Wyprowadzanie wzbogaconych kultur oligodendrocytów i kokultur mielinizujących oligodendrocyty/neurony z postporodowych tkanek myszy

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje metody uzyskiwania wzbogaconych populacji mysich komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC) w hodowli podstawowej, które różnicują się w celu wytworzenia dojrzałych oligodendrocytów (OL). Ponadto w raporcie opisano techniki wytwarzania mysich kokultur mielinizacyjnych poprzez wysiewanie mysich OPC na łożu neurytowym neuronów zwojowych korzenia grzbietowego myszy (DRGN).

Streszczenie

Identyfikacja mechanizmów molekularnych leżących u podstaw rozwoju OL jest nie tylko kluczowa dla pogłębienia naszej wiedzy na temat biologii, ale ma również implikacje dla zrozumienia patogenezy chorób demielinizacyjnych, takich jak stwardnienie rozsiane (MS). Rozwój komórkowy jest powszechnie badany za pomocą pierwotnych modeli hodowli komórkowych. Pierwotna hodowla komórkowa ułatwia ocenę danego typu komórek poprzez zapewnienie kontrolowanego środowiska, wolnego od zmiennych zewnętrznych, które są obecne in vivo. Podczas gdy kultury OL pochodzące od szczurów dostarczyły ogromnego wglądu w biologię OL, podobne wysiłki zmierzające do ustanowienia kultur OL od myszy napotkały poważne przeszkody. Opracowanie metod hodowli mysich pierwotnych OL jest konieczne, aby można było wykorzystać dostępne transgeniczne linie myszy.

Opisano wiele metod ekstrakcji OPC z tkanek gryzoni, począwszy od wyprowadzania neurosfery, różnicowego oczyszczania adhezji i oczyszczania immunologicznego ^1-3. Podczas gdy wiele metod zapewnia skuteczność, większość z nich wymaga długiego czasu hodowli i/lub kosztownego sprzętu/odczynników. Aby temu zapobiec, należy oczyścić OPC z tkanki mysiej za pomocą adaptacji metody pierwotnie opisanej przez McCarthy'ego i Preferowany jest de Vellis ². Metoda ta polega na fizycznym oddzieleniu OPC od mieszanej kultury glejowej pochodzącej z kory noworodków gryzoni. Rezultatem jest oczyszczona populacja OPC, którą można zróżnicować w kulturę wzbogaconą w OL. Takie podejście jest atrakcyjne ze względu na stosunkowo krótki czas hodowli i niepotrzebne zapotrzebowanie na czynniki wzrostu lub przeciwciała immunopanujące.

O ile badanie mechanizmów rozwoju OL w oczyszczonej kulturze jest pouczające, o tyle nie dostarcza najbardziej fizjologicznie istotnego środowiska do oceny powstawania osłonki mielinowej. Wspólna hodowla OL z neuronami dałaby wgląd w molekularne podstawy regulujące mielinizację aksonów za pośrednictwem OL. W wielu badaniach nad współkulturą OL/neuronów, neurony zwojowe korzenia grzbietowego (DRGN) okazały się być typem neuronów z wyboru. Idealnie nadają się do kohodowli z OL ze względu na łatwość ekstrakcji, minimalną ilość komórek zanieczyszczających i tworzenie gęstych pokładów neurytów. Chociaż badania z użyciem ksenokultur mielinizacyjnych szczurów/myszy opublikowano ^4-6, nie opisano metody wyprowadzania takich kokultur mielinizujących OL / DRGN z pourodzeniowej tkanki myszy. Poniżej przedstawiamy szczegółowe metody, jak skutecznie produkować takie kultury, wraz z przykładami oczekiwanych rezultatów. Metody te są przydatne w rozwiązywaniu problemów związanych z rozwojem/funkcją mielinizacyjną OL i są użytecznymi narzędziami w dziedzinie neuronauki.

Protokół

Oświadczenie etyczne

Myszy wykorzystane w tej pracy były utrzymywane zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami (CCAC). Zgoda etyczna na przeprowadzone eksperymenty została uzyskana od Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu w Ottawie w ramach protokołu numer OGH-119.

1. Disekcja – kora mózgu noworodka myszy w celu izolacji OPC

1. Uśmierć myszy P0-P2 zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
2. Wypreparuj mózg i umieść go w szalce Petri zawierającej lodowate MEM (bez antybiotyków).
3. Przenieś szalkę pod mikroskop stereoskopowy.
4. Używając skalpela, przy mózgu skierowanym stroną grzbietową do góry, wykonaj płytkie nacięcie strzałkowe wzdłuż najbardziej przyśrodkowej krawędzi każdej kory (Ryc. 1a). Nacięcie to powinno przejść jedynie przez warstwę opon mózgowych, aby ułatwić ich usunięcie.
5. Za pomocą pęsety o cienkich końcówkach odwarstw opony mózgowe w kierunku bocznym. Przy zachowaniu ostrożności warstwa ta może zostać usunięta w jednym kawałku. Podczas tego kroku usuń opłaty węchowe.
6. Przy mózgu skierowanym stroną brzuszna do góry, wykonaj głębokie nacięcie strzałkowe w miejscu, gdzie kora łączy się z obszarem brzusznym przedmózowia (Ryc. 1b).
7. Przy mózgu skierowanym stroną grzbietową do góry, oddziel korę od śródmózgowia, podważając tkankę w kierunku od przyśrodkowym do bocznego (Ryc. 1c, c'). Na tym etapie usuń wszelkie pozostałości opon mózgowych.
8. Podziel każdą korę na około 4 części i delikatnie przenieś do probówki stożkowej 15 mL zawierającej 350 μL MEM na mózg jednej myszy. Przechowuj probówkę na lodzie do czasu przetworzenia wszystkich myszy.
9. Powtórz kroki 1.1-1.8 dla pozostałych myszy.

