Tworzenie linii limfoblastoidalnych przekształconych przez wirusa Epsteina-Barr

Podsumowanie

Opisujemy metodę generowania przekształconych linii komórek B z wykorzystaniem wirusa Epstein-Barr. Przedstawiamy również nowatorski test, który pozwala zidentyfikować komórki B przeznaczone do transformacji już trzy dni po infekcji.

Streszczenie

Zakażenie limfocytów B wirusem Epsteina-Barr (EBV) prowadzi do ich proliferacji i późniejszej unieśmiertelnienia, co skutkuje utworzeniem linii komórkowych limfoblastoidalnych (LCL) in vitro. Ponieważ LCL są zakażone EBV w sposób latentny, stanowią one system modelowy do badania latencji EBV oraz napędzanej przez wirusa proliferacji limfocytów B i tumorigenezy¹. LCL były wykorzystywane do prezentacji antygenów w różnych testach immunologicznych^{2, 3}. Ponadto LCL mogą być używane do generowania ludzkich przeciwciał monoklonalnych^{4, 5} i stanowią potencjalnie nieograniczone źródło materiału w sytuacjach, gdy dostęp do pierwotnych materiałów biologicznych jest ograniczony^{6, 7}.

Opisano szereg metod generowania LCL. Wcześniejsze metody obejmowały stosowanie mitogenów, takich jak fitohemaglutynina, lipopolisacharyd⁸ oraz mitogen z fitolaki⁹, w celu zwiększenia wydajności immortalizacji indukowanej przez EBV. W ostatnim czasie inni autorzy stosowali leki immunosupresyjne, takie jak cyklosporyna A, aby zahamować zależne od limfocytów T niszczenie zainfekowanych limfocytów B^{7, 10-12}.

Znaczny odstęp czasu od zakażenia EBV do utworzenia linii komórkowych sprawia, że istnieje zapotrzebowanie na szybsze i bardziej niezawodne metody transformacji wzrostu limfocytów B indukowanej przez EBV. Stosując kombinację EBV o wysokim mianie oraz czynnika immunosupresyjnego, jesteśmy w stanie konsekwentnie zakażać, transformować i generować LCL z limfocytów B krwi obwodowej. Metoda ta wykorzystuje niewielką ilość mononuklearnych komórek krwi obwodowej, które są zakażane in vitro, co pozwala na wykazanie skupisk komórek. Obecność CD23 wraz z EBV w obecności FK506, immunosupresanta komórek T. Tradycyjnie przyrost proliferujących limfocytów B monitoruje się poprzez wizualizację mikroskopijnych skupisk komórek około tydzień po zakażeniu EBV. Agregaty LCL są widoczne gołym okiem po kilku tygodniach. Opisujemy test umożliwiający wczesne określenie, czy transformacja wzrostu pośredniczona przez EBV zakończyła się sukcesem, jeszcze przed momentem, gdy można wykazać mikroskopijne skupiska komórek. Obecność komórek CD23^hiCD58⁺ obserwowana już trzy dni po zakażeniu świadczy o pomyślnym wyniku.

