Artykuł metodologiczny

Profilowanie białek powierzchniowych komórek raka jelita grubego z wykorzystaniem mikrotablicy przeciwciał i multipleksowania fluorescencyjnego

13.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3322

⸱

25 września 2011

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Molecular Bioscience, University of Sydney, 2Department of Surgery, Royal Prince Alfred Hospital, 3Department of Anatomical Pathology, Department of Anatomical Pathology, 4Department of Medicine, Concord Repatriation General Hospital

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Opisaliśmy procedurę dysagregacji raka jelita grubego (CRC) w celu uzyskania żywotnych pojedynczych komórek, które następnie są wychwytywane na dostosowane mikrotablice przeciwciał rozpoznających antygeny powierzchniowe (mikrotablica DotScan CRC). Subpopulacje komórek związanych z mikrotablicą mogą być profilowane za pomocą multipleksowania fluorescencyjnego z wykorzystaniem przeciwciał monoklonalnych znakowanych barwnikami fluorescencyjnymi.

Streszczenie

Obecne rokowania i klasyfikacja CRC opierają się na systemach stopniowania, które integrują wyniki histopatologiczne i kliniczne. Jednak w większości przypadków CRC dysfunkcja komórek jest wynikiem licznych mutacji modyfikujących ekspresję białek oraz modyfikacje potranslacyjne1.

Liczne antygeny powierzchniowe komórek, w tym antygeny klastrów różnicowania (CD), zostały zidentyfikowane jako potencjalne biomarkery prognostyczne lub przerzutowe w CRC. Antygeny te stanowią idealne biomarkery, ponieważ ich ekspresja często zmienia się wraz z progresją nowotworu lub w wyniku oddziaływań z innymi typami komórek, takimi jak limfocyty naciekające guz (TILs) oraz makrofagi związane z nowotworem (TAMs).

Zastosowanie immunohistochemii (IHC) w subklasyfikacji i prognozowaniu nowotworów jest dobrze ugruntowane w przypadku niektórych typów guzów2,3. Jednakże żaden pojedynczy „marker” nie wykazał większego znaczenia prognostycznego niż stopień zaawansowania kliniczno-patologicznego i nie zyskał powszechnej akceptacji w rutynowym raportowaniu patomorfologicznym wszystkich przypadków CRC.

Nowsze podejście do stratyfikacji prognostycznej fenotypów choroby opiera się na profilach białek powierzchniowych z wykorzystaniem wielu „markerów”. Choć profilowanie ekspresji w guzach przy użyciu technik proteomicznych, takich jak iTRAQ, jest potężnym narzędziem do odkrywania biomarkerów4, nie jest ono optymalne do rutynowego stosowania w laboratoriach diagnostycznych i nie pozwala na rozróżnienie różnych typów komórek w populacji mieszanej. Ponadto do profilowania oczyszczonych glikoprotein błony plazmatycznej tymi metodami wymagane są duże ilości tkanki nowotworowej.

W niniejszym filmie opisaliśmy prostą metodę profilowania proteomu powierzchniowego żywych komórek z rozaggregated próbek CRC z wykorzystaniem macierzy przeciwciał DotScan CRC. Macierz zawierająca 122 przeciwciała składa się ze standardowego regionu 82 przeciwciał rozpoznających szereg markerów leukocytów specyficznych dla linii komórkowych, cząsteczek adhezyjnych, receptorów oraz markerów stanu zapalnego i odpowiedzi immunologicznej5, wraz z regionem satelitarnym służącym do wykrywania 40 potencjalnych markerów prognostycznych dla CRC. Komórki są wychwytywane wyłącznie przez przeciwciała, dla których wykazują ekspresję odpowiadającego im antygenu. Gęstość komórek na kropce, określana za pomocą skanowania optycznego, odzwierciedla proporcję komórek wykazujących ekspresję danego antygenu, poziom ekspresji antygenu oraz powinowactwo przeciwciała6.

