Pomiary pojemności patch-clamp i obrazowanie Ca2+ na pojedynczych zakończeniach nerwowych w warstwach siatkówki

Summary

Tutaj opisujemy protokół przygotowania plastrów siatkówki z zatopionymi w agaracie, które są odpowiednie do elektrofizjologii i obrazowania Ca²⁺. Metoda ta pozwala na badanie synaps wstęgowych w mikroukładach siatkówki za pomocą bezpośrednich zapisów patch-clamp pojedynczych presynaptycznych zakończeń nerwowych.

Abstract

Bodźce wzrokowe są wykrywane i przekazywane w szerokim zakresie dynamicznym natężenia światła i zmian częstotliwości przez wyspecjalizowane neurony w siatkówce kręgowców. Dwie klasy neuronów siatkówki, fotoreceptory i komórki dwubiegunowe, osiągają to za pomocą stref aktywnych typu wstęgowego, które umożliwiają trwałe i wysokoprzepustowe uwalnianie neuroprzekaźników przez długi czas. Końcówki mieszanych komórek dwubiegunowych (Mb) typu ON w siatkówce złotej rybki, które depolaryzują się na bodźce świetlne i otrzymują mieszane wejście fotoreceptorów pręcików i czopków, są odpowiednie do badania synaps wstęgowych zarówno ze względu na ich duży rozmiar (średnica ~10-12 μm), jak i liczne boczne i wzajemne połączenia synaptyczne z dendrytami komórek amakrynowych. Bezpośredni dostęp do dwubiegunowych zakończeń komórkowych Mb w plastrach siatkówki złotej rybki za pomocą techniki patch-clamp umożliwia pomiar presynaptycznych prądów Ca^{2 +}, zmian pojemności błony i wzajemnego hamowania synaptycznego sprzężenia zwrotnego, w którym pośredniczą receptory GABA_A i GABA_C wyrażane na końcach. Pomiary pojemności błony presynaptycznej egzocytozy pozwalają na badanie krótkotrwałej plastyczności uwalniania neuroprzekaźników pobudzających ^14,15. Ponadto, krótko- i długoterminowa plastyczność hamującego uwalniania neuroprzekaźników z komórek amakrynowych może być również badana przez zapisy wzajemnego hamowania sprzężenia zwrotnego docierającego do terminala Mb ²¹. W krótkich okresach czasu (np. ~10 s) hamowanie wzajemnego sprzężenia zwrotnego GABAergiczne z komórek amakrynowych ulega depresji parzystych impulsów poprzez wyczerpanie puli pęcherzyków GABA ¹¹. W ten sposób można bezpośrednio badać dynamikę synaptyczną mikroobwodów siatkówki w wewnętrznej warstwie splotowatej siatkówki.

Technika wycinania mózgu została wprowadzona ponad 40 lat temu, ale nadal jest bardzo przydatna do badania właściwości elektrycznych neuronów, zarówno na poziomie ¹⁹ pojedynczej komórki somy, pojedynczego dendrytu lub aksonu, jak i mikroobwodu synaptycznego. Tkanki, które są zbyt małe, aby można je było przykleić bezpośrednio do komory krojenia, są często najpierw zatopiane w agarze (lub umieszczane na bibule filtracyjnej), a następnie krojone w plastry ^{20, 23, 18, 9}. W tym filmie stosujemy technikę wstępnego zatapiania agaru przy użyciu siatkówki złotej rybki. Niektóre z gigantycznych dwubiegunowych zakończeń komórkowych w naszych plasterkach siatkówki złotej rybki są akskotomizowane (cięte aksonami) podczas procedury krojenia. Pozwala nam to wyizolować pojedyncze wejścia presynaptycznych zakończeń nerwowych, ponieważ zapis z zakończeń aksotomii wyklucza sygnały z przedziału soma-dendrytycznego. Alternatywnie można również nagrywać z nienaruszonych komórek dwubiegunowych Mb, nagrywając z końcówek podłączonych do aksonów, które nie zostały przecięte podczas procedury krojenia. Ogólnie rzecz biorąc, zastosowanie tego eksperymentalnego protokołu pomoże w badaniach nad fizjologią synaps siatkówki, analizą funkcjonalną mikroobwodów i transmisją synaptyczną w synapsach wstęgowych.