2. Dysocjacja kory mózgowia noworodków i utrzymanie mieszanych kultur glejowych

Uwaga: Podczas wszystkich poniższych etapów należy unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza do zawiesiny komórkowej.

1. Probiórkę stożkową 15 mL zawierającą świeżo wypreparowane mózgi umieść w łaźni wodnej o temperaturze 37°C na 3 min.
2. Przenieś mózgi do sterylnego dygestorium do hodowli tkankowych.
3. Delikatnie przepuść poszatkowaną korę przez końcówkę pipety P1000, aby uzyskać mniejsze fragmenty. Zaprzestań pipetowania, gdy nie będzie już fragmentów mózgu wystarczająco dużych, aby zakłócały płynny przepływ zawiesiny przez końcówkę pipety.
4. Do probówki stożkowej dodaj 75 μL roztworu papainy OPC na każdy mózg. Roztwór papainy OPC musi zostać wstępnie podgrzany do 37°C przez 20 min przed użyciem.
5. Inkubuj w łaźni wodnej o temperaturze 37°C przez 20 min. Przybliżone co 2 minuty delikatnie odwróć probówkę, aby zapobiec agregacji tkanki. W tym czasie do każdej kolby T25 pokrytej poli-L-lizyną (PLL) (1 mg/mL) dodaj 5 mL mieszanej pożywki do hodowli glejowej (jedna kolba na mózg myszy) i umieść w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37°C przy 8.5% CO₂.
6. Po 20 min przenieś zawiesinę tkankową z powrotem do sterylnego dygestorium i dodaj do probówki 2 mL mieszanej pożywki do hodowli glejowej na każdy mózg. Pozostaw na 10 min w temperaturze pokojowej, aby umożliwić inaktywację roztworu papainy OPC.
7. Rozdziel zawiesinę tkankową do plastikowych probówek 5 mL. Liczba probówek powinna odpowiadać liczbie wypreparowanych mózgów, co daje około 2,5 mL na probówkę.
8. Używając sterylnej, wypalanej szklanej pipety Pasteura, delikatnie homogenizuj tkankę w każdej probówce. Homogenizuj powoli na początku, a następnie stopniowo zwiększaj prędkość w miarę dysocjacji fragmentów. Homogenizuj około 10-15 razy, jednak liczba ta może się różnić w zależności od skuteczności trawienia.

Uwaga: Niedostateczna tryturacja spowoduje słabą dysocjację tkanki, natomiast nadmierna tryturacja negatywnie wpłynie na żywotność komórek. Ważne jest, aby nie wprowadzać pęcherzyków powietrza do roztworu, ponieważ znacząco obniży to żywotność komórek.

9. Gdy w zawiesinie nie będzie już widocznych grudek tkanki, przenieś ją do probówki stożkowej 50 mL zawierającej 4 mL mieszanej pożywki do hodowli glejowej na jeden mózg (t.j. 4 mózgi = 16 mL mieszanej pożywki do hodowli glejowej).
10. Delikatnie odwróć probówkę stożkową 50 mL i powtórz czynność dla pozostałych probówek 5 mL.
11. Rozdziel połączoną zawiesinę komórkową do probówek stożkowych 15 mL (około 6,5 mL na probówkę 15 mL). Liczba probówek 15 mL powinna odpowiadać liczbie wypreparowanych mózgów.
12. Wirowarkuj probówki przy 1200 rpm (~300 g) przez 5 min.
13. Ostrożnie odessij supernatant i dodaj 1 mL ciepłej mieszanej pożywki do hodowli glejowej do każdej probówki stożkowej 15 mL.
14. Powoli resuspenduj osad za pomocą końcówki pipety P1000, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Przenieś zawiesinę komórkową z każdej probówki do uprzednio równoważonej kolby T25 powleczonej PLL, tak aby całkowita objętość pożywki wyniosła 6 mL.
15. Umieść kolby w inkubatorze do hodowli tkanek na 3-4 godziny, aby umożliwić przytwierdzenie się komórek do podłoża PLL. Przeprowadź pełną wymianę pożywki, odpipetowując obecną pożywkę i dodając do kolb 6 mL świeżej mieszanej pożywki do hodowli glejowej. Krok ten usuwa większość zanieczyszczeń powstałych podczas trituracji i zwiększa żywotność hodowli. Jeśli wymagane są kokultury OL/DRGN, zapoznaj się z sekcją 3 niniejszego protokołu.
16. Po 3 dniach hodowli przeprowadź wymianę 2/3 pożywki, usuwając 4 mL pożywki i zastępując ją 4 mL świeżej mieszanej pożywki do hodowli glejowej. Na tym etapie na dnie kolb powinna zacząć tworzyć się monowarstwa astrocytów.
17. W 6. dniu przeprowadź ponowną wymianę 2/3 pożywki i uzupełnij pożywkę w kolbach insuliną do stężenia końcowego 5 μg/mL. Na tym etapie monowarstwa astrocytów powinna być wyraźnie widoczna, a na niej powinny proliferować OPC.

3. Izolacja DRGN

Uwaga: Aby przygotować kokultury OL/DRGN, komórki DRGN należy wyhodować dzień po utworzeniu mieszanej kultury glejowej. Oba typy kultur są hodowane niezależnie, a następnie łączone po 9–10 dniach.