W przypadku tkanki CRC lub prawidłowej błony śluzowej jelita skany optyczne odzwierciedlają immunofenotyp mieszanych populacji komórek. Następnie można zastosować multipleksowanie fluorescencyjne w celu profilowania wybranych podpopulacji komórek zainteresowania uchwyconych na macierzy. Na przykład Alexa 647-anty-cząsteczka adhezyjna komórek nabłonkowych (EpCAM; CD326) jest pan-nabłonkowym antygenem różnicowania, który został użyty do wykrywania komórek CRC, a także komórek nabłonkowych prawidłowej błony śluzowej jelita, natomiast fikoerytryna-anty-CD3 posłużyła do wykrywania naciekających limfocytów T7. Mikromacierze DotScan CRC powinny stanowić prototyp diagnostycznej alternatywy dla systemu oceny stopnia zaawansowania CRC opartego na anatomii.

Protokół

Schemat izolacji komórek i macierzy kropelkowej przeciwciał; dezagregacja guza, analiza antygenów komórkowych.
Rycina 1. Schemat postępowania przy przygotowywaniu zawiesiny żywych komórek z próbki chirurgicznej CRC.

1. Dysagregacja próbki klinicznej

Wszystkie próbki zostały pobrane w Royal Prince Alfred Hospital (Camperdown, NSW, Australia) oraz Concord Repatriation Hospital (Concord West, NSW, Australia) za świadomą zgodą pacjentów zgodnie z protokołem nr X08-164.

  1. Pobrać świeże preparaty raka jelita grubego (CRC) lub gruczolaków, a także normalną błonę śluzową jelita z miejsca oddalonego o co najmniej 10 cm od guza. Próbki przechowywać w zrównoważonym roztworze soli Hanksa pH 7.3 (HBSS) w temperaturze 4°C przez maksymalnie 12 h po resekcji.
  2. Przestrzegać zasad bezpieczeństwa dotyczących ludzkich patogenów; wszystkie próbki kliniczne przetwarzać w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II. Posiekać próbki na kostki o boku 2 mm w szalce Petriego, używając dwóch ostrzy skalpela.
  3. Inkubować tkankę nowotworową i prawidłową w oddzielnych probówkach Eppendorf przez 60 min w temperaturze 37°C z okresowym delikatnym mieszaniem, w równej objętości pożywki RPMI 1640 zawierającej 2% (v/v) kolagenazy typu 4 (Worthington, Lakewood, NJ, USA) oraz 0.1% (w/v) doksyrybonukleazy I z trzustki bydlęcej (DNAse I; Sigma-Aldrich).
  4. Przecisnąć częściowo strawioną tkankę przez drobne sito z drucianej siatki, używając tłoka z strzykawki 10 mL; wypłukać komórki za pomocą HBSS.
  5. Przepuścić otrzymaną zawiesinę komórkową przez filtry Filcon 200 μm i 50 μm (BD Biosciences) w celu usunięcia agregatów komórkowych. W tej serii filtracji usuwana jest większość DNA, śluzu oraz agregatów komórkowych.
  6. Wirować zawiesiny komórkowe przy 400 x g w temperaturze 20° przez 5 min.
  7. Resuspendować osady komórkowe w inaktywowanym termicznie FCS zawierającym 10% dimetylosulfoksyd (DMSO), zamrozić powoli w krioprobówkach i przechowywać w temperaturze -80°. Proces zamrażania przyczynia się do redukcji zawartości śluzu w próbce oraz lizy krwinek czerwonych.

2. Przygotowanie próbek do wychwytu komórek

  1. Szybko rozmrozić próbki w łaźni wodnej o temperaturze 37° i resuspender komórki w 10 mL HBSS w celu wypłukania DMSO.
  2. Odwirować zawiesiny komórkowe przy 410 x g w temperaturze 20° przez 5 min.
  3. Odlać nadsącz i resuspender osad komórkowy w 500 μL HBSS.
  4. Traktować próbkę 0,1% (w/v) DNAse I przez 20 min w temperaturze pokojowej.
  5. Wymieszać 10 μL każdej zawiesiny komórkowej z równą objętością błękitu trypanu i nanieść 10 μL mieszaniny do hemocytometru. Używając mikroskopu świetlnego z powiększeniem 100-krotnym, policzyć żywe komórki, które pozostają bezbarwne dzięki wykluczeniu błękitu trypanu, podczas gdy martwe komórki pochłaniają barwnik. Do wychwytu komórek na mikroarray wymagane jest minimum 4 x 106 żywych komórek.
  6. Po traktowaniu DNAse resuspender zawiesinę komórkową w 10 mL HBSS i odwirować przy 410 x g w temperaturze 20° przez 5 min.
  7. Odlać nadsącz i resuspender osady komórkowe w RPMI 1640 do końcowej objętości 200 μL.

