Artykuł metodologiczny

Obrazowanie detekcji feromonów w preparacie cienkich przekrojów tkanki organu vomeronasalnego myszy

DOI:

10.3791/3311

⸱

6 grudnia 2011

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Lausanne, 2Department of Genetics and Evolution, University of Geneva

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

U myszy zdolność wykrywania feromonów jest zapośredniczona głównie przez narząd vomeronasalny (VNO). W niniejszej pracy opisano przygotowanie ostrych skrawków tkanki VNO do obrazowania wapnia. To podejście fizjologiczne umożliwia obserwację subpopulacji i/lub pojedynczych neuronów w żywej tkance i jest wygodne w procesie identyfikacji receptorów i ligandów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Peter Karlson i Martin Lüscher po raz pierwszy użyli terminu feromon w 1959 roku1, aby opisać substancje chemiczne wykorzystywane w komunikacji wewnątrzgatunkowej. Feromony to lotne lub nielotne krótkotrwałe cząsteczki2, wydzielane i/lub zawarte w płynach biologicznych3,4, takich jak mocz, który jest znany jako główne źródło feromonów3. Komunikacja feromonowa bierze udział w wielu kluczowych modalnościach zwierzęcych, takich jak interakcje między krewnymi5,6, organizacje hierarchiczne3 oraz interakcje seksualne7,8, a w konsekwencji jest bezpośrednio skorelowana z przetrwaniem danego gatunku9,10,11. U myszy zdolność wykrywania feromonów jest pośredniczona głównie przez narząd vomeronasalny (VNO)10,12, strukturę parzystą znajdującą się u podstawy jamy nosowej i zamkniętą w chrzęstnej torebce. Każdy VNO ma kształt rurkowaty z światłem13,14, co umożliwia kontakt z zewnętrznym światem chemicznym. Neuroepithelium sensoryczne składa się głównie z dwubiegunowych neuronów sensorycznych vomeronasalnych (VSNs)15. Każdy VSN wysyła pojedyncze dendryt do światła, kończące się dużym guzowatym zakończeniem dendrytycznym z do 100 mikrokosmków biorących udział w detekcji chemicznej16. Występuje wiele subpopulacji VSNs. Są one zróżnicowane pod względem ekspresji chemoreceptorów, a tym samym prawdopodobnie pod względem rozpoznawanych ligandów17,18. Dwie główne rodziny receptorów vomeronasalnych, V1Rs i V2Rs19,20,21,22, składają się odpowiednio z 24023 i 12024 członków i są ekspresjonowane w oddzielnych warstwach neuroepithelium. W VSNs ekspresjonowane są również receptory węchowe (ORs)25 oraz receptory peptydów formylowanych (FPRs)26,27.

Nie wiadomo, czy te subpopulacje neuronalne wykorzystują te same szlaki sygnalizacyjne downstream do wykrywania feromonów. Mimo kluczowej roli kanału przepuszczalnego dla wapnia (TRPC2) obecnego w mikrokosmkach dojrzałych neuronów28, sugerowano istnienie kanałów transdukcyjnych niezależnych od TRPC26,29. Ze względu na dużą liczbę subpopulacji neuronalnych oraz specyficzną morfologię narządu, badania farmakologiczne i fizjologiczne elementów sygnalizacyjnych obecnych w VNO są złożone.

W niniejszej pracy prezentujemy metodę przygotowania ostrych skrawków tkanek VNO myszy do przeprowadzenia badań obrazowania wapnia. To podejście fizjologiczne umożliwia obserwację – w naturalnym środowisku żywej tkanki – ogólnych lub poszczególnych subpopulacji VSN, które uprzednio napełniono barwnikiem wapnia Fura-2AM. Metoda ta jest również dogodna do badania dowolnego receptora feromonowego znakowanego GFP i może być dostosowana do użycia innych fluorescencyjnych sond wapniowych. Jako przykład wykorzystujemy tutaj linię myszy VG30, w której translacja receptora feromonowego V1rb2 jest powiązana z ekspresją GFP za pomocą strategii policistronowej.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Disekcja narządu jamistego Nosem (VNO) myszy

