Zaprojektowano cykliczny bioreaktor ciśnieniowy, który umożliwia poddawanie tkanki zastawek serca fizjologicznym oraz patologicznym warunkom ciśnieniowym. Program LabVIEW pozwala użytkownikom na kontrolowanie wartości, amplitudy oraz częstotliwości ciśnienia. Urządzenie to może być wykorzystywane do badania mechanobiologii tkanki zastawek serca lub izolowanych komórek.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Projekt cyklicznego bioreaktora ciśnieniowego do badań ex vivo zastawek tętniczych serca
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zastawka aorty, znajdująca się pomiędzy lewą komorą a aortą, umożliwia jednokierunkowy przepływ krwi, zapobiegając jej cofaniu się do komory. Płatki zastawki aorty składają się z komórek śródmiąższowych zawieszonych w macierzy pozakomórkowej (ECM) i są wyścielone monowarstwą komórek śródbłonka. Zastawka znosi trudne, dynamiczne warunki i jest stale narażona na siły ścinania, zginanie, rozciąganie i ściskanie. Badania wykazały, że zmiany wapienne w chorych zastawkach występują w obszarach wysokiego naprężenia mechanicznego w wyniku uszkodzenia śródbłonka lub macierzy śródmiąższowej1-3. W związku z tym nie jest zaskakujące, że badania epidemiologiczne wykazały, iż wysokie ciśnienie krwi jest głównym czynnikiem ryzyka wystąpienia choroby zastawki aorty4.
Jedyną obecnie dostępną opcją leczenia chorób zastawek jest chirurgiczna wymiana chorej zastawki na zastawkę bioprotezę lub mechaniczną5. Lepsze zrozumienie biologii zastawek w odpowiedzi na stresy fizyczne pomogłoby wyjaśnić mechanizmy patogenezy zastawek. Z kolei mogłoby to pomóc w opracowaniu terapii nieinwazyjnych, takich jak interwencje farmakologiczne lub profilaktyka. Wcześniej opracowano kilka bioreaktorów do badania mechanobiologii natywnych lub inżynieryjnych zastawek serca6-9. Opracowano również bioreaktory pulsacyjne do badania szeregu tkanek, w tym chrząstki10, kości11 i pęcherza moczowego12. Celem niniejszej pracy było opracowanie systemu cyklicznego ciśnienia, który mógłby zostać wykorzystany do wyjaśnienia biologicznej odpowiedzi płatków zastawki aorty na zwiększone obciążenia ciśnieniowe.
Układ składał się z akrylowej komory, w której umieszczano próbki i generowano cykliczne ciśnienie, elektrozaworów z membraną z vitonu do sterowania czasem cyklu ciśnienia oraz komputera do sterowania urządzeniami elektrycznymi. Ciśnienie monitorowano za pomocą przetwornika ciśnienia, a sygnał był przetwarzany przez wzmacniacz tensometryczny. Program LabVIEW regulował ciśnienie, wykorzystując urządzenie analogowe do pompowania sprężonego powietrza do układu z odpowiednią prędkością. Układ odwzorowywał dynamiczne poziomy ciśnienia transwalwularnego związane z zastawką aorty; fala piłokształtna powodowała stopniowy wzrost ciśnienia, typowy dla gradientu ciśnienia transwalwularnego występującego w zastawce podczas rozkurczu, po czym następował gwałtowny spadek ciśnienia obrazujący otwarcie zastawki w skurczu. Program LabVIEW pozwalał użytkownikom na kontrolę amplitudy i częstotliwości cyklicznego ciśnienia. Układ umożliwiał poddawanie próbek tkanek fizjologicznym i patologicznym warunkom ciśnienia. Urządzenie to może być wykorzystane do poszerzenia wiedzy na temat reakcji zastawek serca na zmiany w lokalnym środowisku mechanicznym.
Protokół
1. Pobranie i przygotowanie tkanek
- Zastawek aorty należy pobrać od dorosłych świń o masie nieprzekraczającej 120 lbs niezwłocznie po śmierci zwierzęcia.
