Opisano test do ilościowego pomiaru inwazji indukowanej przez czynnik wzrostu transformującego (TGF)-β w trójwymiarowych żelach kolagenowych. Test ten wykorzystuje serię linii komórkowych MCF10A, które reprezentują różne stadia rozwoju raka piersi. Metodę tę można dostosować do użytku z innymi liniami komórkowymi oraz wykorzystać do badania innych potencjalnych aktywatorów lub inhibitorów inwazji.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Test sferoidów do pomiaru inwazji indukowanej przez TGF-β
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
TGF-β pełni przeciwstawne role w progresji raka piersi, działając jako supresor nowotworowy w fazie początkowej, ale stymulując inwazję i przerzutowanie w późniejszym stadium1,2. Co więcej, TGF-β jest często nadmiernie ekspresowany w raku piersi, a jego ekspresja koreluje ze złym rokowaniem i przerzutami 3,4. Mechanizmy, poprzez które TGF-β indukuje inwazję, nie są dobrze poznane.
TGF-β wywołuje odpowiedzi komórkowe za pośrednictwem receptorów TGF-β typu II (TβRII) i typu I (TβRI). Po indukowanym przez TGF-β utworzeniu kompleksu heteromerycznego, TβRII fosforyluje TβRI. Aktywowany TβRI inicjuje wewnątrzkomórkowy kanoniczny szlak sygnałowy poprzez fosforylację Smad receptorowych (R-Smads), tj. Smad2 i Smad3. Te aktywowane R-Smads tworzą kompleksy heteromeryczne z Smad4, które gromadzą się w jądrze i regulują transkrypcję genów docelowych5. Oprócz wcześniej opisanego szlaku Smad, aktywacja receptorów prowadzi do aktywacji kilku innych niesmadowych szlaków sygnałowych, na przykład szlaków kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK)6.
Aby zbadać rolę TGF-β w różnych stadiach raka piersi, wykorzystaliśmy system komórkowy MCF10A. System ten składa się ze spontanicznie unieśmielnionych komórek nabłonkowych piersi MCF10A1 (M1)7, pochodnej M1 przekształconej przez H-RAS — MCF10AneoT (M2), która wywołuje zmiany przednowotworowe u myszy8, oraz pochodnej M2 — MCF10CA1a (M4), która została opracowana z ksenoprzeszczepów M2 i tworzy raki wysokiego stopnia zdolne do przerzutów do płuc9. Seria MCF10A umożliwia badanie odpowiedzi komórek o różnym stopniu złośliwości, bez wpływu zróżnicowanego tła genetycznego.
W celu analizy inwazji indukowanej przez TGF-β wygenerowano homotypowe hodowle sferoidów komórkowych MCF10A osadzone w 3D macierzy kolagenowej in vitro (Rys. 1). Modele te ściśle przypominają ludzkie guzy in vivo poprzez tworzenie gradientu tlenu i składników odżywczych, co skutkuje obecnością komórek aktywnych i inwazyjnych na zewnątrz oraz komórek spoczywających lub nawet nekrotycznych wewnątrz sferoidu10. Wykazano również, że testy oparte na sferoidach lepiej odzwierciedlają oporność na leki niż hodowle monolayerowe11. Ten system modelowy 3D MCF10 pozwolił nam zbadać wpływ sygnalizacji TGF-β na właściwości inwazyjne komórek piersi na różnych etapach złośliwości.
Protokół
1. Przygotowanie roztworu methocelu (500 mL)
- Autoklawować 6 g metylocelulozy w butelce o pojemności 500 ml zawierającej mieszadło magnetyczne.
- Rozpuścić metylocelulozę w 250 ml uprzednio podgrzanego DMEM/F12 bez surowicy (60°C) przez 20 min.
- Dodać 250 ml DMEM/F12 (RT) zawierającego 10% surowicy konia. Mieszać przez noc (4°C).
- Klarować roztwór poprzez wirowanie (5000g, 2h, 4°C).
- Przenieść klarowny, wysokolepki roztwór do nowej probówki (około 90-95% roztworu zapasu).
- Przechowywać w temperaturze 4°C do momentu użycia.
2. Hodowla sferoidów
- Przygotować 20% roztwór methocel (10 ml methocel i 40 ml pożywki wzrostowej).
- Przemyć komórki dwukrotnie PBS, dodać 0,1% trypsyny i inkubować komórki w temperaturze 37 °C
- Resuspendować komórki w pożywce wzrostowej i policzyć komórki.
