Artykuł metodologiczny

Monitorowanie aktywności układu ubikwityna-proteasom w żywych komórkach przy użyciu białka reporterowego opartego na zielonym białku fluorescencyjnym (GFP) destabilizowanego przez degron (dgn)

16.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3327

⸱

10 listopada 2012

 ,  ,  ,  , 
1Molecular and Cell Biology, Institute for Biomedical Aging Research, 2Department of Gerontology and Geriatrics, Netherlands Consortium for Healthy Aging, Leiden University Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano metodę monitorowania aktywności ubikwityna-proteasomowej w żywych komórkach. Wygenerowano białka fuzyjne: destabilizowane degronem GFP- (GFP-dgn) oraz stabilne GFP-dgnFS, które następnie wprowadzono do komórek za pomocą lentiwirusem wektora ekspresyjnego. Technika ta pozwala na stworzenie stabilnej linii komórkowej wykazującej ekspresję GFP-dgn/GFP-dgnFS, w której aktywność ubikwityna-proteasomową można łatwo ocenić za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej lub cytometrii przepływowej.

Streszczenie

Proteasom jest głównym organellum wewnątrzkomórkowym zaangażowanym w proteolityczną degradację białek nieprawidłowych, błędnie sfałdowanych, uszkodzonych lub utlenionych 1, 2. Utrzymanie aktywności proteasomu jest powiązane z wieloma kluczowymi procesami komórkowymi, takimi jak odpowiedź komórki na stres 3, regulacja cyklu komórkowego i różnicowanie komórkowe 4 czy odpowiedź układu odpornościowego 5. Dysfunkcja systemu ubikwityna-proteasom została powiązana z rozwojem nowotworów i chorób neurodegeneracyjnych 4, 6. Ponadto spadek aktywności proteasomu stwierdzono jako cechę starzenia się komórek i starzenia organizmu 7, 8, 9, 10. W niniejszej pracy przedstawiamy metodę pomiaru aktywności systemu ubikwityna-proteasom w żywych komórkach przy użyciu białka fuzyjnego GFP-dgn. Aby umożliwić monitorowanie aktywności systemu ubikwityna-proteasom w żywych komórkach pierwotnych, komplementarne konstrukty DNA kodujące białko fuzyjne zielonego białka fluorescencyjnego (GFP)–dgn (GFP–dgn, niestabilne) oraz wariant z mutacją przesunięcia ramki odczytu (GFP–dgnFS, stabilne 11) są wprowadzane do lentiwirusowych wektorów ekspresyjnych. Preferujemy tę technikę nad tradycyjnymi metodami transfekcji, ponieważ gwarantuje ona bardzo wysoką wydajność transfekcji, niezależnie od typu komórek lub wieku dawcy. Różnicę między fluorescencją wykazywaną przez białko GFP–dgnFS (stabilne) a białko destabilizowane (GFP-dgn) w obecności lub w nieobecności inhibitora proteasomu można wykorzystać do oszacowania aktywności systemu ubikwityna-proteasom w danej linii komórkowej. Różnice te mogą być monitorowane za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej lub mierzone metodą cytometrii przepływowej.

Protokół

1. Konstrukcja plazmidu

  1. Zamówć odpowiednio zaprojektowane oligonukleotydy kodujące dgn (ACKNWFSSLSHFVIHL11) oraz dgnFS (HARTGSLACPTSSSICE) i liguj je do wektora pEGFP-C1, aby uzyskać białka fuzyjne GFP z dgn/dgnFS (Rysunek 1).
  2. Amplifikuj sekwencję kodującą GFP-dgn oraz GFP-dgnFS metodą PCR zgodnie z protokołem zestawu pENTR Directional TOPO Cloning Kit, a następnie kontynuuj procedurę z użyciem zestawu pLenti6/V5 Directional TOPO Cloning Kit (Rysunek 6).