  1. Należy użyć myszy dorosłych. Ponieważ wykrywanie feromonów jest zaangażowane w wiele modalności, dokładne rozróżnienie szczepów, genotypów, płci i wieku jest istotne i wpłynie na wyniki. W tej procedurze wybrano dorosłe myszy VG30, wykorzystane wcześniej do identyfikacji pary feromon-receptor (2-heptanon-V1rb2)31 (Rys. 1A).
  2. Przed rozpoczęciem sekcji należy przygotować świeży, zimny sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF; NaCl 118 mM, NaHCO3 25 mM, D-Glucose 10 mM, KCl 2 mM, MgCl2 2 mM, NaH2PO4 1.2 mM, CaCl2 2 mM; pH 7.4) nasycony oxycarbonem (95% O2 : 5% CO2). W tym celu należy zmieszać wszystkie składniki ACSF z wyjątkiem CaCl2. Roztwór należy nasycić poprzez bezpośrednie przemywanie go oxycarbonem. Na koniec należy dodać CaCl2 i uzupełnić objętość do pożądanej wartości za pomocą ddH20. Roztwór ACSF należy przechowywać w lodzie do momentu użycia.
  3. Eutanazję myszy należy przeprowadzić preferencyjnie poprzez zwichnięcie szyi lub inhalację CO2 bezpośrednio przed eksperymentem.
  4. Należy odciąć głowę myszy. Umieścić ją pod mikroskopem sekcyjnym w zimnym ACSF pod stałym nadciśnieniem oxycarbonu.
  5. Należy odciąć dolną szczękę i ustawić głowę tak, aby uwidocznić podniebienie (Rys. 1B).
  6. Za pomocą mikronożyczek należy wykonać poziome nacięcie w górnej części podniebienia (Rys. 1B), a następnie usunąć błonę podniebienną za pomocą mikro-pincety sekcyjnej. Odsłoniętą jamę należy nawodnić i oczyścić ACSF (Rys. 1C).
  7. Należy odciąć górną i dolną część przegrody nosowej (Rys. 1C). Delikatnie wyekstrahować przegrodę nosową zawierającą VNO i umieścić ją bezpośrednio w ACSF w lodzie (Rys. 1D).
  8. Za pomocą mikro-pincety sekcyjnej należy pionowo rozdzielić dwie części VNO i delikatnie usunąć chrzęstną torebkę VNO (Rys. 1E). Należy upewnić się, że wszystkie fragmenty chrząstki zostały usunięte.

2. Przygotowanie przekrojów tkanki VNO

Przygotowanie skrawków tkanki VNO opisane w tej sekcji 2) służy głównie do badań obrazowania wapnia. Skrawki VNO mogą być również wykorzystywane do immunohistochemii na skrawkach swobodnych w celu weryfikacji integralności strukturalnej tkanki (proszę zapoznać się z sekcją 3 protokołu).

  1. Przygotuj agar niskotopliwy (3% w standardowym PBS) oraz stanowisko pracy. Będą potrzebne: ACSF, mikrotom wraz z uchwytami, pęseta mikrosekcyjna, formy do zatapiania (22 x 22 x 20 mm), chusteczki precyzyjne, pędzle, płytki do hodowli tkankowej, klej cyjanoakrylowy, lód oraz termometr.
  2. Wypełnij formę do zatapiania 3% agarem niskotopliwym. Przed pionowym umieszczeniem krótko przetartego VNO (Rys. 2A>) w celu uzyskania przekrojów wieńcowych, upewnij się, że temperatura nie przekracza 41°C.
  3. Umieść formę do zatapiania na lodzie na 1 min aż do zestalenia, a następnie oddziel ją od bloku agarowego. Przytnij blok agarowy do kształtu piramidy i przyklej go do uchwytu mikrotomu (Rys. 2B>).
  4. Wykonaj przekroje wieńcowe VNO za pomocą mikrotomu, z prędkością 0,5 mm/s, amplitudą 0,7 mm i grubością 100 μm w zimnym ACSF; zbieraj skrawki tkanki pędzlem, a następnie umieść je na płytce do hodowli tkankowej wypełnionej zimnym ACSF.
  5. Jeśli skrawki wykazują endogenną fluorescencję, np. GFP (w neuronach z targetowaniem genetycznym), można je wyselekcjonować pod fluorescencyjnym stereomikroskopem (Rys. 2C>).