3. Wychwytywanie komórek na mikrotablicy przeciwciał

  1. Nawilżyć macierz przeciwciał DotScan, zanurzając sekcję nitrocelulozową w roztworze soli fosforanowej (PBS) przez około 20 s. Ostrożnie wytrzeć szklane krawędzie macierzy złożonymi chusteczkami Kimwipes, unikając dotykania sekcji nitrocelulozowej.
  2. Dodać wodę do tacki inkubacyjnej macierzy, aby stworzyć komorę wilgotną. Umieścić macierz w komorze i nanieść pipetą zawiesinę komórek w pożywce RPMI 1640 na wilgotną sekcję nitrocelulozową. Nanieść krople w każdym rogu nitrocelulozy, aby zapewnić równomierne rozprzestrzenienie komórek.
  3. Inkubować macierze w temperaturze 37°C przez 1 h. Inkubacja pozwala komórkom osiąść i wejść w kontakt z przeciwciałami na macierzy. Komórki wykazujące ekspresję antygenów powierzchniowych odpowiadających przeciwciałom, na których osiadły, zostaną uchwycone.
  4. Po inkubacji delikatnie i pionowo zanurzyć macierze w trzech korytkach zawierających co najmniej 15 mL PBS, aby wypłukać niezwiązane komórki (20 s na każde płukanie).
  5. Przygotować 3,7% (w/v) formaldehyd w PBS w celu utrwalenia komórek i przeciwciał poprzez sieciowanie. Delikatnie nanieść pipetą około 1 mL, aby pokryć sekcję nitrocelulozową macierzy. Inkubować przez 20 min w temperaturze pokojowej.
  6. Następnie zanurzyć macierze w trzech kolejnych porcjach PBS (15 mL; po 30 s każda), aby wypłukać nadmiar formaldehydu.
  7. Wytrzeć krawędzie i tył szkiełka przedmiotowego chusteczkami Kimwipes i zeskanować macierz za pomocą skanera DotScan, gdy sekcja nitrocelulozowa jest jeszcze wilgotna. Skan optyczny pozwala uzyskać wzór ekspresji antygenów mieszanej populacji komórek, np. komórek CRC, leukocytów i innych komórek zrębu guza.

4. Fluorescencyjne multipleksowanie

  1. Wyjmij macierz mikroarray ze skanera i nanieś 200 μL buforu blokującego (2% w/v BSA, 2% inaktywowanego ciepłem ludzkiego serum AB, PBS, pH 7.3). Inkubuj w tacy do mikroarray w temperaturze pokojowej przez 20 min.
  2. Przygotuj roztwór do multipleksowania w probówce Eppendorf owiniętej folią aluminiową: 20 μL Phycoerythrin-anti-CD3 (Beckman Coulter, Gladesville, NSW, Australia, #IM12824; końcowe rozcieńczenie 1/7.5), 10 μL Alexa Fluor 647-anti-EpCAM (Biolegend, San Diego, CA, USA; rozcieńczenie 1/15), 2 μL inaktywowanego ciepłem ludzkiego serum AB (Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australia) oraz 118 μL buforu blokującego.
  3. Odlej nadmiar buforu blokującego z mikroarray i nanieś pipetą roztwór do multipleksowania na sekcję z nitrocelulozy, rozprowadzając go równomiernie. Inkubuj przez 30 min w ciemności w temperaturze pokojowej.
  4. Zanurz mikroarray pionowo w trzech korytkach zawierających po 15 ml świeżego PBS (po 30 s w każdym).
  5. Pozostaw mikroarray do wyschnięcia w ciemności i przechowuj w temperaturze 4°C w pudełku na szkiełka. Mikroarray można przechowywać w ciemności do 3 miesięcy bez utraty fluorescencji.
  6. Zeskanuj wysuszony mikroarray za pomocą skanera Typhoon FLA 9000 (GE Healthcare, Rydalmere, NSW, Australia) z rozdzielczością ustawioną na 50 (laser 532 nm, filtr emisji 580 BP30 dla PE; laser 633 nm i filtr emisji 670 BP30 dla Alexa 647). Mikroarray są skanowane stroną z nitrocelulozy skierowaną w dół na szklanej tacy skanera.
  7. Zapisz obrazy fluorescencyjne jako pliki TIFF, a następnie w programie Photoshop ustaw rozmiar obrazu na 17 x 25 cm i rozdzielczość na 72 pixels/cm. Zaimportuj obraz do oprogramowania analitycznego DotScan w celu analizy intensywności plamek.
  8. Program DotReader rejestruje cyfrowy obraz wzoru wiązania plamek i kwantyfikuje gęstość wiązania komórek na każdej plamce przeciwciała w 8-bitowej skali szarości (1-256 U). Sporadyczne nieswoiste wiązanie kontroli izotypowej odjęto od wartości wiązania dla przeciwciał o odpowiadających im izotypach immunoglobulin. Intensywności fluorescencji plamek dla każdego mikroarray znormalizowano względem najjaśniejszej plamki ustawionej na 100% intensywności. Siła sygnału/plamki została zapisana w pliku .xml (dane surowe) lub przedstawiona w formie wykresu słupkowego w pliku .pdf (raport końcowy).
  9. Mapy ciepła (heatmaps) i klasteryzacja hierarchiczna mikroarray zostały wykonane przy użyciu programu MultiExperiment Viewer (MeV) wersja 4.4 z pakietu TM4 Microarray Software Suite (http://www.tm4.org/mev.html). Klasteryzację hierarchiczną przeprowadzono na danych skorygowanych o tło za pomocą programu MeV z analizą pełnego wiązania (complete linkage analysis). Jako miarę podobieństwa zastosowano odległość euklidesową. Do wyznaczenia istotności statystycznej wyników użyto dwustronnego testu t Studenta przy założeniu równości wariancji.