1. Uśmiercić mysz w wieku P5-P10 zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
2. Wyjąć kręgosłup i przenieść go do czystej szalki Petriego.
3. Usunąć z kręgosłupa jak najwięcej mięśni i kości (Ryc. 1d, d'), aby ułatwić wypreparowanie zwojów korzeni grzbietowych (DRGs).
4. Przenieść oczyszczony kręgosłup do nowej szalki Petriego stroną brzuszna do góry. Używając nożyczek chirurgicznych, przeciąć wzdłużnie kolumnę kręgosłupa, zaczynając od strony kaudalnej.
5. Za pomocą dwóch par pęset delikatnie rozchylić kolumnę kręgosłupa, aby odsłonić rdzeń kręgowy.
6. DRGs znajdują się pod rdzeniem kręgowym i bocznie od niego. Używając pęsety z cienkimi końcówkami, delikatnie usunąć DRGs, unikając uszkodzenia zwojów (Ryc. 1e).
7. Przenieść wypreparowane DRGs do schłodzonego do temperatury lodowej buforu solnego Hanksa (HBSS, bez antybiotyków) w nowej szalce Petriego. Należy dążyć do wyekstrahowania 40 DRGs z jednej myszy (Ryc. 1f).
8. Po wyjęciu DRGs należy odciąć zbyt długie korzenie (Ryc. 1g, g'), aby zminimalizować wprowadzenie komórek zanieczyszczających do hodowli (komórek glejowych, fibroblastów).
9. Przenieść DRGs do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mL zawierającej 500 μL schłodzonego HBSS.
10. Wirować przy 1200 rpm (~300 g) przez 5 min w temperaturze 4°C w celu osadzenia DRGs.
11. Przenieść probówki wirówkowe do sterylnego dygestorium do hodowli tkanek i usunąć HBSS z probówek.
12. Dodać 500 μL uprzednio ogrzanego (20 min w 37°C) roztworu papainy dla DRG i inkubować probówki w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C przez 10 min. Odwracać probówki co 2 min, aby zapobiec agregacji tkanki.
13. Powtórzyć krok 3.10.
14. Usunąć roztwór papainy i dodać 500 μL uprzednio ogrzanego (20 min w 37°C) roztworu kolagenazy A. Inkubować w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C przez 10 min, odwracając co 2 min.
15. Powtórzyć krok 3.10.
16. Usunąć supernatant i dodać 1 mL pożywki DRGN. Kilkukrotnie odwrócić probówkę.
17. Powtórzyć krok 3.10.
18. Powtórzyć krok 3.16.
19. Pokryć sterylną, polerowaną ogniowo szklaną pipetę Pasteura albuminą surowiczą bydlęcą (BSA), pipetując kilka razy roztwór 0,25% BSA w HBSS. Powlekanie roztworem BSA zapobiegnie przywieraniu DRGs do ścianek szklanej pipety.
20. Triturować DRGs za pomocą pipety pokrytej BSA – początkowo delikatnie, a następnie z coraz większą intensywnością, gdy agregaty zaczną się rozpadać. Triturować około 10-15 razy, przy czym liczba ta zależy od stopnia trawienia i liczby DRGs w probówce.
21. Po uzyskaniu dysocjacji przelać zawiesinę przez filtr 50 μm do sterylnej szalki Petriego zawierającej 7 mL pożywki DRGN. Filtracja usunie znaczną część zanieczyszczeń z zawiesiny komórkowej, choć krok ten nie jest krytyczny.
22. Inkubować szalkę Petriego w atmosferze 8,5% CO₂ przez około 1,25 godziny.
23. W czasie tej inkubacji pokryć kilka szkiełek podstawkowych o średnicy 12 mm LN2 (10 μg/mL w PBS) w naczyniu 24-dołkowym.
24. Po zakończeniu inkubacji obejrzeć szalkę Petriego pod mikroskopem w świetle przechodzącym. DRGN są identyfikowane jako komórki o dużym ciele, ciemne w kontraście fazowym. Delikatnie zakręcić zawartością szalki Petriego, aby oderwać wszelkie przywarte DRGN.

Uwaga: Wiele zanieczyszczających komórek silnie przylgnie do szalki Petriego, co pozwoli na wzbogacenie zawiesiny komórkowej w DRGNs.

25. Przenieść zawiesinę komórkową do stożkowatej probówki o pojemności 15 mL. Delikatnie wypłukać płytkę 4 mL medium DRGN, aby zebrać pozostałe DRGN. Przenieść dodatkowe 4 mL do probówki stożkowatej.
26. Wirować przez 5 min przy 1200 rpm (~300 g).
27. Odssać supernatant i resuspender osad w 500 μL świeżego medium DRGN.
28. Obliczyć liczbę uzyskanych DRGN za pomocą hemocytometru. Należy pamiętać, aby liczyć wyłącznie DRGN, a nie inne typy komórek. DRGN można zidentyfikować po ich dużych, sferycznych ciałach komórkowych.
29. Zasiać 30 000–50 000 DRGN na każde szkiełko zakrywkowe powlekane LN2 w 1 mL medium DRGN i inkubować przez noc w inkubatorze do hodowli tkankowej w temperaturze 37°C przy 8,5% CO₂.
30. Następnego ranka przeprowadzić całkowitą wymianę medium, zastępując medium DRGN medium OL (bez CNTF) o końcowym stężeniu 1% Pen/Strep i 10 μM FuDR.
31. W dniu 3. i 5. przeprowadzić wymianę 3/4 objętości medium, stosując to samo medium co w kroku 3.30.
32. W dniu 7. przeprowadzić całkowitą wymianę medium na medium OL (bez CNTF, Pen/Strep, FuDR).
33. W dniu 9. DRGN powinny utworzyć rozbudowaną sieć neurytów i są teraz gotowe do kokultury z OPC.

