W niniejszej pracy wykorzystujemy ludzką bibliotekę pulową LentiPlex oraz tradycyjne metody sekwencjonowania w celu identyfikacji genów docelowych sprzyjających przeżyciu komórek. Przedstawiamy sposób przygotowania i dekonwolucji screeningu LentiPlex oraz walidacji uzyskanych wyników.
Artykuł metodologiczny
Przesiewanie biblioteki połączonej shRNA MISSION LentiPlex w komórkach ssaków
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Interferencja RNA (RNAi) jest naturalnym mechanizmem komórkowym służącym do regulacji ekspresji genów. Wykorzystanie wrodzonej mocy tego systemu umożliwia obniżenie poziomów ekspresji genów w badaniach nad utratą funkcji genu.
Istnieją dwie główne metody przeprowadzania RNAi. Pierwsza polega na wykorzystaniu syntetycznie otrzymywanych małych interferujących RNA (siRNAs), a druga opiera się na wykorzystaniu krótkich RNA w formie spinki (shRNAs) kodowanych w plazmidach 1. Te drugie mogą być wprowadzane do komórek bezpośrednio poprzez transfekcję lub pakowane do niezdolnych do replikacji cząsteczek lentiwirusowych. Głównymi zaletami stosowania lentiwirusowych shRNAs są łatwość wprowadzenia ich do szerokiej gamy typów komórek, zdolność do stabilnej integracji z genomem w celu długotrwałego wyciszania genów i selekcji, a także ich skuteczność w prowadzeniu wysokoprzepustowych badań przesiewowych funkcji utraconych. Aby ułatwić ten proces, stworzyliśmy połączoną bibliotekę shRNA LentiPlex.
Biblioteka puli shRNA dla ludzi MISSION LentiPlex jest genomową pulą lentiwirusową wytworzoną przy użyciu zastrzeżonego procesu. Biblioteka składa się z ponad 75 000 konstruktów shRNA z kolekcji TRC, celujących w ponad 15 000 ludzkich genów 2. Każda biblioteka jest testowana pod kątem reprezentatywności shRNA przed wprowadzeniem produktu do obrotu, aby zapewnić szerokie pokrycie biblioteki. Biblioteka jest dostarczana w gotowym do użycia formacie lentiwirusowym o mianie co najmniej 5 x 108 TU/ml określonym za pomocą analizy p24 i jest wstępnie podzielona na dziesięć podpuli, z których każda zawiera około 8 000 konstruktów shRNA. Do późniejszej identyfikacji celów dostarczone są również primery do amplifikacji i sekwencjonowania.
Poprzednie badania wykazały synergistyczną aktywność przeciwnowotworową TRAIL w połączeniu z Paklitakselem w komórkach A549, linii komórkowej raka płuca człowieka 3, 4. W niniejszym badaniu prezentujemy zastosowanie puli biblioteki LentiPlex shRNA w celu szybkiego przeprowadzenia przesiewowego badania selekcji pozytywnej genów zaangażowanych w cytotoksyczność komórek A549 po ekspozycji na TRAIL i Paklitaksel. Jedną z barier często spotykanych w badaniach wysokoprzepustowych jest koszt i trudność dekonwolucji; szczegółowo opisujemy również kosztowo efektywne podejście poliklonalne z wykorzystaniem tradycyjnego sekwencjonowania.
Protokół
Przygotowanie do badania przesiewowego LentiPlex Pooled Screen
W celu zidentyfikowania interesujących sekwencji shRNA krytyczne jest zaprojektowanie badania w taki sposób, aby większość komórek otrzymała tylko jedną konstrukcję shRNA. Dzięki zastosowaniu niskiego MOI (multiplicity of infection), prawdopodobieństwo obecności wielu integrantów w jednej komórce jest znacznie zmniejszone. Jednakże wydajność transdukcji, a co za tym idzie pożądane wartości MOI, silnie zależą od rodzaju komórek docelowych. Dlatego przed rozpoczęciem badania w nowym typie komórek niezbędne jest wyznaczenie optymalnego MOI.
