Opisano niezawodną i powtarzalną metodę wywoływania jednostronnego urazu rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym przy użyciu impaktora Infinite Horizon. Metoda ta wykorzystuje specjalnie zaprojektowaną ramę i zacisk do stabilizacji kręgosłupa. Standaryzowana procedura oraz biomechaniczne parametry urazu pozwalają na uzyskanie wystarczających i trwałych obrażeń.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Model kontuzyjny jednostronnego urazu rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym z wykorzystaniem urządzenia Infinite Horizon Impactor
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Chociaż większość urazów rdzenia kręgowego u ludzi występuje w odcinku szyjnym, ogromna większość badań laboratoryjnych wykorzystuje zwierzęce modele urazu rdzenia kręgowego (SCI), w których uszkodzeniu ulega odcinek piersiowy. Ponadto, ponieważ większość urazów rdzenia u ludzi jest wynikiem tępego, niepenetrującego urazu (np. wypadku komunikacyjnego, urazu sportowego), w którym rdzeń kręgowy zostaje gwałtownie uderzony przez przemieszczoną kość lub tkanki miękkie, większość badaczy SCI uważa, że najbardziej istotne klinicznie modele urazów to te, w których dochodzi do szybkiego stłuczenia rdzenia kręgowego.1 Dlatego ważnym krokiem w przedklinicznej ocenie nowych metod leczenia na etapie przygotowań do badań na ludziach jest ocena ich skuteczności w modelu stłuczenia SCI w odcinku szyjnym rdzenia kręgowego. W niniejszej pracy opisujemy aspekty techniczne oraz wynikające z nich efekty anatomiczne i behawioralne jednostronnego modelu stłuczeniowego SCI odcinka szyjnego, w którym wykorzystano impaktor do urazów rdzenia kręgowego Infinite Horizon.
Szczury rasy Sprague Dawley zostały poddane jednostronnej laminektomii lewostronnej na poziomie C5. Aby zoptymalizować powtarzalność wyników biomechanicznych, funkcjonalnych i histologicznych modelu uszkodzenia, wykonano kontuzję rdzeni kręgowych przy użyciu siły uderzenia 150 kdyn, trajektorii uderzenia 22,5° (zwierzęta obrócone o 22,5°) oraz miejsca uderzenia oddalonego od linii środkowej o 1,4 mm. Powrót funkcji oceniano za pomocą testu wznoszenia w cylindrze, testu drabiny poziomej, testu pielęgnacji oraz zmodyfikowanego testu schodów Montoyi przez okres do 6 tygodni, po czym dokonano oceny histologicznej rdzeni kręgowych w celu zbadania stopnia zachowania istoty białej i szarej.
Przedstawiony tutaj model urazu wywołuje spójne i powtarzalne siły biomechaniczne działające na rdzeń kręgowy, co jest istotną cechą każdego eksperymentalnego modelu SCI. Skutkuje to wyraźnymi uszkodzeniami histologicznymi bocznej połowy rdzenia kręgowego, które ograniczają się głównie do strony ipsilateralnej względem urazu. Uraz jest dobrze tolerowany przez zwierzęta, lecz prowadzi do znaczących i utrzymujących się przez kolejne tygodnie deficytów funkcjonalnych kończyny przedniej. Przedstawiony tutaj model jednostronnego urazu szyjnego może być pomocnym narzędziem dla badaczy pragnących ocenić potencjalnie obiecujące terapie przed ich wdrożeniem w badaniach klinicznych u ludzi.
Protokół
1. Przygotowanie: Projekt ramy i zacisku do unieruchomienia zwierzęcia
- Ramę oraz zacisk do unieruchomienia zwierzęcia zaprojektowano specjalnie tak, aby były kompatybilne z urządzeniem do wywoływania urazów rdzenia kręgowego Infinite Horizon (IH) Spinal Cord Injury Impactor.
