Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pomiary pojemności metodą patch-clamp oraz obrazowanie Ca2+ w pojedynczych zakończeniach nerwowych w skrawkach siatkówki

17.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3345

⸱

19 stycznia 2012

 ,  , 
1The Vollum Institute, Oregon Health and Science University

W tym artykule

Podsumowanie

W niniejszej pracy opisujemy protokół przygotowania skrawków siatkówki zatopionych w agarze, które nadają się do elektrofizjologii oraz obrazowania Ca2+. Metoda ta pozwala na badanie synaps wstążkowych w mikroobwodach siatkówki przy użyciu bezpośrednich rejestracji patch-clamp z pojedynczych przedsynaptycznych zakończeń nerwowych.

Streszczenie

Bodźce wzrokowe są wykrywane i przekazywane w szerokim zakresie dynamicznym natężeń światła i zmian częstotliwości przez wyspecjalizowane neurony w siatkówce kręgowców. Dwie klasy neuronów siatkówki, fotoreceptory i komórki bipolarne, realizują to zadanie za pomocą aktywnych stref typu wstążkowego, które umożliwiają trwałe i wysokowydajne uwalnianie neuroprzekaźników przez długie okresy czasu. Zakończenia zmieszanych komórek bipolarnych typu ON (Mb) w siatkówce złotej rybki, które depolaryzują w odpowiedzi na bodźce świetlne i otrzymują sygnały od fotoreceptorów pręcikowych i czopkowych, są odpowiednie do badania synaps typu wstążkowego zarówno ze względu na swój duży rozmiar (~10-12 μm średnicy), jak i liczne boczne oraz wzajemne połączenia synaptyczne z dendrytami komórek amakrynowych. Bezpośredni dostęp do zakończeń komórek bipolarnych Mb w skrawkach siatkówki złotej rybki z wykorzystaniem techniki patch-clamp umożliwia pomiar presynaptycznych prądów Ca2+, zmian pojemności błony oraz wzajemnego hamowania synaptycznego zapśredniczonego przez receptory GABAA i GABAC ekspresjonowane na zakończeniach. Pomiary pojemności błony presynaptycznej podczas egzocytozy pozwalają na badanie krótkotrwałej plastyczności uwalniania pobudzających neuroprzekaźników 14,15. Ponadto, badając wzajemne hamowanie zwrotne docierające do zakończenia Mb, można badać krótkotrwałą i długotrwałą plastyczność uwalniania hamujących neuroprzekaźników z komórek amakrynowych 21. W krótkich odstępach czasu (np. ~10 s) GABA-ergiczne wzajemne hamowanie zwrotne z komórek amakrynowych ulega depresji parowej w wyniku wyczerpania puli pęcherzyków GABA 11. W ten sposób można bezpośrednio badać dynamikę synaptyczną mikroukładów siatkówki w wewnętrznej warstwie splotowej siatkówki.

Technika plastrów mózgu została wprowadzona ponad 40 lat temu, lecz nadal jest bardzo przydatna do badania właściwości elektrycznych neuronów, zarówno na poziomie pojedynczej somy komórkowej, pojedynczej dendryty lub aksonu, jak i na poziomie synaptycznym mikroobwodów 19. Tkanki zbyt małe, aby można je było przykleić bezpośrednio do komory do krojenia, są często najpierw zatapiane w agarze (lub umieszczane na papierze filtracyjnym), a następnie krojone 20, 23, 18, 9. W tym filmie stosujemy technikę wstępnego zatapiania w agarze z wykorzystaniem siatkówki złotej rybki. Niektóre zakończenia olbrzymich komórek bipolarnych w naszych plastrach siatkówki złotej rybki zostają aksotomizowane (przecięte w obrębie aksonu) podczas procedury krojenia. Pozwala nam to wyizolować wejścia pojedynczych presynaptycznych zakończeń nerwowych, ponieważ rejestracja z aksotomizowanych zakończeń wyklucza sygnały z przedziału somatyczno-dendrytycznego. Alternatywnie można również rejestrować sygnały z nienaruszonych komórek bipolarnych Mb, dokonując pomiarów z zakończeń przyłączonych do aksonów, które nie zostały przecięte podczas procedury krojenia. Ogólnie rzecz biorąc, zastosowanie tego protokołu eksperymentalnego pomoże w badaniach fizjologii synaptycznej siatkówki, funkcjonalnej analizie mikroobwodów oraz przekazywania synaptycznego w synapsach wstążkowych.