- Przygotować zawiesinę o stężeniu 10 000 komórek na ml w 20% methocel.
- Dodać zawiesinę komórek do 96-dołkowych płytek do zawiesin z okrągłym dnem (100 μl na dołek).
- Następnego dnia sprawdzić formowanie się sferoidów w płytkach do zawiesin. Sferoidy będą gotowe do użycia po 1-3 dniach.
3. Przygotowanie kolagenu
- Przygotować w lodzie roztwór składający się z 8 ml kolagenu, 1 ml 10x PBS, 1 ml 0,1 N NaOH oraz 3 kropli 0,1 N HCl. Sprawdzić za pomocą pasków wskaźnikowych, czy pH wynosi 7,4. W razie potrzeby skorygować wartość pH.
- Do dołków płytki 96-dołkowej dodać po 50 μl zneutralizowanego roztworu kolagenu.
- Inkubować w temperaturze 37°C do momentu stężenia kolagenu (90 min).
- Przygotować w lodzie roztwory metocel-kolagen-ligand: dla każdego ligandu odpipetować 1 część roztworu kolagenu. Dodać TGF-β w ilości 20 ng na ml kolagenu. Po rozcieńczeniu metocelem i dyfuzji przez poszczególne warstwy, końcowe stężenie TGF-β wyniesie 5 ng/ml. Wymieszać za pomocą wortexa. Dodać 1 część roztworu metocelu. Wymieszać za pomocą wortexa.
4. Osadzanie sferoidów
- Na pipetę 200 μl nałóż końcówkę 200 μl, w której odcięto około 5 mm wierzchołka. Za pomocą pipety pobierz jeden sferoid i ostrożnie odlej medium do pustej płytki. Sprawdź, czy sferoid pozostał wewnątrz końcówki. Sferoid jest widoczny jako biała kropka. Bez zwalniania tłoka pobierz 100 μl mieszaniny kolagenu i metocelu, a następnie przenieś sferoid wraz z mieszaniną kolagenową do studzienki płytki 96-dołkowej powlekonej kolagenem. Powtórz tę czynność dla 12 sferoidów dla każdego wariantu doświadczalnego.
- Pozostaw kolagen do zastygnięcia na co najmniej 30 minut w temperaturze 37°C.
- Usuń pęcherzyki powietrza za pomocą końcówki 200 μl.
- Dodaj 50 μl medium z 1,6 % surowicy oraz inhibitorami rozpuszczonymi w DMSO. W przypadku SB-431542 dodaj 4 μl roztworu zapasu (10 mM) do 1 ml medium. Po dyfuzji końcowe stężenie inhibitora wyniesie 10 μM. TGF-β oraz inhibitory będą obecne przez cały czas trwania eksperymentu. Wykonaj zdjęcia sferoidów pod mikroskopem przy powiększeniu 40X.
- Po 48h stymulacji TGF-β i/lub inhibitorami wykonaj zdjęcia sferoidów pod mikroskopem przy powiększeniu 40X.
- Zmierz pole powierzchni naciekających sferoidów po 2 dniach i odejmij powierzchnię początkową. Pomiar powierzchni sferoidu: Otwórz zdjęcie sferoidu w programie Adobe Photoshop Extended (rycina 2A) i wybierz narzędzie Szybki wybór (Quick Selection tool) (rycina 2B). Wskaźnik myszy zmieni się w okrąg ze znakiem „plus” (+) (rycina 2C). Podczas przesuwania kursora nad sferoidem, program Photoshop rozpozna jego granice. Jeśli zaznaczony zostanie obszar poza sferoidem, można go wykluczyć z zaznaczenia, naciskając klawisz Alt lub używając narzędzia do negatywnego zaznaczania, oznaczonego znakiem (-) na pasku narzędzi. Kursor zmieni się w okrąg ze znakiem „minus” (-) i poprzez przesunięcie go nad błędnie zaznaczonym obszarem, obszar ten zostanie usunięty z zaznaczenia (rycina 2D). W razie potrzeby można zaznaczyć wiele obszarów, naciskając przycisk Shift. Aby pracować dokładniej, można dostosować rozmiar wskaźnika myszy, zmieniając średnicę pędzla na pasku narzędzi (rycina 2E). Po zaznaczeniu całego sferoidu, powierzchnia zaznaczenia jest obliczana poprzez menu ANALIZA-POMIAR (ANALYSIS-MEASURE) lub po naciśnięciu Ctrl + Shift + M (rycina 2F). Pojawi się okno zapisu pomiarów, wyświetlające nazwę pliku i powierzchnię zaznaczenia w pikselach, a także inne dane (rycina 2G). W przypadku pomiaru wielu zaznaczeń, pierwsza linia pokazuje sumę wszystkich powierzchni. Pomiary poszczególnych zaznaczeń są przedstawione w liniach poniżej. Dane ze wszystkich pomiarów można wyeksportować do pliku tekstowego i otworzyć w programie Excel.