- Zastawki należy dwukrotnie przemyć sterylnym roztworem soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) i przetransportować do laboratorium w lodzie.
- Wszystkie kolejne etapy powinny być przeprowadzane w warunkach sterylnych.
- Należy upewnić się, że płatki zastawek nie wykazują oznak degeneracji, pęknięć ani zwapnień. Płatki należy oddzielić od pierścienia aorty, przecinając tkankę w odległości 1/3 od pierścienia.
- Płatki należy umieścić w poszczególnych dołkach płytki 6-dołkowej i inkubować przez noc w 3ml pożywki DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) uzupełnionej o 1% roztwór antybiotyków i środków przeciwgrzybiczych oraz 10% płodowej surowicy bydlęcej w temperaturze 37°C i 5% CO2.
- Alternatywnie można wysiać wyizolowane komórki na 6-dołkowe płytki hodowlane i wykorzystać je w urządzeniu do badania ciśnienia. Izolację komórek śródbłonka i komórek śródmiąższowych zastawek można przeprowadzić zgodnie z wcześniej opisaną procedurą13, 14.
2. Badania ciśnieniowe
- W celu zbadania mechanobiologicznych efektów cyklicznego ciśnienia na tkankę zastawki aorty zaprojektowano specjalistyczny układ ciśnieniowy15.
- Zaloguj się do komputera i uruchom program labVIEW (Rycina 1).
- Kalibracja:
- Przed przystąpieniem do eksperymentów układ należy odpowiednio skalibrować.
- Podłącz zasilacz do płytki obwodowej. Zapewnia to zasilanie elektrozaworów sterujących przepływem powietrza do komory i z niej.
- Upewnij się, że sprężone powietrze jest podłączone do układu i otwórz dopływ powietrza do pełnej prędkości.
- Włącz wzmacniacz sygnałowy. Upewnij się, że odczyt napięcia wynosi 0.00. W razie potrzeby dokonaj regulacji.
- Interfejs labVIEW posiada przełącznik oznaczony jako „TEST/RECORD”. Upewnij się, że przełącznik jest ustawiony na „TEST”. Kliknij przycisk oznaczony jako „Air Supply”, aby otworzyć wlotowy elektrozawór.
- Za pomocą regulatora ciśnienia gazu zwiększ ciśnienie w komorze sprężonym powietrzem do 1 PSI. Ciśnienie w komorze można odczytać z cyfrowego manometru znajdującego się na tylnej płycie końcowej komory. Po wyrównaniu ciśnienia zapisz odczyt napięcia ze wzmacniacza sygnałowego. Powtórz czynność dla 2, 3, 4 i 5 PSI.
- Wykreśl krzywą kalibracyjną ciśnienia w funkcji napięcia. Ciśnienie należy przeliczyć z PSI na mmHg. Równanie uzyskane z wykresu można wprowadzić do kodu programu labVIEW.
- Zdejmij aluminiową płytę przednią z komory ciśnieniowej i spryskaj komorę 70% etanolem. Pozostaw na minimum 10 minut, aby pozostałości oparów etanolu odparowały.
- Umieść płytkę sześciodołkową zawierającą próbki płatków w komorze i zamontuj przednią płytę końcową. Upewnij się, że uszczelnienie jest szczelne, dokręcając ręcznie nakrętki znajdujące się na czterech prętach gwintowanych (umieszczonych w każdym rogu płyty końcowej). Umieść komorę ciśnieniową w inkubatorze w temperaturze 37°C. Schemat komory ciśnieniowej przedstawiono na rycinie 2.
- Interfejs poprosi użytkownika o podanie czasu cykli między dopływem a odpływem sprężonego powietrza. Wartości te należy ustawić odpowiednio na 0.6s i 0.4s, aby odwzorować warunki rozkurczowe i skurczowe przy częstotliwości 1Hz. Użytkownik powinien również wprowadzić ścieżkę do pliku danych.
- W programie labVIEW kliknij „run” i przełącz przełącznik „TEST/RECORD” na „RECORD”.