- Podstawa ramy stanowi aluminiową platformę dociętą do następujących wymiarów (30.2 cm x 20.3 cm x 1.3 cm), aby pasowała do wspornika prowadnicy stołu, który jest standardowym elementem urządzenia IH (Rycina 1A).
- Do platformy przymocowano cztery stopki wspierające Flexaframe (Fisher Scientific, Toronto, ON), a osiem prętów wspierających Flexaframe (Fisher Scientific, Toronto, ON, 30.5 cm) zmontowano przy użyciu ośmiu łączników wspierających Flexaframe (Rycina 1B).
- Dwa dodatkowe łączniki wspierające Flexaframe, przymocowane do dwóch środkowych prętów, stanowią uchwyty dla zacisku (Rycina 1B).
- Kąt, pod którym rdzeń kręgowy zwierzęcia jest obrócony względem pionu, ustala się poprzez pozostawienie jednego z prętów poziomych w stałej pozycji i zmianę wysokości drugiego pręta poziomego (Rycina 2).
- Zacisk ma długość 35.6 mm, wysokość 25.4 mm oraz szczęki o szerokości 7.6 mm, zaprojektowane tak, aby sztywno chwytać od spodu wyrostki poprzeczne od C4 do C6 (Rycina 1C). Dodatkowe szczegóły dotyczące konstrukcji zacisku zostały opisane wcześniej przez Choo et al., 2009.
2. Operacja
- Samce szczurów Sprague Dawley (Charles River Laboratories) o masie 300-350 g znieczulono izofluranem (4% do indukcji i 2% do podtrzymania) w tlenie (1 L/min).
- Po wprowadzeniu zwierząt w stan znieczulenia, umieszcza się je w aparacie stereotaksycznym (Kopf, Tujunga, CA).
- Aby zminimalizować krwawienie podczas procedury chirurgicznej, w okolicy grzbietowej szyi, wokół miejsca operowanego, wstrzykuje się domięśniowo 0,4 mL lidokainy (20 mg/mL; Bimeda-MTC Animal Health Inc., Cambridge, Ontario, Canada) z epinefryną.
- Za pomocą sterylnego skalpela (#15) wykonuje się nacięcie wzdłuż linii środkowej grzbietu o długości 4-5 cm, zaczynając od podstawy czaszki i kierując się w stronę ogona.
- Przy użyciu sterylnej pęsety Adsona wykonuje się tępe rozcięcie przez mięśnie grzbietowe, aby dotrzeć do kręgosłupa, a następnie wprowadza się sterylny rozwieracz Alma (Fine Science Tools, North Vancouver, BC), aby utrzymać mięśnie w rozstawieniu.
- Za pomocą skalpela #15 zeskrobuje się mięśnie pokrywające blaszki łukowe C4-C7, zaczynając od linii środkowej i przesuwając je bocznie.
- Sterylnym skalpelem (#15) wykonuje się nacięcie mięśnia przyczepionego do wyrostków poprzecznych po obu stronach kręgosłupa, aby umożliwić umieszczenie zacisku pod wyrostkami poprzecznymi C4 do C6.
- Za pomocą sterylnych kleszczyków kuretażowych Friedman-Pearson o cienkich końcówkach (Fine Science Tools, North Vancouver, BC) ostrożnie usuwa się lewą blaszkę łukową C5, aby uwidocznić oponę twardą i rdzeń kręgowy.
- Pod ramiona aparatu wsuwa się pręt o średnicy 1,5 mm, aby podeprzeć zwierzę, co nieznacznie unosi kręgosłup i ułatwia wprowadzenie zacisku.
- Szczęki sterylnego zacisku montuje się na bocznych wyrostkach poprzecznych C4 do C6 i dokręca śruby.
- Usuwa się rozwieracz Alma.
3. Uraz rdzenia kręgowego
- Po zamontowaniu zacisku na zwierzęciu, zwierzę zostaje przeniesione do impaktora IH.