2. Produkcja wirusa

  1. Dzień przed transfekcją (Dzień 1) wysiej komórki HEK 293FT do kolb T75 tak, aby w dniu transfekcji osiągnęły konfluencję na poziomie 90-95%.
  2. W dniu transfekcji rozcieńcz 36 μl odczynnika Lipofectamine 2000 w 1,5 ml DMEM bez surowicy i antybiotyków w probówce Falcon 15 ml. W drugiej probówce Falcon 15 ml rozcieńcz 3 μg plazmidu pLenti6/V5 zawierającego komplementarną konstrukcję DNA dla GFP-dgn lub GFP-dgnFS, 2,5 μg plazmidu pMD2.G kodującego białko otoczki oraz 7,5 μg wektora pomocniczego psPAX2 w 1,5 ml DMEM bez surowicy i antybiotyków. Po 5 min połącz rozcieńczone DNA z rozcieńczonym odczynnikiem Lipofectamine 2000.
  3. Inkubuj mieszaninę przez 20 min w temperaturze pokojowej, aby umożliwić utworzenie kompleksów DNA-lipofektamina.
  4. Usuń medium z komórek HEK 293FT, ostrożnie zastąp je 7 ml medium (bez antybiotyków), dodaj do kolby mieszaninę DNA-lipofektamina i delikatnie nią potrząśnij w celu wymieszania (Dzień 2). Inkubuj kolbę przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotną atmosferą i 5% CO2.
  5. Następnego dnia wymień medium (10 ml medium bez antybiotyków; Dzień 3).
  6. Po 48 h (Dzień 5) zbierz nadsącz, odwiruj go przy 300 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej, a następnie przefiltruj nadsącz przez filtr PVDF 0,45 μm.

Pożywka hodowlana - DMEM (HEK 293FT)

DMEM
10% FBS
0.1 mM MEM NEAA
6 mM L-glutamine
1 mM MEM piwczan sodu
1% Pen-Strep (opcjonalnie)
500 μg/ml Geneticin (opcjonalnie)

3. Koncentracja wirusa poprzez wytrącanie glikolem polietylenowym (PEG)

  1. Do czterech objętości supernatantu dodać jedną objętość roztworu glikolu polietylenowego (50 mM glikol polietylenowy, 41 mM NaCl, autoklawowany, pH =7,2; PEG) i inkubować przez 2 hr w temperaturze 4 °C. Co 20-30 min należy ostrożnie wymieszać zawiesinę poprzez odwracanie probówki.
  2. Odwirować przy 1500 x g przez 30 min w temperaturze 4 °C. Powinien pojawić się biały osad.
  3. Odssać supernatat i ponownie odwirować przy 1500 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Odssać pozostały roztwór PEG.
  4. Resuspendować osad w medium lub soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), pipetując ciecz w górę i w dół, a następnie intensywnie mieszać na wortexie przez 20 do 30 sekund. Jako wytyczną należy przyjąć 500 μl na jedną kolbę T75 i rozdzielić roztwór na aliquoty po 100 μl. Wirusy przechowywać w temperaturze -80 °C.

4. Oznaczanie miana wirusa

  1. Dzień przed transfekcją wysiać 5×104 komórek U2-OS do każdego dołka płytki 6-dołkowej.
  2. W dniu transfekcji usunąć medium hodowlane i zastąpić je 1 ml DMEM zawierającego 8 μg/ml polybrene (bromek heksadymetryny). Skoncentrowany nadpływ wirusa rozcieńczyć w stosunkach 1:10 oraz 1:100 i dodać po 1 μl każdego rozcieńczenia do osobnych dołków. W celu uzyskania wyższych stężeń wirusa, do pozostałych dołków dodać odpowiednio 1 μl, 5 μl i 10 μl skoncentrowanego nadpływu wirusa. Jeden dołek pozostawić jako kontrolę pozytywną.
  3. Następnego dnia wymienić medium na 2 ml DMEM.
  4. Selekcję rozpocząć kolejnego dnia. Do każdego dołka dodać Blastycydynę w stężeniu 10 μg/ml. Medium zawierające antybiotyk wymieniać co drugi dzień.
  5. fueling Około 6-7 dni po rozpoczęciu selekcji komórki nietransdukowane obumrą. Przed barwieniem przemyć komórki trzykrotnie PBS, a następnie pokryć je fioletem krystalicznym (10 mg/l fioletu krystalicznego w 20% etanolu) i inkubować przez 5-10 min w temperaturze pokojowej. Odessać fiolet krystaliczny (można go wykorzystać ponownie kilka razy), przemyć dołki dwukrotnie ddH2O i wysuszyć płytkę.
  6. Policzyć kolonie i pomnożyć wynik przez 1 000 oraz odpowiednie rozcieńczenie (Rysunek 7). Procedura ta pozwala na obliczenie jednostek transfekcyjnych (TU) wirusa / ml.