3. Immunohistochemia na wolnopływających skrawkach VNO

Celem niniejszej procedury jest weryfikacja integralności preparatów tkanek VNO uzyskanych w sekcji 2). Acetylulowana tubulina jest markerem mikrotubul / cytoszkieletu wykazującym ekspresję w dendrytach i mikrokosmkach neuronów sensorycznych VNO. W przypadku eksperymentów z obrazowaniem wapnia należy przejść bezpośrednio do sekcji 4) protokołu. Metoda immunohistochemicznego barwienia pływających skrawków VNO może zostać dostosowana do oceny ekspresji dowolnego białka zainteresowania. W tym celu zalecamy utrwalenie VNO przez 1h w 4°C w roztworze utrwalającym (paraformaldehyda 4% w PBS, pH 7.6) po punkcie 1.7) protokołu oraz stosowanie od tego momentu PBS o pH 7.6 zamiast roztworu ACSF.

  1. Próbki tkanek w płytce do hodowli komórkowych należy utrwalić w roztworze utrwalającym (4% paraformaldehyd w PBS, pH 7,6) przez 1 h w temperaturze 4°C.
  2. Próbki tkanek należy blokować przez noc w temperaturze 4°C w roztworze PBS zawierającym 10% NGS (normalne surowica kozia) oraz 0,5% triton X-100.
  3. Próbki należy inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym (anty-acetylated-tubulin, mysie, 1:2000) przez 16 h w temperaturze pokojowej (RT) w roztworze PBS zawierającym 5% NGS i 0,25% Triton X-100.
  4. Próbki należy przemyć 3 razy przez 5 minut roztworem PBS zawierającym 2% NGS.
  5. Próbki należy inkubować w ciemności z przeciwciałem wtórnym (cy5-konjugowane anty-mysie kozie, 1:200) w roztworze PBS zawierającym 2% NGS przez 1 h w temperaturze RT.
  6. Próbki należy przemyć 3 razy przez 5 minut kolejno: roztworem PBS z 2% NGS, PBS z 1% NGS oraz samym PBS.
  7. Próbki należy zamontować w medium do montowania fluorescencyjnego (z dodatkiem DAPI lub bez), umieszczając je w centrum stref ograniczonych hydrofobowo (używając pisaka hydrofobowego), a następnie przykryć szkiełkami podstawowymi.
  8. Obserwacje i akwizycję danych należy przeprowadzić za pomocą mikroskopii konfokalnej i oprogramowania umożliwiającego rekonstrukcje 3D (Rys. 2D-F).

4. Obrazowanie wapnia w skrawkach VNO

  1. Następujące procedury będą odbywać się w ciemności. Inkubować skrawki VNO przez 1h w 37°C w roztworze ładującym składającym się z zimnego ACSF z Fura-2AM (7 μM; roztwór zapasowy 1 mM w DMSO) i pluronicu 0,1% (w/v; roztwór zapasowy 20% w ddH2O).
  2. Przechowywać załadowane skrawki w lodzie z oxycarbonacją do momentu użycia. Załadowane skrawki można przechowywać przez 3-4h.
  3. Umieścić załadowane skrawki za pomocą pędzla w komorze perfuzyjnej zawierającej ACSF i utrzymać skrawki za pomocą kotwicy do skrawków tkankowych (Rys. 3A).
  4. Umieścić komorę perfuzyjną na stole mikroskopu do obrazowania wapnia (Rys. 3B) i stale perfundować oxycarbonatowanym ACSF w RT. Temperaturę można dostosować za pomocą bipolarnego kontrolera temperatury.
  5. Obserwacje załadowanych skrawków VNO (Rys. 3C-E) przeprowadza się za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego, z obiektywem 25x lub 63x i kamerą CooL SNAP-HQ. Oświetlanie odbywa się sekwencyjnie (340/380 nm) za pomocą polichromatora i jest rejestrowane z częstotliwością 5Hz. Filtrowana emisja odbywa się przy 510 nm. Zmiany stosunku wapnia wewnątrzkomórkowego (ΔF = 340 nm/380 nm) są monitorowane za pomocą odpowiedniego oprogramowania.
  6. Chemostymulację należy dobrać zgodnie z własnym celem eksperymentalnym. W tym przypadku przeprowadzono perfuzje ACSF zawierającego mieszankę feromonów (izobutyloamina, 2-heptanon, 4-heptanon, 2-heptanol, octan pentylu, dimetylopirazyna, α/β-farnezene, 10-6 M), 2-heptanon (10-6 M) lub świeżo pobrany mocz myszy samca i samicy (1:1) (1:100)32. Perfuzyjny ATP (125 μM) jest stosowany jako test żywotności na koniec eksperymentów (Rys. 3F) i powinien wskazywać odsetek około 80% żywych neuronów. W tych warunkach skrawki można wykorzystać do 2 godzin.
  7. Subpopulacje neuronów sensorycznych znakowanych GFP są wizualizowane poprzez specyficzne oświetlenie (tutaj neurony wykazujące ekspresję V1rb2) i mogą być precyzyjnie analizowane (Rys. 3G-I).

