Multipleksowa detekcja bakterii w złożonych próbkach klinicznych i środowiskowych z wykorzystaniem mikrosfer fluorescencyjnych sprzężonych z oligonukleotydami

Podsumowanie

Opisujemy metodę multipleksową do wykrywania mikroorganizmów w próbce z wykorzystaniem kulek fluorescencyjnych sprzężonych z oligonukleotydami. Amplikony wszystkich organizmów w próbce są hybrydyzowane z panelem kulek sprzężonych z sondami. Do analizy typu każdej kulki oraz sygnału hybrydyzacji wykorzystywany jest instrument Luminex lub Bio-Plex.

Streszczenie

Bakteryjne zapalenie pochwy (BV) to nawracający zespół polimikrobiologiczny, który charakteryzuje się zmianą „normalnej” mikrobioty z dominacji Lactobacillus na mikrobiotę zdominowaną przez szereg gatunków bakteryjnych, w tym Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae i inne^1-3. Stan ten wiąże się z szeregiem negatywnych skutków zdrowotnych, w tym z nabyciem wirusa HIV⁴, i może być trudny do opanowania klinicznie⁵. Ponadto diagnostyka BV opierała się na stosowaniu barwienia metodą Grama rozmazów z wymazów z pochwy, które oceniano według różnych kryteriów numerycznych^6,7. Chociaż ta metoda diagnostyczna jest prosta, tania i odpowiednia dla warunków o ograniczonych zasobach, może ona obarczona być problemami związanymi z subiektywną interpretacją i nie dostarcza szczegółowego profilu składu mikrobioty pochwy⁸. Niedawne prace nad głębokim sekwencjonowaniem ujawniły bogatą i różnorodną mikrobiotę pochwy z wyraźnymi różnicami między próbkami pobranymi od osób zdiagnozowanych z BV a osobami uznanymi za zdrowe^9,10, co doprowadziło do zidentyfikowania szeregu potencjalnych celów dla molekularnej diagnostyki BV^11,12. Badania te dostarczyły bogatej i użytecznej wiedzy, jednak głębokie sekwencjonowanie nie jest jeszcze praktyczne jako metoda diagnostyczna w warunkach klinicznych. Ostatnio opisaliśmy metodę szybkiego profilowania mikrobioty pochwy w formacie multipleksowym z wykorzystaniem kulek fluorescencyjnych sprzężonych z oligonukleotydami z detekcją na platformie Luminex¹³. Metoda ta, podobnie jak obecne metody oparte na barwieniu metodą Grama, jest szybka i prosta, ale daje dodatkową zaletę wykorzystania wiedzy molekularnej płynącej z badań sekwencyjnych przy projektowaniu sond. Zatem metoda ta zapewnia sposób profilowania głównych mikroorganizmów obecnych w wymazie z pochwy, który może być stosowany do diagnozowania BV z wysoką specyficznością i czułością w porównaniu do barwienia metodą Grama, dostarczając jednocześnie dodatkowych informacji o obecności i liczebności gatunków w sposób półilościowy i szybki. Ta metoda multipleksowa jest rozszerzalna daleko poza zakres obecnych testów ilościowego PCR dla konkretnych organizmów, które są obecnie ograniczone do 5 lub 6 różnych testów w jednej próbce¹⁴. Co istotne, metoda ta nie ogranicza się do wykrywania bakterii w wymazach z pochwy i może być łatwo zaadaptowana do szybkiego profilowania niemal każdej interesującej społeczności mikrobiologicznej. Na przykład niedawno zaczęliśmy stosować tę metodologię do opracowania narzędzi diagnostycznych do użytku w oczyszczalniach ścieków.

Protokół

Metoda ta została zastosowana w badaniach opisanych w pracy Dumonceaux et al. J. Clin. Microbiol. 47, 4067-407, doi:10.128/jcm.012-09 (209).

Schematyczny rysunek przedstawiający ogólną procedurę zaprezentowano na Rysunku 1.