- Upewnij się, że ciśnienie znajduje się na pożądanym poziomie, korzystając z wykresu w interfejsie labVIEW. Ciśnienie można regulować za pomocą regulatora ciśnienia gazu.
- Uruchom program na żądany czas.
- Po zakończeniu eksperymentu kliknij przycisk stop w programie labVIEW, wyłącz dopływ powietrza i otwórz zawór spustowy w komorze ciśnieniowej.
- Zdejmij przednią płytę końcową z komory i wyjmij płytkę sześciodołkową z próbkami. Próbki mogą być teraz analizowane pod kątem ekspresji genów, ekspresji białek, histologii, właściwości mechanicznych itp.
3. Reprezentatywne wyniki:
Układ ciśnieniowy jest w stanie symulować maksymalne ciśnienia transwalwularne obserwowane w warunkach normotensyjnych oraz w nadciśnieniu stopnia I i stopnia II. Jednakże układ nie był w stanie odwzorować gradientu ciśnienia skurczowego, który in vivo wynosi w zasadzie zero. Częstotliwość jest utrzymywana na poziomie 1Hz, przy czasie wlotu powietrza wynoszącym 0,6s i czasie wylotu 0,4s. Reprezentatywne przebiegi ciśnienia dla warunków ciśnienia prawidłowego i podwyższonego, uzyskane z układu, przedstawiono na rysunku 3.
Rycina 1: Zrzut ekranu interfejsu LabVIEW.
Rysunek 2: Schematyczny rysunek komory ciśnieniowej A. Widok izometryczny komory ciśnieniowej; B. Widok boczny komory ciśnieniowej; C. Widok z góry komory ciśnieniowej.
Rycina 3: Wykres symulacji ciśnienia w komorze ciśnieniowej w warunkach (A) normotensyjnych, (B) nadciśnienia stopnia I oraz (C) nadciśnienia stopnia II.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
System ciśnieniowy pomyślnie poddał płatki zastawki aorty cyklicznym ciśnieniom reprezentującym rozkurczowe ciśnienie transzastawkowe. Nie był on jednak w stanie odtworzyć skurczowego ciśnienia transzastawkowego, ponieważ ciśnienie spadało jedynie do 40 mmHg. Ciśnienie transzastawkowe to różnica między ciśnieniem w aorcie wstępującej a ciśnieniem w lewej komorze. Podczas rozkurczu, gdy zastawka jest zamknięta, różnica ciśnień wynosi 80 mmHg w warunkach normotensyjnych oraz odpowiednio 90 mmHg i 100 mmHg w nadciśnieniu st...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy są wdzięczni Shad Schipke i Danielowi Chesserowi za pomoc w projektowaniu i wykonaniu układu oraz Valtresie Myles za pomoc w przygotowaniu rękopisu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| PBS Dulbecco’a | Sigma-Aldrich | D5652 | |
| Roztwór antybiotyk-antybiotyki | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Płodowa surowica bydlęca | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30070 | |
| Elektrozawory z membraną z Vitonu | McMaster-Carr | 4868K11 | |
| Przetwornik ciśnienia | Omega Engineering, Inc. | PX302-200GV | |
| Kondycjoner tensometru | Encore Electronics, Inc. | 4025-101 | |
| Moduł akwizycji danych (DAQ) | Measurement Computing | PMD1608 |
Bibliografia
- Freeman, R. V., Otto, C. M. Spectrum of calcific aortic valve disease: pathogenesis, disease progression, and treatment strategies. Circulation. 111, 3316-3326 (2005).
- Robicsek, F., Thubrikar, M. J., Fokin, A. A. Cause of degenerative disease of the trileaflet aortic valve: review of subject and presentation of a new theory. Ann Thorac Surg. 73, 1346-1354 (2002).
- Thubrikar, M. J., Aouad, J., Nolan, S. P. Patterns of calcific deposits in operatively excised stenotic or purely regurgitant aortic valves and their relation to mechanical stress. Am J Cardiol. 58, 304-308 (1986).