4. Oczyszczanie OPC z mieszanych kultur glejowych w celu stworzenia kultur wzbogaconych w OL lub kokultur OL/DRGN

1. Dziewiątego dnia hodowli mieszanej gleju przenieść kolby na wytrząsarkę orbitalną w inkubatorze do hodowli tkankowych z 5% CO₂. Kolby umieścić na pustych kolbach T25, aby zapobiec niekorzystnemu wpływowi ciepła generowanego przez wytrząsarkę na mieszane hodowle gleju. Pozostawić hodowle w nowym inkubatorze przez 1 godzinę w celu wyrównania temperatury.
2. Po wyrównaniu temperatury w kolbach wytrząsać je z prędkością 50 rpm przez 45 min. Celem tego etapu jest usunięcie z monowarstwy słabo przylegających komórek zanieczyszczających.
3. Przenieść komórki do komory z laminarnym przepływem powietrza i usunąć z kolb całe medium. Zastąpić je 4 mL świeżego medium do hodowli mieszanej gleju uzupełnionego o 5 μg/mL insuliny.
4. Umieścić kolby z powrotem na wytrząsarce i pozostawić przez około 3 godziny w celu wyrównania temperatury.
5. Po wyrównaniu temperatury w kolbach mocno przymocować je do wytrząsarki orbitalnej i wytrząsać przez około 16 godzin z prędkością 220 rpm (przez noc).
6. Następnego dnia rano, jeśli OL mają być hodowane bez DRGN (tzn. hodowla wzbogacona w OL), pokryć kilka sterylnych szkiełek nakrywek 12 mm LN2 (10 μg/mL w PBS) przez 1 godzinę. Przenieść szkiełka do płytek 24-dołkowych, przemyć PBS, a następnie przemyć medium do OL. Do każdego dołka dodać 1 mL medium do OL i inkubować w 8,5% CO₂ do wyrównania parametrów.
7. Przygotować 10 cm szalki do hodowli tkankowych w 5% CO₂ przez 30 min. Jedna szalka będzie potrzebna na każde 2 kolby. Zostaną one wykorzystane do wzbogacania zawiesiny OPC poprzez różnicową adhezję.
8. Po upływie 30-minutowego okresu wyrównywania przenieść medium z wytrząśniętych kolb do szalek. Każda szalka powinna otrzymać medium z 2 kolb, co daje około 8 mL zawiesiny komórkowej na szalkę 10 cm.
9. Inkubować szalki w 5% CO₂ przez 30 min, delikatnie poruszając nimi w 15. minucie. To potrząśnięcie pomoże zapobiec przyleganiu OPC do szalki 10 cm.
10. Po zakończeniu inkubacji zbadać szalki w świetle przechodzącym. OPC identyfikuje się jako małe skupiska komórek, zazwyczaj od 3 do 5 komórek, choć czasem tworzą one duże agregaty przypominające neurosfery. Wiele komórek spoza linii OL powinno być silnie przyległych do dna płytki. Delikatnie zakręcić płytkami, aby odczepić słabo przylegające OPC, a następnie przenieść zawiesinę komórkową z każdej płytki do 15 mL probówki stożkowej.
11. Wirować z prędkością 1200 rpm (~300 g) przez 5 min.
12. Resuspendować osad w 1 mL medium do OL za pomocą końcówki do pipety P1000, a następnie ponownie resuspendować końcówką do pipety P200.
13. Policzyć komórki za pomocą komory licznikowej (hemocytometru).
14. W przypadku hodowli wzbogaconych w OL, wysiać od 25 000 do 50 000 OPC na każde szkiełko nakrywkowe 12 mm pokryte LN2 w końcowej objętości 1 mL medium do OL.
15. W przypadku kokultur OL/DRGN, przeprowadzić całkowitą wymianę medium do OL (bez CNTF) w przypadku DRGN z sekcji [3], a następnie delikatnie dodać 50 000 komórek z zawiesiny wzbogaconej w OPC. Należy uważać, aby nie uszkodzić sieci neurytów DRGN podczas dodawania OPC.
16. Umieścić hodowle w inkubatorze w temperaturze 37°C przy 8,5% CO₂ i nie wyjmować ich aż do momentu fiksacji. Mysie OPC są wrażliwe na zmiany pH, a wyjęcie z inkubatora zmieni pH medium do OL. Warto również zauważyć, że dodanie dH₂O do pustych dołków otaczających hodowle komórkowe zapobiegnie odparowywaniu medium hodowlanego, minimalizując tym samym wahania stężeń substancji rozpuszczonych w medium do OL. Zapewni to bardziej stabilne środowisko dla OPC.

5. Przetwarzanie kultur do mikroskopii immunofluorescencyjnej

1. Utrwalone hodowle za pomocą 100% metanolu w temperaturze -20°C przez 10 min lub 3% paraformaldehydu w temperaturze pokojowej przez 15 min.
2. Przeprowadzić permeabilizację szkiełek podstawkowych za pomocą 0,1% Triton-X-100 przez 10 min, przemyć solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS) i blokować przez 1 godzinę w 10% surowicy koziej.
3. Inkubować szkiełka podstawkowe z przeciwciałami pierwszorzędowymi rozcieńczonymi w roztworze blokującym przez noc w temperaturze 4°C.
4. Przemyć szkiełka podstawkowe 3 razy PBS i inkubować z przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z Alexa-fluor (Invitrogen) rozcieńczonymi w roztworze blokującym przez 45 min.
5. Przeprowadzić kontrastowanie z użyciem 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) i kilkukrotnie przemyć szkiełka podstawkowe PBS.
6. Zamontować szkiełka podstawkowe w medium montażowym do fluorescencji DAKO.
7. Przeanalizować preparaty za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. W niniejszym protokole preparaty analizowano za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego Zeiss Axiovert 200M lub konfokalnego mikroskopu skaningowego z laserem Zeiss LSM 510 META.