1. Sprzęganie kulek

W niniejszym rozdziale opisano metody sprzęgania sond oligonukleotydowych z polistyrenowymi kuleczkami Luminex (patrz Tabela 2). Objętości zostały nieznacznie dostosowane w celu oceny nowych sond wychwytujących w ramach prób; objętości te wskazano w nawiasach.

1. Wyjąć proszek 1-etylo-3-(3-dimetylaminopropylo)karbodiimidu HCl (EDC) z -20°C eksykator i ogrzać do temperatury pokojowej.
2. Resuspender mikrosfery poprzez sonikację w kąpieli ultradźwiękowej przez 20 sekund, a następnie mieszać na wortexie przez około 20 sekund.
3. Transfer 400 μl (100 μl) mikrosfer do probówki Eppendorf (odpowiada to 5x10⁶ lub 1,25x10⁶ mikrosfery). Firma Luminex sugeruje stosowanie probówek do mikrowirowania o niskim wiązaniu białek (np. probówek Eppendorf Protein LoBind, numer katalogowy 030 108.094), aby zapobiec przywieraniu niepowiązanych kulek do ścianek probówek i zakłócaniu ich odzyskiwania. W naszym doświadczeniu nie stanowiło to problemu przy użyciu standardowych polipropylenowych probówek do mikrowirowania, których zazwyczaj używamy (np. VWR numer katalogowy 8703-298).
4. Wirować z prędkością 14 00 x g przez 1 minutę. Zdjąć i odrzucić nadsącz.
5. Resuspendować mikrosfery w 50 μl (12.5 μl) kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES) o stężeniu 0,1 M o pH 4,5 w temperaturze pokojowej.
6. Przygotuj świeży roztwór EDC o stężeniu 10 mg/ml w wodzie.
   1. Przygotować mniej niż 1 ml tego roztworu, odważając 5-10 mg EDC na wadze analitycznej, a następnie dodając wodę do uzyskania stężenia 10 mg/ml.
7. Do mikrosfer należy dodać 1 nmol 5'-amino-zmodyfikowanego C12 oligonukleotydu wychwytującego (Tabela 2) i wymieszać za pomocą wortexa. 1 nmol to 5 μl z 200 μM oligonukleotyd
8. Dodaj 2.5 μl świeżego roztworu EDC do mikrosfer i wymieszać w wirówce typu vortex przez 5 sekund.
9. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności.
10. Wylać roztwór EDC (krok 1.6) i przygotować nową próbkę EDC w wodzie o stężeniu 10 mg/ml zgodnie z powyższą instrukcją (krok 1.6).
11. Dodaj kolejny 2.5 μl świeżego roztworu EDC do mikrosfer i mieszać wortexie przez 5 sekund.
12. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności.
13. Wypłucz kuleczki, dodając 1 ml 0,02% Tween 20. Wymieszaj na wortexie (opcjonalnie można dodatkowo sonikować przez 20 sekund), aby resuspendować kuleczki.
14. Wirować przy 14 0 x g przez 1 minutę. Zebrać i usunąć nadsącz.
15. Ponownie przemyj kuleczki, dodając 1 ml 0,1% dodecylosiarczanu sodu (SDS). Wymieszaj w wstrząsarce Vortex (opcjonalnie można również sonikować przez 20 sekund), aby resuspender kuleczki.
16. Wiruj przy 14 0 x g przez 1 minutę. Usuń i odrzuć supernatant.
17. Resuspenduj kuleczki w 100 μl (25 μl) buforu Tris-EDTA (TE) [10 mM Tris-Cl pH 8,0, 1 mM EDTA, pH 8,0].
18. Policz kuleczki w komorze countingowej (hemocytometrze) lub w liczniku Coulter'a, aby określić stężenie roztworu matecznego.
19. Przygotuj główną mieszaninę (Master Mix) mikrosfer, rozcieńczając każdą kuleczkę do końcowego stężenia 10 kuleczek/μl w buforze TE. Połączyć kuleczki sprzężone odpowiadające żądanej wielości (plex) testu (np. dla testu 10-plex zmieszać 10 różnych kuleczek sprzężonych do końcowego stężenia 10/μl każdej kuleczki).
20. Przechowywać Microsphere Master Mix w temperaturze 4°C w ciemności. Mieszaninę można przechowywać przez wiele miesięcy, jeśli zostanie zachowane powyższe warunki.

