Edycja genomu przy użyciu niestandardowych nukleaz z palcami cynkowymi (ZFN) CompoZr

Podsumowanie

Usługa CompoZr Custom Zinc-Finger Nuclease (ZFN) umożliwia precyzyjną edycję genomu w dowolnym organizmie lub linii komórkowej w dowolnym locus zdefiniowanym przez użytkownika. Niniejszy artykuł opisuje proces projektowania, produkcji, walidacji i wdrażania usługi CompoZr Custom ZFN.

Streszczenie

Edycja genomu to potężna technika, która może być wykorzystana do wyjaśnienia funkcji genów oraz genetycznych podstaw chorób. Tradycyjne metody edycji genów, takie jak mutogeneza chemiczna czy losowa integracja sekwencji DNA, wprowadzają niekontrolowane zmiany genetyczne w sposób mało wydajny i wymagają włączenia niepożądanych sekwencji syntetycznych lub zastosowania nietypowych warunków hodowli, co może zaburzyć analizę biologiczną. W przeciwieństwie do nich, przejściowa ekspresja ZFN w komórce umożliwia precyzyjną, dziedziczną edycję genów przy wysokiej wydajności, bez konieczności podawania substancji chemicznych czy integracji syntetycznych transgenów.

Nukleazy z palcem cynkowym (ZFN) to enzymy, które wiążą i przecinają określone sekwencje dwuniciowego DNA (dsDNA). Funkcjonalna jednostka CompoZr ZFN składa się z dwóch pojedynczych białek monomerycznych, które wiążą „półwitrynę” DNA o długości około 15-18 nukleotydów (patrz Rysunek 1). Gdy dwa monomery ZFN „trafią” w swoje sąsiednie miejsca docelowe, domeny tnące DNA dimeryzują, powodując pęknięcie obu nici (DSB) w DNA.¹ Wprowadzenie indukowanych przez ZFN pęknięć DSB w genomie stanowi podstawę do wysoce wydajnej edycji genomu. Niedoskonała naprawa pęknięć DSB w komórce poprzez szlak naprawy DNA poprzez niespecyficzne łączenie końców (NHEJ) może prowadzić do powstania niewielkich insercji i delecji (indeli). Powstanie indeli w sekwencji kodującej gen komórki może skutkować przesunięciem ramki odczytu i następczym funkcjonalnym wyłączeniem locusu genu z wysoką wydajnością.² Choć niniejszy protokół opisuje zastosowanie ZFN do stworzenia knockoutu genu, integracja transgenów może być również przeprowadzona poprzez naprawę kierowaną homolgią w miejscu cięcia ZFN.

Usługa CompoZr Custom ZFN stanowi systematyczne, kompleksowe i dobrze scharakteryzowane podejście do celowanej edycji genów dla społeczności naukowej z wykorzystaniem technologii ZFN. Naukowcy z firmy Sigma ściśle współpracują z badaczami, aby 1) przeprowadzić analizę wstępną, obejmującą badanie struktury odpowiedniego genu, jego biologii oraz systemu modelowego zgodnie z celami projektu, 2) wykorzystać tę wiedzę do opracowania właściwej strategii celowania, 3) a następnie zaprojektować, zbudować i funkcjonalnie zwalidować ZFN pod kątem aktywności w odpowiedniej linii komórkowej. Badacz otrzymuje genomiczne DNA kontroli dodatniej i startery, a także gotowe do użycia odczynniki ZFN dostarczone w formie plazmidowego DNA oraz mRNA transkrybowanego in vitro. Odczynniki te mogą być następnie dostarczone w celu transientnej ekspresji w wybranej przez badacza linii lub typie komórek. Próbki są następnie testowane pod kątem edycji genów w interesującym locus za pomocą standardowych technik biologii molekularnej, w tym amplifikacji PCR, trawienia enzymatycznego i elektroforezy. Po wykryciu pozytywnego sygnału edycji genów w początkowej populacji, komórki są klonowane metodą pojedynczych komórek i genotypowane w celu identyfikacji klonów/alleli mutantowych.