5. Reprezentatywne wyniki:

Aby opracować test funkcjonalny do badania wielu ścieżek transdukcji zachodzących w VNO myszy lub zidentyfikować nowe pary feromon-receptor, wykorzystujemy linię myszy VG (Ryc. 1A). W tej linii jeden z 240 receptorów V1R, receptor V1Rb2, jest znakowany GFP, co umożliwia łatwą wizualizację konkretnej subpopulacji neuronów sensorycznych narządu Jacobsona. Po wyjęciu i wypreparowaniu VNO (Ryc. 1E) przygotowujemy świeże skrawki VNO (Ryc. 2C). Część z nich utrwalamy, aby sprawdzić i potwierdzić integralność tkankową preparatu poprzez wykonanie barwienia immunohistochemicznego przeciwko białku tubulinie acetylowanej (Ryc. 2D-F). Pozostała część skrawków jest wykorzystywana do eksperymentów z obrazowaniem wapnia. W tym celu skrawki obciąża się Fura-2AM (Ryc. 3C-E), a wewnątrzkomórkowy poziom wapnia w każdym neuronie jest monitorowany jako stosunek ΔF (Ryc. 3F). Żywotność neuronów ocenia się poprzez perfuzję ATP (125 μM), po której oczekiwany jest szybki i przejściowy wzrost stosunku ΔF (Ryc. 3F). Ponieważ mocz jest głównym źródłem feromonów, perfuzja świeżo pobranego moczu mysiego (1:100) służy jako kontrola endogenna. Wywołuje ona przejściowe wzrosty poziomu wapnia w około 50% rejestrowanych neuronów (komórka 1 i 2, Ryc. 3F). Przy oświetleniu GFP widoczne są neurony wykazujące ekspresję V1Rb2, a perfuzja jego znanego ligandu feromonowego, 2-heptanonu, inicjuje aktywację komórkową (komórka 1, Ryc. 3I). Co ciekawe, aktywacje neuronów są również widoczne w części neuronów, które nie wykazują ekspresji receptora V1Rb2 (neurony GFP-ujemne) (komórka 2, Ryc. 3I), co demonstruje złożoność kodowania feromonów w VNO.

figure-protocol-1
Rysunek 1. Disekcja narządu jamistego myszy. (A) Mysz z linii VG. (B) Po euthanazji myszy cała głowa zostaje umieszczona pod mikroskopem binokularnym, a żuchwa zostaje usunięta w celu uwidocznienia podniebienia. Wykonuje się niewielkie poziome nacięcie (czarna przerywana linia). (C) Po usunięciu podniebienia przegroda nosowa wyścielona VNO zostaje przecięta w części górnej i dolnej (białe przerywane linie), aby ułatwić ekstrakcję VNO. (D) VNO zostaje umieszczone w roztworze ACSF i oddzielone (wstawka: widok przy większym powiększeniu dwóch części). (E) Chrzęstna torebka VNO zostaje delikatnie usunięta, a VNO bez torebki chrzęstnej jest wykorzystywane w dalszych eksperymentach. Paski skali: B-E, 1 mm.

