Multipleksowa detekcja bakterii w złożonych próbkach klinicznych i środowiskowych przy użyciu mikrosfer fluorescencyjnych sprzężonych z oligonukleotydami

Summary

Opisujemy metodę multipleksową do wykrywania mikroorganizmów w próbce za pomocą fluorescencyjnych kulek sprzężonych z oligonukleotydami. Amplikon ze wszystkich organizmów w próbce jest hybrydyzowany z panelem kulek sprzężonych z sondą. Przyrząd Luminex lub Bio-Plex służy do sprawdzania każdego koralika pod kątem typu koralika i sygnału hybrydyzacji.

Abstract

Bakteryjne zapalenie pochwy (BV) to powtarzający się zespół wielodrobnoustrojowy, który charakteryzuje się zmianą w "normalnej" mikrobiocie z zdominowanej przez Lactobacillus na mikrobiotę zdominowaną przez wiele gatunków bakterii, w tym Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae i inne^1-3. Stan ten wiąże się z szeregiem negatywnych skutków zdrowotnych, w tym z nabyciem wirusa HIV⁴ , i może być trudny do leczenia klinicznego⁵. Ponadto rozpoznanie BV opiera się na wykorzystaniu barwień metodą Grama z wymazów z pochwy, które są oceniane na podstawie różnych kryteriów numerycznych^6,7. Chociaż ta diagnostyka jest prosta, niedroga i dobrze nadaje się do zastosowań o ograniczonych zasobach, może powodować problemy związane z subiektywnymi interpretacjami i nie daje szczegółowego profilu składu mikrobioty pochwy⁸. Niedawne badania głębokiego sekwencjonowania ujawniły bogatą, zróżnicowaną mikrobiotę pochwy z wyraźnymi różnicami między próbkami pobranymi od osób, u których zdiagnozowano BV w porównaniu z osobami, które uważa się za normalne^9,10, co zaowocowało identyfikacją wielu potencjalnych celów do diagnozy molekularnej BV^11,12. Badania te dostarczyły wielu przydatnych informacji, ale głębokie sekwencjonowanie nie jest jeszcze praktyczne jako metoda diagnostyczna w warunkach klinicznych. Niedawno opisaliśmy metodę szybkiego profilowania mikrobioty pochwy w formacie multipleksowym przy użyciu koralików fluorescencyjnych sprzężonych z oligonukleotydami z detekcją na platformie Luminex¹³. Metoda ta, podobnie jak obecne metody oparte na barwieniu metodą Grama, jest szybka i prosta, ale ma dodatkową zaletę w postaci wykorzystania wiedzy molekularnej wynikającej z badań sekwencjonowania w projektowaniu sond. Metoda ta zapewnia zatem sposób profilowania głównych mikroorganizmów obecnych w wymazie z pochwy, który można wykorzystać do diagnozowania BV z wysoką swoistością i czułością w porównaniu z barwieniem metodą Grama, dostarczając jednocześnie dodatkowych informacji na temat obecności i liczebności gatunków w sposób półilościowy i szybki. Ta metoda multipleksowa może zostać rozszerzona znacznie poza zakres obecnych ilościowych testów PCR dla poszczególnych organizmów, który jest obecnie ograniczony do 5 lub 6 różnych testów w jednej próbce¹⁴. Co ważne, metoda ta nie ogranicza się do wykrywania bakterii w wymazach z pochwy i można ją łatwo dostosować do szybkiego profilowania niemal każdej społeczności drobnoustrojów będących przedmiotem zainteresowania. Na przykład niedawno zaczęliśmy stosować tę metodologię do opracowywania narzędzi diagnostycznych do stosowania w oczyszczalniach ścieków.

Protocol

Ta metoda została użyta w badaniach opisanych w Dumonceaux et al. J. Clin. Mikrobiol. 47, 4067-4077, doi:10.1128/jcm.00112-09 (2009).

Schemat przedstawiający całą procedurę jest przedstawiony na rysunku 1.

1. Sprzężenie koralików

To opisuje metody, które mają być używane do łączenia sond oligonukleotydowych z polistyrenowymi kulkami Luminex (patrz Tabela 2). Objętości są nieznacznie dostosowane do oceny nowych sond wychwytujących na zasadzie próby; Woluminy te są podane w nawiasach.

1. Usunąć proszek 1-etylo-3-(3-dimetyloamiopropylo)karbodimidu HCl (EDC) z ek....

Discussion

Specyfika generowania sygnału ma kluczowe znaczenie; Musisz mieć pewność, że obserwowany sygnał naprawdę odzwierciedla detekcję amplikonu generowanego przez ten organizm. Oprogramowanie takie jak PrimerPlex (Premier Biosoft) może pomóc w projektowaniu sond, które będą skutecznie hybrydyzować, ale mogą, ale nie muszą, krzyżować się z gatunkami niedocelowymi. W przypadku stosowania uniwersalnych starterów PCR zgodnie z opisem w niniejszym protokole należy pamiętać, że wygenerowany amplikon reprezentuje wszystkie organizmy .......