Protokół

1. Roztwory zewnętrzne i wewnętrzne

  1. Przygotować roztwór do krojenia (z niską zawartością wapnia) z 10-krotnego roztworu zapasowego, dodając codziennie MgCl2, CaCl2 oraz D-glukozę. Końcowy roztwór 1x składa się z (w mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 3,2 MgCl2, 0,25 CaCl2, 12 D-glukozy, 0,2 kwasu L-askorbinowego, 12 HEPES. Ustawić pH na 7,4 (za pomocą NaOH) i dostosować osmolalność do 260 mOsm (używając H2O oraz 10-krotnego roztworu zapasowego).
  2. Odważyć 3% agar o niskiej temperaturze żelowania (Agarose type VII-A, A0701, Sigma; Rieke, 2001) i wymieszać z roztworem do krojenia. Podgrzewać roztwór z agarem w kuchence mikrofalowej przez 1-2 min lub do całkowitego rozpuszczenia, a następnie inkubować agar w łaźni wodnej (30-33°C), aby zapobiec szybkiemu zestaleniu (temperatura przejścia w żel: 26 ± 2°C).
  3. Przygotować roztwór do rejestracji (z normalną zawartością wapnia) z 10-krotnego roztworu zapasowego, dodając codziennie MgCl2, CaCl2 oraz D-glukozę. Końcowy roztwór 1x składa się z (w mM): 100 NaCl, 2,5 KCl, 1 MgCl2, 25 NaHCO3, 0,2 kwasu L-askorbinowego, 2,5 CaCl2, 12 D-glukozy. Po napowietrzaniu roztworu mieszanką 95% O2 / 5% CO2 (karbogenem) przez 5-10 minut, ustawić pH na 7,4 (za pomocą NaOH) i dostosować osmolalność do 260 mOsm (używając H2O oraz 10-krotnego roztworu zapasowego).
  4. Aliquoty (po 1 ml) wewnętrznych roztworów do pipet należy przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać w zamrażarce (-20°C). Do izolacji prądów wapniowych komórek bipolarnych zazwyczaj stosuje się dwa wewnętrzne roztwory do pipet (w mM):
    1. 40 CsCl, 60 glukonianu Cs, 10 tetraetyloamoniowego (TEA)-Cl, 28 HEPES, 3 Mg-ATP, 1 Na-GTP oraz 2 EGTA. Dostosować pH do 7,2 (za pomocą CsOH) i ustawić osmolalność na 250 mOsm. Ten wewnętrzny roztwór o wysokiej zawartości chlorków zazwyczaj zapewnia rejestracje przy niższej rezystancji szeregowej (lepsze warunki clampowania napięcia) i większe hamujące prądy postsynaptyczne (IPSCs) przy potencjale spoczynkowym błony komórki bipolarnej wynoszącym -60 mV.
    2. 95 glukonianu Cs, 10 TEA-Cl, 25 HEPES, 3 Mg-ATP, 0,5 Na-GTP oraz 0,5 EGTA. Dostosować pH do 7,2 (za pomocą CsOH) i ustawić osmolalność na 250 mOsm 22. Ten wewnętrzny roztwór o niskiej zawartości EGTA zazwyczaj prowadzi do większych zmian pojemności błony wywołanych depolaryzującymi impulsami skokowymi, co pozwala na badanie wyczerpywania się puli pęcherzyków oraz depresji krótkotrwałej.

2. Elektrody pipetowe do metody patch-clamp

  1. Przygotować borokrzemowe szkło o grubych ściankach (zewnętrzna średnica 1,5 mm) (1B150F-4; World Precision Instruments, Sarasota, FL) i wyciągnąć pipety do patch-clampu za pomocą pionowej wyciągarki (Narishige, PP830; Tokio, Japonia). Oporność pipet o otwartym wylocie w roztworach pomiarowych wynosi 7-8 MΩ, gdy pipeta jest wypełniona wewnętrznym roztworem do pipety nr 1.
  2. Równomiernie pokryć pipetę do patch-clampu woskiem dentystycznym (Cavex, West Chester, PA), od końcówki do poziomu trzpienia sięgającego uchwytu pipety. Pozwoli to zminimalizować pojemność pipety oraz szumy elektryczne, co umożliwi dokładniejsze pomiary pojemności o niskim poziomie szumów. Niska pojemność pipety wspomaga również elektroniczną kompensację C-fast (szybka pojemność) wzmacniacza patch-clamp EPC-9 (lub EPC-10).