5. Reprezentatywne wyniki:

Wyniki z mikroarray DotScan powinny wykazywać spójne wzorce wiązania komórek pomiędzy powtórzonymi macierzami. Silne wiązanie kropek wyrównawczych (CD44/CD29) umożliwia nałożenie siatki na obszar macierzy. Rysunek 2 przedstawia przykład optymalnego wychwytu komórek i multipleksowania. Rysunek 3 przedstawia niektóre typowe problemy napotykane podczas wychwytu komórek oraz możliwe rozwiązania.

Wyniki wiązania komórek w mikrotablicy można ilościowo określić poprzez pomiar intensywności plamek wyrażonej w skali szarości od 1 do 256. Rysunek 4 przedstawia dane numeryczne z 58 chirurgicznych próbek CRC, zabarwionych przeciwciałem EpCAM-Alexa 647, w formie mapy ciepła z klastrowaniem hierarchicznym. Mimo ograniczonej liczby próbek, CRC w tym samym stadium mają tendencję do grupowania się w jednej grupie.

Schemat mikrotablicy białkowej z wizualizacją danych: a) układ, b) wyniki w skali szarości, c) fluorescencja czerwona, d) fluorescencja niebieska.
Rysunek 2. Wzór wiązania komórek guza raka jelita grubego z próbki klinicznej (Australian Clinic-Pathological Staging, stopień ACP B1). (a) Legenda przeciwciał DotScan wskazująca lokalizację przeciwciał dla lewej połowy zdublowanej mikrotablicy (obrysowanej). Górna sekcja zawiera oryginalne 82 przeciwciała z mikrotablicy DotScan do białaczek. Dodatkowo dodano 40 przeciwciał odpowiadających specyficznym antygenom powierzchniowym, których nadekspresja została wykazana w literaturze, tworząc „satelitarną” mikrotablicę CRC. Dolna sekcja składa się z przeciwciał kontrolnych izotypowych. (b) Obraz optyczny komórek CRC wiążących się z mikrotablicą. (c) Obraz fluorescencyjny CD showing T-cells. (d) Obraz fluorescencyjny EpCAM wskazujący komórki CRC.