Protokół

1. Proces projektowania niestandardowych ZFN

1. Aby przyspieszyć proces projektowania ZFN, badacz powinien dostarczyć:
   • Informacje o genie docelowym, takie jak nazwa genu, gatunek oraz numer adnotacji/identyfikacji genu.
   • Jasno sformułowany ogólny cel eksperymentu (np. knockout lub knockin).
   • Wszelkie specyficzne cechy genu docelowego, w tym nietypową strukturę genu, szczególną biologię związaną z locus genetycznym lub wszelkie regiony homologiczne w innych częściach genomu.
   • Konkretny zakres sekwencji DNA, który ma być celem dla nukleaz z palcami cynkowymi.
2. Zespół bioinformatyczny Sigma przeprowadza projektowanie ZFN in silico w celu opracowania wstępnych miejsc docelowych dla palców cynkowych.
3. Wstępne miejsca docelowe ZFN są przekazywane konsultantowi technicznemu ds. ZFN. W przypadku bardziej złożonych technicznie projektów naukowiec z Sigma współpracuje z badaczami nad opracowaniem strategii projektu.
4. Zespół bioinformatyczny Sigma przeprowadza analizę z wykorzystaniem algorytmów ZFN w celu wygenerowania projektów ZFN in silico. Obejmuje to przeszukiwanie całego genomu w poszukiwaniu miejsc poza celem (off-target), maskowanie powtórzeń oraz analizę SNP dla każdego potencjalnego miejsca docelowego ZFN.
5. Dział bioinformatyki przekazuje badaczowi do wglądu najlepsze miejsca docelowe ZFN. Po zatwierdzeniu potencjalnych miejsc docelowych ZFN, informacje te są przekazywane zespołowi produkcji ZFN w celu rozpoczęcia procesu wytwarzania ZFN.

2. Produkcja niestandardowych ZFN

1. Archiwum modułów palców cynkowych Sigma jest wykorzystywane do składania zatwierdzonych projektów ZFN.
2. Każdy projekt ZFN jest składany i weryfikowany pod kątem sekwencji na wysokoprzepustowej platformie klonowania.
3. Po zakończeniu produkcji wszystkich projektów ZFN, każdy ZFN jest przekazywany do walidacji.

3. Walidacja niestandardowych ZFN

1. Projekty ZFN dla gatunków ludzkich, myszy, szczura lub linii CHO są walidowane w dobrze scharakteryzowanych liniach komórkowych dla każdego gatunku; w przypadku pozostałych organizmów lub typów komórek stosowany jest test oparty na drożdżach.
2. Konstrukty ZFN są dostarczane do odpowiedniej linii komórkowej poprzez nukleofekcję, a następnie następuje ekspresja ZFN.
3. DNA jest izolowane z puli komórek transfekowanych ZFN, a następnie przeprowadzana jest amplifikacja PCR regionu zainteresowania.
4. Następnie produkt PCR poddawany jest analizie w teście Cel-1. W celu walidacji aktywności ZFN przeprowadzana jest elektroforeza żelowa produktu testu Cel-1.
5. Projekt ZFN o najwyższej aktywności, potwierdzony testem Cel-1, jest przekazywany klientowi. ZFN są dostarczane w formie mRNA oraz plazmidowego DNA, wraz z primerami PCR do testu Cel-1 oraz genomowym DNA jako kontrolą pozytywną.