3. Przygotowanie skrawków siatkówki zatopionych w agarze

  1. Wybrać złotą rybkę (Carassius auratus; 8-16 cm) i umieścić w przykrytym wiadrze w ciemnym pomieszczeniu na 30 min w celu adaptacji do ciemności. Po znieczuleniu przeprowadzić eutanazję oszołomionej rybki poprzez szybką dekapitację oraz podwójne zniszczenie rdzenia kręgowego i pnia mózgu (pithing). Następnie usunąć oczy za pomocą nożyczek i pęset o zakrzywionych końcach. Procedury te zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) na Oregon Health & Science University.
  2. Przeciąć każde oko w poprzek, wykonując równomiernie cięcie wokół przedniej części oka nożyczkami sprężynowymi (15003-08, Fine Science Tools; cięcie rozpocząć od nakłucia końcówkami nożyczek), a następnie umieścić skorupki gałek ocznych w schłodzonym roztworze do skrawania (o niskiej zawartości wapnia). W razie potrzeby usunąć soczewkę pęsetą (soczewka zazwyczaj oddziela się wraz z przednią częścią oka). Usunąć siatkówkę wraz z przylegającym nabłonkiem barwnikowym, używając cienkich pęsety o końcówkach pod kątem 45° (11251-35, Fine Science Tools), aby odwarstwić siatkówkę od skorupki oka, posuwając się powoli wokół pełnych 360°. Przeciąć lub odciąć nerw wzrokowy cienką pęsetą lub nożyczkami sprężynowymi. Ostrożnie usunąć siatkówkę, łącząc użycie pęsety o cienkich końcówkach pod kątem z odsysaniem za pomocą zmodyfikowanej pipety Pasteura lub pipety transferowej (z dużą końcówką). Użyć pęsety o cienkich końcówkach pod kątem, aby usunąć pozostałości nabłonka barwnikowego przytwierdzone do siatkówki. Powierzchnia oczyszczonej i zdrowej siatkówki powinna być ciemna, gładka i czerwona. W celu całkowitego usunięcia wszystkich ciemnych komórek nabłonka barwnikowego, poddać siatkówkę adaptacji do ciemności przez 1 godzinę (8, 1992).
  3. Traktować wyizolowaną siatkówkę hialuronidazą o stężeniu ~0,03% (mas.rodz.; ~0,36 mg/mL w 1x roztworze do skrawania) (3; H6254, Sigma) przez 15-30 min w temperaturze pokojowej (20-23°C), aby usunąć ciałko szkliste. Podczas inkubacji można przygotować lodowaty roztwór do skrawania.
  4. Wyciąć prostokątny fragment siatkówki (~2x2 mm, obejmujący pełną grubość siatkówki), usuwając zakrzywione krawędzie małym segmentem żyletki (Personna, dwustronna, oczyszczona 70% etanolem i H2O) przymocowanym do korpusu plastikowej strzykawki 1 mL, a następnie przenieść fragment siatkówki do małego pojemnika wypełnionego roztworem agaru (przygotowanym w (1.2)). Należy starać się zminimalizować ilość roztworu wokół siatkówki podczas umieszczania jej w ciekłym agarze. Zanurzyć bezpośrednio w lodowatym roztworze do skrawania (przygotowanym w (3.3)), aby zestalić agar 20, 18, 9. Stosujemy mały, wykonany ręcznie pojemnik. W skrócie, mała probówka cylindryczna (Fisherbrand, Polyethylene sample vials 2.5 ml, 03-338-1B) została odcięta z obu końców i uszczelniona łatkami z Parafilmu (PM-996, Pechiney Plastic Packaging).
  5. Odciąć stały blok agaru w sześcian o boku 1x1x1 cm zawierający prostokątny fragment siatkówki.
  6. Przenieść blok do komory do skrawania i przykleić go do powierzchni płytki do skrawania. Komora do skrawania jest wstępnie schłodzona w zamrażarce (-20°C). Pociąć blok na plastry o grubości 200-250 μm za pomocą wibrotomu (VT1000S lub VT 1200S, Leica) w lodowatym roztworze do skrawania. Można uzyskać łącznie od 5 do 10 plastrów, które pozostają żywe przez około 5 do 6 godzin.
  7. Przenieść jeden z plastrów do komory rejestracyjnej. Na wierzchu plastra umieścić siatkę z nici nylonowych przyklejonych do platynowej ramki w kształcie litery U 19 i prowadzić ciągłą perfuzję (z szybkością 1-2 mL na minutę) roztworem rejestracyjnym napowietrzonym mieszanką 95% O2 / 5% CO2 (karbogenem).