2. Produkcja amplikonu uniwersalnego celu chaperoniny 60 (cpn60 UT) i generowanie pojedynczych nici.

1. Przygotować produkt polimerazy łańcuchowej (PCR) dla każdej próbki. Należy zastosować zestaw starterów 5' zmodyfikowanych fosforotiolanem i biotyną (Tabela 1). Objętości do zmieszania oraz stężenia znajdują się w Tabeli 3.
2. Niezwłocznie po zakończeniu PCR dodać 2 μl (20 jednostek) egzonukleazy T7 do każdej probówki PCR (bufor PCR będzie wystarczający dla reakcji T7). Inkubować reakcję w temperaturze pokojowej (~2-25°C) przez 40 minut.
3. Po zakończeniu tej inkubacji dodać 12,5 μl 0,5 M kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) o pH 8,0 i wymieszać. Otrzymana zostanie całkowita objętość ~64,5 μl jednoniciowego produktu PCR.

3. Hybrydyzacja jednoniciowego produktu PCR z kuleczkami polistyrenowymi sprzężonymi z oligonukleotydami.

1. Podgrzej urządzenie do 60°C, aby utrzymać temperaturę hybrydyzacji podczas analizy. Włącz grzałkę platformy za pomocą oprogramowania instrumentu, upewniając się, że użyto mosiężnego bloku grzejnego dopasowanego do płytki typu PCR zawierającej hybrydyzowaną mieszaninę kulek.
2. Resuspenduj Microsphere Master Mix (krok 1.20) za pomocą pipety, odmień odpowiednią ilość do probówki Eppendorf, zakręć probówkę i poddaj sonikacji w sonicatorze kąpielowym przez 2 minuty. Alternatywnie, aby zapewnić absolutną spójność resuspensji kulek, można resuspendować microsphere master mix poprzez wortexowanie i pipetowanie, a następnie sonikację jak opisano powyżej i odmierzanie żądanej ilości do polipropylenowej probówki Eppendorf.
3. Odmień 17 μl jednoniciowego produktu PCR (krok 2.2) do odpowiednich dołków niskoprofilowej 96-dołkowej płytki PCR Thermowell (Tabela 2). Dodaj 3 μl zresuspendowanej, poddanej sonikacji mieszaniny kulek do każdego dołka. Przykryj pokrywą silikonową (Tabela 2) i delikatnie stuknij.
4. Włóż płytkę do termocyklera z następującym programem: 95°C przez 5 min, 60°C przez 10 min, utrzymanie 60°C, 60°C przez 5 min, koniec. Uruchom program.
5. Przygotuj świeży roztwór streptawidyny-fikoerytryny (SA-PE); będziesz potrzebować 25 μl na dołek (przygotuj roztwór dla kilku dodatkowych dołków). Przygotuj roztwór SA-PE, rozcieńczając zapas SA-PE (1 mg/ml) w stosunku 1:50 do stężenia 20 μg/ml w buforze 1x tetrametylu chlorku amonu (TMAC) (3 M TMAC; 0.1% Sarkosyl; 50 mM Tris-HCl, pH 8.0; 4 mM EDTA, pH 8.0).
6. Gdy termocykler dotrze do kroku utrzymania temperatury 60°C, otwórz pokrywę, zdejmij pokrywę silikonową i dodaj roztwór SA-PE bezpośrednio do każdego dołka (NIE wyjmuj płytki z termocyklera). Nałóż z powrotem pokrywę silikonową, zamknij pokrywę termocyklera i wznowij program.
7. Po zakończeniu programu wyjmij płytkę i szybko przenieś ją do urządzenia BioPlex w celu odczytu. Płytkę należy odczytać w ciągu 10 minut. Odczytu należy dokonać w temperaturze 60°C; upewnij się, że BioPlex został uprzednio rozgrzany do tej temperatury. Upewnij się, że wysokość sondy została dostosowana do zastosowanej płytki, zgodnie z opisem w instrukcji obsługi użytego urządzenia.
8. W celu dokładnej detekcji kulek i sygnału ustawienia bramki (gate settings) w BioPlex muszą być dostosowane do rodzaju używanych mikrosfer. Kulki polistyrenowe BioRad wymagają ustawienia bramki 4 35-10 0, natomiast mikrosfery magnetyczne wymagają ustawienia 5 00-25 0. Istnieje również możliwość odczytu płytki z użyciem ustawienia High PMT, które zwiększa wartość wzmocnienia reportera. Może to zwiększyć intensywność słabszych sygnałów, jednak ważne jest uwzględnienie odpowiedniej kontroli negatywnej, ponieważ wzrośnie również sygnał tła.