Protokół

1. Przygotowanie zapasu EBV

1. Przeszczepić komórki B95-8 (ATCC # CRL 1612; 13) w fazie wzrostu wykładniczego w zagęszczeniu 3 x 10⁵ komórek/ml do kolby hodowlanej o powierzchni 75cm², stosując technikę sterylną. Komórki hodować w pełnej pożywce RPMI 1640 zawierającej 10% inaktywowanej ciepłem płodowej surowicy bydlęcej (FBS), penicylinę/streptomycynę w stężeniach odpowiednio 100U/ml i 100 μg/ml oraz amfoterycynę B w stężeniu 0,5 μg/ml w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO₂.
2. Po czterdziestu ośmiu godzinach resuspendować komórki w świeżej pełnej pożywce RPMI 1640 w zagęszczeniu 1 x 10⁶ komórek/ml. Aby indukować produkcję wirusa, stymulować komórki tetradekanoilowym octanem forbolu (TPA) w stężeniu 20ng/ml przez 1 godzinę w standardowym inkubatorze CO₂. Przemyć komórki trzy razy pożywką RPMI 1640 w celu usunięcia TPA.
3. Resuspendować komórki w pierwotnej objętości pełnej pożywki RPMI 1640 (z punktu 1.2) i umieścić kolbę w inkubatorze CO₂ na 96 godzin. Wykazano, że metoda ta pozwala na uzyskanie wysokich mian zakaźnych cząsteczek wirusa⁶.
4. Wirować przy 600 x g przez 10 min w temperaturze 4°C, aby oddzielić znadpływ hodowlany zawierający EBV od komórek. Przefiltrować znadpływ przez filtr 0,45 mikrona, podzielić na alykwoy i przechowywać w temperaturze -70°C przez ponad rok.
   Alternatywnie można pozyskać znadpływ z komórek B95-8 zawierających EBV z ATCC (VR-1492) i stosować go w rozcieńczeniu zalecanym przez ATCC.

2. Izolacja mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC)

1. Pobrać 10 ml krwi od dawcy do heparynowanej strzykawki lub heparynowanej probówki do krwi. Rozcieńczyć krew w 20 ml PBS w temperaturze pokojowej w 50 ml probówce stożkowej.
2. Nałożyć rozcieńczoną krew na 15 ml medium do separacji limfocytów Ficoll Hypaque. Wirować przy 225 x g bez hamowania w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
3. zebrać warstwę leukocytarną (buffy coat) i przenieść ją do nowej 50 ml probówki stożkowej. Uzupełnić objętość do 50 ml za pomocą PBS i wirować przy 600 x g w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
4. Odlać nadsącz. Przemyć komórki, resuspendując osad w 50 ml PBS i wirując przy 600 x g w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Powtórzyć proces mycia jeszcze dwukrotnie w ten sam sposób.
5. Resuspender przemyte komórki w 1 ml kompletnego medium RPMI. Odiebrać 5 μL zawiesiny komórek w celu przygotowania rozcieńczenia 1/10 w błękicie trypanu. Policzyć żywe komórki za pomocą hemocytometru.
6. Dostosować objętość za pomocą kompletnego medium RPMI w kolbie do hodowli tkankowej o powierzchni 25 cm², aby uzyskać stężenie komórek 2 x 10⁶/ml.

3. Infekcja EBV

1. Do zawiesiny komórek z punktu 2.6 dodać FK506 (AG Scientific) do stężenia końcowego 20 nM. Kolbę umieścić w inkubatorze CO₂ w temperaturze 37°C na jedną godzinę.
2. Szybko rozmrozić alikwot EBV. Wyjąć kolbę z inkubatora i dodać EBV do komórek w rozcieńczeniu 1/10. Zazwyczaj takie rozcieńczenie zapewnia MOI na poziomie 50-100. Zamieszać zawartość kolby i ustawić ją pionowo w inkubatorze CO₂ w temperaturze 37°C.

Należy pamiętać, że krok 4, wykonywany w celu przewidzenia pomyślnego wyniku, jest krokiem opcjonalnym. Jeśli krok 4 ma zostać przeprowadzony, konieczne będzie inkubowanie dodatkowej kolby niezinfekowanych PBMC w stężeniu 2 x 10⁶ cells/ml jako kontroli.

