Model kontuzyjny jednostronnego urazu rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym z wykorzystaniem urządzenia Infinite Horizon Impactor

Podsumowanie

Opisano niezawodną i powtarzalną metodę wywoływania jednostronnego urazu rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym przy użyciu impaktora Infinite Horizon. Metoda ta wykorzystuje specjalnie zaprojektowaną ramę i zacisk do stabilizacji kręgosłupa. Standaryzowana procedura oraz biomechaniczne parametry urazu pozwalają na uzyskanie wystarczających i trwałych obrażeń.

Streszczenie

Chociaż większość urazów rdzenia kręgowego u ludzi występuje w odcinku szyjnym, ogromna większość badań laboratoryjnych wykorzystuje zwierzęce modele urazu rdzenia kręgowego (SCI), w których uszkodzeniu ulega odcinek piersiowy. Ponadto, ponieważ większość urazów rdzenia u ludzi jest wynikiem tępego, niepenetrującego urazu (np. wypadku komunikacyjnego, urazu sportowego), w którym rdzeń kręgowy zostaje gwałtownie uderzony przez przemieszczoną kość lub tkanki miękkie, większość badaczy SCI uważa, że najbardziej istotne klinicznie modele urazów to te, w których dochodzi do szybkiego stłuczenia rdzenia kręgowego.¹ Dlatego ważnym krokiem w przedklinicznej ocenie nowych metod leczenia na etapie przygotowań do badań na ludziach jest ocena ich skuteczności w modelu stłuczenia SCI w odcinku szyjnym rdzenia kręgowego. W niniejszej pracy opisujemy aspekty techniczne oraz wynikające z nich efekty anatomiczne i behawioralne jednostronnego modelu stłuczeniowego SCI odcinka szyjnego, w którym wykorzystano impaktor do urazów rdzenia kręgowego Infinite Horizon.

Szczury rasy Sprague Dawley zostały poddane jednostronnej laminektomii lewostronnej na poziomie C5. Aby zoptymalizować powtarzalność wyników biomechanicznych, funkcjonalnych i histologicznych modelu uszkodzenia, wykonano kontuzję rdzeni kręgowych przy użyciu siły uderzenia 150 kdyn, trajektorii uderzenia 22,5° (zwierzęta obrócone o 22,5°) oraz miejsca uderzenia oddalonego od linii środkowej o 1,4 mm. Powrót funkcji oceniano za pomocą testu wznoszenia w cylindrze, testu drabiny poziomej, testu pielęgnacji oraz zmodyfikowanego testu schodów Montoyi przez okres do 6 tygodni, po czym dokonano oceny histologicznej rdzeni kręgowych w celu zbadania stopnia zachowania istoty białej i szarej.

Przedstawiony tutaj model urazu wywołuje spójne i powtarzalne siły biomechaniczne działające na rdzeń kręgowy, co jest istotną cechą każdego eksperymentalnego modelu SCI. Skutkuje to wyraźnymi uszkodzeniami histologicznymi bocznej połowy rdzenia kręgowego, które ograniczają się głównie do strony ipsilateralnej względem urazu. Uraz jest dobrze tolerowany przez zwierzęta, lecz prowadzi do znaczących i utrzymujących się przez kolejne tygodnie deficytów funkcjonalnych kończyny przedniej. Przedstawiony tutaj model jednostronnego urazu szyjnego może być pomocnym narzędziem dla badaczy pragnących ocenić potencjalnie obiecujące terapie przed ich wdrożeniem w badaniach klinicznych u ludzi.

Protokół

1. Przygotowanie: Projekt ramy i zacisku do unieruchomienia zwierzęcia

1. Rama i zacisk do unieruchomienia zwierzęcia zostały zaprojektowane specjalnie tak, aby były kompatybilne z urządzeniem Infinite Horizon (IH) Spinal Cord Injury Impactor.
2. Podstawą ramy jest platforma aluminiowa docięta do następujących wymiarów (30.2 cm x 20.3 cm x 1.3 cm), aby pasowała do prowadnicy stołu dostarczanej standardowo z urządzeniem IH (Rycina 1A).
3. Do platformy przymocowano cztery stopki wsporcze Flexaframe (Fisher Scientific, Toronto, ON), a osiem prętów wsporczych Flexaframe (Fisher Scientific, Toronto, ON, 30.5 cm) zmontowano za pomocą ośmiu łączników wsporczych Flexaframe (Rycina 1B).
4. Dwa dodatkowe łączniki wsporcze Flexaframe, przymocowane do dwóch środkowych prętów, utrzymują specjalnie wykonane uchwyty zacisku (Rycina 1B).
5. Kąt, pod którym rdzeń kręgowy zwierzęcia jest obrócony względem pionu, ustala się poprzez pozostawienie jednego pręta poziomego w stałej pozycji i zmianę wysokości drugiego pręta poziomego (Rycina 2).
6. Zacisk ma długość 35.6 mm, wysokość 25.4 mm i szczękę o szerokości 7.6 mm, zaprojektowaną do sztywnego chwytania od spodu wyrostków poprzecznych od C4 do C6 (Rycina 1C). Dodatkowe szczegóły dotyczące konstrukcji zacisku zostały opisane wcześniej przez Choo et al., 2009.