Protocol

1. Rozwiązania zewnętrzne i wewnętrzne

1. Przygotuj roztwór do krojenia (o niskiej zawartości wapnia) z 10x roztworu podstawowego i dodawaj MgCl₂, CaCl₂ i D-glukozę dziennie. Końcowy 1x roztwór składa się z (w mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 3,2 MgCl₂, 0,25 CaCl₂, 12 D-glukozy, 0,2 kwasu L-askorbinowego, 12 HEPES. Ustaw pH na 7,4 (z NaOH) i dostosuj osmolarność do 260 mOsm (używając_H2Oi 10x roztworu podstawowego).
2. Odważyć 3% agar o niskiej temperaturze żelowania (Agaroza typ VII-A, A0701, Sigma; Rieke, 2001) i wymieszać z roztworem do krojenia. Podgrzewać roztwór zawierający agar w kuchence mikrofalowej przez 1-2 minuty lub do momentu, gdy całkowicie się rozpuści, a następnie inkubować agar w łaźni wodnej (30-33°C), aby zapobiec szybkiemu krzepnięciu (temperatura przejścia żelu: 26 ± 2°C).
3. Przygotować roztwór zapisowy (normalny wapń) z 10-krotnego roztworu podstawowego i codziennie dodawać MgCl₂, CaCl₂ i D-glukozę. Końcowy roztwór 1x składa się z (w mM): 100 NaCl, 2,5 KCl, 1 MgCl₂, 25 NaHCO₃, 0,2 kwasu L-askorbinowego, 2,5 CaCl₂, 12 D-glukozy. Po bulgotaniu roztworu w 95%_O2 / 5% CO₂ (karbogen) przez 5-10 minut, ustaw pH na 7,4 (z NaOH) i dostosuj osmolarność do 260 mOsm (używając_H2Oi 10x roztworu podstawowego).
4. Podwielokrotności (po 1 ml każdy) roztworów pipet wewnętrznych przygotowuje się wcześniej i przechowuje w zamrażarce (-20°C). Do izolowania dwubiegunowych prądów wapniowych komórek (w mM) zwykle stosuje się dwa roztwory pipet wewnętrznych:
   1. 40 CsCl, 60 Cs-glukonian, 10 tetraetyloamoniu (TEA)-Cl, 28 HEPES, 3 Mg-ATP, 1 Na-GTP i 2 EGTA. Dostosuj pH do 7,2 (z CsOH) i osmolarność ustaw na 250 mOsm. To wewnętrzne rozwiązanie o wysokiej zawartości chlorków zazwyczaj zapewnia niższe zapisy rezystancji szeregowej (lepsze warunki cęgów napięciowych) i większe hamujące prądy postsynaptyczne (IPSC) przy bipolarnym potencjale spoczynkowym błony komórkowej wynoszącym -60 mV.
   2. 95 Cs-glukonian, 10 TEA-Cl, 25 HEPES, 3 Mg-ATP, 0,5 Na-GTP i 0,5 EGTA. Dostosuj pH do 7,2 (za pomocą CsOH) i ustaw osmolarność na 250 mOsm ²². To wewnętrzne rozwiązanie o niskiej EGTA zazwyczaj prowadzi do wyższych zmian pojemności błony wywoływanych przez depolaryzujące impulsy krokowe, a tym samym umożliwia badania wyczerpania puli pęcherzyków i krótkotrwałej depresji.

2. Elektrody do pipet z zaciskiem krosowym

1. Przygotować grubościenne (średnica zewnętrzna 1,5 mm) szkło borokrzemowe (1B150F-4; World Precision Instruments, Sarasota, Floryda) i wyciągnąć pipety krosowe za pomocą pionowego ściągacza (Narishige, PP830; Tokio, Japonia). Rezystancja pipet krosowych z otwartą końcówką w roztworach rejestrujących wynosi 7-8 MΩ, gdy pipeta jest napełniona wewnętrznym roztworem pipet #1.
2. Pokryj pipetę plastrową równomiernie, od końcówki do poziomu trzonu, który sięga do uchwytu pipety, woskiem dentystycznym (Cavex, West Chester, PA). Zminimalizuje to pojemność pipety i szumy elektryczne oraz umożliwi dokładniejsze pomiary pojemności przy niskim poziomie szumów. Niska pojemność pipety pomaga również w elektronicznej kompensacji C-fast (szybkiej pojemności) wzmacniacza patch clamp EPC-9 (lub EPC-10).