figure-protocol-2
Rycina 2. Przygotowanie ostrych przekrojów narządu VNO myszy oraz integralność tkankowa. (A) VNO myszy jest osadzone pionowo w 3% roztworze agaru. Temperatura agaru musi być niższa niż 41°C. (B) Blok agaru jest przycinany w kształt piramidy, a następnie w ACSF przygotowuje się przekroje VNO o grubości 100 μm (czarna przerywana linia). (C) Przekroje VNO mogą być wybierane pod fluorescencyjnym stereomikroskopem w celu wizualizacji specyficznej populacji znakowanych neuronów sensorycznych. (D-F) Integralność tkankową można ocenić za pomocą barwień immunohistochemicznych przeciwko białku tubulinie acetylowanej; powiększenie obrazu neuronów celowanych w gen V1rb2 wykazuje doskonałą konserwację preparatu. Można zaobserwować neurony z długimi dendrytami sięgającymi powierzchni światła (E), a także ekspresję białka strukturalnego w guzkach dendrytycznych i mikrokosmkach (F). Paski skali: B, 5 mm; C, 60 μm; D, 40 μm; E-F, 20 μm.

figure-protocol-3
Rysunek 3. Obrazowanie wapnia i detekcja feromonów w ostrych skrawkach tkanek narządu jamistego. (A) Po fazie ładowania Fura-2AM, skrawki VNO są umieszczane w komorze perfuzyjnej i utrzymywane za pomocą dostosowanego kotwiczenia (widok przy dużym powiększeniu). (B) Eksperymenty są przeprowadzane w ciemności, a skrawki VNO są stale perfundowane ACSF w temperaturze RT za pomocą systemu próżniowego. Temperaturę można dobrać za pomocą systemu sterownika temperatury składającego się z bipolarnego elementu Peltiera i sondy termicznej. Ten konkretny eksperyment przeprowadzono w RT. (C-E) Skrawki VNO są widoczne w kontraście fazowym Hoffmana (C, Hv) lub pod oświetleniem Fura 380 nm przed (D) i podczas aktywacji neuronalnej (E, tutaj z użyciem ATP). (F) Żywotność neuronów jest oceniana poprzez perfuzję ATP (125 μM). Tutaj chemostymulacja jest przeprowadzana przy użyciu mocznika (Urine, 1:100) lub mieszanki feromonów mysich (mix ph., 10-6 M) przy stałym przepływie 165 ml/h. Poziomy wapnia wewnątrzkomórkowego (ΔF) mogą być rejestrowane indywidualnie dla każdej komórki (komórka 1 do 3). (G) Neuron V1Rb2 jest wizualizowany pod oświetleniem GFP (1). (H) Przedstawiono ładowanie tego neuronu (1) oraz neuronu niewyrażającego V1rb2 (2). (I) Neuron V1rb2 jest w stanie odpowiedzieć na 2-heptanon wzrostem stężenia wapnia wewnątrzkomórkowego. Ten konkretny neuron niewyrażający V1rb2 również reaguje na 2-heptanon (komórka 2). Skala: C-E, 20 μm; G-H, 15 μm; ΔF = 340 nm / 380 nm. (F i I) Czas trwania aplikacji bodźca jest wskazany przez paski pod każdym śladem. Dowolna skala kolorów reprezentuje intensywność fluorescencji.