2. Operacja

1. Samce szczurów Sprague Dawley (Charles River Laboratories) o masie 300-350 g znieczulono izofluranem (4% w fazie indukcji i 2% w fazie podtrzymania) w tlenie (1 L/min).
2. Po wprowadzeniu zwierząt w stan znieczulenia, zwierzę umieszcza się w aparacie stereotaktycznym (Kopf, Tujunga, CA).
3. Aby zminimalizować krwawienie podczas procedury chirurgicznej, wokół miejsca operacyjnego w grzbietnej części szyi wstrzykuje się domięśniowo 0,4 mL lidokainy (20 mg/mL; Bimeda-MTC Animal Health Inc., Cambridge, Ontario, Kanada) z epinefryną.
4. Za pomocą sterylnego skalpela (#15) wykonuje się nacięcie wzdłuż linii pośrodkowej grzbietu o długości 4-5 cm, rozpoczynając od podstawy czaszki i kierując się kudalnie.
5. Sterylną pęsetą Adsona wykonuje się rozczepianie tępe mięśni grzbietowych w celu odsłonięcia kręgosłupa, a następnie wprowadza się sterylny rozwieracz Alma (Fine Science Tools, North Vancouver, BC), aby utrzymać mięśnie w rozciągnięciu.
6. Używając skalpela #15, usuwa się mięśnie pokrywające blaszki łukowate kręgów C4-C7, zaczynając od linii pośrodkowej i przesuwając je bocznie.
7. Za pomocą sterylnego skalpela (#15) wykonuje się nacięcie mięśni przytwierdzonych do wyrostków poprzecznych po obu stronach kręgosłupa, aby umożliwić umieszczenie zacisku pod wyrostkami poprzecznymi kręgów od C4 do C6.
8. Za pomocą sterylnych kleszczyków kubitowych Friedman-Pearsona o cienkich końcówkach (Fine Science Tools, North Vancouver, BC) ostrożnie usuwa się lewą blaszkę łukową kręgu C5, aby uwidocznić oponę twardą i rdzeń kręgowy.
9. Pod ramiona aparatu wsuwa się pręt o średnicy 1,5 mm, aby podeprzeć zwierzę, co lekko unosi kręgosłup i ułatwia wprowadzenie zacisku.
10. Szczęki sterylnego zacisku montuje się na bocznych wyrostkach poprzecznych kręgów od C4 do C6 i dokręca śruby.
11. Usuwa się rozwieracz Alma.

3. Uraz rdzenia kręgowego

1. Po zamontowaniu zacisku na zwierzęciu, zwierzę zostaje przeniesione do impaktora IH.
2. Zacisk zostaje włożony do metalowych uchwytów na dwóch środkowych prętach ramy, które zostały zabezpieczone pod kątem 22,5° względem poziomu (Rysunek 2).
3. Podnośnik nożycowy zapewniający stabilną regulację wysokości (VWR, Mississauga, ON) jest podnoszony do momentu, aż zwierzę będzie leżało płasko.
4. Należy upewnić się, że zacisk znajduje się w poziomie, umieszczając na jego górze małą poziomicę cylindryczną i dokręcając śruby. Ważne jest, aby wszystkie śruby były mocno dokręcone, a cała konstrukcja była sztywna i pozbawiona jakichkolwiek ruchów.
5. Dalsza część procedury jest przeprowadzana pod mikroskopem (Leica MZ8).
6. Za pomocą pokrętła regulacji pionowej oraz dwóch pokręteł regulacji poziomej w impaktorze IH należy opuścić i wycelować końcówkę impaktora (o średnicy 15 mm i zaokrąglonych krawędziach), aż centrum końcówki impaktora znajdzie się nad wierzchołkiem wyrostka kolczystego C6.
7. Po wycentrowaniu końcówki impaktora należy obrócić pokrętło regulacji osi y o jeden i dwie piąte obrotu (1,4 mm), aby przesunąć końcówkę bocznie na lewą stronę, oraz obrócić pokrętło regulacji poziomej osi x, aby przesunąć końcówkę impaktora do środka C5.
8. Należy opuścić końcówkę tuż nad oponę twardą, aby zweryfikować, czy końcówka impaktora jest skierowana na boczną połowę istoty szarej.
9. Należy obrócić pokrętło regulacji pionowej o dwa obroty, aby podnieść końcówkę na 4 mm powyżej opony twardej.
10. Przy użyciu patyczka higienicznego lub tamponu bawełnianego należy upewnić się, że obszar uderzenia jest suchy.
11. W programie należy ustawić pożądaną siłę na 150 kdyn i kliknąć „Start Experiment”, aby uruchomić impaktor.
12. Po urazie ranę zamyka się warstwowo szwami z vicrylu 5-0. Buprenorfinę (0,03 mg/kg SC, Temgesic; Schering-Plough Corporation, Kenilworth, NJ) oraz sól fizjologiczną (10 mL) podaje się podskórnie przed zabiegiem oraz dwa razy dziennie przez dwa dni po operacji. Zwierzęta są ściśle monitorowane dwa razy dziennie przez 2 tygodnie i raz w tygodniu przez 6 tygodni po urazie.