3. Przygotowanie plastrów siatkówki z zatopionym w agarze

1. Wybierz złotą rybkę (Carassius auratus; 8-16 cm) i umieść w przykrytym wiadrze w ciemnym pomieszczeniu na 30 minut adaptacji do ciemności. Po znieczuleniu poddaj eutanazji uspokojoną złotą rybkę poprzez szybkie ścięcie głowy i podwójne nacięcie rdzenia kręgowego i pnia mózgu. Następnie usuń oczy nożyczkami z zakrzywioną końcówką i pęsetą z zakrzywioną końcówką. Procedury te zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Zdrowia i Nauki w Oregonie.
2. Wyciąć każde oko, przecinając równomiernie wokół przedniej części oka nożyczkami sprężynowymi (15003-08, Fine Science Tools; rozpocznij cięcie przez nakłucie końcówkami nożyczek) i umieść muszle oczne w schłodzonym roztworze plastrów (o niskiej zawartości wapnia). W razie potrzeby wyjmij soczewkę pęsetą (soczewka zwykle odczepia się wraz z przednią częścią oka). Usuń siatkówkę z przymocowanym nabłonkiem pigmentowym za pomocą pary cienkich kleszczyków z końcówką pod kątem 45° (11251-35, Fine Science Tools), aby odkleić siatkówkę od muszli ocznej, powoli przesuwając się wokół pełnych 360°. Przeciąć lub przeciąć nerw wzrokowy za pomocą cienkich kleszczy lub nożyczek sprężynowych. Delikatnie usuń siatkówkę za pomocą kombinacji kleszczyków z cienką końcówką pod kątem i ssania za pomocą zmodyfikowanej pipety Pasteura lub pipety transferowej (duża końcówka). Użyj kątowych kleszczyków z cienką końcówką, aby usunąć pozostałą część nabłonka pigmentowego przyczepionego do siatkówki. Powierzchnia oczyszczonej i zdrowej siatkówki powinna wydawać się ciemna, gładka i zabarwiona na czerwono. W celu całkowitego usunięcia wszystkich ciemnych komórek nabłonka pigmentowego należy przystosować siatkówkę do ciemności na 1 godzinę (⁸, 1992).
3. Izolowaną siatkówkę należy potraktować ~0,03% (wag./obj.; ~0.36 mg/ml w 1x roztworze w plastrze) hialuronidazą (³; H6254, Sigma) przez 15-30 minut w temperaturze pokojowej (20-23°C) w celu usunięcia ciała szklistego. Podczas tej inkubacji można przygotować lodowaty roztwór plastrów.
4. Wyciąć prostokątny kawałek siatkówki (~2x2 mm, zawierający pełną grubość siatkówki), usuwając zakrzywione krawędzie małym segmentem żyletki (Personna, obosiecznej, oczyszczonej 70% etanolem i_H2O) przymocowanej do korpusu plastikowej strzykawki o pojemności 1 ml i przenieś kawałek siatkówki do małego pojemnika wypełnionego roztworem agaru (przygotowanym w (1.2)). Staraj się zminimalizować ilość roztworu wokół siatkówki, gdy jest on umieszczany w płynnym agarze . Zanurzyć bezpośrednio w lodowatym roztworze plastrów (przygotowanym w (3.3)) w celu zestalenia agaru ^{20, 18, 9}. Używamy małego, ręcznie robionego pojemnika. Krótko mówiąc, mała, cylindryczna tubka (Fisherbrand, fiolki z próbkami polietylenu 2,5 ml, 03-338-1B) została przecięta na obu końcach i uszczelniona plastrami Parafilm (PM-996, Pechiney Plastic Packaging).
5. Pokrój stały blok agaru w sześcian o wymiarach 1x1x1 cm zawierający prostokątny kawałek siatkówki.
6. Przenieś blok do komory plastrów i przyklej go do powierzchni płyty do krojenia. Komora plastrów jest wstępnie schładzana w zamrażarce (-20°C). Pokrój blok na plastry o grubości 200-250 μm za pomocą krajalnicy Vibratome (VT1000S lub VT 1200S, Leica) w lodowatym roztworze do krojenia. W sumie można uzyskać od 5 do 10 plastrów, które są żywotne przez około 5 do 6 godzin.
7. Przenieś jeden z plastrów do komory rejestracyjnej. Umieść siatkę nylonowych nici przyklejonych do platynowej ramy ¹⁹ w kształcie litery U na wierzchu plastra i wykonuj w sposób ciągły (szybkość 1-2 ml na minutę) roztworem nagrywającym z bąbelkami 95% O₂ / 5% CO₂ (karbogen).