4. Reprezentatywne wyniki:

Jednym z naszych celów podczas opracowywania i wdrażania tego testu było uczynienie go jak najprostszym i jak najbardziej usprawnionym. Zoptymalizowaliśmy zatem krytyczne etapy po amplifikacji, w tym czas traktowania egzonukleazą T7 oraz czas hybrydyzacji, aby opracować test, który można przeprowadzić w rozsądnym czasie. Jak pokazano na rysunku 2A, traktowanie amplikonu enzymem T7 jest niezbędne do generowania sygnału, ponieważ większość sond wykazywała słaby lub żaden sygnał przy krótkim czasie traktowania lub jego braku. Sygnał rósł liniowo do około 40 minut, po czym przyrost sygnału spowolnił. Nie zaobserwowano degradacji sygnału nawet przy 2-godzinnym czasie traktowania T7, co wskazuje, że modyfikacja fosforotiolanowa primerów jest wysoce skuteczna w zapobieganiu degradacji nici docelowej, zgodnie z opisem¹⁵. Wybraliśmy 40 minut jako czas traktowania T7, aby zminimalizować całkowity czas protokołu, jednak z rysunku 2A wynika jasno, że traktowanie T7 może trwać znacznie dłużej. Określiliśmy również wpływ czasu hybrydyzacji na generowanie sygnału (rysunek 2B) i stwierdziliśmy, że 10 minut jest wystarczające do uzyskania maksymalnego sygnału, ponieważ nie zaobserwowano dalszego wzrostu sygnału nawet po 4 godzinach hybrydyzacji. W związku z tym wybrano 10-minutowy etap hybrydyzacji, ponownie w celu zminimalizowania całkowitego czasu testu. Biorąc pod uwagę te wyniki oraz stosując szybkie techniki ekstrakcji DNA, takie jak InstaGene (Bio-Rad), cały test, obejmujący ekstrakcję DNA, PCR i analizę Luminex, można ukończyć w 4-5 godzin.

W ramach uwagi ostrzegawczej należy zaznaczyć, że poziom agregacji kulek polistyrenowych podczas analizy w systemach Luminex lub BioPlex może mieć istotny wpływ na wydajność testu. Oprogramowanie BioPlex wyświetla poziom agregacji kulek, która występuje, gdy w ścieżce lasera wykrytych zostanie więcej niż jedna kulka, co skutkuje odrzuceniem sygnału hybrydyzacji z agregatu. Pozorną agregację kulek mogą również powodować wszelkie cząstki stałe, które nie mają odpowiedniej wielkości pojedynczej kulki, a nawet pęcherzyki powietrza. W każdym z tych przypadków sygnał pochodzący z agregatu kulek, pęcherzyka powietrza lub cząstki jest odrzucany. W większości przypadków stwierdzamy, że agregacja kulek jest minimalna (Rysunek 3A), a założony poziom 10 zdarzeń zliczania dla każdej kulki jest łatwy do osiągnięcia. Sporadycznie jednak kulki wykazują umiarkowany (Rysunek 3B) lub silny (Rysunek 3C) stopień agregacji. W takich sytuacjach, ponieważ większość danych jest odrzucana, instrument może mieć trudności z osiągnięciem 10 zdarzeń na typ kulki, a wyniki mogą być wątpliwe. Krok sonikacji (krok 3.2) ma na celu zminimalizowanie agregacji kulek. Ponadto pomocne może być przechowywanie kulek w formie rozcieńczonego roztworu głównego mikrosfer (krok 1.20). Zauważyliśmy, że wykluczenie TMAC z buforu do hybrydyzacji – i dodanie go zamiast tego do rozcieńczalnika SA-PE (krok 3.5) – pomaga zminimalizować agregację kulek. Co więcej, choć nie zostało to przez nas przetestowane, uważa się, że nowsze kulki magnetyczne dostępne w ofercie Luminex lub BioRad wykazują mniejszą tendencję do agregacji.