6. Ekstrakcja białek całkowitych z kultur wzbogaconych w OL

1. Wyjąć hodowle w płytkach 24-dołkowych z inkubatora i chłodzić na lodzie przez 3 min.
2. Ostrożnie usunąć pożywkę i dodać do każdego dołka 10-20 μL buforu lizującego (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 0,5% dejksykolanu sodu, 1% Triton-X-100, z dodatkiem 0,1% pepstatyny, aprotininy, PMSF, leupeptyny i ortowanadanu sodu) (Sugeruje się użycie minimum 8 dołków na próbkę).
3. Zeskrobać zawartość dołków za pomocą końcówki do pipety P1000 o szerokim otworze i przenieść lizat do probówki do wirowania o pojemności 1,5 mL.
4. Przepuścić lizat przez strzykawkę z igłą o rozmiarze 30½ G około 15 razy, a następnie chłodzić na lodzie przez 30 min.
5. Wirować probówki z prędkością 14 000 rpm (~20 000 g) przez 15 min w temperaturze 4°C.
6. Przenieść nadpływ do nowych probówek do wirowania i przechowywać w temperaturze -80°C.

7. Analiza SDS-PAGE białek z hodowli wzbogaconej w OL

1. Rozdziel 30 μg białka na próbkę w buforze redukującym za pomocą SDS-PAGE na standardowych 12% żelach poliakrylamidowych.
2. Przenieś białka z żeli na membrany PVDF metodą półsuchego transferu.
3. Blokuj membrany przez 1 godzinę w 5% roztworze mleka odtłuszczonego w proszku w TBST (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20).
4. Inkubuj membrany z przeciwciałami pierwszorzędowymi rozcieńczonymi w roztworze blokującym przez 1 godzinę.
5. Przemyj membrany 3 razy w TBST przez 10 min.
6. Inkubuj membrany z przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z HRP przez 45 min w roztworze blokującym.
7. Kilkukrotnie przemyj membrany w TBST, a następnie inkubuj z odczynnikiem do detekcji western blotting Amersham ECL Plus (GE Healthcare) przez 5 min.
8. Wykryj prążki białkowe przy użyciu standardowej naukowej folii rentgenowskiej.

8. Reprezentatywne wyniki:

W niniejszym protokole OPC są namnażane na monowarstwie astrocytów w obrębie mieszanej kultury glejowej. Mieszana kultura glejowa jest pochodną kory noworodka myszy w dniach P0-P2. W 1. dniu in vitro (DIV1) mieszana kultura glejowa zawiera komórki o zróżnicowanej morfologii, co jest widoczne w mikroskopii kontrastowej (Rys. 2a). W DIV3 na dnie kolby zaczyna tworzyć się monowarstwa astrocytów, a w DIV8 na powierzchni monowarstwy można wyraźnie zaobserwować OPC. W DIV9 proliferujące OPC osiągają gęstość wystarczającą do oczyszczenia poprzez całonocne wytrząsanie na orbitalnej wytrząsarce z dużą prędkością. Po zakończeniu procesu oczyszczania wynikiem jest populacja komórek wzbogacona w OPC. W DIV1 po oczyszczeniu OPC mają prostą morfologię i emitują niewiele wypustek (Rys. 2b). W DIV3 po oczyszczeniu komórki wytworzyły złożoną sieć wypustek, przypominającą niedojrzałe OL. W DIV6 po oczyszczeniu oczyszczone OL spłaszczyły się i wytworzyły listkowate struktury błonowe. Taki rozwój morfologiczny jest typowy dla dojrzewania OL in vitro.

Mikroskopia immunofluorescencyjna wskazuje, że oczyszczone komórki należą do linii OL (Rys. 3a). Wysiane OPC początkowo wykazują ekspresję proteoglikanu siarczanu chondroityny (NG2), a w ciągu trzech dni od wysiania przekształcają się w niedojrzałe OL dodatnie pod względem glikoproteiny związanej z mieliną (MAG) (Rys. 3b). W 6. dniu in vitro (DIV6) wiele komórek OL wykazuje ekspresję podstawowej białka mielinowej (MBP) i posiada typową morfologię dojrzałych OL. Procent komórek linii OL został ilościowo określony w różnych punktach czasowych, aby ustalić czystość kultur wzbogaconych w OL (Rys. 3c). W DIV1 po oczyszczaniu kultury składają się w 50±14% z OPC NG2^+ve, bez obecności OL MAG^+ve lub MBP^+ve. Wskazuje to, że oczyszczone komórki linii OL w momencie wysiewania znajdują się w stadium prekursorów, z pomijalną liczbą zróżnicowanych OL. W DIV3 wiele komórek OL zróżnicowało się w komórki MAG^+ve (24±5,9%), podczas gdy niektóre zachowują fenotyp prekursora i pozostają NG2+ (13±8,0%). W DIV3 niewielka proporcja komórek MAG^+ve (3,2 1,2%) wykazuje również ekspresję MBP. W DIV6 20±5,9% komórek OL jest MAG^+ve, podczas gdy 12±7,3% pozostaje jako OPC NG2^+ve. Dodatkowo w tym punkcie czasowym 21±9,3% komórek w kulturze to OL MBP^+ve. Analiza SDS-PAGE wykazuje stopniową ekspresję 2'3'-cyklicznej nukleotydowej 3'-fosfodiesterazy (CNP) oraz MBP w ciągu 6-dniowego okresu hodowli, co dodatkowo potwierdza zdolność OPC w kulturze do terminalnego różnicowania się w dojrzałe OL (Rys. 3d). Zbiorczo dane te potwierdzają, że metoda ta stanowi sposób wytwarzania systemu kultur wzbogaconych w OL, odpowiedniego do badania dojrzewania OL z OPC.