1. Transdukcja komórek docelowych za pomocą puli biblioteki shRNA Mission LentiPlex
- Rzeczywista wartość MOI będzie się różnić w zależności od rodzaju komórek. W przypadku chęci wykonania powtórzeń należy odpowiednio zwiększyć liczbę płytek. Ponadto zazwyczaj nie jest korzystne łączenie różnych subpooli. Przechowywanie subpooli oddzielnie ułatwi proces dekonwolucji. Należy zapewnić właściwe oznakowanie każdej szalki hodowlanej numerem subpoola zastosowanego podczas transdukcji. Zaleca się stosowanie niskiego MOI w celu zmniejszenia prawdopodobieństwa wystąpienia wielu integrantów w jednej komórce.
- Dzień 1 – Wysiać odpowiednią liczbę szalek 60 mm z taką ilością komórek, aby następnego dnia uzyskać ok. 70% konfluencji (łącznie 10 pul, każda wykonana w trzech powtórzeniach = łącznie 30 szalek). W naszym badaniu na szalkach 60 mm wysiano 6 x 10⁵ komórek A549, aby osiągnąć 70% konfluencji przed transdukcją. Zapewnia to, że komórki znajdują się nadal w fazie wzrostu wykładniczego. Szybkość wzrostu będzie się różnić w zależności od typu komórek i musi zostać określona przed rozpoczęciem screeningu.
- Pozostawić komórki do adhezji, inkubując je przez noc w temperaturze 37°C w inkubatorze z nawilżaniem w atmosferze 5% CO22.
- (Opcjonalnie) Należy dołączyć dwie dodatkowe szalki 60-mm do transdukcji z wykorzystaniem negatywnych shRNA kontrolnych. Szalki należy oznaczyć jako „Control A” dla SHC001H oraz „Control B” dla SHC002H.
- Dzień 2 – Transdukcja komórek za pomocą cząsteczek wirusowych LentiPlex. W dniu transdukcji rozmrozić cząsteczki lentiwirusowe na lodzie.
- Przenieś rozmrożone cząsteczki do komory z laminarnym przepływem powietrza i przechowuj w lodzie, jeśli nie są używane natychmiast.
- Obliczyć, ile z każdego poszczególnego sub-poolu wirusa należy dodać do komórek, aby uzyskać MOI równy 1 we wszystkich naczyniach hodowlanych.
- Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. 1 x 106 komórek/szalkę; Miano wirusa = 5 x 108 TU/ml; pożądana wielokrotność infekcji (MOI) wynosząca 1. i.) 1 x 106 komórek/szalkę x (MOI = 1) = 1 x 106 jednostek transdukcyjnych (TU) potrzebnych ii.) 1 x 106 TU/(5,0 x 108 TU/ml) uzyskane z C of A = 2 μL roztworu zapasu lentiwirusa należy dodać do odpowiedniej płytki. Obliczoną ilość wirusa należy rozcieńczyć w 100-300 μL pełnej pożywki, aby zapewnić lepszą dystrybucję wirusa po dodaniu go do szalki z hodowlą komórek.
- Usunąć pożywkę z wcześniej wysianych komórek. Do każdej szalki dodać pełną pożywkę zawierającą roztwór bromku heksadimetryny. Zalecane stężenie końcowe bromku heksadimetryny w pożywce wynosi 8 μg/mlNależy użyć mniejszej ilości bromku heksadymetryny, jeśli okaże się on toksyczny dla komórek docelowych.
- Dodaj lentiwirusem dostarczane cząsteczki shRNA do odpowiednich naczyń, zgodnie z przyjętym planem doświadczalnym. Delikatnie zakręć płytkami, aby równomiernie rozprowadzić wirusa po komórkach.
- Inkubować przez 18–20 godzin w temperaturze 37°C w inkubatorze z nawilżaniem w atmosferze 5% CO22.
- (Opcjonalnie) Powtórzyć kroki 3–8 przy identycznym MOI z zastosowaniem SHC001H (kontrolny pusty wektor shRNA) w szalce kontrolnej A oraz SHC002H (kontrolny shRNA o losowej sekwencji) w szalce kontrolnej B. Szalki te należy traktować w sposób identyczny jak szalki eksperymentalne przez cały czas trwania eksperymentu.
- Dzień 3 – Wymiana pożywki. Odessać pożywkę zawierającą wirusa i dodać świeżą pożywkę kompletną (bez bromku heksadymetryny). Inkubować komórki w 37°C przez noc.