4. Dostarczanie zwalidowanych ZFN poprzez nukleofekcję

1. Dzień przed nukleofekcją wysiać komórki w zagęszczeniu 2x10⁵ komórek/ml.
2. W dniu nukleofekcji wyjąć zestaw Cell Line Nucleofector Kit V i pozwolić mu ogrzać się do temperatury pokojowej.
3. Dodać suplement do roztworu Nucleofection Solution V zgodnie z protokołem producenta.
4. Policzyć komórki. Zagęszczenie komórek powinno wynosić od 2,5-5x10⁵ komórek/ml.
5. Napełnić płytkę 6-dołkową, wlewając do każdego dołka 2ml medium, a następnie wstępnie ogrzać w inkubatorze CO₂ w temperaturze 37 °C przez co najmniej 20 minut przed nukleofekcją.
6. Odwirować 2x10⁶ komórek na jedną transfekcję (łącznie 8x10⁶) przy 200xg przez 5 minut.
7. Przemyć komórki dwukrotnie 20 ml zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS).
8. Przygotować probówki eksperymentalne: (patrz tabela w biuletynie technicznym Custom ZFN)
9. Wyjąć z inkubatora płytkę 6-dołkową z medium z kroku (6.5).
10. Resuspender komórki w 400 μl (100 μl/reakcja) roztworu Nucleofection Solution V.
11. Kolejno, dla jednej reakcji na raz, dodać 100 μl komórek do każdej probówki zawierającej DNA lub mRNA. Przenieść mieszaninę do 2 mm kuwety do elektroporacji i przeprowadzić nukleofekcję w urządzeniu Nucleofector przy użyciu odpowiedniego programu.
12. Natychmiast po nukleofekcji każdej próbki, za pomocą pipety transferowej dodać ~500 μl wstępnie ogrzanego medium z płytki 6-dołkowej z kroku (6.9) do kuwety. Następnie ostrożnie przenieść komórki z kuwety do pozostałego wstępnie ogrzanego medium w płytce 6-dołkowej.
13. Zakończyć wszystkie reakcje i umieścić płytkę 6-dołkową z powrotem w inkubatorze CO₂ w temperaturze 37 °C.

5. Odzyskiwanie genomowego DNA po dostarczeniu ZFN

1. płytka 6-dołkowa – nie należy zbierać wszystkich połączonych komórek. Ważne jest utrzymanie hodowli, aby dysponować komórkami do klonowania metodą rozcieńczeń do pojedynczych komórek po potwierdzeniu obecności produktów trawienia Cel-1. Od jednego do trzech dni po nukleofekcji należy zebrać komórki w celu przygotowania chromosomalnego DNA przy użyciu zestawu GenElute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit.

6. Analiza Cel-1

1. Przeprowadź amplifikację PCR genomowego DNA z próbek transfekowanych ZFN oraz genomowego DNA kontroli pozytywnej dostarczonej w zestawie, używając dołączonych starterów. Reakcję PCR przeprowadza się zgodnie z następującymi warunkami: (patrz tabela w biuletynie technicznym Custom ZFN).
2. Aby uzyskać heterodupleksy z homodupleksów PCR, pobierz 10 μl reakcji PCR z każdej próbki traktowanej ZFN oraz z kontroli i zastosuj następujący program w termocyklerze:
   95 °C, 10 minut
   95 °C do 85 °C, -2 °C/sekundę
   85 °C do 25 °C, -0,1 °C/sekundę
   4 °C, bezterminowo
3. Do każdej reakcji dodaj 1 μl wzmacniacza (enhancer) i 1 μl Nukleazy S (z Transgenomic, numer katalogowy 706025), a następnie inkubuj w temperaturze 42 °C przez 20-40 minut.
4. Produkty trawienia rozdziel w żelu PAGE-TBE 10% z odpowiednimi markerami, takimi jak DirectLoad WideRange DNA Ladder (numer katalogowy D7058) (patrz wyniki w biuletynie technicznym Custom ZFN).
5. Po wykryciu pozytywnego sygnału w populacjach traktowanych ZFN za pomocą testu cel-I, przystąp do izolacji i charakterystyki klonalnej.

7. Izolacja i charakterystyka klonalna

1. Wyizoluj pojedyncze klony z próbek traktowanych ZFN standardowymi metodami, takimi jak FACS i klonowanie przez rozcieńczenia.
2. Pozwól klonom na dostateczną ekspansję, a następnie wydziel odpowiednią frakcję komórek do pozyskania genomowego DNA, zamrażając pozostałe jako materiał bankowany.
3. Wytnij genomowe DNA z klonów, używając starterów Cel-I, a następnie poddaj amplikon analizie testem Cel-I (z dodatkiem i bez dodatku WT DNA) lub alternatywnie wykorzystaj ten amplikon do bezpośredniego genotypowania.
4. Przeprowadź genotypowanie preferowaną metodą w celu weryfikacji klonów kandydackich zidentyfikowanych jako posiadające edytowane allele.