- Zacisk zostaje włożony do metalowych uchwytów na dwóch środkowych prętach ramy, które zostały zabezpieczone pod kątem 22,5° względem poziomu (Rysunek 2).
- Podnośnik nożycowy zapewniający stabilną regulację wysokości (VWR, Mississauga, ON) jest podnoszony do momentu, aż zwierzę będzie leżeć płasko.
- Należy upewnić się, że zacisk jest w poziomie, umieszczając na jego górze małą poziomicę cylindryczną i dokręcając śruby. Ważne jest, aby wszystkie śruby były dokręcone, a cała konstrukcja była sztywna i nieruchoma.
- Pozostała część procedury jest przeprowadzana pod mikroskopem (Leica MZ8).
- Należy opuścić i wycelować końcówkę impaktora (średnica 15 mm, z zaokrąglonymi krawędziami), korzystając z pokrętła regulacji pionowej oraz dwóch pokręteł regulacji poziomej impaktora IH, aż środek końcówki impaktora znajdzie się nad wierzchołkiem wyrostka kolczystego C6.
- Po wycentrowaniu końcówki impaktora należy obrócić pokrętło regulacji osi y o jeden i dwie piąte obrotu (1,4 mm), aby przesunąć końcówkę bocznie na lewą stronę, a następnie użyć poziomego pokrętła regulacji osi x, aby przesunąć końcówkę impaktora do środka C5.
- Należy opuścić końcówkę tuż nad oponę twardą, aby zweryfikować, czy końcówka impaktora jest skierowana na boczną połowę istoty szarej.
- Należy obrócić pokrętło regulacji pionowej o dwa obroty, aby podnieść końcówkę na wysokość 4 mm nad oponę twardą.
- Należy upewnić się, że obszar uderzenia jest suchy, używając do tego patyczka watnego lub drewnianego.
- W programie należy ustawić pożądaną siłę na 150 kdyn i kliknąć „Start Experiment”, aby uruchomić impaktor.
- Po urazie ranę zamyka się warstwowo szwami z nici vicryl 5-0. Buprenorfinę (0,03 mg/kg SC, Temgesic; Schering-Plough Corporation, Kenilworth, NJ) oraz sól fizjologiczną (10 mL) podaje się podskórnie przed operacją i dwa razy dziennie przez dwa dni po zabiegu. Zwierzęta są ściśle monitorowane dwa razy dziennie przez 2 tygodnie oraz raz w tygodniu przez 6 tygodni po urazie.
4. Reprezentatywne wyniki
Dwudziestu dziewięciu samców szczurów Sprague Dawley (Charles River Laboratories) o masie 300-350 g poddano urazowi przy ustawieniu siły 150 kdyn. Końcówkę impaktora skierowano 1,4 mm bocznie od linii środkowej, pod kątem 22,5° względem pionu. Średnia rzeczywista siła wyniosła 155,55 ± 0,73 kdyn. Średnie przemieszczenie wyniosło 1512,72 ± 27,86 μm, a prędkość 120,24 ± 0,52 mm/s (Rysunek 3).
Mierniki wyników behawioralnych
Powrót funkcji oceniano za pomocą testu poziomej drabiny, testu podnoszenia się w cylindrze, testu pielęgnacji oraz zmodyfikowanego testu schodów Montoyi1. Zwierzęta przechodziły trening przed urazem, a oceny przeprowadzano w 2., 4. i 6. tygodniu po urazie. W całym okresie eksperymentalnym utrzymywały się istotne zaburzenia funkcji kończyn przednich.
Test drabiny poziomej. Przed urazem zwierzęta popełniały jedynie 4,75 ± 0,73% błędów przednią kończyną po stronie ipsilateralnej podczas przechodzenia przez poziomą drabinę o nieregularnych odstępach między szczeblami. Po urazie u zwierząt odnotowano wyraźny wzrost odsetka błędów przednią kończyną. Odsetek błędów przednią kończyną po stronie ipsilateralnej wynosił odpowiednio 26,97 ± 2,92%, 26,23 ± 2,84% oraz 22,06 ± 2,05% w 2., 4. i 6. tygodniu po urazie (Rycina 4A). Co istotne, upośledzenie funkcji przedniej kończyny w tym teście utrzymywało się przez cały okres 6 tygodni.