Pożywka hodowlana - DMEM (HFF-2/U2-OS)

DMEM
10% FBS
6mM L-glutamina
1% Pen-Strep

5. Transdukcja ludzkich diploidalnych fibroblastów (tę procedurę można zastosować do każdego typu komórek).

  1. Dzień przed transdukcją wysiać 5×104 ludzkich diploidalnych fibroblastów (HDFs) na płytki 6-dołkowe.
  2. Zastosować wielokrotność zakażenia (MOI) równą dwa oraz 8 μg/ml polybrene jako wzmacniacz transdukcji w całkowitej objętości jednego mililitra.
  3. Następnego dnia wymienić pożywkę.
  4. Gdy komórki osiągną 70-80% konfluencji, rozpocząć selekcję blastycydyną w stężeniu 10 μg/ml. Po zakończeniu selekcji (gdy nie giną już nieprzetransformowane komórki), można rozpocząć namnażanie komórek; są one wówczas gotowe do eksperymentów. Przewlekła selekcja blastycydyną pozwala na wygenerowanie stabilnej linii komórkowej nadprodukującej białka fuzyjne GFP-dgn lub GFP-dgnFS, gotowej do pomiaru aktywności proteasomów. Procedura ta gwarantuje bardzo wysoką wydajność transfekcji, niezależnie od typu komórek.

6. Pomiar metodą cytometrii przepływowej

  1. Dzień przed eksperymentem wysiać 1×105 komórek (wyrażających GFP-dgn lub GFP-dgnFS).
  2. Komórki kontrolne traktować inhibitorem proteasomów, np. 100 μg/ml LLnL, 3 h przed pomiarem.
  3. Przemyć dwukrotnie PBS i zebrać komórki, używając 0,5 ml trypsyny. Aby przerwać proces trypsynizacji, dodać 4,5 ml pożywki hodowlanej i przenieść komórki do probówki typu Falcon 15 ml.
  4. Odwirować komórki z prędkością 300 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej.
  5. Odssać pożywkę, resuspendować komórki w PBS i ponownie odwirować z prędkością 300 x g przez 5 min w 37 °C.
  6. Odssać PBS, resuspendować w 400 μl buforu FACS (10 mM Hepes, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2, pH=7,4) i przenieść komórki do probówek do FACS.
  7. Przechowywać komórki w lodzie i zmierzyć próbki za pomocą cytometrii przepływowej. Komórki nie powinny być przechowywane dłużej niż 30 min w 4 °C.

7. Reprezentatywne wyniki

Białko fuzyjne GFP-dgn zawiera sekwencję kierującą do proteasomu, w związku z czym białko to ulega natychmiastowej degradacji; odpowiada to spadkowi sygnału fluorescencji GFP. Mutant z przesunięciem ramki odczytu (GFP-dgnFS) posiada zmutowaną wersję tej sekwencji i nie jest degradowany przez proteasom, co prowadzi do wyższej fluorescencji zielonej. Z tych powodów młode komórki HDF o spodziewanie wysokiej aktywności proteasomu, po transdukcji GFP-dgn, wykazują niski sygnał fluorescencji (6% komórek pozytywnych) zarówno w pomiarze cytometrycznym, jak i w epifluorescencji (Rycina 2A i B, Rycina 3). Te same HDFy po transdukcji GFP-dgnFS wykazują 39,7% komórek pozytywnych. Traktowanie komórek inhibitorem proteasomów LLnL (N-acetylo-L-leucylo-L-leucylo-L-norleucynalem) zwiększyło sygnał do maksymalnie 62,9% zarówno w komórkach GFP-dgn, jak i GFP-dgnFS (Rysunek 2A i B).