Rozwiązywanie problemów:

Jeśli kawałek siatkówki osadzony w bloku agaru zostanie oderwany lub wyjdzie z agaru podczas krojenia, można zwiększyć grubość plastra z 200 μm do 300 μm w krokach co 20 μm. Staraj się również zminimalizować ilość roztworu wokół siatkówki podczas przenoszenia i umieszczania go w płynnym agarze poprzez zasysanie dodatkowego roztworu za pomocą zwiniętej papierowej końcówki "Kimwipe". Innym sposobem uniknięcia tego problemu jest zmniejszenie rozmiaru kawałka siatkówki początkowo umieszczonego w agare. Ponieważ ciecz ciała szklistego uniemożliwia pełne przyczepienie się agaru do części siatkówki, może być konieczne wykonanie świeżej hialuronidazy lub dostosowanie czasu inkubacji (krok (3.3)).

4. Identyfikacja zakończenia synaptycznego komórki dwubiegunowej w przekroju siatkówki

1. Umieść wycinek siatkówki pod mikroskopem pionowym (np. BX51WI, Olympus). Oglądamy wycinek siatkówki z optyką kontrastu różnicowego w podczerwieni (IR-DIC) przez obiektyw z 60-krotnym zanurzeniem w wodzie (NA 0.90, Olympus) i kamerę CCD (XC-75, Sony). Sygnał wyjściowy z kamery CCD jest wysyłany do kontrolera kamery (C2400, Hamamatsu) w celu zwiększenia kontrastu przed wizualizacją na analogowym 13-calowym czarno-białym monitorze Sony. Mikroskop jest zamontowany na stoliku translacyjnym X-Y, a komora zapisu jest umieszczona na stałym stoliku ¹⁴.
2. Znajdź nienaruszone i aksotomizowane (wycięte aksonowo) dwubiegunowe zakończenia komórek, które można zidentyfikować na podstawie ich rozmiaru, kształtu i położenia w wycinku (ryc. 1). Akskotomizowane i nienaruszone zaciski można również odróżnić, badając ich pojemnościowe czasy zaniku prądu przejściowego (odpowiednio pojedyncze rozpady wykładnicze i podwójnie wykładnicze) oraz prądy Ca²⁺ (rysunek 2; ^{12, 14, 15}). Zakończenia Mb znajdują się w najbardziej proksymalnej warstwie sublaminy b (warstwa typu ON; przylegająca do warstwy komórek zwojowych) w wewnętrznej warstwie splotowatej siatkówki złotej rybki. Końcówki Mb, ze swoją matową powierzchnią i płaskim wyglądem, można łatwo odróżnić od zwojów i przemieszczonych somy amakrynowych, które wydają się jasne fazowo i kuliste. Ponadto krawędź końców Mb pokryta jest dużą gęstością kontaktów synaptycznych i wydaje się szorstka i nieregularna w porównaniu z gładkimi, czystymi powierzchniami komórek ganglionowych i amakrynowych (ryc. 1a-c). Aksotomizowane zakończenia Mb wydają się okrągłe i prawie okrągłe (ryc. 1c), podczas gdy nienaruszone zakończenia wydają się eliptyczne i rozciągnięte, często ze ściśniętym końcem skierowanym w stronę wewnętrznej warstwy jądrowej siatkówki (ryc. 1a,b).
3. Uszkodzone lub niezdrowe terminale często wyglądają na spuchnięte i mają kilka małych ziarnistych struktur na powierzchni. Możliwe jest uzyskanie plomby GΩ na tych zaciskach, ale istnieje prawdopodobieństwo, że pękną one wkrótce po włamaniu. Inne oznaki niezdrowych terminali obejmują pusty wygląd, kontrast i/lub jasność identyczną z otaczającym wycinkiem, a czasem lokalizację na powierzchni wycinka. Możliwe jest nagrywanie zarówno ze zdrowych końcówek głęboko w wycinku (zaleta: bardziej nienaruszone obwody synaptyczne), jak i w pobliżu powierzchni wycinka (zaleta: szybszy dostęp do perfuzji leków w roztworze zewnętrznym; łatwiejsze do uszczelnienia).