Równowaga statyczna; ΣFx=0; analiza wzoru kropek; eksperyment; wizualizacja rozkładu sił.
Rycina 3. Przykłady nieprawidłowych wyników DotScan oraz możliwe rozwiązania. (a) Słabe wiązanie komórek; rozwiązanie: upewnij się, że na matrycy znajduje się co najmniej 4x106 żywych komórek (b) Wiązanie kontroli izotypowej i nieswoiste wiązanie komórek; rozwiązanie: przed inkubacją na mikrotablicy dodaj do próbki inaktywowaną ciepłem ludzkie surowicę AB, aby zminimalizować wiązanie kontroli izotypowej. Sporadycznie w próbkach CRC występuje niewielka ilość nieswoistego wiązania komórek do nitrocelulozy, co nie wpływa znacząco na wyniki. (c) Wysychanie nitrocelulozy podczas inkubacji; rozwiązanie: upewnij się, że próbka pokrywa całą sekcję nitrocelulozy, a mikrotablica jest inkubowana na płaskiej powierzchni. (d) Artefakty wysokiego tła; rozwiązanie: upewnij się, że mikrotablica została dokładnie wypłukana po inkubacji.

Analiza raka jelita grubego; skany optyczne i multipleksowe; markery EpCAM, CD; porównawcze wykresy słupkowe.
Rysunek 4. Wykresy słupkowe wygenerowane przez oprogramowanie analityczne DotScan przedstawiające gęstość wiązania komórek w skali szarości od 1 do 256. Liczby na osi odnoszą się do antygenów CD. Pozostałe skróty to: TCR, receptor limfocytów T; κ, λ, lekkie łańcuchy immunoglobulin; sIg, immunoglobuliny powierzchniowe; DCC, białko DCC (deleted in colorectal cancer); EGFR, receptor epidermalnego czynnika wzrostu; FAP, białko aktywacji fibroblastów; HLA-A,B,C i HLA-DR, odpowiednio ludzkie antygeny leukocytarne A, B, C oraz DR; MICA, białko MICA (MHC class I chain-related protein A); MMP-14, metalopeptydaza macierzy 14; PIGR, receptor polimerycznej immunoglobulin; TSP-1, trombospondyna-1; Mabthera, humanizowane przeciwciało anty-CD20. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym filmie demonstrujemy, w jaki sposób macierz przeciwciał DotScan może być wykorzystana w prosty, półilościowy sposób do badania profili antygenów powierzchniowych dla populacji komórek z tkanki CRC.

Uzyskanie żywotnej zawiesiny pojedynczych komórek z tkanki jest kluczowe dla sukcesu eksperymentu, ponieważ procesy zależne od energii (np. tworzenie czapek antygenowych i/lub pseudopodiów) wydają się być niezbędne do trwałego wiązania całych komórek z kropkami przeciwciał podczas inkubacji, p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy pracownikom Laboratoriów Patologii Anatomicznej w szpitalach Royal Prince Alfred i Concord Repatriation za pobranie świeżych próbek CRC oraz prawidłowej błony śluzowej jelit. Praca była finansowana z grantu Programu Translacyjnego Cancer Institute New South Wales.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zrównoważony roztwór soli Hanksa’Sigma-AldrichH6136-10X1LBuforowany 25 mM Hepes (Sigma #H3375)
Biologiczna komora bezpieczna klasy II AirpureWestinghouse1687-2340/612
Skalpele chirurgiczneLivingstone090609Opakowanie po 100 szt.
RPMI 1640 z 2 mM HepesSigma-AldrichR4130-10X1L
Kolagenaza typu 4Worthington Biochemical4188
Deoksiryb nukleaza 1Sigma-AldrichDN25-1G
Strzykawka Terumo (10 mL)Terumo Medical Corp.SS+10LPudełko po 100 szt.
Filtr Filcon (200 μm)BD Biosciences340615
Filtr Filcon (50 μm)Filtr Filcon (50 µm)Filtr Filcon (50 µm) Filtr Filcon (50 µm) 340603
Płodowa surowica cielęcaGIBCO, by Life Technologies10099-141
Wirówka 5810 REppendorf7017
DimetylosulfotlenekSigma-AldrichD2650
Błękit trypanuSigma-AldrichT8154
Hemocytometr Technocolor NeubarHirschmannbrak danych
Mikroskop świetlnyNikon InstrumentsNikon TMS
Probówki kriogeniczne CyrovialGreiner Bio-One121278
Kontener do mrożenia kriogenicznegoNalge Nunc international5100-0001
Zestaw do mikroarray przeciwciał DotScanMedsaicbrak danych
Kuweta do płukania mikroarray DotScanMedsaicbrak danych
KimWipesKimberly-Clark Corporation4103
Formaldehyd 37%Sigma-AldrichF1635-500ML
DotReaderTMMedsaicbrak danych
Seryjna albumina wołowaSigma-AldrichA9418-10G
Inaktywowana ciepłem surowica AB 2%Invitrogen34005100
CD3 sprzężone z fiko–erytrynąBeckman Coulter Inc.ET386
EpCAM sprzężone z AlexaFluor647BioLegend324212
Typhoon FLA 9000GE Healthcare28-9558-08laser 532 nm, filtr emisyjny 580 BP30 dla PE; laser 633 nm i filtr emisyjny 670 BP30 dla Alexa647
MultiExperiment Viewer v4.4TM4 Microarray Software SuiteOprogramowanie o otwartym – źródle (Ref 11)