Test wznoszenia w cylindrze (Cylinder Rearing test). Procent wykorzystania kończyny przedniej po stronie ipsilateralnej (lewa + obie) podczas eksploracji znacząco spadł po SCI. Przed urazem zwierzęta wykorzystywały kończynę przednią po stronie ipsilateralnej w 75,12 ± 2,25%. Po urazie zwierzęta wykorzystywały kończynę przednią po stronie ipsilateralnej w 8,59 ± 1,80% w 2. tygodniu, 14,25 ± 2,65% w 4. tygodniu oraz 11,76 ± 2,66% w 6. tygodniu (Rycina 4B).
Zmodyfikowany test schodów Montoyi. Liczba granulek odzyskanych przy użyciu przedniej kończyny po stronie ipsilateralnej drastycznie spadła po urazie. Przed urazem zwierzęta zbierały 84,85 ± 2,88% nagród pokarmowych. Jednak w 2., 4. i 6. tygodniu po urazie zwierzęta odzyskały odpowiednio tylko 30,91 ± 4,03%, 28,94 ± 4,38% i 25,86 ± 3,09% granulek (Rycina 4C).
Test pielęgnacji. Odnotowano gwałtowne spadki w punktacji pielęgnacji po urazie. Po SCI wyniki pielęgnacji po stronie ipsilateralnej wynosiły: 2 tygodnie: 2,00 ± 0,17, 4 tygodnie: 1,83 ± 0,17 oraz 6 tygodni: 1,79 ± 0,11 (Ryc. 4D).
Wyniki histologiczne
Oszczędzenie istoty białej i istoty szarej. Przykład urazu rdzenia kręgowego przy sile 150 kdyn, kącie 22,5° i bocznym celowaniu 1,4 mm przedstawiono na Rysunku 5. Uraz spowodował znaczne uszkodzenie istoty szarej i białej po stronie ipsilateralnej. Uszkodzeniu uległy zarówno drogi korowo-rdzeniowe, jak i rubro-rdzeniowe, a u 23 z 29 zwierząt uszkodzenia miąższowe ograniczały się do strony ipsilateralnej. Podłużny zasięg uszkodzeń istoty białej i szarej wynosił 2400 rostralnie i 2400 kaudalnie (Rysunek 6). Po zsumowaniu przekrojów w celu uzyskania ogólnej oceny „skumulowanego rozprzestrzenienia” oszczędzenia istoty białej i szarej (2000 μm rostralnie i kaudalnie od epicentrum), po stronie ipsilateralnej oszczędzono jedynie 51,8% istoty białej i pozostało 39,7% istoty szarej w porównaniu ze stroną kontralateralną (Rysunek 6).
Rycina 1. Impaktor do urazów rdzenia kręgowego Infinite Horizon. A. Impaktor Infinite Horizon i ogólny schemat zestawu. B. Konfiguracja ramy. C. Zbliżenie zacisku do unieruchomienia wyrostków poprzecznych kręgów szyjnych. D. Specyfikacja (jednostka: inch) zacisku. Sugerowana tolerancja <0.002 in (Choo et al. 2009). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.
Rysunek 2. A. Ilustracja i odpowiadająca jej konfiguracja ramki w celu uzyskania rotacji rdzenia kręgowego o 0° (pozycja neutralna) lub B. 22,5° przy bocznym celowaniu wynoszącym 1,4 mm.