4. Identyfikacja proliferującej populacji komórek (Krok opcjonalny)

1. Przygotować bufor FACS: PBS + 5% FBS. Przechowywać w temperaturze 4°C.
2. Przygotować następujące mieszaniny przeciwciał w objętości 50 μL każda do barwienia komórek w kroku 4.6. Rozcieńczenia przeciwciał należy wykonać w buforze FACS zawierającym 1mg/ml mysiego IgG (Sigma) w celu zahamowania niespecyficznego wiązania przeciwciał.
   1. barwienie pojedyncze przeciwciałem anty-CD23 sprzężonym z PE (rozcieńczenie 1/50)
   2. barwienie pojedyncze przeciwciałem anty-CD58 sprzężonym z FITC (rozcieńczenie 1/50)
   3. barwienie pojedyncze przeciwciałem anty-CD19 sprzężonym z PE-Cy5 (rozcieńczenie 1/50)
   4. barwienie potrójne dla CD23, CD58 i CD19 (każde w rozcieńczeniu 1/50)
   5. barwienie pojedyncze przeciwciałem kontrolnym izotypowym sprzężonym z PE, dopasowanym do CD23-PE (w tym samym stężeniu co przeciwciało anty-CD23)
   6. barwienie pojedyncze przeciwciałem kontrolnym izotypowym sprzężonym z FITC, dopasowanym do CD58-FITC (w tym samym stężeniu co przeciwciało anty-CD58)
   7. barwienie pojedyncze przeciwciałem kontrolnym izotypowym sprzężonym z PE-Cy5, dopasowanym do CD19-PE-Cy5 (w tym samym stężeniu co przeciwciało anty-CD19)
   8. barwienie potrójne wszystkimi trzema przeciwciałami kontrolnymi izotypowymi.
   Mieszaniny przechowywać tymczasowo w temperaturze 4°C w ciemności.
3. Trzeciego dnia po ekspozycji na EBV delikatnie zakręcić kolbą, aby uzyskać bardziej jednorodną zawiesinę komórek. Przenieść 2ml z kolby do probówki Eppendorf o pojemności 2ml. Wirować probówkę w mikrowirówce z prędkością 3000 rpm w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.
4. Odssać nadsącz i resuspender komórki w buforze FACS w stężeniu od 5 x 10⁶ do 1 x 10⁷komórek/ml.
5. Odmierzyć osiem alikwotów po 50μl do oddzielnych probówek Eppendorf lub na płytkę 96-dołkową z dnem w kształcie litery V. Wirować probówki lub płytkę z przyspieszeniem 1500 x g przez 3 minuty.
6. Usunąć nadsącz i wymieszać zawartość probówek/płytki na wstrząsarze typu vortex. Resuspender komórki w każdej probówce/dołku w 50 μL buforu FACS zawierającego odpowiednie rozcieńczenia przeciwciał przygotowane w punkcie 4.2.
7. Inkubować probówki/płytkę na lodzie w ciemności przez 30 minut. Wirować komórki z prędkością 3000 rpm przez 3 minuty, usunąć nadsącz i dodać 200 μL buforu FACS. Ponownie wirować komórki i usunąć nadsącz, aby zakończyć przemywanie. Powtórzyć procedurę przemywania jeszcze dwa razy.
8. Resuspender komórki w 200 μL buforu FACS i zebrać dane za pomocą cytometru przepływowego, rejestrując 20 000 zdarzeń/probówkę.
9. Przeanalizować dane za pomocą oprogramowania WinMDI (bezpłatne oprogramowanie do analizy danych FACS na komputerach PC). Wyznaczyć bramkę dla żywych komórek na podstawie profilu rozproszenia światła przedniego (FSC) i bocznego (SSC). Następnie wyznaczyć bramkę dla żywych komórek wykazujących ekspresję CD19⁺ (marker limfocytów B) po porównaniu z komórkami barwionymi przeciwciałem kontrolnym izotypowym dopasowanym do przeciwciała anty-CD19. Przedstawić żywe limfocyty B CD19⁺ na wykresie, gdzie na osi x znajduje się intensywność fluorescencji dla CD23, a na osi y intensywność fluorescencji dla CD58. Wyznaczyć komórki CD23⁺ i CD58⁺ poprzez porównanie z komórkami eksponowanymi na EBV i barwionymi dopasowanymi przeciwciałami kontrolnymi izotypowymi. Obecność komórek CD23^hiCD58⁺ w kulturze eksponowanej na EBV (Rycina 2C) zwiastuje udany wzrost komórek przekształconych wzrostowo zakażonych EBV. W przeciwieństwie do tego, komórki CD23^hiCD58⁺ nie pojawiają się, gdy komórki nie są eksponowane na EBV (Rycina 2A) lub są eksponowane na nieuniezależniający szczep EBV (Rycina 2B). Wykazano eksperymentalnie, że komórki CD23^hiCD58⁺ ulegają proliferacji, a następnie tworzą linie LCL (14).

