcji mRNA są prostsze i bardziej czułe niż metody detekcji białek, detekcja mRNA nie wykryje żadnych celów miRNA, które nie ulegają degradacji. Niedawne raporty z laboratorium Bartella, porównujące wyniki celów miRNA z detekcji RNA z wynikami uzyskanymi za pomocą SILAC [8] lub profilowania rybosomalnego [9], wskazują, że ssacze miRNA działają głównie poprzez redukcję poziomów mRNA celu. Jednak wiele innych laboratoriów pracujących z poszczególnymi celami miRNA wykryło zmianę poziomu białka przy braku zmian poziomu mRNA. Raporty o zjawiskach, które wydają się być regulacją translacyjną bez wykrywalnej utraty mRNA, obejmują: miR-10b w odniesieniu do HOXD10 [10], miR221/222 w odniesieniu do p27kip1 [11], miR-21 w odniesieniu do Pdcd4 [12], miR-126 w odniesieniu do p85β [13], miR-34 w odniesieniu do SIRT1 [14], miR-21 w odniesieniu do PTEN [15], miR-302d w odniesieniu do Arid4b [16], miR-200c w odniesieniu do JAG1 [17] oraz miR-299, 297, 567 i 609 w odniesieniu do VEGFA [18]. Ponadto Clancy i wsp. [19] niedawno donieśli, że regulacja translacyjna przez let-7 została wykryta tylko wtedy, gdy selektywnie wykrywano poszczególne izoformy mRNA zawierające miejsce wiązania let-7. To ostatnie sugeruje, że przynajmniej w niektórych przypadkach regulacja translacyjna może zostać pominięta w profilu złożonym – tzn. gdy wszystkie izoformy mRNA są wykrywane jako jedno mRNA – co ma miejsce w wielu analizach z użyciem mikromacierzy i sekwencjonowania. Ko-immunoprecypitacja kompleksów miRNA-mRNA za pośrednictwem argonaute (zazwyczaj ago2) lub innego białka stowarzyszonego (immunoprecypitacja RNA, czyli RIP) pozwoli na wyizolowanie celów miRNA niezależnie od mechanizmu regulacji. Dodatkowo RIP wykrywa endogenne i prawdopodobnie istotne biologicznie interakcje. Jednak nie wiadomo, czy wszystkie interakcje miRNA-mRNA są funkcjonalne, a RIP pomija wszelkie cele mRNA, które wiążą się tylko przejściowo lub są szybko degradowane. Ponadto konkretne pary miRNA-mRNA muszą być wnioskowane bioinformatycznie, ponieważ wszystkie pary miRNA-mRNA są ko-precypitowane razem. Wreszcie SILAC bezpośrednio identyfikuje końcowy produkt regulacji miRNA, czyli samo białko, ale jest mało czuły, a zatem pomija rzadkie białka i niewielkie zmiany krotności w poziomach białek.
W obliczu ograniczeń obecnych metod identyfikacji celów miRNA, uznaliśmy, że konieczne jest wprowadzenie dodatkowego testu globalnego do identyfikacji funkcjonalnych celów miRNA poprzez alternatywny mechanizm. Aby zaspokoić tę potrzebę, licencjonowaliśmy technologię opracowaną przez Joopa Gakena i Azima Mohameda z King’s College London. Ich wynalazkiem jest białko fuzyjne o podwójnej selektywności, a konkretnie fuzja kinazy tymydynowej z zeocyną, regulowana przez bibliotekę cDNA potencjalnych sekwencji docelowych miRNA w jej regionie 3′UTR. Komórki stabilnie przetransfekowane i wykazujące ekspresję konstruktów TKzeo-cDNA mogą być selekcjonowane za pomocą zeocyny, co przedstawiono na Rys. 2. Po ekspresji interesującego nas miRNA, jego cele można wyselekcjonować za pomocą gancyklowiru, co zilustrowano na Rys. 3. Gancyklowir zabija komórki wykazujące ekspresję kinazy tymydynowej, czyli wszystkie komórki wykazujące ekspresję TKzeo-cDNA, które nie posiadają celu dla interesującego nas miRNA. Docelowe cDNA można wyizolować poprzez amplifikację PCR DNA z komórek, które przeżyły działanie gancyklowiru, przy użyciu starterów flankujących cDNA, a następnie przeprowadzić sekwencjonowanie produktów PCR w celu zidentyfikowania celów.
Opracowaliśmy technologię King’s College w nowe narzędzie do globalnej identyfikacji i odkrywania funkcjonalnych celów ludzkiego miRNA – bibliotekę MISSION Target ID. Dzięki bibliotece Target ID użytkownicy mogą izolować cele miRNA poprzez serię transfekcji kultur komórek ssaków i etapów selekcji lekiem. Biblioteka jest kompleksowa i zawiera od 66% do 79% ludzkich genów. Wstępne wyniki wskazują, że z biblioteki MISSION Target ID można izolować zarówno cele odkryte wcześniej, jak i nowe.
Mimo że protokół jest dość obszerny, korzystanie z biblioteki Target ID wymaga standardowych technik biologii molekularnej – hodowli komórek ssaczych, transfekcji, selekcji lekowej, PCR oraz sekwencjonowania – i w związku z tym powinno być w zasięgu możliwości większości biologów. Sugerujemy, aby zwrócić należytą uwagę na właściwy projekt eksperymentalny, optymalizację warunków hodowli oraz, co najważniejsze, wstępne przetestowanie każdego nowego typu komórek w celu ustalenia optymalnych stężeń leków do etapów selekcji (krzywe przeżywalności/kill-curves), aby zapewnić sukces przy użyciu biblioteki Target ID.