4. Reprezentatywne wyniki

Dwudziestu dziewięciu samców szczurów Sprague Dawley (Charles River Laboratories) o masie 300-350 g poddano urazowi przy ustawieniu siły 150 kdyn. Końcówka impaktora została skierowana 1,4 mm bocznie od linii środkowej, pod kątem 22,5° względem pionu. Średnia rzeczywista siła wyniosła 155,55 ± 0,73 kdyn. Średnie przemieszczenie wyniosło 1512,72 ± 27,86 μm, a prędkość 120,24 ± 0,52 mm/s (Rysunek 3).

Mierniki wyników behawioralnych

Powrót funkcji oceniano za pomocą testu drabiny poziomej, testu podnoszenia się w cylindrze, testu pielęgnacji ciała oraz zmodyfikowanego testu schodów Montoyi¹. Zwierzęta zostały przeszkolone przed urazem, a następnie ocenione w 2., 4. i 6. tygodniu po urazie. Przez cały okres eksperymentalny utrzymywały się znaczące upośledzenia funkcji kończyn przednich.

Test poziomej drabiny. Przed urazem zwierzęta popełniały jedynie 4,75 ± 0,73% błędów kończyną przednią po stronie ipsilateralnej podczas przechodzenia przez poziomą drabinę z nieregularnymi odstępami między szczeblami. Po urazie u zwierząt odnotowano wyraźny wzrost odsetka błędów kończyn przednich. Procent błędów kończyny przedniej po stronie ipsilateralnej wynosił odpowiednio 26,97 ± 2,92%, 26,23 ± 2,84% oraz 22,06 ± 2,05% w 2., 4. i 6. tygodniu po urazie (Rysunek 4A). Co istotne, upośledzenie funkcji kończyny przedniej w tym teście utrzymywało się przez okres 6 tygodni.

Test wznoszenia w cylindrze (Cylinder Rearing test). Procentowe użycie kończyny przedniej po stronie ipsilateralnej (lewej + obu) podczas eksploracji uległo znacznemu zmniejszeniu po SCI. Przed urazem zwierzęta używały kończyny przedniej po stronie ipsilateralnej w 75,12 ± 2,25%. Po urazie zwierzęta używały kończyny przedniej po stronie ipsilateralnej w 8,59 ± 1,80% w 2. tygodniu, 14,25 ± 2,65% w 4. tygodniu oraz 11,76 ± 2,66% w 6. tygodniu (Rysunek 4B).

Zmodyfikowany test schodów Montoyи. Liczba granulek odzyskanych za pomocą przedniej kończyny po stronie ipsilateralnej drastycznie spadła po urazie. Przed urazem zwierzęta zebrały 84,85 ± 2,88% nagród pokarmowych. Jednak w 2., 4. i 6. tygodniu po urazie zwierzęta odzyskały jedynie 30,91 ± 4,03%, 28,94 ± 4,38% oraz 25,86 ± 3,09% granulek (Rycina 4C).

Test pielęgnacji. Odnotowano gwałtowny spadek wyników w teście pielęgnacji po wystąpieniu urazu. Po SCI wyniki pielęgnacji po stronie ipsilateralnej wynosiły: 2,00 ± 0,17 w 2. tygodniu, 1,83 ± 0,17 w 4. tygodniu oraz 1,79 ± 0,11 w 6. tygodniu (Rycina 4D).

Wyniki histologiczne

Oszczędzenie istoty białej i istoty szarej. Przykład urazu rdzenia kręgowego przy sile 150 kdyn, kącie 22,5° i bocznym celowaniu 1,4 mm przedstawiono na Rysunku 5. Uraz spowodował znaczne uszkodzenie istoty szarej i białej po stronie ipsilateralnej. Uszkodzeniu uległy zarówno drogi korowo-rdzeniowe, jak i czerwono-rdzeniowe, a u 23 z 29 zwierząt uszkodzenia miąższu ograniczały się do strony ipsilateralnej. Rozciągłość podłużna uszkodzeń istoty białej i szarej wynosiła 2400 rostralnie i 2400 caudalnie (Rysunek 6). Po zsumowaniu przekrojów w celu uzyskania ogólnej oceny „skumulowanego rozprzestrzenienia” oszczędzenia istoty białej i szarej (2000 μm rostralnie i caudalnie od epicentrum), po stronie ipsilateralnej oszczędzono jedynie 51,8% istoty białej i pozostało 39,7% istoty szarej w porównaniu ze stroną kontralateralną (Rysunek 6).