Niniejszy protokół opisuje również metody tworzenia kokultur OL/DRGN z wykorzystaniem wyłącznie mysich źródeł tkankowych. Jednak w celu uzyskania kokultury, DRGN muszą najpierw być hodowane osobno, aby wytworzyć odpowiednią sieć neurytów. Te ponatalne hodowle neuronów mysich są prowadzone przez 9 dni w pożywkach z niską zawartością surowicy z dodatkiem 10 μM FuDR, aby zapobiec proliferacji zanieczyszczających fibroblastów i komórek glejowych. W ciągu 9 dni in vitro izolowane DRGN tworzą gęste łoże neurytów (Ryc. 4a). Łoże neurytów to jest immunopozytywne w stosunku do markerów neuronalnych: neurofilamentu 200 (NF) oraz Tuj1 (Ryc. 4b). W tym momencie do łóżek neurytów można dodać oczyszczone OPC i hodować je przez kolejne 6 dni w celu wytworzenia mielinizujących kokultur.

W 6. dniu in vitro (DIV6) kokultury OL/DRGN można zaobserwować wiele MBP^+ve OL wśród NF^+ve neurytów DRGN (Ryc. 5a). Po dokładniejszej analizie stwierdzono, że OL nawiązują kontakt z licznymi neurytami DRGN, często otaczając je MBP^+ve błoną (Ryc. 5b,c).

Rycina 1. Obrazy z mikroskopu stereoskopowego przedstawiające poszczególne etapy izolacji kory mózgu i zwojów rdzeniowych (DRG) noworodka myszy. (a) Widok grzbietowy świeżo wyizolowanego mózgu noworodka myszy. Linie przerywane wskazują obszar, w którym należy wykonać nacięcia, aby ułatwić usunięcie warstwy opon mózgowych. (b) Widok brzuszny mózgu, linie przerywane wskazują obszar, w którym kora styka się z brzuszną częścią międzymózgowia. Wzdłuż linii przerywanych należy wykonać głębokie nacięcia, aby wspomóc izolację kory. (c-c') Przedstawienie wizualne sposobu oddzielania kory od pozostałej części mózgu. (d) Świeżo wyizolowany rdzeń kręgowy myszy P5-P10 przed usunięciem nadmiaru mięśni i kości (d'). (e) Lokalizacja zwojów DRG w obrębie kolumny kręgowej. (f) Przybliżona liczba zwojów DRG, które należy wyizolować z jednej myszy. (g) Zwój DRG z długimi korzonkami, które wymagają przycięcia przed trawieniem enzymatycznym. Linia przerywana wskazuje obszar, w którym należy przyciąć korzonki. (g') Zwój DRG po przycięciu korzonków.

Rycina 2. OPC są namnażane w mieszanej kulturze glejowej, oczyszczane, a następnie różnicowane w kulturę wzbogaconą w OL. (a) Obrazy w kontraście fazowym mieszanych kultur glejowych na różnych etapach rozwoju. W dniu DIV1 komórki mają kształt okrągły, z niewielką liczbą komórek spłaszczonych. Stratyfikacja mieszanej kultury glejowej rozpoczyna się w dniu DIV3, kiedy astrocyty tworzą jednolitą monowarstwę u podstawy kolby, na której proliferują OPC. W dniu DIV8 widocznych jest wiele OPC (strzałki) przylegających do powierzchni monowarstwy astrocytów. (b) Po oczyszczeniu z mieszanej kultury glejowej, OPC w dniu DIV1 wykształciły jedynie kilka wypustek. W dniu DIV3 komórki posiadają wiele wypustek, przypominając OL na etapie pośrednim. W dniu DIV6 spłaszczone OL (gwiazdka) wydają się wytwarzać błoniaste płaty (linia przerywana). Paski skali: 50 μm.

Rysunek 3. Charakterystyka kultury wzbogaconej w OL. (a) Obrazy konfokalne wyizolowanych OL na różnych etapach rozwoju. OPC^+ve NG2 wykazują prostą morfologię, podczas gdy OL^+ve MAG posiadają liczne rozgałęzione wypustki. OL^+ve MBP mają rozległe błonowe arkusze podobne do mieliny. Pasek skali, 50 μm. (b) Oczyszczone komórki linii OL powstają jako OPC i różnicują się w OL^+ve MAG oraz OL^+ve MBP w ciągu 6 DIV. W DIV1 wszystkie OPC są NG2^+ve, podczas gdy żadne nie są MAG^+ve ani MBP^+ve. W DIV3 widoczne są już OL^+ve MAG i nieliczne OL^+ve MBP. W DIV6 większość OL jest MAG i MBP^+ve, przy niewielkiej liczbie pozostałych OPC^+ve NG2. Pasek skali, 100 μm. (c) Wartości średnie ± SD procentu komórek linii OL na różnych etapach rozwoju w ciągu 6 DIV. W DIV1 wszystkie komórki linii OL są NG2^+ve, stanowiąc 50±14% całkowitej liczby komórek w kulturze. W DIV3 i DIV6 komórki linii OL stanowią odpowiednio 36±6,8% i 32±8,4% wszystkich komórek, składając się ze zmiennych proporcji OL^+ve NG2, OL^+ve MAG i OL^+ve MBP. (d) SDS-PAGE wykonane na białku pochodzącym z kultur wzbogaconych w OL, wykazujące stopniową ekspresję markerów OL: CNP i MBP w ciągu 6-dniowego okresu hodowli (DIV).