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiona tutaj metoda obrazowania wapnia umożliwia rejestrację odpowiedzi feromonowych neuronów VNO myszy w preparacie zacutego skrawka. Dzięki temu podejściu, przy pewnej praktyce, proces od preparacji zwierzęcia po uzyskanie neuronów vomeronasalnych jest łatwo osiągalny i zapewnia długotrwałą żywotność tkanki. Pozwala to na prowadzenie czasochłonnych eksperymentów, takich jak badania farmakologiczne czy analiza kodowania feromonowego. Dzięki tej technice fizjologicznej można specyficznie analizować zarówno duże populacje, jak i precyzyjne subpopulacje neuronalne. Ponadto metodę tę można łatwo dostosować do podejść immunohistochemicznych lub eksperymentów opartych na innych barwnikach wapniowych. Zastosowanie tych połączonych metodologii z pewnością pozwoli na identyfikację nowych ligandów feromonowych dla wielu osieroconych chemoreceptorów eksprymowanych w narządzie vomeronasalnym myszy.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pragniemy szczególnie podziękować Monique Nenniger Tosato za doskonałe wsparcie techniczne, a także Jean-Yves Chatton za rady naukowe oraz platformie obrazowania CIF UNIL za udostępnienie sprzętu mikroskopowego. Finansowanie zostało zapewnione przez Szwajcarską Narodową Fundację Naukową (Swiss National Science Foundation).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Roztwór soli sodowej 5’-trifosforanu adenozyny (ATP)Sigma-AldrichA6559-25UMO
AgarSigma-AldrichA7002-100GPreferowany do immunohistochemii
Agar (niskotopliwy)Sigma-AldrichA0701-25GPreferowany do obrazowania wapnia
Bipolarny kontroler temperatury CL-100Warner InstrumentsW64-0352
Mikroskop konfokalnyLeica MicrosystemsSP5 AOBS
Cy5-AffiniPure przeciwmysia IgG z kozyJackson ImmunoResearch115-175-071Chronić przed światłem
DMSO (siarczek dimetylu)Merck & Co., Inc.317275-100ML
Formy do zatapiania, Peel-A-WayPolysciences, Inc.18646A-1 22 x 22 x 20 mm
Fluorescencyjne medium montażowe (Vectashield z DAPI, 10 ml)RectolabH-1200
FURA-2AMTeflabs0103Chronić przed światłem
Glisseal N (smar próżniowy, 60 g)Borer ChemieGlisseal N
Duża komora pomiarowa z kąpielą (RC-26G)Warner Instruments64-0235
MetaFluor (oprogramowanie do obrazowania wapnia; v.7.6.5.0)Visitron Systems
Monoklonalne przeciwciało przeciw tubulinie acetylowanej, mysieSigma-AldrichT6793-.2ML
Normalne surowica kozia (NGS, 10 ml)InterchimUP379030
Platforma dla komór (P-1)Warner Instruments64-0277
Pluronic F-127, 2 gInvitrogenP-6867
Roti Coll (butelka dozująca, 10 g)Carl Roth GmbH0258.1
Podwójny przepływowy podgrzewacz/chłodnica roztworów SC-20Warner InstrumentsW64-0353
Uchwyt do skrawków (SHD-26GKIT)Warner Instruments64-0266
Stereomikroskop fluorescencyjnyLeica MicrosystemsMZ16FA
Super PAP PEN (pisak hydrofobowy)Pelco International22309
Triton X-100Fluka93420-250ML
Wibracyjny mikrotom nożowy VT 1200SLeica Microsystems14048142066
Szybki system polichromatora VisiChromeVisitron Systems
Wizualizacja danych 3D (Imaris; v.6.3.1)Bitplane Scientific Software