Wyniki zastosowania macierzy Luminex 5-plex skierowanej przeciwko G. vaginalis, A. vaginae, L. iners, L. crispatus oraz L. gasseri wraz z odpowiadającymi im rozmazami z wymazów pochwowych barwionych metodą Grama przedstawiono na Rysunku 4. Próbki te pobrano od jednej osoby w kilku punktach czasowych. W punkcie czasowym 0 u pacjentki zdiagnozowano BV na podstawie barwienia metodą Grama (Rysunek 4A), a wyniki Luminex z tej samej próbki (Rysunek 4B) wykazują, że spośród organizmów reprezentowanych w macierzy, najliczniejszy był G. vaginalis, natomiast wyniki dla A. vaginae i L. iners były również dodatnie. Dziewięć dni później pacjentka nadal wykazywała obecność BV, a sygnał dla G. vaginalis znacznie wzrósł, podczas gdy A. vaginae i L. iners nadal były dodatnie. Co ważne, po tym czasie u pacjentki zaczął następować powrót do prawidłowej mikrobioty, gdyż w rozmazach wykrywalne stały się prątki Gram-dodatnie (Rysunek 4A), podczas gdy sygnał dla G. vaginalis słabł, a sygnał dla L. iners wzrastał (Rysunek 4B). Zgodnie z naszą pierwotną definicją BV przy zastosowaniu tej metody (próbki dodatnie w kierunku G. vaginalis i/lub A. vaginae uznawano za dodatnie pod kątem BV)¹³, osoba ta była dodatnia pod kątem BV we wszystkich punktach czasowych, mimo że barwienie metodą Grama nie wykryło G. vaginalis w dwóch ostatnich punktach czasowych. Dzięki opisanej tutaj metodzie Luminex trendy można łatwo porównać z metodami opartymi na sekwencjonowaniu, a wyniki testu Luminex zazwyczaj potwierdzają wyniki barwień metodą Grama¹³, dostarczając jednocześnie dodatkowych informacji o tożsamości i liczebności organizmów.