5. Reprezentatywne wyniki:
Przykład testu sferoidów z zastosowaniem normalnych komórek nabłonka piersi MCF10A1 (M1), komórek MCF10AneoT (M2) przekształconych przez H-RAS oraz pochodnych od M2 komórek MCF10CA1a (M4) przedstawiono na rysunku 3. Komórki M1 wykazywały jedynie słabą inwazję bez stymulacji, natomiast po stymulacji TGF-β inwazja była znacznie silniejsza. W przeciwieństwie do nich, przekształcona przez RAS pochodna M1, czyli komórki M2, inwadowały już efektywnie bez dodawania bodźców, a efekt ten wzrósł dodatkowo 4-5 krotnie po zastosowaniu TGF-β. Komórki M4 wykazały najsilniejszą inwazję, zarówno z dodatkiem, jak i bez dodatku TGF-β.
Następnie zbadaliśmy, czy możemy zakłócić indukowaną przez TGF-β inwazję w tym modelu sferoidów przy użyciu inhibitorów chemicznych. W tym celu zastosowaliśmy SB-431542, analog ATP i selektywny inhibitor aktywności kinazy TβRI, a także receptora aktywiny typu IB (ActRIB) oraz kinazy podobnej do receptora aktywiny (ALK)712. Zgodnie z oczekiwaniami, SB-431542 silnie hamował indukowaną przez TGF-β inwazję komórek M1, M2 i M4 (Ryc. 4), co wskazuje, że inwazja indukowana przez TGF-β jest zależna od kinazy TβRI. Ponadto silnie zahamowano również podstawową inwazję sferoidów, co sugeruje, że inwazja podstawowa jest również zależna od TGF-β.
Rycina 1. Schemat blokowy testu sferoidów 3D. W pierwszej kolejności komórki są wysiewane w warunkach nieprzylegających w płytkach zawiesinowych o dnie w kształcie litery U. Komórki agregują w wielokomórkowe sferoidy, które mogą zostać zatopione w matrycy kolagenowej. W tej matrycy kolagenowej sferoidy mogą prowadzić inwazję.
Rycina 2. Ilościowe określenie powierzchni sferoidów przy użyciu programu Adobe Photoshop Extended. (A) Otwarcie zdjęcia sferoidu w programie Adobe Photoshop Extended (B) Wybór narzędzia Szybkie zaznaczanie (C) Przeciąganie kursora nad sferoidem w celu zaznaczenia jego powierzchni (D) Usunięcie błędnie włączonego obszaru za pomocą narzędzia Szybkie zaznaczanie w trybie odejmowania (E) Dostosowanie rozmiaru pędzla narzędzia Szybkie zaznaczanie w celu dokładniejszego zaznaczenia obszaru (F) Wybór polecenia pomiaru w celu rejestracji danych (G) Przykład zapisu pomiaru.
Rysunek 3. Inwazja sferoidów spontanicznie unieśmiertelnionych komórek MCF10A1 (M1) (A), przetransformowanych przez RAS komórek MCF10AneoT (M2) (B) oraz ich przerzutowej pochodnej MCF10CA1a (M4) (C) indukowana przez TGF-β. Sferoidy M1, M2 i M4 zatopione w kolagenie traktowano 5ng/ml TGF-β przez 48h zgodnie z oznaczeniem. A-C Reprezentatywne zdjęcia wykonane w dniu zatopienia oraz dwa dni później. D Względną inwazję określono jako różnicę powierzchni w dniu 2. minus dniu 0. Wyniki przedstawiono jako średnia ± s.d. Adaptowano z13.