Rozwiązywanie problemów:

Jeśli fragment siatkówki zatopiony w bloku agaru odklei się lub wypadnie z agaru podczas krojenia, można zwiększyć grubość plastrów z 200 μm do 300 μm w przyrostach 20 μm. Należy również starać się zminimalizować ilość roztworu wokół siatkówki podczas jej przenoszenia i umieszczania w ciekłym agarze, odsysając nadmiar roztworu za pomocą zwiniętego papierowego ręcznika „Kimwipe”. Innym sposobem na uniknięcie tego problemu jest zmniejszenie rozmiaru fragmentu siatkówki początkowo umieszczanego w agarze. Ponieważ ciałko szkliste uniemożliwia pełne przyleganie agaru do fragmentu siatkówki, może być konieczne przygotowanie świeżej hialuronidazy lub dostosowanie czasu inkubacji (krok (3.3)).

4. Identyfikacja zakończenia synaptycznego komórki bipolarnej w skrawku siatkówki

  1. Umieść skrawek siatkówki pod mikroskopem pionowym (np. BX51WI, Olympus). Skrawek siatkówki obserwujemy za pomocą optyki kontrastu interferencyjnego w podczerwieni (IR-DIC) przez obiektyw imersyjny wodny 60x (NA 0.90, Olympus) i kamerę CCD (XC-75, Sony). Sygnał z kamery CCD jest przesyłany do kontrolera kamery (C2400, Hamamatsu) w celu wzmocnienia kontrastu przed wizualizacją na analogowym czarno-białym monitorze Sony 13". Mikroskop jest zamontowany na stole translacyjnym X-Y, a komora rejestracyjna znajduje się na stole stałym 14.
  2. Znajdź nienaruszone lub aksotomizowane (z przeciętym aksonem) zakończenia komórek bipolarnych, które można zidentyfikować po ich wielkości, kształcie i położeniu w skrawku (Ryc. 1). Zakończenia aksotomizowane i nienaruszone można również rozróżnić poprzez badanie czasów zaniku pojemnościowego prądu przejściowego (odpowiednio zaniki pojedynczo wykładnicze i podwójnie wykładnicze) oraz prądów Ca2+ (Ryc. 2; 12, 14, 15). Zakończenia Mb znajdują się w najbardziej proksymalnej warstwie sublamina b (warstwa typu ON; przylegająca do warstwy komórek zwojowych) w warstwie splotowej wewnętrznej siatkówki złotej rybki. Zakończenia Mb, z ich matową powierzchnią i płaskim wyglądem, można łatwo odróżnić od ciał komórek zwojowych i przemieszczonych komórek amacrynowych, które wydają się jasne w fazie i sferyczne. Ponadto krawędź zakończeń Mb jest pokryta wysoką gęstością kontaktów synaptycznych i wydaje się chropowata i nieregularna w porównaniu do gładkich, czystych powierzchni komórek zwojowych i amacrynowych (Ryc. 1a-c). Aksotomizowane zakończenia Mb mają kształt okrągły lub zbliżony do koła (Ryc. 1c), podczas gdy zakończenia nienaruszone wydają się eliptyczne i rozciągnięte, często z zawężonym końcem skierowanym w stronę warstwy jądrowej wewnętrznej siatkówki (Ryc. 1a,b).
  3. Uszkodzone lub niezdrowe zakończenia często wyglądają na obrzęknięte i wykazują kilka małych struktur ziarnistych na powierzchni. Możliwe może być uzyskanie uszczelnienia GΩ na takich zakończeniach, ale prawdopodobnie pękną one wkrótce po przełamaniu oporności membrany (break-in). Inne oznaki niezdrowych zakończeń obejmują wklęsły wygląd, kontrast i/lub jasność identyczną z otaczającym skrawkiem, a czasem lokalizację na powierzchni skrawka. Można rejestrować sygnały zarówno ze zdrowych zakończeń głęboko w skrawku (zaleta: bardziej nienaruszone obwody synaptyczne), jak i w pobliżu powierzchni skrawka (zaleta: szybszy dostęp do perfundowanych leków w roztworze zewnętrznym; łatwiejsze uszczelnienie).