Rysunek 1. Schemat protokołu Luminex służącego do określania profilu mikrobioty złożonej próbki klinicznej lub środowiskowej. Protokół rozpoczyna się od matrycowego DNA wyekstrahowanego z analizowanej próbki. (1) Generowanie produktu PCR z matrycowego DNA przy użyciu specyficznych dla nici, biotinylowanych, modyfikowanych fosforotioatowymi cpn60 Startery do PCR UT połączone z niemodyfikowanymi cpn60 startery PCR UT (Tabela 1); (2) pozwala to na otrzymanie puli produktów PCR reprezentujących mikrobiotę z modyfikacją biotynowo-fosforotioanową na jednej nici; (3) poddaj dwuniciowy produkt PCR trawieniu egzonukleazą T7, która nie degraduje nici z modyfikacją fosforotioanową, co prowadzi do powstania jednoniciowego DNA z modyfikacją biotynową na końcu 5'; (4) połącz kuleczki polistyrenowe ze specyficznymi dla gatunków cpn60 Sondy UT – każdy koralik posiada unikalny adres spektralny (oznaczony kolorem koralika), który jest rozpoznawalny przez urządzenie Luminex lub Bio-Plex; (5) Przeprowadzić hybrydyzację jednoniciowego produktu PCR otrzymanego z analizowanej próbki z zestawem koralików sprzężonych z gatunkowo specyficznymi oligonukleotydami; (6) Dodać koniugat streptawidyna-fykoerytryna, który wiąże się z biotynylowanym jednoniciowym produktem PCR i pełni rolę wskaźnika hybrydyzacji; (7) Wyznaczyć adres spektralny (tożsamość koralika) oraz intensywność sygnału hybrydyzacji przy użyciu urządzenia Luminex lub Bio-Plex. Dla każdej tożsamości koralika przeliczanych jest co najmniej 10 koralików, a jako wynik podaje się medianę intensywności fluorescencji (MFI) sygnału fykoerytryny. Jednocześnie można ocenić do 100 różnych typów koralików, lecz zilustrowano test wykazujący rozróżnienie trzech typów koralików. (8) Jeśli MFI powtórzeń PCR otrzymanych z tej samej próbki jest istotnie wyższe niż w przypadku kontroli negatywnej dla danego koralika (jednostronny test t-Studenta, p<0,05), próbkę uznaje się za dodatnią w kierunku obecności tego organizmu.

Rysunek 2. Optymalizacja parametrów analizy Luminex. Pięć różnych sond skierowanych przeciwko Peptostreptococcus anaerobius wykorzystano z amplikonami otrzymanymi z mieszanego szablonu składającego się z plazmidów zawierających sklonowane cpn60 UT 20 bakterii znanych z występowania w pochwie, w tym *P. anaerobius*(A). Wpływ czasu traktowania egzonukleazą T7. Postępowano zgodnie z opisanym powyżej protokołem, zmieniając czas traktowania egzonukleazą T7 przed hybrydyzacją, a następnie określono medianę intensywności fluorescencji (MFI) dla wszystkich sond. (B). Wpływ czasu hybrydyzacji. Postępowano zgodnie z opisanym powyżej protokołem, stosując różne czasy hybrydyzacji. Wykorzystano te same zestawy sond z amplikonem otrzymanym z tego samego matrycy co w punkcie A, a następnie określono medianę intensywności fluorescencji (MFI) dla wszystkich sond.

Rysunek 3. Oznaczanie agregacji kulek za pomocą oprogramowania BioPlex. Przedstawiono trzy przykłady pomiarów BioPlex, w których poziom agregacji kulek jest (A) dopuszczalny (5%); (B) graniczny (50%); oraz (C) niedopuszczalny (80%).

Rysunek 4. Zastosowanie macierzy Luminex 5-plex w diagnostyce BV w próbkach pobranych sekwencyjnie od tej samej osoby. (A). Preparaty barwione metodą Grama przedstawiające tradycyjną diagnostykę stosowaną do oceny każdej próbki pod kątem BV. (B). Zastosowanie macierzy Luminex 5-plex, przygotowanej i wykonanej zgodnie z opisem w niniejszym protokole, w tych samych czterech próbkach przedstawionych w punkcie (A). Cele bakteryjne, których sygnał MFI był istotnie dodatni zgodnie z naszą definicją (jednostronny test studenta) t-test, p<0,05) są oznaczone gwiazdką (*).

Dyskusja

Specyficzność generowania sygnału ma krytyczne znaczenie; należy mieć pewność, że obserwowany sygnał rzeczywiście odzwierciedla detekcję amplikonu wygenerowanego z danego organizmu. Oprogramowanie takie jak PrimerPlex (Premier Biosoft) może pomóc w projektowaniu sond, które będą hybrydyzować efektywnie, jednak mogą one, lub nie, wykazujeć hybrydyzację krzyżową z gatunkami niebędącymi celem. Przy zastosowaniu uniwersalnych starterów PCR, zgodnie z opisem w niniejszym protokole, należy pamiętać, że wygenerowany amplikon re...