5. Ekspansja i kriokonserwacja LCL

1. Wizualizacja komórek za pomocą mikroskopii świetlnej: Tydzień po infekcji EBV w mikroskopii świetlnej widoczne są skupiska komórek. Rycina 3 przedstawia przykład wczesnych skupisk mikroskopowych (Rycina 3B) w kolbie.
2. Wraz z upływem czasu skupiska mikroskopowe powiększają się, tak że w kolbie widoczne stają się makroskopowe grudki. Rycina 3C przedstawia większe skupiska komórek w ugruntowanych LCL w mikroskopii świetlnej.
3. Dokarmianie komórek: W 12. dniu należy podwoić objętość pożywki hodowlanej w kolbie hodowlanej. Następnie należy rozszerzyć hodowlę, zwiększając jej objętość 2-3 krotnie przy użyciu pełnego RPMI.
4. Okresowość dokarmiania komórek powinna być określona na podstawie tempa wzrostu komórek. Gdy pożywka hodowlana zmieni kolor na żółty, zazwyczaj nadszedł czas na jej wymianę zgodnie z powyższym opisem. Zazwyczaj dzieje się to raz w tygodniu. Jednak niektóre linie komórkowe mogą wymagać częstszego lub rzadszego dokarmiania. W ciągu kolejnych kilku tygodni należy rozszerzyć hodowlę do 75-100 ml.
5. Kriokonserwacja: Podczas zamrażania komórek należy je odwirować przy 600 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Należy usunąć nadsącz i zawiesić osad komórkowy w zimnym medium do zamrażania zawierającym 90% FBS i 10% dimetylosulfotlenku w stężeniu 1 × 10⁷ komórek/ml. Probówkę należy umieścić w ciekłym azocie.

6. Reprezentatywne wyniki:

Pomyślny wynik jest przewidywany przez obecność komórek CD23^hiCD58⁺. Około 2-3% żywych komórek w 3-4 dniu po ekspozycji na EBV powinno wykazywać taki profil (Rycina 2C). Inne subpopulacje komórek CD23⁺, CD23^-, CD58⁺ oraz CD58^- obserwowane po ekspozycji na EBV wykazują minimalną proliferację¹⁴. Komórki niezinfekowane (Rycina 2A) oraz komórki eksponowane na EBV pochodzący z linii HH514-16 (Rycina 2B), zawierającej nieunieśmiertelniający szczep EBV, nie wykazują obecności komórek CD23^hiCD58⁺.

Można również wizualizować komórki za pomocą mikroskopii świetlnej w celu monitorowania pomyślnego wyniku: jak wspomniano wcześniej, w ciągu tygodnia po infekcji EBV, w kolbie widoczne są pod mikroskopem świetlnym małe skupiska komórek (Rycina 3B). Wraz z upływem czasu i rozwojem komórek w LCL, mikroskopowe skupiska stają się większe (Rycina 3C), tak że grudki są widoczne makroskopowo w kolbie.

Rycina 1. Procedura generowania i kriokonserwacji limfoblastoidalnych linii komórkowych. Krew obwodową wiruje się przez gradient Ficoll. PBMC obecne w warstwie leukocytarnej utworzonego gradientu poddaje się działaniu FK506, a następnie dodaje EBV. Komórki eksponowane na EBV hoduje się w temperaturze 37°C w obecności 5% CO₂ w celu utworzenia, a następnie namnożenia LCL do późniejszej kriokonserwacji.