5. Zapisy elektrofizjologiczne i obrazowanie Ca²⁺

1. Za pomocą strzykawki z końcówką filtrującą 0,2 μm (Nalgene) napełnić szklaną pipetę z plastrem roztworem wewnętrznym do poziomu 1-2 centymetrów od tyłu pipety. Po usunięciu pęcherzyków powietrza z końcówki zabezpiecz pipetę w uchwycie, zastosuj nadciśnienie (1,2-1,6 psi) i przesuń ją w kierunku docelowego terminala za pomocą mikromanipulatora (MPC-200, Sutter Instrument). Przesuwając końcówkę w dół przez plasterek, przesuwaj pipetę w bocznym kierunku zamiatania, aby upewnić się, że plasterek nie jest ciągnięty razem z końcówką.
2. Przesuwaj końcówkę pipety po końcówce, aby oczyścić powierzchnię membrany. Popchnij końcówkę w dół na krawędzi terminala, aby utworzyć wgłębienie (wgłębienie) i zwolnij nadciśnienie. Jeśli uszczelka GΩ nie utworzy się natychmiast, zastosuj lekkie podciśnienie.
3. Po uszczelnieniu GΩ przełącz się na tryb nagrywania na ogniwie wzmacniacza patch clamp EPC-9 i zmień potencjał podtrzymania na -60 lub -70 mV. Zastosuj korekcję C-fast (szybkiej pojemności), poczekaj, aż uszczelka ustabilizuje się w zakresie 5-10 GΩ, a następnie rozerwij membranę za pomocą ostrego, delikatnego ssania podawanego doustnie, aby ustalić konfigurację zapisu całej komórki. Jeśli konfiguracja całego ogniwa została prawidłowo ustalona, rezystancja szeregowa będzie wynosić od 14 do 30 MΩ. Rezystancja wejściowa będzie wynosić 200-500 MΩ dla nienaruszonych końcówek i 1-3 GΩ dla aksotomijnych końcówek ¹⁴.
4. Obserwuj pojemnościowy prąd przejściowy (rysunek 2a i 2c), aby odróżnić nienaruszone i akskotomizowane dwubiegunowe zakończenia komórek. Nienaruszone i akskotomizowane końcówki Mb mają podstawową pojemność membrany wynoszącą odpowiednio 9-16 pF i 3-8 pF.
5. Zastosuj krok cęgowy napięcia o czasie trwania 200 ms od -70 do 0 mV do aksotomizowanego terminala Mb. Umożliwi to bezpośredni pomiar dużych (~200-600 pA), izolowanych prądów wewnętrznych Ca²⁺ aktywowanych przez otwarcie zależnych od napięcia kanałów Ca²⁺ typu L (ilustracja 2b). Równolegle można monitorować skok pojemności spowodowany egzocytozą pęcherzyków synaptycznych oraz szybkie, zależne od pH hamowanie prądu Ca^{2 +}, które następuje po egzocytozie ¹⁵, oraz hamowanie wzajemnego sprzężenia zwrotnego GABA-ergiczne (ryc. 3c; ²²). Jeśli załata się nienaruszony dwubiegunowy terminal komórkowy Mb, wynik będzie taki, jak pokazano na rysunku 2c i 2d. Nie obserwuje się dostrzegalnych prądów Ca²⁺ z powodu dużych prądów "upływowych" spowodowanych sprzężeniem szczelinowo-złączowym w dendrytach ogniw bipolarnych Mb ¹.