2. Inkubacja wysianych komórek z komponentem terapeutycznym/odczynnikiem
- Dzień 4 – Odessać pożywkę z dołków i dodać świeżą pożywkę zawierającą składnik terapeutyczny w optymalnym stężeniu. Podobnie jak w przypadku warunków hodowli, rodzaje terapii będą się różnić, a odpowiednie stężenia i czasy ekspozycji należy ustalić wcześniej. W naszym badaniu zastosowaliśmy 100 ng/mL TRAIL oraz 1 μM Paklitakselu. Komórki były traktowane przez 48 godzin.
- Przeżyłe komórki należy ponownie wysiać do kolb T75 i pozwolić im na namnażanie do osiągnięcia niemal 100% konfluencji.
- (Opcjonalnie) Po zakończeniu selekcji sprawdzić szalkę kontrolną A oraz szalkę kontrolną B. Szalka A i szalka B powinny zawierać mniej kolonii niż co najmniej jedna z szalek z połączoną biblioteką. Jeśli w szalce A znajduje się nieoczekiwanie duża liczba kolonii, oznacza to, że proces transdukcji wpłynął na szlak związany z pożądanym fenotypem lub presja selekcyjna jest niewystarczająco silna, co może wymagać ponownej optymalizacji testu. Jeśli szalka B zawiera zbyt wiele kolonii, ekspresja shRNA i aktywacja szlaku RNAi mogą mieć wpływ na badany fenotyp. W takim przypadku należy powtórzyć procedurę z użyciem SHC001H, aby upewnić się, że efekt nie jest specyficzny dla SHC002H.
3. Dekonwolucja z poliklonalnej populacji komórek
- Zebierz heterogenną populację komórek z każdej podgrupy i wyizoluj DNA genomiczne. W naszym badaniu komórki krótko przemyto w PBS i poddano trypsynizacji, a następnie wyizolowano DNA genomiczne przy użyciu zestawu GenElute Mammalian Genomic Miniprep i załączonego protokołu (Sigma-Aldrich, G1N70). Alternatywnie, do izolacji DNA można użyć dowolnych innych dostępnych na rynku zestawów do oczyszczania genomowego. Ważne jest przestrzeganie zaleceń protokołu dotyczących początkowej ilości hodowanych komórek.
- Amplifikacja PCR celów. Procedura odzyskiwania matrycy shRNA umożliwia amplifikację całej puli wstawek shRNA z wybranej populacji komórek lub odzyskanie pojedynczych matryc shRNA z kolonii, które zostały indywidualnie wyselekcjonowane i namnożone. Po amplifikacji wstawek shRNA z komórek kontrolnych i wybranych komórek docelowych, produkty PCR można poddać sekwencjonowaniu.
- Ten etap amplifikacji PCR został zoptymalizowany przy użyciu Sigma ReadyMix, nr katalogowy P2893. Do amplifikacji można użyć innych odczynników, jednak warunki cykliczne i/lub stężenie magnezu mogą wymagać modyfikacji w celu uzyskania pomyślnej amplifikacji. Primery do amplifikacji w stężeniu 20 mM są dołączone do zestawu LentiPlex.
- Przygotuj reakcję PCR zgodnie z opisem w Tabeli 1. Dodawaj składniki w wymienionej kolejności. Opisane ilości dotyczą jednej reakcji o objętości 50 μL. W przypadku większej liczby reakcji przeskaluj składniki master mixu zgodnie z pożądaną liczbą reakcji, uwzględniając 10% nadmiaru. Zalecana ilość matrycy DNA to 50-100 ng.
- Zdecydowanie zaleca się, aby w jednej reakcji matrycę stanowił MISSION shRNA Human Positive Control Vector rozcieńczony do odpowiedniego stężenia. Pomyślna amplifikacja z tą matrycą wskazuje, że składniki testu PCR i warunki cykliczne są odpowiednie. UWAGA: Aby zapobiec kontaminacji przeniesionej (carryover) do próbek i odczynników eksperymentalnych, sugeruje się rozcieńczanie kontroli pozytywnej w innym miejscu niż to, w którym przygotowywane są kolejne reakcje PCR.