Rysunek 3. Reprezentatywne wykresy siły i przemieszczenia dla impaktora Infinite Horizon. Strzałka wskazuje moment, w którym końcówka impaktora osiągnęła wartość 20 kdyn oraz punkt rozpoczęcia rejestracji przemieszczenia. Rzeczywistą siłę odczytuje się z piku krzywej siły w funkcji czasu, a następnie oblicza odpowiadające jej przemieszczenie. Poniższe wykresy przedstawiają typowe stłuczenie o sile 150 kdyn: A. Wykres przemieszczenia w funkcji czasu, B. Wykres siły w funkcji czasu. Wykresy te pokazują, że rzeczywista osiągnięta siła wyniosła 152 kdyn, a przemieszczenie impaktora w rdzeń zmierzono na 1287 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.
Rycina 4. Oceny behawioralne dla siły 150 kdyn, kąta nachylenia impaktora 22,5° i celowania 1,4 mm na lewo od linii środkowej. A. Test drabiny poziomej. B. Test wspinania w cylindrze. C. Zmodyfikowany test schodów Montoyi. D. Test pielęgnacji. Kończyna przednia po stronie ipsilateralnej wykazała istotne i trwałe upośledzenia w porównaniu z kończyną przednią po stronie kontralateralnej.
Rycina 5. Reprezentatywne obrazy uszkodzonego rdzenia kręgowego od 1600 μm w kierunku rostralnym do 1600 μm w kierunku kaudalnym.
Rycina 6. Oceny histologiczne. A. Procent oszczędzonej istoty białej i szarej. Tkanka w obrębie 2000 μm od centrum uszkodzenia została w dużej mierze oszczędzona. B. Skumulowana ilość oszczędzonej istoty białej i szarej w obrębie 2000 μm od centrum uszkodzenia. Po stronie ipsilateralnej odnotowano znacznie mniejszą ilość oszczędzonej istoty białej i szarej w porównaniu ze stroną kontralateralną. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niniejszej pracy opisujemy model jednostronnego stłuczenia szyjnego z wykorzystaniem impaktora Infinite Horizon (IH) przy sile 150 kdyn, kącie 22,5° względem pionu i bocznym celowaniu w odległości 1,4 mm od linii środkowej. Dzięki tym ustawieniom udało nam się wywołać trwałe deficyty behawioralne w kończynie przedniej po stronie ipsilateralnej, przy czym uszkodzenia miąższu ograniczały się głównie do strony ipsilateralnej, gdzie wystąpiły znaczne uszkodzenia w obszarach, w których spodziewany jest przebieg dróg rdzenio...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Impaktor Infinite Horizon | Precision Systems and Instrumentation | IH-0400 | |
| Aluminiowa blacha | Metalsupermarlets.com | APT6061/500 | |
| Płytki wsporcze Flexaframe | Fishers Scientific | 1466625Q | |
| Pręty wsporcze Flexaframe | Fishers Scientific | 1466610GQ | |
| Łączniki wsporcze Flexaframe | Fishers Scientific | 1466620Q | |
| Zacisk1 | Wykonany na zamówienie | Choo et al., 2009 | |
| Uchwyty metalowe | Wykonane na zamówienie | Patrz powyżej | |
| Grot impaktora | Wykonany na zamówienie | Średnica: 1,15 mm | |
| Rama stereotaktyczna | David Kopf Instruments | Model 900 | |
| Poziomica cylindryczna | YIJIA TOOLS | YJ-SL0620 | |
| Mikroskop | Leica | Nr modelu: MZ8 | |
| Laboratoryjny podnośnik nożycowy | VWR | 12620-902 |
Bibliografia
- Lee, J. H., Tigchelaar, S., Liu, J., Stammers, A. M., Streijger, F., Tetzlaff, W., Kwon, B. K. Lack of neuroprotective effects of simvastatin and minocycline in a model of cervical spinal cord injury. Exp. Neurol. 225, 219-230 (2010).
- Kwon, B. K., Hillyer, J., Tetzlaff, W. Translational research in spinal cord injury: a survey of opinion from the SCI community. J. Neurotrauma. 27, 21-33 (2010).