8. Reprezentatywne wyniki

Przykład całego procesu CompoZr ZFN przedstawiono na Rysunku 2. ZFN są dostarczane do komórek, gdzie wiążą się i przecinają odpowiednią sekwencję DNA, co powoduje powstanie pęknięcia obu nici (DSB). Naturalny proces naprawczy, niehomologiczne łączenie końców (NHEJ), naprawia DSB. W niektórych przypadkach nieprawidłowe NHEJ prowadzi do delecji, insercji lub substytucji nukleotydów. Amplifikacja PCR wyizolowanego DNA genomowego prowadzi do tworzenia heterodupleksów między amplikonami typu dzikiego a zmodyfikowanymi po etapie denaturacji/odżalania reakcji PCR. Dodatek enzymu Cel-1 powoduje przecięcie wszelkich cząsteczek heterodupleksów. Wyniki analizy Cel-1 są rozdzielane za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE) w celu potwierdzenia cięcia przez ZFN. Rysunek 3 przedstawia schemat testu Cel-1 oraz oczekiwane wyniki.

Reprezentatywne wyniki dla Cel-1 przedstawiono na Rycina 4 i 5. Rycina 4 zawiera wyniki dla bardzo aktywnej pary ZFN (21%) w komórkach K562; Rycina 5 zawiera wyniki dla mniej aktywnej pary ZFN (2,4%) w komórkach K562. Aktywność ZFN jest potwierdzona na obu rycinach przez obecność dwóch fragmentów PCR poniżej rodzimego fragmentu PCR.

Rysunek 1. Przedstawienie związanych nukleaz z palcami cynkowymi. ZFN to białka inżynieryjne składające się z domeny wiążącej DNA z palcami cynkowymi połączonej z domeną tnącą endonukleazy restrykcyjnej FokI. Po związaniu w formie heterodimeru ZFN wywołują pęknięcie obu nici w określonej przez użytkownika sekwencji DNA.

Rycina 2. Schemat procesu świadczenia usług niestandardowych ZFN. Graficzna reprezentacja procesu generowania genetycznie zmodyfikowanej linii komórkowej przy użyciu CompoZr ZFNs.

Rysunek 3. Schemat testu Cel-1 i jego wyników. A) Plazmid ZFN lub mRNA zostaje dostarczony do komórek. B) Wyekspresowane ZFN wiążą się z sekwencją docelową i przecinają ją, tworząc pęknięcie obu nici (DSB) w części komórek. C) Błędna naprawa niektórych DSB poprzez niehomologiczne łączenie końców prowadzi do insercji lub delecji nukleotydów. D) Genomiczne DNA jest izolowane z transfektowanej puli komórek i amplifikowane w obrębie locusu zainteresowania. E-F) Produkt PCR jest denaturowany i ponownie hybrydyzowany, co prowadzi do powstania heterodupleksów między amplikonami typu dzikiego a zmodyfikowanymi. G) Test z użyciem endonukleazy Cel-1 rozpoznającej niedopasowania prowadzi do rozcięcia cząsteczek heterodupleksu. H) Produkty trawienia enzymem Cel-1 są rozdzielane za pomocą PAGE. Obserwowany stosunek produktu rozcięcia do pasma wyjściowego, wyznaczony za pomocą oprogramowania ImageJ, wskazuje frakcję przeciętą i wydajność ZFN.

Rysunek 4. Wyniki Cel-1 dla 21% aktywnych ZFN. Oprogramowanie ImageJ jest dostępne pod adresem: http://rsbweb.nih.gov/ij/.

Rysunek 5. Wyniki Cel-1 dla 2,4% aktywnych ZFN. Oprogramowanie ImageJ jest dostępne pod adresem: http://rsbweb.nih.gov/ij/.