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Karlson, P., Lüscher, M. "Pheromones" a new term for a class of biologically active substances. Nature. 183, 55-56 (1959).
  2. Cavaggioni, A., Mucignat-Caretta, C., Redaelli, M., Zagotto, G. The scent of urine spots of male mice, Mus musculus: Changes in chemical composition over time. Rapid Commun. Mass Spectrom. 20, 3741-3746 (2006).
  3. Novotny, M., Harvey, S., Jemiolo, B. Chemistry of male dominance in the house mouse, Mus domesticus. Experientia. 46, 109-113 (1990).
  4. Leinders-Zufall, T. Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons. Nature. 405, 792-796 (2000).
  5. Leinders-Zufall, T. MHC class I peptides as chemosensory signals in the vomeronasal organ. Science. 306, 1033-1037 (2004).
  6. Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides. Nat. Neurosci. 12, 1551-1558 (2009).
  7. Jemiolo, B., Xie, T. M., Novotny, M. Socio-sexual olfactory preference in female mice: attractiveness of synthetic chemosignals. Physiol. Behav. 50, 1119-1122 (1991).
  8. Achiraman, S., Archunan, G. Characterization of urinary volatiles in Swiss male mice (Mus musculus): bioassay of identified compounds. J. Biosci. 27, 679-686 (2002).
  9. Dulac, C., Torello, A. T. Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour. Nat. Rev. Neurosci. 4, 551-562 (2003).
  10. Brennan, P. A., Zufall, F. Pheromonal communication in vertebrates. Nature. 444, 308-315 (2006).
  11. Mondor, E. B., Roitberg, B. D. Inclusive fitness benefits of scent-marking predators. Proc. Biol. Sci. 271, Suppl 5. 341-343 (2004).
  12. Holy, T. E., Dulac, C., Meister, M. Responses of vomeronasal neurons to natural stimuli. Science. 289, 1569-1572 (2000).
  13. Keverne, E. B. The Vomeronasal Organ. Science. 286, 716-720 (1999).
  14. Weiler, E. Postnatal development of the rat vomeronasal organ. Chem. Senses. 30, Suppl 1. 127-128 (2005).
  15. Zufall, F., Kelliher, K. R., Leinders-Zufall, T. Pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons. Microsc. Res. Tech. 58, 251-260 (2002).
  16. Ciges, M., Labella, T., Gayoso, M., Sanchez, G. Ultrastructure of the organ of Jacobson and comparative study with olfactory mucosa. Acta. Otolaryngol. 83, 47-58 (1977).
  17. Munger, S. D., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. Subsystem organization of the mammalian sense of smell. Annu. Rev. Physiol. 71, 115-140 (2009).
  18. Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat. Rev. Neurosci. 5, 263-278 (2004).
  19. Ryba, N. J. P., Tirindelli, R. A new multigene family of putative pheromone receptors. Cell. 19, 371-379 (1997).
  20. Matsunami, H., Buck, L. B. A multigene family encoding a diverse array of putative pheromone receptors in mammals. Cell. 90, 775-784 (1997).
  21. Herrada, G., Dulac, C. A novel family of putative pheromone receptors in mammals with a topographycally organized and sexually dimorphic distribution. Cell. 90, 763-773 (1997).
  22. Dulac, C., Axel, R. A novel family of genes encoding putative pheromone receptors in mammals. Cell. 83, 195-206 (1995).
  23. Young, J. M., Massa, H. F., Hsu, L., Trask, B. J. Extreme variability among mammalian V1R gene families. Genome. Res. 20, 10-18 (2009).
  24. Yang, H., Shi, P., Zhang, Y. P., Zhang, J. Composition and evolution of the V2r vomeronasal receptor gene repertoire in mice and rats. Genomics. 86, 306-315 (2005).
  25. Levai, O., Feistel, T., Breer, H., Strotmann, J. Cells in the vomeronasal organ express odorant receptors but project to the accessory olfactory bulb. J. Comp. Neurol. 498, 476-490 (2006).
  26. Riviere, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors. Nature. 459, 574-577 (2009).
  27. Liberles, S. D. Formyl peptide receptors are candidate chemosensory receptors in the vomeronasal organ. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9842-9847 (2009).
  28. Liman, E. R., Corey, D. P., Dulac, C. TRP2: A candidate transduction channel for mammalian pheromone sensory signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 5791-5796 (1999).
  29. Kelliher, K. R., Spehr, M., Li, X. H., Zufall, F., Leinders-Zufall, T. Pheromonal recognition memory induced by TRPC2-independent vomeronasal sensing. Eur. J. Neurosci. 23, 3385-3390 (2006).
  30. Rodriguez, I., Feinstein, P., Mombaerts, P. Variable patterns of axonal projections of sensory neurons in the mouse vomeronasal system. Cell. 97, 199-208 (1999).
  31. Boschat, C. Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor. Nature. Neuroscience. 5, 1261-1262 (2002).
  32. Brechbühl, J., Klaey, M., Broillet, M. C. Grueneberg ganglion cells mediate alarm pheromone detection in mice. Science. 321, 1092-1095 (2008).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Narz d jamisto nosowyobrazowanie wapniaVNO myszyreceptory feromonoweadowanie Fura 2AMmikroskopia konfokalnaneurony znakowane GFPkana TRPC2Vomeronasal Sensory Neurons

Powiązane artykuły