Rysunek 4. Charakterystyka kultury DRGN przed wysianiem OPC. (a) Obrazy w kontraście fazowym DRGN w okresie 9 DIV hodowli przed wysianiem OPC. DRGN powstają jako komórki o dużym ciele z niewielką liczbą wypustek, tworząc coraz bardziej złożoną sieć neurytów. Pasek skali, 100 μm. (b) Obrazy konfokalne kultur DRGN utrwalonych w DIV9 (przed wysianiem OPC) i zabarwionych na markery specyficzne dla neuronów Tuj1 i NF200. DRGN wytworzyły sieć neurytów, na której można wysiać OPC w celu utworzenia mielinizujących kokultur OL/DRGN. Pasek skali, 50 μm.

Rysunek 5. Współhodowla OL z DRGN skutkuje opłaszczaniem neurytów DRGN przez OL błoną MBP^+ve. (a) Montaż z czterech pól obrazu konfokalnego współhodowli OL/DRGN w 6. dniu in vitro (DIV6). Widoczne są liczne MBP^+ve OL oddziałujące z leżącym pod nimi podłożem neurytów DRGN. Pasek skali, 100 μm. (b) Powiększony widok konfokalny MBP^+ve OL opłaszczających wiele neurytów DRGN. Pasek skali, 50 μm. (c) Cyfrowe powiększenie obszaru zaznaczonego w (b), w którym neuryt DRGN jest opłaszczany przez błonę OL. Pasek skali, 25 μm.

Dyskusja

W niniejszym raporcie opisano metodę izolowania mysich OPC w celu różnicowania w kulturach wzbogaconych w OL lub kokulturach OL/DRGN. Podczas samodzielnej hodowli OPC różnicują się w MBP^+ve OL, wytwarzając błoniaste arkusze podobne do mieliny. Po dodaniu do złoża neurytów DRGN, neuryty DRGN otaczają je membraną MBP^+ve . Model ten jest korzystny dla badania złożonych podstaw rządzących powłoką aksonalną, w której pośredniczy OL.

Chociaż ma to wielką wartość, ustanowienie takich kultur jest technicznie trudne. W szczególności wymagające aspekty obejmują efektywne trawienie/dysocjację tkanek, utrzymanie zrównoważonego pH pożywek hodowlanych oraz zmiany pożywek DRGN. Ważne jest, aby wziąć pod uwagę, że długość trawienia, ilość trawionej tkanki i ilość rozcierania wpływa na skuteczność i końcowy wynik dysocjacji tkanek. Nie jest niczym niezwykłym, że doświadczeni badacze uzyskują niską wydajność komórkową z dysocjowanych tkanek układu nerwowego. Ponadto mysie OPC są zwykle wrażliwe na zmiany pH pożywki hodowlanej, szczególnie w warunkach zasadowych. Utrzymanie kultur na poziomie 8,5% CO₂ ma na celu zapobieżenie temu, ponieważ OPC wydają się lepiej tolerować lekko kwaśne warunki niż zasadowe. Jeśli chodzi o karmienie DRGN, zmiany pożywki muszą być wykonywane szybko, aby nie wysuszyć neuronów, jednak muszą być delikatne, aby nie zakłócić rozwijającego się łożyska neurytowego. Nagłe zmiany podłoża mogą spowodować przemieszczenie złoża neurytów z podłoża i prawdopodobnie spowodować jego całkowitą dysocjację od szkiełka nakrywkowego.

Potencjalne zalety tego modelowego systemu znacznie przyćmiewają jego wymagający technicznie charakter. Jedną z zalet tego systemu jest wykorzystanie myszy po urodzeniu do uzyskania hodowli komórkowych, co pozwala uniknąć konieczności poświęcania samic hodowlanych w celu pobrania tkanki embrionalnej. Kolejną zaletą jest brak wymogu stosowania czynników wzrostu (GF) do ekspansji OPC. Mieszane kultury glejowe zapewniają środowisko, które wspiera rozmnażanie OPC, prawdopodobnie ze względu na obecność czynników troficznych pochodzących z astrocytów. Inne metody, takie jak wyprowadzanie za pomocą neurosfer^7,8, opierają się na mitogennych właściwościach GF, takich jak podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF), naskórkowy czynnik wzrostu (EGF) i płytkopochodny czynnik wzrostu (PDGF) do ekspansji OPC. Podobnie, użycie myszy po urodzeniu (P5-10) do DRGN pozwala uniknąć konieczności uzupełniania pożywki hodowlanej o czynnik wzrostu nerwów (NGF), czynnik neurotroficzny wymagany do przeżycia in vitro zarodkowych DRGN ^{9, 10}. Interesujące jest unikanie stosowania NGF, ponieważ negatywnie wpływa on na zdolność mielinizacyjną OL podczas hodowli z DRGNs ⁴. Unikanie stosowania pożywek z dodatkiem GF przynosi również korzyści ekonomiczne, ponieważ odczynniki te stają się kosztowne, gdy są stosowane na dużą skalę.