6. Zmiany pojemności membrany mogą być wywołane przez skokową depolaryzację od potencjału podtrzymania -70 mV do 0 mV przy użyciu metody "sinus + DC" czasowo-rozdzielczych pomiarów pojemności membrany ⁶. Skoki pojemności błony wskazują na fuzję pęcherzyków synaptycznych z błoną plazmatyczną. Sinusoidalne napięcie cęgowe 2 kHz (30 mV międzyszczytowe) zostało dodane do potencjału podtrzymania -70 mV. Prąd zapisu był analizowany w dwóch ortogonalnych kątach fazowych przez programową emulację wzmacniacza patch-clamp EPC-9 wzmacniacza typu lock-in (HEKA, Lambrecht, Niemcy). W nienaruszonym zacisku na rysunku 2d sinusoidalny bodziec o wysokiej częstotliwości (2 kHz) ogranicza analizowaną pojemność membrany do końców końcowych i aksonu, które mają pojemność bazową Cm ~ 6,8 pF. Błona ciała komórki i dendryty komórki bipolarnej są w ten sposób odfiltrowywane przez sinusoidę cęgową ¹³ o wysokiej częstotliwości.
7. W przypadku eksperymentów z obrazowaniem^Ca2+ należy dokładnie wymieszać roztwór pipety wewnętrznej z plastrem z barwnikiem fluorescencyjnym wrażliwym na^Ca2+ (np. Oregon Green 488 BAPTA-1 (100-200 μM; O-6806, Invitrogen)) i powtórzyć protokół od 5.1 do 5.5. Pozwoli to na połączenie obrazowania fluorescencyjnego z zapisem elektrofizjologicznym. Na przykład, możliwe jest zobrazowanie stanu przejściowego Ca²⁺ związanego z krokiem 200 ms od -70 do 0 mV w małych przydatkach telodendriów terminala Mb (Rysunek 3a,b). Zintegrowaliśmy nasz pionowy mikroskop Olympus z systemem laserowego mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem (CSU-X1, Yokogawa). Mikroskop konfokalny wykorzystuje linie laserowe o długości fali 488 nm i 561 nm, które są modulowane przez przestrajalny filtr akustyczno-optyczny. Dane pozyskiwane są za pomocą oprogramowania Slidebook (3i; Inteligentne instrumenty do obrazowania). Więcej informacji na temat technik obrazowania wapnia z wykorzystaniem neuronów siatkówki złotej rybki znajduje się w ^{24, 17, 3}.