- Gensel, J. C., Tovar, C. A., Hamers, F. P., Deibert, R. J., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. Behavioral and histological characterization of unilateral cervical spinal cord contusion injury in rats. J. Neurotrauma. 23, 36-54 (2006).
- Kwon, B. K., Borisoff, J. F., Tetzlaff, W. Molecular targets for therapeutic intervention after spinal cord injury. Mol. Interv. 2, 244-258 (2002).
- Allen, A. R. Surgery of experimental lesions of spinal cord equivalent to crush injury of fracture dislocation. J. Am. Med. Assoc. 57, 878-880 (1911).
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. Graded histological and locomotor outcomes after spinal cord contusion using the NYU weight-drop device versus transection. Exp Neurol. 139, 244-256 (1996).
- Gruner, J. A. A monitored contusion model of spinal cord injury in the rat. J. Neurotrauma. 9, 123-128 (1992).
- Choo, A. M., Liu, J., Liu, Z., Dvorak, M., Tetzlaff, W., Oxland, T. R. Modeling spinal cord contusion, dislocation, and distraction: characterization of vertebral clamps, injury severities, and node of Ranvier deformations. J. Neurosci. Methods. 181, 6-17 (2009).
- Whishaw, I. Q., Piecharka, D. M., Drever, F. R. Complete and partial lesions of the pyramidal tract in the rat affect qualitative measures of skilled movements: impairment in fixations as a model for clumsy behavior. Neural. Plast. 10, 77-92 (2003).
- Jones, T. A., Schallert, T. Overgrowth and pruning of dendrites in adult rats recovering from neocortical damage. Brain Res. 581, 156-160 (1992).
- Liu, Y., Kim, D., Himes, B. T., Chow, S. Y., Schallert, T., Murray, M., Tessler, A., Fischer, I. Transplants of fibroblasts genetically modified to express BDNF promote regeneration of adult rat rubrospinal axons and recovery of forelimb function. J. Neurosci. 19, 4370-4387 (1999).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
- Soblosky, J. S., Song, J. H., Dinh, D. H. Graded unilateral cervical spinal cord injury in the rat: evaluation of forelimb recovery and histological effects. Behav. Brain Res. 119, 1-13 (2001).
- McKenna, J. E., Prusky, G. T., Whishaw, I. Q. Cervical motoneuron topography reflects the proximodistal organization of muscles and movements of the rat forelimb: a retrograde carbocyanine dye analysis. J. Comp. Neurol. 419, 286-296 (2000).
- Sandrow, H. R., Shumsky, J. S., Amin, A., Houle, J. D. Aspiration of a cervical spinal contusion injury in preparation for delayed peripheral nerve grafting does not impair forelimb behavior or axon regeneration. Exp. Neurol. 210, 489-500 (2008).
- Popovich, P. G., Lemeshow, S., Gensel, J. C., Tovar, C. A. Independent evaluation of the effects of glibenclamide on reducing progressive hemorrhagic necrosis after cervical spinal cord injury. Exp. Neurol. 233, 615-622 (2012).
- Dunham, K. A., Siriphorn, A., Chompoopong, S., Floyd, C. L. Characterization of a graded cervical hemicontusion spinal cord injury model in adult male rats. J. Neurotrauma. 27, 2091-2106 (2010).
- Lee, J. H., Roy, J., Sohn, H. M., Cheong, M., Liu, J., Stammers, A. T., Tetzlaff, W., Kwon, B. K. Magnesium in a polyethylene glycol formulation provides neuroprotection after unilateral cervical spinal cord injury. Spine (Phila Pa 1976). 35, 2041-2048 (2010).
- Alstermark, B., Isa, T., Lundberg, A., Pettersson, L. G., Tantisira, B. The effect of low pyramidal lesions on forelimb movements in the cat. Neurosci. Res. 7, 71-75 (1989).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