Podobnie jak w przypadku wszystkich metod identyfikacji celów miRNA, zdecydowanie zaleca się, aby cele zidentyfikowane poprzez przeszukiwanie biblioteki Target ID zostały zwalidowane za pomocą drugiej metody, takiej jak mikromacierze, qRT-PCR, test reporterowy (np. lucyferazowy) lub analiza Western.
Oświadczenia
Autorzy deklarują powiązania finansowe z podmiotami komercyjnymi, które mają interes w przedłożonej pracy.
Podziękowania
Dziękujemy całemu zespołowi odpowiedzialnemu za opracowanie biblioteki Sigma Life Science Mission Target ID, w szczególności Kevinowi Gutshallowi za znalezienie technologii i wynegocjowanie warunków licencyjnych oraz Heather Holemon za wsparcie i udział w owocnych dyskusjach dotyczących rozwiązywania problemów. Dziękujemy również dr. Joopowi Gäkenowi z King’s College London za bezpłatne udostępnienie niepublikowanych wyników i sugestii oraz Qaziemu Hamidowi z RxBiosciences za przygotowanie wysokiej jakości partii cDNA i wytrwałość w procesie klonowania. Chcielibyśmy również podziękować Nan Lin i Scottowi Bahr z SAFC za przeprowadzenie analiz macierzy cDNA oraz analizę danych.
MISSION jest zarejestrowanym znakiem towarowym Sigma-Aldrich Biotechnology L.P.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| JumpStart REDTaq ReadyMix |  Sigma-Aldrich | P0982 | |
| Gancyklowir | Sigma-Aldrich | G2536 | |
| G418 | Sigma-Aldrich | G8168 | |
| Puromycyna | Sigma-Aldrich | P9620 | |
| Topo TA | Invitrogen | KNM450-01 | |
| GenElute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | G1N10 | |
| Zestaw do nukleofekcji specyficzny dla komórek | Lonza Inc. | ||
| Nukleofektor | Lonza Inc. | AAD-101 | |
| Zeocyna | Invitrogen | R250-01 | |
| Biblioteka Target ID | Sigma-Aldrich | MREH01 |
Bibliografia
- Target ID Library Technical Bulletin, Catalog # MREH01. [Internet]. , Sigma Aldrich. St Louis. Available from: http://www.sigma-aldrich.com (2012).
- Huang, Q., Gumireddy, K., Schrier, M. The microRNAs miR-373 and miR-520c promote tumour invasion and metastasis. Nat. Cell Biol. 10 (2), 202-210 (2008).
- Lichner, Z., Pall, E., Kerekes, A. The miR-290-295 cluster promotes pluripotency maintenance by regulating cell cycle phase distribution in mouse embryonic stem cells. Differentiation. 81 (1), 11-24 (2011).
- Subramanyam, D., Lamouille, S., Judson, R. L. Multiple targets of miR-302 and miR-372 promote reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 29 (5), 443-448 (2001).
- Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P. Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs. Nature. 433 (7027), 769-773 (2005).
- Huntzinger, E., Izaurralde, E. Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay. Nat. Rev. Genet. 12 (2), 99-110 (2011).
- Thomas, M. Desperately seeking microRNA targets. Nat. Struc. Mol. Biol. 17 (10), 1169-1174 (2010).
- Baek, D. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 455 (7209), 71-71 (2008).
- Guo, H. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466 (3708), 835-840 (2010).
- Ma, L. Tumour invasion and metastasis initiated my microRNA-10b in breast cancer. Nature. 449 (7163), 682-688 (2007).
- Visone, R., et al. MicroRNAs miR-221 and miR-222, both overexpressed in human thyroid papillary carcinomas, regulate p27Kip1 protein levels and cell cycle. Endocrine-Related Cancer. 14 (3), 791-798 (2007).
- Lu, Z., et al. MicroRNA-21 promotes cell transformation by targeting the programmed cell death 4 gene. Oncogene. 27 (31), 4373-4379 (2008).
- Guo, C., et al. The noncoding RNA, miR-126, suppresses the growth of neoplastic cells by targeting phosphatidylinositol 3-kinase signaling and is frequently lost in colon cancers. Genes Chrom. Cancer. 47 (11), 939-946 (2008).
- Yamakuchi, M., et al. miR-34a repression of SIRT1 regulates apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (36), 13421-13426 (2008).
- Wickramasinghe, N. S., et al. Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells. Nucleic Acid Res. 37 (8), 2584-2595 Forthcoming.
- Ciaudo, C., et al. Highly dynamic and sex-specific expression of microRNAs during early ES cell differentiation. PLoS Genetics. 5, e1000620(2009).
- Vallejo, D. M., et al. Targeting Notch signaling by the conserved miR-8/200 microRNA family in development and cancer cells. EMBO J. 30 (4), 756-769 (2011).
- Jafarifar, F., et al. Repression of VEGFA by CA-rich element-binding microRNAs is modulated by hnRNAP. L. EMBO J. 30 (7), 1324-1334 (2011).
- Clancy, J. L., et al. mRNA isoform diversity can obscure detection of miRNA-mediated control of translation. RNA. 17 (6), 1025-1033 (2011).
Przedruki i uprawnienia