Rycina 4. Inwazja sferoidów bazalna i indukowana TGF-β jest hamowana przez SB-431542. Sferoidy M1, M2 i M4 osadzono w kolagenie i traktowano 5ng/ml TGF-β oraz/lub 10 μM SB-431542 zgodnie z oznaczeniem. Reprezentatywne zdjęcia wykonane po 2 dniach (A). Względną inwazję określono jako różnicę pól powierzchni w dniu 2. minus dniu 0 (B). Wyniki przedstawiono jako średnia ± s.d. Zaadaptowano z13.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opracowaliśmy model sferoidowy, w którym komórki MCF10A1 oraz ich złośliwe pochodne naciekają macierz kolagenową w sposób zależny od TGF-β. Najpierw sferoidy są formowane w 96-dołkowych płytkach zawiesinowych z okrągłym dnem w obecności metylocelulozy. Oczywiście w tym celu można również zastosować płytki w kształcie litery U powlekane poly-HEMA. Metyloceluloza jest w tym kroku absolutnie niezbędna, ponieważ w jej nieobecności komórki giną. TGF-β dodaje się bezpośrednio do mieszaniny kolagenowo-metocelowej, ponieważ stwi...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Brak konfliktów interesów.
Podziękowania
Jesteśmy wdzięczni Kenowi Iwacie (OSI Pharmaceuticals, Nowy Jork, USA) za dostarczenie odczynników oraz Fredowi Millerowi (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, USA) za udostępnienie linii komórkowych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Metyloceluloza | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| PureCol | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| Paski wskaźnikowe pH | Merck & Co., Inc. | 9533 | |
| Płytki zawiesinowe 96-dołkowe | Greiner Bio-One | 650 185 | |
| Płytki adhezyjne TC 96-dołkowe | Greiner Bio-One | 655 180 |
Bibliografia
- Akhurst, R. J., Derynck, R. TGF-β signaling in cancer--a double-edged sword. Trends. Cell. Biol. 11, S44-S51 (2001).
- Massagué, J. TGF-β in Cancer. Cell. 134, 215-215 (2008).
- Ghellal, A. Prognostic significance of TGF-β1 and TGF-β in human breast carcinoma. Anticancer. Res. 20, 4413-4413 (2000).
- Sheen-Chen, S. M. Serum levels of transforming growth factor-β1 in patients with breast cancer. Arch. Surg. 136, 937-937 (2001).
- ten Dijke, P., Hill, C. S. New insights into TGF-β-Smad signaling. Trends Biochem. Sci. 29, 265-265 (2004).
- Moustakas, A., Heldin, C. H. Non-Smad TGF-β signals. J. Cell Sci. 118, 3573-3573 (2005).
- Soule, H. D. Isolation and characterization of a spontaneously immortalized human breast epithelial cell line, MCF-10. Cancer Res. 50, 6075-6075 (1990).
- Strickland, L. B. Progression of premalignant MCF10AT generates heterogeneous malignant variants with characteristic histologic types and immunohistochemical markers. Breast Cancer Res. Treat. 64, 235-235 (2000).
- Santner, S. J. Malignant MCF10CA1 cell lines derived from premalignant human breast epithelial MCF10AT cells. Breast Cancer Res. Treat. 65, 101-101 (2001).
- Smalley, K. S., Lioni, M., Herlyn, M. Life isn't flat: taking cancer biology to the next dimension. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 42, 242-242 (2006).
- Kobayashi, H. Acquired multicellular-mediated resistance to alkylating agents in cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 3294-3294 (1993).
- Inman, G. J. SB-431542 is a potent and specific inhibitor of transforming growth factor-b superfamily type I activin receptor-like kinase (ALK) receptors ALK4, ALK5, and ALK7. Mol. Pharmacol. 62, 65-65 (2002).
- Wiercinska, E. The TGF-β/Smad pathway induces breast cancer cell invasion through the up-regulation of matrix metalloproteinase 2 and 9 in a spheroid invasion model system. Breast Cancer Res. Treat. 128, 657-657 (2011).
- Tang, B. TGF-β switches from tumor suppressor to prometastatic factor in a model of breast cancer progression. J. Clin. Invest. 112, 1116-1116 (2003).
- Provenzano, P. P. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC. Med. 6, 11-11 (2008).
- Ramaswamy, S. A molecular signature of metastasis in primary solid tumors. Nat. Genet. 33, 49-49 (2003).
- Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nat. Rev. Cancer. 5, 675-675 (2005).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 839-839 (2007).
- Lee, G. Y. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat. Methods. 4, 359-359 (2007).
- Petersen, O. W. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 9064-9064 (1992).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. 30, 256-256 (2011).
- Li, Q. p21-Activated kinase 1 coordinates aberrant cell survival and pericellular proteolysis in a three-dimensional culture model for premalignant progression of human breast cancer. 10, 314-314 (2011).
- Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 332, 821-821 (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