- Zapisz program PCR wymieniony w Tabeli 2 w termocyklerze.
- Dla każdej próbki połącz 3 μL reakcji PCR z 1 μL barwnika i przeprowadź elektroforezę wraz z 5 μL DirectLoad™ PCR 100 bp Low Ladder, nr katalogowy D3687, na 1% żelu agarozowym, aby potwierdzić obecność amplikonu o długości 309 bp.
- Subklonowanie amplikonów PCR: Produkty PCR zostały sklonowane metodą TOPO przy użyciu zestawu do klonowania TOPO-TA, zgodnie z protokołem producenta (Invitrogen, K4575-01). W rezultacie każdy wektor zawiera jeden produkt PCR.
- Wyizolowano 250 pojedynczych kolonii bakteryjnych (każda zawierająca pojedynczy amplikon PCR) i wyhodowano je w 2 mL kulturach LB z 100 mg/mL ampicyliny. Następnie wyekstrahowano DNA plazmidowe przy użyciu zestawu GenElute Plasmid Miniprep (Sigma-Aldrich, PLN70).
- Oczyszczone DNA plazmidowe poddano trawieniu enzymem EcoRI i elektroforezie w celu potwierdzenia obecności wstawki.
- Próbki DNA plazmidowego zostały następnie poddane sekwencjonowaniu, a wstawka shRNA została zidentyfikowana przy użyciu bazy danych LentiPlex shRNA Sequence Search dostarczonej wraz z biblioteką LentiPlex.
4. Identyfikacja i walidacja celu
- Sekwencja shRNA rozpoczyna się od 5'-GAAACACCGG-3'. Wprowadź co najmniej kolejne 10, ale mniej niż 21 nukleotydów jako sekwencję zapytania w polu wyszukiwania w dołączonym formularzu bazy danych shRNA Sequence Search Access.
- Wybierz gatunek z puli shRNA. Opcjonalnie wybierz podpulę, w której znaleziono sekwencję.
- Kliknij przycisk „Find Potential Hits”, aby przeprowadzić wyszukiwanie. Powinno to zidentyfikować odpowiadające sekwencje shRNA z TRC, które są zgodne z danymi sekwencjonowania. Więcej informacji na temat zidentyfikowanych sekwencji shRNA z TRC i odpowiadających im genów docelowych można łatwo znaleźć w serwisie Sigma-Aldrich Your Favorite Gene: http://www.sigma.com/yfg
- Zidentyfikowane geny docelowe należy zwalidować poprzez powtórzenie oryginalnego testu przesiewowego z oryginalnym klonem TRC oraz co najmniej dwoma dodatkowymi shRNA celującymi w ten sam gen, stosując format 1 shRNA na 1 dołek. Prawdziwe trafienia wykażą ten sam fenotyp w większości dołków.
5. Reprezentatywne wyniki
Przykład przebiegu procesu przesiewowego LentiPlex pooled screen przedstawiono na rysunku 1. Przetransdukowane komórki, które proliferowały w obecności TRAIL i Paclitaxel, pozostawiono do namnożenia aż do uzyskania konfluencji w kolbach. DNA genomowe zostało wyizolowane i poddane amplifikacji PCR oraz klonowaniu, zgodnie z ilustracją na rysunku 1 A, a następnie przekazane do sekwencjonowania i identyfikacji shRNA, jak opisano na rysunku 1 C. Zsekwencjonowano 250 klonów, z czego 25 było reprezentowanych przez wiele klonów, a pozostałe 225 przez tylko jeden klon i nie były one analizowane na tym etapie.
Jak pokazano na Ryc. 2, kilka genów kandydackich, w tym TBX3, PPP2CA i AKT2, było reprezentowanych przez wiele klonów. czynnik transkrypcyjny T-box, TBX3, pojawił się w łącznie czterech klonach i jest powiązany z migracją nowotworową5. Wykazano, że obniżenie poziomu ekspresji PPP2CA podtrzymuje wzrost komórek LNCaP hodowanych w warunkach niedoboru androgenów poprzez zniesienie indukowanego deprywacją androgenów zatrzymania cyklu komórkowego i zapobieganie apoptozie 6. AKT2 jest RAC-beta seryno-/treonino-proteinową kinazą i domniemanym onkogenem, o którym wykazano, że pełni kilka ról w rozwoju nowotworów 7, 8.