Dyskusja

Po wyizolowaniu komórek zmodyfikowanych za pomocą ZFN posiadają one trwałe i dziedziczne modyfikacje DNA. Umożliwia to generowanie stabilnie zmodyfikowanych linii komórkowych lub hodowlę zwierząt z pożądanymi modyfikacjami genetycznymi w celu prowadzenia badań. Custom ZFN firmy CompoZr stanowią niezawodną metodę edycji genomu w szerokim zakresie typów komórek. Publikacje dotyczące udanej edycji genomu za pomocą ZFN obejmują między innymi ludzkie linie komórkowe oraz modele badawcze myszy, szczura, danio-ostrobramowego, żaby, świni oraz CHO.^{3,4,5,6,7,8,9} Zdolność do wywołania pęknięcia dwuniciowego w pożądanym miejscu docelowym w określonym typie komórek jest zapewniona, gdy ZFN zostaną prawidłowo wprowadzone do komórki. Możliwe jest również przeprowadzanie sekwencyjnych modyfikacji palcami cynkowymi w komórce, aby uzyskać więcej niż jedną modyfikację genetyczną w obrębie jednej komórki.¹⁰ Możliwość wyboru specyficznej sekwencji docelowej i modyfikacji wyłącznie tego konkretnego locus jest głównym czynnikiem umożliwiającym wprowadzanie wielu modyfikacji.

Certyfikat analizy CompoZr Custom ZFN jest generowany przy użyciu tych samych odczynników, które znajdują się w zestawie, co zapewnia, że wszystkie komponenty zestawu zostały dokładnie zwalidowane w celu zagwarantowania sukcesu użytkownika. Poniżej przedstawiono krytyczne etapy całego przebiegu pracy:

Klonowanie komórek

Zdolność do izolacji i namnażania danej linii komórkowej powinna zostać przetestowana przed rozpoczęciem jakichkolwiek eksperymentów z użyciem ZFN. Pojedyncze komórki powinny zostać wyizolowane i namnożone, aby upewnić się, że możliwe jest uzyskanie populacji pochodzącej z jednego klonu. Niektóre linie komórkowe są oporne na ten proces; w takim przypadku pomocne mogą okazać się techniki takie jak wzbogacanie klonów poddanych edycji lub hodowla w pożywce warunkowanej.

Wydajność dostarczania

Optymalizacja wydajności dostarczania jest niezbędna przed wprowadzeniem ZFN. Można zastosować wiele metod, w tym transfekcję opartą na lipidach, elektroporację oraz nukleofekcję. Idealna metoda dostarczania to taka, która zapewnia najbardziej optymalny balans pomiędzy wydajnością dostarczania a przeżywalnością komórek. Ilościowe określenie tej wydajności można przeprowadzić poprzez dostarczenie plazmidu kontrolnego GFP i wykonanie pomiaru za pomocą inspekcji wizualnej lub FACS 24-48 h po dostarczeniu.

Analiza Cel-I

Niezbędne jest przeprowadzenie analizy Cel-I równolegle z odpowiednimi kontrolami, aby upewnić się, że parametry PCR, trawienia i elektroforezy nie wpłyną na interpretację eksperymentu z ZFN. Każdy zestaw zawiera kontrolne DNA genomiczne, które służy do stworzenia obrazu Cel-I w certyfikacie analizy. Amplifikacja kontrolnego DNA z zastosowaniem dostarczonych starterów, a następnie analiza Cel-I, umożliwi użytkownikowi porównanie wyników z obrazem zamieszczonym w certyfikacie analizy (CofA) i wyizolowanie wszelkich potencjalnych nieefektywności w tym aspekcie eksperymentu. Należy również uwzględnić odpowiednią kontrolę negatywną, taką jak próbka typu mock lub próbka komórek traktowanych GFP, aby umożliwić identyfikację wszelkich niespecyficznych produktów cięcia.