Rycina 1. Impaktor do urazów rdzenia kręgowego Infinite Horizon. A. Impaktor Infinite Horizon i ogólny schemat układu. B. Konfiguracja ramy. C. Powiększone zdjęcie zacisku do unieruchamiania wyrostków poprzecznych kręgów szyjnych. D. Specyfikacja (jednostka: cal) zacisku. Sugerowana tolerancja <0,002 in (Choo et al. 2009). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinię.

Rycina 2. A. Ilustracja i odpowiadające jej ustawienie ramy w celu uzyskania rotacji rdzenia kręgowego o 0° (pozycja neutralna) lub B. 22,5° z bocznym przesunięciem wynoszącym 1,4 mm.

Rysunek 3. Reprezentatywne wykresy siły i przemieszczenia dla impaktora Infinite Horizon. Strzałka wskazuje czas, w którym końcówka impaktora osiągnęła 20 kdyn oraz moment rozpoczęcia rejestracji przemieszczenia. Rzeczywistą siłę odczytuje się z szczytu krzywej siły w funkcji czasu, a następnie oblicza odpowiadające jej przemieszczenie. Poniższe wykresy przedstawiają typowe stłuczenie o wartości 150 kdyn: A. Wykres przemieszczenia w funkcji czasu, B. Wykres siły w funkcji czasu. Wykresy te pokazują, że osiągnięta rzeczywista siła wyniosła 152 kdyn, a zmierzone przemieszczenie impaktora w rdzeń wyniosło 1287 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek.

Rycina 4. Oceny behawioralne dla siły 150 kdyn, kąta nachylenia impaktora 22,5° i celowania 1,4 mm na lewo od linii środkowej. A. Test poziomej drabiny. B. Test podnoszenia przednich kończyn w cylindrze. C. Modyfikowany test schodów Montoyi. D. Test pielęgnacji ciała. W obrębie kończyny przedniej po stronie ipsilateralnej stwierdzono znaczące i trwałe upośledzenia w porównaniu z kończyną przednią po stronie kontralateralnej.

Rysunek 5. Reprezentatywne obrazy uszkodzonego rdzenia kręgowego od poziomu rostralnego 1600 μm do poziomu kaudalnego 1600 μm.

Rysunek 6. Oceny histologiczne. A. Procent zachowanej istoty białej i szarej. Tkanka w odległości 2000 μm od epicentrum uszkodzenia została w dużej mierze oszczędzona. B. Skumulowana ilość zachowanej istoty białej i szarej w promieniu 2000 μm od epicentrum uszkodzenia. Strona ipsilateralna wykazała istotnie mniejszą ilość zachowanej istoty białej i szarej w porównaniu ze stroną kontralateralną. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek.

Dyskusja

W niniejszej pracy opisujemy model jednostronnego stłuczenia szyjnego z wykorzystaniem impaktora Infinite Horizon (IH) przy sile 150 kdyn, kącie 22,5° względem pionu i bocznym celowaniu w odległości 1,4 mm od linii środkowej. Dzięki tym ustawieniom udało nam się wywołać trwałe deficyty behawioralne w kończynie przedniej po stronie ipsilateralnej, przy czym uszkodzenia miąższu ograniczały się głównie do strony ipsilateralnej, gdzie wystąpiły znaczne uszkodzenia w obszarach, w których spodziewany jest przebieg dróg rdzenio...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Impaktor Infinite Horizon	Precision Systems and Instrumentation	IH-0400
Aluminiowa blacha	Metalsupermarlets.com	APT6061/500
Płytki wsporcze Flexaframe	Fishers Scientific	1466625Q
Pręty wsporcze Flexaframe	Fishers Scientific	1466610GQ
Łączniki wsporcze Flexaframe	Fishers Scientific	1466620Q
Zacisk1	Wykonany na zamówienie		Choo et al., 2009
Uchwyty metalowe	Wykonane na zamówienie		Patrz powyżej
Grot impaktora	Wykonany na zamówienie		Średnica: 1,15 mm
Rama stereotaktyczna	David Kopf Instruments	Model 900
Poziomica cylindryczna	YIJIA TOOLS	YJ-SL0620
Mikroskop	Leica		Nr modelu: MZ8
Laboratoryjny podnośnik nożycowy	VWR	12620-902