*Końcowe stężenie Mg2+ w roztworze wyniesie 3 mM; 1,5 mM pochodzi z Taq ReadyMix, a 1,5 mM z roztworu chlorku magnezu.
Tabela 1. Warunki reakcji PCR Lentiplex
Tabela 2. Program amplifikacji PCR Lentiplex
Rysunek 1. (A) Przesiewanie zbiorcze LentiPlex, (B) schemat dekonwolucji poliklonalnej oraz (C) identyfikacja celów shRNA.
A. Przesiewanie z pulą LentiPlex. Najpierw wysiej komórki, a następnie dodaj podpule shRNA (łącznie 10 pul, każda wykonana w trzech powtórzeniach, co daje łącznie 30 szalek). Następnie potraktuj je komponentem terapeutycznym/odczynnikiem (w naszym przypadku odpowiednio TRAIL i Paclitaxel). Potem ponownie wysiej przeżyłe komórki do kolb i pozwól im namnożyć się. Zbierz heterogenną populację komórek z każdej podpuli i wyizoluj DNA genomiczne.
B. Dekonwolucja poliklonalna. Przeprowadź reakcję PCR w celu amplifikacji DNA zawierającego insert shRNA. Produkt PCR jest jednorodny pod względem wielkości, ale poliklonalny pod względem sekwencji, ponieważ matrycowe gDNA było również poliklonalne. Produkt PCR jest klonowany do wektora, a następnie transformowany do kompetentnych bakterii.
C. Identyfikacja celów shRNA. Poszczególne kolonie są izolowane, a następnie ekstrahuje się DNA plazmidowe. Każdy klon zawiera wektor klonujący z jednym pojedynczym fragmentem PCR. DNA plazmidowe jest trawione w celu potwierdzenia obecności insertu, a następnie sekwencjonowane. Insert shRNA jest identyfikowany przy użyciu bazy danych LentiPlex shRNA Sequence Search.
Rysunek 2. Zidentyfikowane geny kandydackie. Zidentyfikowano 25 genów kandydackich, które wykazały wiele trafień. 225 genów kandydackich miało tylko 1 trafienie i nie było dalej analizowanych. Szczegółowy wykaz poszczególnych klonów dla każdego genu kandydackiego znajduje się w Tabeli Uzupełniającej 1.
Tabela uzupełniająca 1. Poszczególne klony biblioteki TRC zidentyfikowane na podstawie sekwencjonowania poliklonalnego: trafienia ID genu i wykryte klony.
Dyskusja
W niniejszym badaniu przedstawiamy przesiew genomowy w celu zidentyfikowania genów zaangażowanych w cytotoksyczność komórek A549 po zastosowaniu leczenia paklitakselem/TRAIL. Zastosowanie metody pulowanej w przesiewie genomowym pozwala zredukować czas, koszty oraz nakłady sprzętowe zazwyczaj związane z konwencjonalnymi przesiewami w układzie macierzowym. Kluczowe dla sukcesu przesiewu są eksperymenty optymalizacyjne przeprowadzone wcześniej. Warunki transdukcji oraz MOI muszą zostać określone empirycznie.
Metoda selekcji powinna umożliwiać skuteczne wyłonienie komórek wykazujących pożądany fenotyp (np. przeżywalność, ekspresję białek powierzchniowych itp.). Optymalizacja tych parametrów pozwoli ograniczyć liczbę wykrytych wyników fałszywie dodatnich.
W niniejszym badaniu gDNA pozyskano z całej populacji wybranych komórek, a następnie poddano klonowaniu TOPO w celu zidentyfikowania poszczególnych wstawk shRNA. Potencjalną modyfikacją ulepszającą ten eksperyment byłaby selekcja żywych komórek za pomocą FACS, aby zapewnić pobranie wyłącznie żywych komórek. Zidentyfikowane cele zostaną zwalidowane poprzez transdukcję specyficznymi dla celu shRNA w teście przesiewowym. Prawdziwe trafienia będą wykazywać dany fenotyp w większości studzienek.