Rycina 2. Identyfikacja subpopulacji limfocytów B, w których oczekiwano proliferacji po ekspozycji na EBV. Niezakażone PBMC (A) lub PBMC eksponowane na EBV pochodzące z komórek HH514-16 (B) lub z komórek B95-8 (C) w obecności FK506 zebrano w 3. dniu. Komórki barwiono przeciwciałami koniugowanymi z fluorochromami skierowanymi przeciwko CD19, CD23 i CD58. Po wyznaczeniu bramki dla żywych komórek, badano ekspresję CD23 i CD58 w niezakażonych (A) oraz eksponowanych na EBV (B i C) limfocytach B CD19⁺. Przedstawiono subpopulację limfocytów B wykazujących ekspresję CD58 i wysoki poziom CD23 (CD23^hiCD58⁺), zaobserwowaną wyłącznie w komórkach eksponowanych na EBV zdolny do transformacji (pochodzący z komórek B95-8).

Rysunek 3. Wizualizacja skupisk komórek w komórkach zainfekowanych EBV. PBMC poddano działaniu FK506 i zainfekowano EBV. Komórki niezinfekowane (A) oraz eksponowane na EBV (B) zbadano tydzień po infekcji za pomocą mikroskopii fazowo-kontrastowej (powiększenie 10X). Na zdjęciu C przedstawiono pięciotygodniową linię komórkową limfoblastoidalną.

Dyskusja

Metoda opisana w niniejszej pracy pozwala na generowanie LCL z krwi obwodowej dawcy z zachowaniem krótkiego czasu immortalizacji i krio konserwacji. Dzięki zastosowaniu FK506, leku immunosupresyjnego dla limfocytów T, oraz wysokich mian wirusa zakaźnego, jesteśmy w stanie promować proliferację zakażonych EBV limfocytów B z mononuklearnych komórek krwi obwodowej. Interwencje te zwiększają wydajność opisanej metody, co skutkuje szybką ekspansją komórek do późniejszych eksperymentów.

Tradycyjnie transformację wzrostową monitorowano poprzez wizualizację skupisk komórek za pomocą mikroskopii świetlnej około tydzień po ekspozycji na EBV^{6, 15}. Jednak tworzenie skupisk komórek nie jest specyficznym wskaźnikiem transformacji wzrostowej indukowanej przez EBV. Wcześniej wykazaliśmy możliwość spójnej identyfikacji proliferującej populacji komórek za pomocą cytometrii przepływowej¹⁴, co zapewnia dokładną i specyficzną metodę określenia pomyślnego wyniku już trzy dni po ekspozycji limfocytów B na EBV.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Amfoterycyna B	Fisher Scientific	BP 928-250
Dimetylosulfotlenek	Sigma-Aldrich	D 2650
Płodowa surowica bydlęca, inaktywowana ciepłem	Sigma-Aldrich	F 4135
Medium do separacji limfocytów Ficoll Hypaque	Mediatech, Inc.	25-072
FK506	A.G Scientific	F 1030
IgG z surowicy mysiej	Sigma-Aldrich	I 8765
Przeciwciało mysie anty-ludzkie CD23 sprzężone z PE	BD Biosciences	555711
Myszia izotypowa IgG1 sprzężona z PE	BD Biosciences	554680
Przeciwciało mysie anty-ludzkie CD58 sprzężone z FITC	Pierce, Thermo Scientific	MA1-82159
Myszia izotypowa IgG1 sprzężona z FITC	BD Biosciences	550616
Przeciwciało mysie anty-ludzkie CD19 sprzężone z PE-Cy5	BD Biosciences	555414
Myszia izotypowa IgG1 sprzężona z PE-Cy5	Dako	X 0955
Penicylina/Streptomycyna	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
Medium RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R 8758
Octan tetradekanoyloforbolu (TPA)	Calbiochem	407952
Bufor FACS (1X roztwór soli fosforanowej PBS + 5% płodowej surowicy bydlęcej)