Analiza jakościowa/ilościowa pojedynczych klonów komórkowych

Po zastosowaniu ZFN i klonowaniu pojedynczych komórek, populacje komórek można przesiewać pod kątem edycji w interesującym badacza locus za pomocą szeregu metod. W celu zidentyfikowania klonów kandydatów do dalszego genotypowania można przeprowadzić test Cel-I na DNA genomicznym z klonów. Ważne jest, aby przed przeprowadzeniem trawienia Cel-I dodać do amplikonów z próbek amplikon WT w stosunku 1:1, ponieważ klony mutanty homozygotyczne będą zawierać jednorodne cząsteczki, co przełoży się na negatywny wynik testu Cel-I. Alternatywną metodą przesiewania tych klonów kandydatów jest zaprojektowanie jednego starteru PCR wiążącego się bezpośrednio w miejscu docelowym ZFN. Przy zastosowaniu wraz z jednym ze starterów kontrolnych, negatywny wynik testu wskazuje na utratę sekwencji WT. Klon heterozygotyczny zawierający co najmniej jeden allel WT wygeneruje sygnał PCR, lecz można go odróżnić od klonów w pełni WT poprzez przeprowadzenie PCR w formie SYBR qPCR.

Po zidentyfikowaniu potencjalnych klonów za pomocą powyższych metod, można przeprowadzić ich genotypowanie standardową pirosekwencją, sekwencjonowaniem głębokim lub innymi metodami sekwencjonowania. W przypadku wszystkich metod sekwencjonowania należy wytworzyć amplikon z klonalnego DNA genomicznego. W tradycyjnej pirosekwencji allele można rozdzielić poprzez klonowanie TA produktu PCR i sekwencjonowanie poszczególnych kolonii. W przypadku takich metod jak sekwencjonowanie głębokie krok ten nie jest konieczny.

Naprawa kierowana homologią (HDR)

Niniejszy protokół przedstawia metodę wyciszania genów za pomocą ZFN z wykorzystaniem mechanizmu NHEJ. Integracja transgenów może być również przeprowadzona poprzez wprowadzenie plazmidu donora z ramionami homologii flankującymi miejsce cięcia ZFN.¹¹ W takim przypadku pęknięcie dwuniciowe utworzone przez ZFN jest naprawiane przez HDR zamiast NHEJ. Integrację transgenów kierowaną przez HDR można potwierdzić, stosując metody podobne do procedur opisanych w niniejszym protokole.

Rozwiązywanie problemów

Dostarczanie ZFN

Dostarczanie i ekspresja ZFN – proces dostarczania można kontrolować poprzez wprowadzenie plazmidu GFP lub innego podobnego plazmidu w celu wizualizacji i/lub kwantyfikacji. Niską ekspresję wynikającą z niekompatybilności promotora z badanym typem komórek można zniwelować, dostarczając ZFN w formie mRNA. Dodatkowo, w celu dalszego zwiększenia skuteczności ZFN w komórkach, można zastosować metodę szoku termicznego (cold shock).¹² W przypadku użycia mRNA niezbędne jest przemycie komórek przed dostarczaniem, aby upewnić się, że wszystkie pochodzące z surowicy RNazy zostały usunięte. Zaleca się również rozmrażanie mRNA na lodzie i dodawanie go do komórek w ostatniej możliwej chwili, aby zminimalizować ryzyko degradacji.

test Cel-I

Podstawą testu Cel-I jest specyficzna i obfita amplifikacja interesującego locus. W przypadku zaobserwowania niespecyficznych produktów amplifikacji należy zastosować standardowe procedury rozwiązywania problemów z PCR w celu zwiększenia specyficzności, takie jak optymalizacja ilości matrycy, stężenia starterów oraz parametrów cykliczności. Należy przeprowadzić analizę PAGE zamiast standardowej elektroforezy w żelu agarozowym, ponieważ ta druga metoda nie zapewnia odpowiedniej rozdzielczości i czułości. Warunki trawienia Cel-I mogą być również optymalizowane, jeśli nie zaobserwowano produktu trawienia lub występuje nadmierne rozmycie prążków. W celu poprawy tych aspektów można przeprowadzić miareczkowanie ilości nukleazy Cel-1 i/lub czasu trawienia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Nukleaza S (enzym Cel-1)	Transgenomic	706025
System Expand High Fidelity PCR	Roche Group	03 300 242 001
Zestaw Cell Line Nucleofector Kit V	Lonza Inc.	VCA-1003
Zestaw GenElute HP Endotoxin-Free Plasmid Maxiprep	Sigma-Aldrich	NA0400