Aby ocenić możliwy spadek aktywności proteasomów w próbkach skóry ludzkiej osób starszych, fibroblasty skórne wyizolowane od dawców młodych, w średnim wieku i starszych zainfekowano GFP-dgn oraz GFP-dgnFS, zgodnie z opisaną powyżej procedurą, a następnie hodowano do uzyskania tej samej liczby pasaży przed analizą metodą cytometrii przepływowej. W eksperymentach tych zaobserwowano wyraźny wzrost sygnału GFP między osobami młodymi (11,2±0,88% komórek GFP-dodatnich) a dawcami w średnim wieku (20,4±2,27% komórek GFP-dodatnich, P=0,003), co wskazuje na spadek aktywności proteasomów w próbkach pobranych od dawców starszych7 (Rysunek 4). W fibroblastach wyizolowanych od osób najstarszych nie zaobserwowano dalszego spadku aktywności proteasomów (Rysunek 4). Intensywność fluorescencji dla GFP-dgnFS wynosiła we wszystkich przypadkach ~90% (dane niepokażane), co wskazuje na wysoką wydajność transfekcji w trzech różnych grupach wiekowych.

Schemat sekwencji genetycznej GFP; kodowanie białka; analiza mutacji DNA; ilustracja edycji genów.
Rysunek 1. Sekwencje GFP-dgn i GFP-dgnFS. Przedstawiono koniec 3' GFP (kolor zielony), wielomiejscowy klonujący wektor pEGFP-CL1 (kolor szary) oraz sekwencję dgn/dgnFS (kolor czerwony).

Analiza fluorescencji GFP, wykres słupkowy i histogramy cytometrii przepływowej, z uwzględnieniem wpływu inhibitora proteasomów.
Rysunek 2. Analiza cytometryczna GFP-dgn i GFP-dgnFS w ludzkich diploidowych fibroblastach. A. Młode ludzkie fibroblasty skóry napletka (HFF-2) zainfekowano wektorami lentiwirusowymi niosącymi gen białka fluorescencyjnego (GFP)–dgn lub konstrukt GFP–dgnFS (przesunięcie ramki odczytu), zgodnie z oznaczeniami, a następnie przeanalizowano fluorescencję GFP za pomocą cytometrii przepływowej (FACS Canto II, Becton Dickinson). Tam, gdzie wskazano, komórki poddano również 3-godzinnej inkubacji z inhibitorem proteasomów N-acetylo-L-leucylo-L-leucylo-L-norleucynaldem (LLnL). W jako kontrolę wykorzystano komórki niezainfekowane. Doświadczenia przeprowadzono w trzech powtórzeniach. B. Dane są reprezentatywne dla trzech niezależnych eksperymentów. Liczby odzwierciedlają ilość komórek pozytywnych pod kątem GFP. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Porównanie ekspresji GFP w komórkach; obrazy mikroskopowe pokazujące różnice w intensywności fluorescencji.
Rysunek 3. Analiza mikroskopowa fluorescencyjna komórek HFF-2 GFP-dgn i GFP-dgnFS. Młode komórki HFF-2 poddano zabiegom zgodnie z opisem na Rysunku 2. W 9. dniu po infekcji komórki wizualizowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i fazokontrastowej.

Wykres słupkowy fluorescencji GFP porównujący odsetek komórek dodatnich w grupach osób młodych, w średnim wieku i starszych.
Rycina 4. Zmiany w aktywności proteasomów podczas starzenia się ludzkiej skóry. Fibroblasty z napletka ludzkiego pochodzące od dziewięciu różnych dawców w zaznaczonych grupach wiekowych poddano minimalnej ekspansji, a następnie zainfekowano konstruktami lentiwirusowymi kodującymi GFP–dgn. W 9. dniu po infekcji komórki poddano analizie metodą cytometrii przepłyewej. Dane uzyskano z trzech próbek na grupę wiekową, wykonanych w duplikacie (± SE).

Schemat konstrukcji plazmidu i produkcji wirusa, transfekcja komórek, analiza cytometrii przepływowej.
Rysunek 5. Podejście eksperymentalne. Syntetyczne oligonukleotydy dla dgn i dgnFS są klonowane do wektora pEGFP-C1, a następnie z wykorzystaniem komórek HEK 293FT produkowane są wirusy dla każdej konstrukcji. Wyznaczany jest miano wirusów. Komórki są transdukowane wirusem i namnażane. Po zastosowaniu odpowiedniejy obróbki komórki są analizowane pod kątem sygnału fluorescencji za pomocą cytometrii przepływowej.