Rozwiązywanie problemów:

Jeśli często nie udaje się ustalić konfiguracji całego ogniwa, nawet po utworzeniu stabilnego uszczelnienia GΩ, pomocne może być zmniejszenie podciśnienia używanego do przebicia membrany końcowej. Może się również zdarzyć, że optymalne ciśnienie ssania dla ustalenia konfiguracji całej komórki zmienia się w zależności od krzywizny błony (soma > końcu). Możliwe jest również użycie protokołu zap (amplituda: 400 mV, czas trwania: 100 μs), aby wprowadzić konfigurację całego ogniwa, samodzielnie lub w połączeniu z ostrym impulsem podciśnienia. Stwierdziliśmy, że protokół zap jest szczególnie przydatny w przypadku włamania przy użyciu końcówki do pipety o rezystancji kąpieli przekraczającej 12 MΩ.

6. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1. Identyfikacja dwubiegunowych zakończeń komórek Mb w wycinkach siatkówki złotej rybki. lit. a-c) Obrazy IR-DIC dwubiegunowych końców komórek Mb. Możemy zidentyfikować prawdopodobne akskotomizowane (wycięte aksonami) i nienaruszone zakończenia na obrazie IR-DIC. Aksotomiczny koniec wydaje się okrągły i okrągły, jak pokazano w c, podczas gdy nienaruszony koniec jest bardziej skłonny do wydania eliptycznego, jak pokazano w a i b. Klasyfikacja ta może być potwierdzona przez pomiar pojemności przejściowej (patrz rysunek 2) lub przez metodę napełniania barwnikiem (d-f). Czerwone strzałki wskazywały położenie przecięcia między aksonem a końcem aksonu dla nienaruszonych końców w a i b. Czerwona przerywana linia oznaczała kontur dwubiegunowych zakończeń komórek Mb. (D-F). Obrazy fluorescencyjne dwubiegunowych zakończeń komórek Mb z nienaruszonym aksonem (d), częściowo przeciętym aksonem (e) lub całkowicie usuniętym aksonem (f). Barwnik fluorescencyjny Alexa 555 (A20501MP, Invitrogen) został wypełniony roztworem wewnętrznym przed nagraniem. Bezpośrednio po zarejestrowaniu patch-clamp wycinek siatkówki przeniesiono do 4% (wag./obj.) paraformaldehydu (P6148, Sigma) w roztworze buforu fosforanowego (70013, GIBCO) i inkubowano przez 30 min. Plastry zamontowano na szkiełkach Superfrost (Fisher Scientific) w wodnym podłożu montażowym ze środkami zapobiegającymi blaknięciu (Biomeda corp). Alexa 555 zawierająca dwubiegunowe końcówki komórkowe Mb była oglądana za pomocą linii laserowej 555 nm (czerwonej) przy użyciu 40-krotnego obiektywu zanurzonego w wodzie na konfokalnym laserowym mikroskopie skaningowym (LSM 710, Carl Zeiss). Zwróć uwagę na obecność małych wyrostków telodendriów wystających z końców aksonów (niebieskie strzałki). Podziałka skali wskazuje 10 μm (a-f). INL: wewnętrzna warstwa jądrowa, IPL: wewnętrzna warstwa splotowata, GCL: warstwa komórek zwojowych.

Rysunek 2. Właściwości elektryczne aksotomizowanych i nienaruszonych dwubiegunowych końców komórek Mb. lit. a,c) Przejściowa odpowiedź prądowa aktywowana hiperpolaryzacją krokową napięcia od -60 mV do -70 mV. Krótka odpowiedź prądowa na krok cęgowy napięcia -10 mV może spowodować: 1) pojedynczy szybki wykładniczy zanik prądu o wysokiej rezystancji wejściowej przy -70 mV (wskazujący na akskotomizowany zacisk; panel a) lub 2) podwójny zanik wykładniczy z niską rezystancją wejściową przy -70 mV (wskazujący na nienaruszony zacisk; panel c; patrz także ^{12, 14, 15}). lit. b,d) Prądy Ca²⁺ i skoki pojemności membrany zostały wywołane przez depolaryzację skokową od -70 do 0 mV. Pomiary pojemności membrany w czasie wykorzystuje bodziec sinusoidalny o częstotliwości 2 kHz nałożony na spoczynkowy potencjał utrzymywania -70 mV ⁶. Czerwony ślad to uśredniona wartość punktów danych pojemności. Zauważ, że skok pojemności na rysunkach 2b i 2d jest równy około 200 fF.