Być może najważniejszą zaletą tego modelu hodowli jest jego pochodzenie z tkanek wyłącznie myszy, co daje możliwość uzyskania zarówno OPC, jak i DRGN z szerokiej gamy transgenicznych linii myszy. Pozwala to na badanie zarówno właściwości specyficznych dla DRGN, jak i/lub OPC, które rządzą mielinizacją. Będzie to szczególnie ważne dla wyjaśnienia interakcji receptor/ligand regulujących mielinizację aksonów za pośrednictwem OL. Ogólnie rzecz biorąc, technika ta ma ogromną wartość w odniesieniu do badań neurobiologicznych ze względu na jej zastosowania w zrozumieniu sygnałów molekularnych leżących u podstaw mielinizacji.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Multicell		319-005-CL
Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS)	Invitrogen	14170-112
Minimum Essential Podłoża (MEM)	GIBCO, firmy Life Technologies	12360-038
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	GIBCO, firmy Life Technologies	10091-148
Penicylina-Streptomycyna (Pen/Strep)	GIBCO, firmy Life Technologies	15140-122
GlutaMAX	Invitrogen	35050-061
Poli-l-lizyna	Sigma-Aldrich	P2636
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503
Ludzkie białko oczyszczone merozyną (LN2)	EMD Millipore	CC085
Rekombinowany szczurzy rzęskowy czynnik neurotroficzny (CNTF)	PeproTech Inc	450-50
L-tyroksyna	Biochemika	89430
Holotransferyna	Sigma-Aldrich	T0665
B27 suplement	GIBCO, firmy Life Technologies	0080085-SA
Insulina bydlęca	Sigma-Aldrich	I6634
3,3',5- Triiodo-L-tyronina	Sigma-Aldrich	I6634
Progesteron	Sigma-Aldrich	P8783
Putrescyna	Sigma-Aldrich	P7505
Selenin sodu	Sigma-Aldrich	S5261
5-fluoro-2'-deoksyurydyna (FuDR)	Sigma-Aldrich	F0503
Roztwór papainy	Worthington Biochemiczny
DNaseI	Roche Group	1010159001
L-cysteina	Sigma-Aldrich	C7352
24-dołkowe naczynia do hodowli tkankowych	Cellstar	662-160
Kolby do hodowli tkankowych T25 z nasadką odpowietrzającą	Corning	430639
10 cm Naczynia do hodowli tkankowych	Corning	430167
10 cm szalka Petriego	Fisher Scientific	0875713
Kolagenaza A	Grupa Roche	103578
CellTrics 50 μ Filtr m (opcjonalnie)	PARTEC	04-004-2327
Przeciwciało przeciwko zasadowemu białku mieliny (MBP)	AbD Serotec	MCA409S
Przeciwciało NG2	EMD Millipore	AB5320
Przeciwciało glikoproteiny związanej z mieliną (MAG)	EMD Millipore	MAB1567
2',3'-cykliczny nukleotyd 3'-fosfodiesterazy (CNP)	Covance	SMI-91R-100
Przeciwciało Actin pan Ab-5	Fitzgerald	10R-A106AX
Przeciwciało Neurofilament-200 (NF)	Sigma-Aldrich	N4142
Przeciwciało przeciwko łańcuchowi beta-3 tubuliny (Tuj1)	EMD Millipore	MAB5544
Alexa Fluor 488 kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L)	Invitrogen	A11008
Alexa Fluor 555 kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H+L) drugorzędowe	Invitrogen	A21422
Alexa Fluor 647 kozie przeciwciało antyszczurze (IgG) (H+L) drugorzędowe	Invitrogen	A21247
Kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H+L)-HRP sprzężone drugorzędowe	Bio-Rad	170-6516
Kozie przeciwciało anty-szczurze IgG (H+L)-HRP sprzężone przeciwciało drugorzędowe	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-2065
4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542
Przepisy medialne 100X Suplement OL* Składnik Ilość do dodania DMEM 100 mL BSA 1,02 g Progesteron 0,6 mg putrescyna 161 mg Selenin sodu 0,05 mg 3,3',5-Trijodo-L-tyronina 4 mg *Przechowywać przy -80 ° C w 250 μ L porcje OL media Składnik Ilość do dodania DMEM 23,75 mL 100X OL-Suplement 250 μ L Insulina bydlęca (od 1 mg/ml insuliny podstawowej) 125 μ L GlutaMAX 250 μ L Holotransferyna (z zapasów 33 mg/ml) 37,5 μ L B27 Suplement 500 μ L FBS 125 μ L CNTF (od 50 ng/μ L zapasy) 25 μ L Mieszane podłoża do hodowli glejowych (wykonane w DMEM) Składnik Końcowe stężenie FBS 10% Pen/Strep (0,33% od magazynu) 33 jednostek/ml Penicyliny i 33 μ g/mL Streptomycyny GlutaMAX 1% DRGN media (utworzone w DMEM) < strong>Składnik Końcowe stężenie FBS 10% Pen/Strep (1% z magazynu) 100 jednostek/ml Penicyliny i 100 μ g/ml Streptomycyny Przepisy na roztwór trawienny:
Składnik	Stężenie końcowe
roztwór papainy	1,54 mg/ml
L-cysteina	360 μ g/mL
DNaseI	60 μ g/mL

LS003126

DRG roztwór papainy (złożony z HBSS)

Składnik	Końcowe stężenie
papaina	1,54 mg/ml
L-cysteina	360 μ g/mL

DRG Roztwór kolagenazy A (złożony w HBSS)

Składnik	Stężenie końcowe
Kolagenaza A	4 mg/ml