Mapa plazmidu wektora lentiwirusowego GFP-degron; edycja genów; schemat; komponenty ekspresji genów wirusowych.
Rysunek 6. Mapa pLenti GFP-dgn. Przedstawiono mapę wektora pLenti6/V5-DEST zawierającą sekwencję GFP-dgn. Skróty: PCMV (promotor CMV), GFP-dgn (sekwencja GFP-dgn), PSV40 (wczesny promotor SV40), EM7 (promotor EM7), Blasticidin (gen oporności na blastycydynę), ΔU3/3'LTR (3'LTR z usuniętym regionem U3), SV40 pA (sygnał poliadenylacji SV40), Ampicillin (gen oporności na ampicylinę), pUC ori (replikon pUC), PRSV/5'LTR (hybrydowy promotor RSV/5'LTR), Ψ (sygnał pakowania HIV-1 Ψ), RRE (element odpowiedzi Rev HIV-1).

eksperyment z hodowlą komórkową, wyniki testu kolonigennego, analiza hamowania wzrostu, różne rozcieńczenia, płytka 6-dołkowa
Rycina 7. Płytka do miareczkowania U2-OS. Komórki U2-OS wysiano na płytkę 6-dołkową i transfekowano różnymi stężeniami wirusa (rozcieńczenia 1/100 i 1/10, 1, 5 i 10 μl skoncentrowanego nadsączu wirusowego). Jeden dołek posłużył jako kontrola nietransfekowana (NT). Po 6-7 dniach komórki zabarwiono fioletem krystalicznym i wysuszono na powietrzu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Pierwsza publikacja wykorzystująca zielone białko fluorescencyjne (GFP) jako substrat reporterowy dla aktywności ubikwityna-proteasomu została opublikowana w 2000 roku 12. Od tego czasu GFP stało się powszechnym narzędziem do wizualizacji procesów komórkowych, w szczególności procesu ubikwityna-proteasomu. W celu monitorowania aktywności ubikwityna-proteasomu in vivo wprowadzono transgeniczny model mysi z reporterem opartym na GFP 13. Dodatkowe badania in vivo pozwoliły na opracowa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Badanie to było finansowane przez: Narodową Sieć Badawczą nad Starzeniem się (NFN S93) z Austriackiej Fundacji Naukowej (FWF), zintegrowane projekty Komisji Europejskiej MiMAGE i PROTEOMAGE, Holenderską Inicjatywę Genomiki/Holenderską Organizację Badań Naukowych (NGI/NWO; 05040202 oraz 050-060-810 NCHA), finansowaną przez UE Sieć Doskonałości Lifespan (FP6 036894) oraz Zorientowany na Innowacje Program Badawczy w dziedzinie Genomiki (SenterNovem; IGE01014 i IGE5007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wektor pEGFP-C1BD Bioscience Clontech6084-1
Zestaw do kierunkowego klonowania TOPO pENTRInvitrogenK2400-20
Zestaw do kierunkowego klonowania TOPO pLenti6/V5InvitrogenV496-10
Odczynnik Lipofectamine 2000Invitrogen11668019
DMEMSigma-AldrichD5546
filtr PVDF (Rotilabo-Spritzenfilter) Carl Roth GmbhP667.1
Glikol polietylenowySigma-AldrichP2139
NaClMerck & Co., Inc.1.06404.1000
1x roztwór soli PBS według Dulbecco (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)Invitrogen14190
bromek heksadymetrynySigma-Aldrich10,768-9
BlastycydynaInvitrogenR21001
Fiolet krystalicznySigma-AldrichC3886
probówki do FACSBD Biosciences
penicylina z streptomycyną (Pen-Strep)Invitrogen15140130
L-glutamina 200 mMInvitrogen25030024
płodowa surowica bydlęca (FBS)Biochrom AGS0115
Niezbędne aminokwasy nieessentialne (NEAA) do pożywki MEM 100xInvitrogen11140035
MEM pirogronian sodu 100 mMInvitrogen11360039
D-(+)-glukoza (45%)Sigma-AldrichG8769
GenetycynaInvitrogen11811023
CaCl2Merck & Co., Inc.C5080
HepesSigma-AldrichH3375
Trypsyna-EDTA (0,05%)Invitrogen25300054