Rysunek 3. Bezpośrednie pomiary sygnałów obrazowania Ca^{2 +}, egzocytozy i hamującego sprzężenia zwrotnego w dwubiegunowym końcu komórki Mb. (a) Przejściowy wzrost stężenia Ca²⁺ w telodendriach zacisku Mb był aktywowany przez stopniową depolaryzację napięciowo-cęgową od -70 do 0 mV przez 200 ms (strzałka). Oregon Green 488 BAPTA-1 (100 μM), barwnik wskaźnikowy Ca²⁺, został zawarty w pipecie z łatą. (b) Odpowiedni obraz fluorescencyjny telodendrii Mb (obszar zainteresowania oznaczony czerwoną linią przerywaną). (c) Krótkotrwała depresja synaptyczna uwalniania neuroprzekaźników (egzocytoza). Prądy Ca²⁺ (środkowa ścieżka) i pojemność membrany (dolna ścieżka) wywołane parą depolaryzacji 20 ms do 0 mV (górna ścieżka; interwał międzyimpulsowy 200 ms). Strzałka wskazuje wpływ egzocytozowanych protonów na prąd Ca^{2 +}, a także hamowanie wzajemnego sprzężenia zwrotnego GABAergiczne z sąsiednich komórek amakrynowych ^{15, 21}. Należy zauważyć, że hamowanie prądu Ca^{2 +} za pośrednictwem protonów, a także hamowanie wzajemnego sprzężenia zwrotnego GABAergiczne są obecne tylko w pierwszej odpowiedzi depolaryzacyjnej, która ma również skok pojemności z powodu egzocytozy pęcherzyków synaptycznych.

Discussion

Krytycznym i trudnym krokiem w naszym protokole jest przeniesienie fragmentu siatkówki do roztworu agaru (protokół 3.4). Konieczne jest ostrożne usunięcie cieczy ciała szklistego i resztkowego roztworu plastra z kawałka siatkówki i przeniesienie go bez zniekształceń lub zginania. Aby to osiągnąć, używamy małej szpatułki (21-401-25B, Fisherbrand) z końcówką wygiętą pod kątem 90°, wraz z kątowymi kleszczami do końcówek (11251-35, Fine Science Tools), aby ustawić kawałek siatkówki przez cały proces przenosz...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar o niskiej temperaturze żelowania	Sigma-Aldrich	A0701	agarozowa typu VII-A
	World Precision Instruments, Inc.	1B150F-4	Grubościenne (średnica zewnętrzna 1,5 mm) szkło borokrzemowe
Ściągacz pionowy	Narishige International	PP830
Wosk dentystyczny	Cavex
Nożyczki sprężynowe	Fine Science Tools	15003-08
45° kątowe kleszcze z cienką końcówką	Fine Science Tools	11251-35
Żyletka	Personna Opieka		Obusieczny, czyszczony 70% etanolem i H2O
Cylindryczna rurka	Fisher Scientific	03-338-1B	Fiolki na próbki polietylenu 2,5 ml
Hialuronidaza	Sigma-Aldrich	H6254
Krajalnica wibratomowa	Leica Microsystems	VT1000S lub VT1200S
Mikroskop pionowy	Olympus Corporation	BX51WI
60-krotny obiektyw zanurzeniowy w wodzie	Olympus Corporation	LUMPlanFl	NA 0.90
CCD	Sony Corporation	XC-75
Kontroler kamery	Hamamatsu Corp.	C2400
Monitor	Sony Corporation		13” czarno-biały
Filtr strzykawkowy	Nalge Nunc international		0,2 #x03BC; m
Mikromanipulator	Sutter Instrument Co.	MPC-200
Wzmacniacz blokujący	HEKA Instruments		Wzmacniacze EPC-9/10 mają emulację programową
Laserowy mikroskop konfokalny z wirującym dyskiem	Yokogawa	CSU-X1	Obrazowanie żywych komórek po nagraniu całych komórek z zaciskiem krosowym
Oprogramowanie do książeczki slajdów	Inteligentne instrumenty do obrazowania (3i)		Akwizycja i analiza danych obrazowych
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	P6148
Fosforanowy roztwór buforowy	GIBCO, firmy Life Technologies	70013
Szkiełko Superfrost	Fisher Scientific		Szkło ślizgowe
Środki zapobiegające blaknięciu	Biomeda corp.
Konfokalny laserowo-skaningowy mikroskop	Carl Zeiss, Inc.	LSM 710	Obrazowanie utrwalonej tkanki
Szpatułka	Fisher Scientific	21-401-25B
Krajalnica pionowa Manuel	Narishige International	ST-20
Oregon Green 488 BAPTA-1	Invitrogen	O-6806	Ca2+ wrażliwy barwnik fluorescencyjny
Alexa Fluor 555 Hydrazide	Invitrogen	A-20501MP	Barwnik fluorescencyjny