Biblioteka LentiPlex Pooled Library charakteryzuje się elastycznością zastosowań. Jest ona kompatybilna z szeroką gamą aplikacji następczych i może być wykorzystywana w strategiach selekcji pozytywnej lub negatywnej. W zależności od warunków przesiewania, dekonwolucja wstawek shRNA jest przeprowadzana za pomocą PCR/klonowania, mikromacierzy lub sekwencjonowania nowej generacji 9, 10. Choć moc i szybkość tych technik w dekonwolucji przesiewów RNAi są dobrze udokumentowane, pewną obawą w przypadku metod z użyciem mikromacierzy i sekwencjonowania nowej generacji jest dostępność zasobów bioinformatycznych oraz wiedzy niezbędnej do prawidłowej analizy i interpretacji wyników eksperymentalnych. Koszty związane z tymi technikami mogą często stanowić barierę w realizacji przesiewów w skali całego genomu. Podejście oparte na PCR/klonowaniu, choć nie jest tak wydajne jak mikromacierze i sekwencjonowanie nowej generacji, stanowi skuteczną i tańszą alternatywę.
Firma Agilent oferuje obecnie niestandardową macierz opartą na bibliotece shRNA TRC, aby dodatkowo wspomóc badania przesiewowe LentiPlex. Opcje te umożliwiają badaczom wykorzystanie LentiPlex do analizy szerokiego zakresu funkcji komórkowych.
Oświadczenia
Matthew J. Coussens, Courtney Corman, Ashley L. Fischer, Jack Sago oraz John Swarthout są zatrudnieni w firmie Sigma-Aldrich, która produkuje narzędzia i odczynniki wykorzystane w niniejszym artykule.
Podziękowania
MISSION jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy Sigma-Aldrich Biotechnology L.P.
LentiPlex jest znakiem towarowym firmy Sigma-Aldrich Biotechnology L.P.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| LentiPlex Pooled Array |  Sigma-Aldrich | SHPH01 | |
| Komórki A549 | ATCC | CCL-185 | |
| TRAIL | Sigma-Aldrich | T5694 | |
| Paklitaksel | Sigma-Aldrich | T7402 | |
| Topo TA Cloning Kit | Invitrogen | K4575-01 | |
| JumpStart Taq ReadyMix | Sigma-Aldrich | P2893 | |
| GenElute Plasmid Miniprep kit | Sigma-Aldrich | PLN70 | |
| EcoR1 | New England Biolabs | R0101 | |
| bromek heksadymetryny | Sigma-Aldrich | H9268 |
Bibliografia
- Rao, D. siRNA vs. shRNA: similarities and differences. Adv. Drug Deliv. Rev. 61 (9), 746-746 (2009).
- Root, D. Genome-scale loss-of-function screening with a lentiviral RNAi library. Nat Methods. 3 (9), 715-715 (2006).
- Fan, Q. Synergistic antitumor activity of TRAIL combined with chemotherapeutic agents in A549 cell lines in vitro and in vivo. Cancer Chemother Pharmacol. 55, 189-189 (2005).
- Ji, D. A screen of shRNAs targeting tumor suppressor genes to identify factors involved in A549 paclitaxel sensitivity. Oncology Reports. 18, 1499-1499 (2007).
- Fillmore, C. Estrogen expands breast cancer stem-like cells through paracrine FGF/Tbx3 signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 14 (50), 21737-21737 (2010).
- Bhardwaj, A. Modulation of protein phosphatase 2A activity alters androgen-independent growth of prostate cancer cells: therapeutic implications. Mol. Cancer. Ther. 10 (5), 720-731 (2011).
- Cheng, J. AKT2, a putative oncogene encoding a member of a subfamily of protein-serine/threonine kinases, is amplified in human ovarian carcinomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (19), 9267-9267 (1992).
- Fernandez, A. Akt1 and Akt2: differentiating the aktion. Histol. Histopathol. 26 (5), 651-651 (2011).
- Luo, J. A genome-wide RNAi screen identifies multiple synthetic lethal interactions with the Ras oncogene. Cell. 137 (5), 835-835 (2009).
- Ketela, T. A comprehensive platform for highly multiplexed mammalian functional genetic screens. B.M.C. Genomics. 12 (1), 213-213 (2011).
Przedruki i uprawnienia