Bibliografia

  1. Coux, O., Tanaka, K., Goldberg, A. L. Structure and functions of the 20S and 26S proteasomes. Annu. Rev. Biochem. 65, 801-847 (1996).
  2. Davies, K. J. Degradation of oxidized proteins by the 20S proteasome. Biochimi. 83, 301-310 (2001).
  3. Stangl, K., Stangl, V. The ubiquitin-proteasome pathway and endothelial (dys)function. Cardiovasc. Res. 85, 281-290 (2009).
  4. Tuoc, T. C., Stoykova, A. Roles of the ubiquitin-proteosome system in neurogenesis. Cell Cycle. 9, 3174-3180 (2010).
  5. Rock, K. L., et al. Inhibitors of the proteasome block the degradation of most cell proteins and the generation of peptides presented on MHC class I molecules. Cell. 78, 761-771 (1994).
  6. Lehman, N. L. The ubiquitin proteasome system in neuropathology. Acta Neuropathol. 118, 329-347 (2009).
  7. Koziel, R., Greussing, R., Maier, A. B., Declercq, L., Jansen-Durr, P. Functional Interplay between mitochondrial and proteasome activity in skin aging. J. Invest. Dermatol. 131, 594-603 (2010).
  8. Grillari, J., Grillari-Voglauer, R., Jansen-Durr, P. Post-translational modification of cellular proteins by ubiquitin and ubiquitin-like molecules: role in cellular senescence and aging. Adv. Exp. Med. Biol. 694, 172-196 (2010).
  9. Bulteau, A. L., Szweda, L. I., Friguet, B. Age-dependent declines in proteasome activity in the heart. Arch. Biochem. Biophys. 397, 298-304 (2002).
  10. Strucksberg, K. H., Tangavelou, K., Schroder, R., Clemen, C. S. Proteasomal activity in skeletal muscle: A matter of assay design, muscle type, and age. Anal. Biochem. , (2009).
  11. Bence, N. F., Sampat, R. M., Kopito, R. R. Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation. Science. 292, 1552-1555 (2001).
  12. Dantuma, N. P., Lindsten, K., Glas, R., Jellne, M., Masucci, M. G. Short-lived green fluorescent proteins for quantifying ubiquitin/proteasome-dependent proteolysis in living cells. Nat. Biotechnol. 18, 538-543 (2000).
  13. Lindsten, K., Menendez-Benito, V., Masucci, M. G., Dantuma, N. P. A transgenic mouse model of the ubiquitin/proteasome system. Nat. Biotechnol. 21, 897-902 (2003).
  14. Liu, J., et al. Impairment of the ubiquitin-proteasome system in desminopathy mouse hearts. FASEB J. 20, 362-364 (2006).
  15. Bowman, A. B., Yoo, S. Y., Dantuma, N. P., Zoghbi, H. Y. Neuronal dysfunction in a polyglutamine disease model occurs in the absence of ubiquitin-proteasome system impairment and inversely correlates with the degree of nuclear inclusion formation. Hum. Mol. Genet. 14, 679-691 (2005).
  16. Myung, J., Kim, K. B., Lindsten, K., Dantuma, N. P., Crews, C. M. Lack of proteasome active site allostery as revealed by subunit-specific inhibitors. Mol. Cell. 7, 411-420 (2001).
  17. Menendez-Benito, V., Heessen, S., Dantuma, N. P. Monitoring of ubiquitin-dependent proteolysis with green fluorescent protein substrates. Methods Enzymol. 399, 490-511 (2005).
  18. Lener, B., et al. The NADPH oxidase Nox4 restricts the replicative lifespan of human endothelial cells. Biochem. J. 423, 363-374 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Reporter GFP Dgninhibitor proteasom wcytometria przep ywowamikroskopia epifluorescencyjnaekspresja lentiwirusowastabilna linia kom rkowapomiar sygna u fluorescencjitest na ywych kom rkachmonitorowanie aktywno ci proteasom w

Powiązane artykuły