Bibliografia

  1. Steinert, R., Buschmann, T., vander Linden, M., Fels, L. M., Lippert, H., Reymond, M. A. The role of proteomics in the diagnosis and outcome prediction in colorectal cancer. Technol. Cancer. Res. Treat. 1, 297(2002).
  2. Eifel, P., Axelson, J. A., Costa, J., Crowley, J., Curran, W. J., Deshler, A., Fulton, S., Hendricks, C. B., Kemeny, M., Kornblith, A. B., Louis, T. A., Markman, M., Mayer, R., Roter, D. National Institutes of Health Consensus Development Conference Statement: adjuvant therapy for breast cancer. J. Natl. Canc. Inst. 93, 979(2001).
  3. Swerdlow, S. H., Campo, E., Harris, H. L., Jaffe, E. S., Pileri, S. A., Stein, H., Thiele, J., Vardiman, J. W. WHO classification of tumour of haematopoietic and lymphoid tissues. IARC WHO Classification of Tumours. 2, Fourth, (2008).
  4. Xiao, G. G., Recker, R. R., Deng, H. W. Recent advances in proteomics and cancer biomarker discovery. Clin. Med. Oncol. , (2008).
  5. Belov, L., Mulligan, S. P., Barber, N., Woolfson, A., Scott, M., Stoner, K., Chrisp, J. S., Sewell, W. A., Bradstock, K. F., Bandall, L., Pascovici, D. S., Thomas, M., Erber, W., Huang, P., et al. Analysis of human leukaemias and lymphomas using extensive immunophenotypes from an antibody microarray. Br. J. Haematol. 135, 184(2006).
  6. Belov, L., Huang, P., Barber, N., Mulligan, S. P., Christopherson, R. I. Identification of repertories of surface antigens on leukemias using an antibody microarray. Proteomics. 3, 2147(2003).
  7. Zhou, J., Belov, L., Huang, P. Y., Shin, J., Solomon, M. J., Chapuis, P. H., Bokey, L., Chan, C., Clarke, C., Clarke, S. J., Christopherson, R. I. Surface antigen profiling of colorectal cancer using antibody microarrays with fluorescence multiplexing. J. Immunol. Methods. 355 (1-2), 40-51 (2010).
  8. Ellmark, P., Belov, L., Huang, P., Lee, C. S., Solomon, M. J., Morgan, D. K., Christopherson, R. I. Multiplex detection of surface molecules on colorectal cancers. Proteomics. 6, 1791(2006).
  9. Pearson, J. P., Allen, A., Hutton, D. A. Rheology of mucin. Methods Mol. Biol. 125, 99(2000).
  10. Yang, Y. H., Dudoit, S., Luu, P., Lin, D. M., Peng, V., Ngai, J., Speed, T. P. Normalization for cDNA microarray data: a robust composite method addressing single and multiple slide systematic variation. Nucleic Acids Res. 30, 15(2002).
  11. Al Saeed,, et al. TMA: A free, open-source system for microarray data management and analysis. BioTechniques. 34, 374-378 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing
Posted by JoVE Editors on 7/03/2015. Citeable Link.

The author's email has been corrected in the publication of Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing. There was an error with the author, Jerry Zhou's, email. The author's email has been updated to:

j.zhou@uws.edu.au

from:

jzho7551@mail.usyd.edu.au

Tagi

Profilowanie powierzchni kom rekantygeny powierzchnioweantygeny CDwychwytywanie kom rekskanowanie fluorescencyjnetrawienie tkanekywe kom rki

Powiązane artykuły