- Agno, F. S., Chinali, M., Bella, J. N., Liu, J. E., Arnett, D. K., Kitzman, D. W. Aortic valve sclerosis is associated with preclinical cardiovascular disease in hypertensive adults: the Hypertension Genetic Epidemiology Network study. J Hypertens. 23, 867-8673 (2005).
- Cawley, P. J., Otto, C. M. Prevention of calcific aortic valve stenosis - fact or fiction. Annals of Medicine. 41, 100-108 (2009).
- Durst, C. A., Grande-Allen, J. K. Design and physical characterization of a synchronous multivalve aortic valve culture system. Ann Biomed Eng. 38, 319-3125 (2010).
- Engelmayr, G. C., Soletti, L., Vigmostad, S. C., Budilarto, S. G., Federspiel, W. J., Chandran, K. B. A novel flex-stretch-flow bioreactor for the study of engineered heart valve tissue mechanobiology. Ann Biomed Eng. 36, 700-712 (2008).
- Sucosky, P., Padala, M., Elhammali, A., Balachandran, K., Jo, H., Yoganathan, A. P. Design of an ex vivo culture system to investigate the effects of shear stress on cardiovascular tissue. J Biomech Eng. 130, 035001-03 (2008).
- Syedain, Z. H., Tranquillo, R. T. Controlled cyclic stretch bioreactor for tissue-engineered heart valves. Biomaterials. 30, 4078-4084 (2009).
- Lagana, K., Moretti, M., Dubini, G., Raimondi, M. T. A new bioreactor for the controlled application of complex mechanical stimuli for cartilage tissue engineering. Proc Inst Mech Eng H. 222, 705-715 (2008).
- Wartella, K. A., Wayne, J. S. Bioreactor for biaxial mechanical stimulation to tissue engineered constructs. J Biomech Eng. 131, 044501-044501 (2009).
- Wallis, M. C., Yeger, H., Cartwright, L., Shou, Z., Radisic, M., Haig, J. Feasibility study of a novel urinary bladder bioreactor. Tissue Eng Part A. 14, 339-348 (2008).
- Butcher, J. T., Nerem, R. M. Valvular endothelial cells regulate the phenotype of interstitial cells in co-culture: effects of steady shear stress. Tissue Eng. 12, 905-915 (2006).
- Metzler, S. A., Pregonero, C. A., Butcher, J. T., Burgess, S. C., Warnock, J. N. Cyclic Strain Regulates Pro-Inflammatory Protein Expression in Porcine Aortic Valve Endothelial Cells. J Heart Valve Dis. 17, 571-578 (2008).
- Schipke, K. J. Design of a cyclic pressure bioreactor for the ex vivo study of aortic heart valve mechanobiology. , Mississippi State University. Mississippi State. (2008).
- Smith, K. E., Metzler, S. A., Warnock, J. N. Cyclic strain inhibits acute pro-inflammatory gene expression in aortic valve interstitial cells. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. , (2009).
- Warnock, J. N., Burgess, S. C., Shack, A., Yoganathan, A. P. Differential immediate-early gene responses to elevated pressure in porcine aortic valve interstitial cells. J Heart Valve Dis. 15, 34-41 (2006).
- Brathwaite, D., Weissman, C. The new onset of atrial arrhythmias following major noncardiothoracic surgery is associated with increased mortality. Chest. 114, 462-468 (1998).
- Walsh, S. R., Oates, J. E., Anderson, J. A., Blair, S. D., Makin, C. A., Walsh, C. J. Postoperative arrhythmias in colorectal surgical patients: incidence and clinical correlates. Colorectal Dis. 8, 212-216 (2006).
- Walsh, S. R., Tang, T., Gaunt, M. E., Schneider, H. J. New arrhythmias after non-cardiothoracic surgery. BMJ. 7, 333-333 (2006).
- Walsh, S. R., Tang, T., Wijewardena, C., Yarham, S. I., Boyle, J. R., Gaunt, M. E. Postoperative arrhythmias in general surgical patients. Ann R Coll Surg Engl. 89, 91-95 (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