5. Rejestracje elektrofizjologiczne i obrazowanie Ca2+

  1. Używając strzykawki z końcówką z filtrem 0,2 μm (Nalgene), napełnij szklaną pipetę do patch-clampu roztworem wewnętrznym do poziomu 1-2 centymetrów od tylnej części pipety. Po usunięciu pęcherzyków powietrza z końcówki, zamocuj pipetę w uchwycie, przyłóż dodatnie ciśnienie (1,2-1,6 psi) i przesuń ją w stronę docelowego terminala za pomocą mikromanipulatora (MPC-200, Sutter Instrument). Przesuwając końcówkę w dół przez skrawkę, poruszaj pipetą w kierunku bocznym (zamiatając), aby upewnić się, że skrawka nie jest pociągana wraz z końcówką.
  2. Przesuwaj końcówkę pipety wokół terminala, aby oczyścić powierzchnię błony. Dociśnij końcówkę w dół do krawędzi terminala, aby utworzyć wgłębienie (dołek), a następnie zwolnij dodatnie ciśnienie. Jeśli uszczelnienie GΩ nie utworzy się natychmiast, przyłóż lekkie podciśnienie.
  3. Po uzyskaniu uszczelnienia GΩ przełącz wzmacniacz patch-clamp EPC-9 w tryb rejestracji on-cell i zmień potencjał podtrzymujący na -60 lub -70 mV. Zastosuj korekcję C-fast (szybkiej pojemności), poczekaj, aż uszczelnienie ustabilizuje się w zakresie 5-10 GΩ, a następnie przerwij błonę za pomocą gwałtownego, delikatnego ssania ustnego, aby ustanowić konfigurację rejestracji whole-cell. Jeśli konfiguracja whole-cell została poprawnie ustanowiona, rezystancja szeregowa wyniesie od 14-30 MΩ. Rezystancja wejściowa wyniesie 200-500 MΩ dla nienaruszonych terminali i 1-3 GΩ dla terminali aksotomizowanych 14.
  4. Obserwuj przejściowy prąd pojemnościowy (Rysunek 2a i 2c), aby odróżnić nienaruszone terminale komórek dwubiegunowych od aksotomizowanych. Nienaruszone i aksotomizowane terminale Mb mają bazową pojemność błony wynoszącą odpowiednio 9-16 pF i 3-8 pF.
  5. Zastosuj skok potencjału clamp-voltage o czasie trwania 200 ms od -70 do 0 mV do aksotomizowanego terminala Mb. Pozwoli to na bezpośredni pomiar dużych (~200-600 pA), izolowanych prądów wewnątrzkomórkowych Ca2+ aktywowanych przez otwarcie napięziozależnych kanałów Ca2+ typu L (Rysunek 2b). Równolegle można monitorować skok pojemności spowodowany egzocytozą pęcherzyków synaptycznych oraz następującą po egzocytozie szybką, zależną od pH inhibicję prądu Ca2+ 15, a także GABAergiczną reciprocalną inhibicję zwrotną (Rysunek 3c; 22). W przypadku patch-clampu nienaruszonego terminala dwubiegunowej komórki Mb wynik będzie taki, jak przedstawiono na Rysunku 2c i 2d. Nie obserwuje się zauważalnych prądów Ca2+ ze względu na duże prądy „wycieku” wynikające z połączeń typu gap-junction w dendrytach dwubiegunowych komórek Mb 1.
  6. Zmiany pojemności błony można wywołać poprzez skokową depolaryzację z potencjału podtrzymującego -70 mV do 0 mV, stosując metodę „sine + DC” pomiarów pojemności błony w rozdzielczości czasowej 6. Skoki pojemności błony wskazują na fuzję pęcherzyków synaptycznych z błoną plazmatyczną. Do potencjału podtrzymującego -70 mV dodano sinusoidalną komendę clamp-voltage o częstotliwości 2 kHz (30 mV szczyt-szczyt). Prąd rejestrowany był analizowany pod dwoma ortogonalnymi kątami fazy przez emulację wzmacniacza lock-in w oprogramowaniu wzmacniacza patch-clamp EPC-9 (HEKA, Lambrecht, Niemcy). W nienaruszonym terminalu na Rysunku 2d wysokoczęstotliwościowy (2 kHz) bodziec sinusoidalny ogranicza analizowaną pojemność błony do zakończeń terminalnych i aksonu, które mają pojemność bazową Cm ~6,8 pF. W ten sposób błona ciała komórki i dendrytów komórki dwubiegunowej jest odfiltrowana przez wysokoczęstotliwościową sinusoidę clamp-voltage 13.
  7. W eksperymentach z obrazowaniem Ca2+ dokładnie wymieszaj wewnętrzny roztwór do pipety patch z fluorescencyjnym barwnikiem czułym na Ca2+ (np. Oregon Green 488 BAPTA-1 (100-200 μM; O-6806, Invitrogen)) i powtórz protokół od punktu 5.1 do 5.5. Pozwoli to na połączenie obrazowania fluorescencyjnego z rejestracją elektrofizjologiczną. Możliwe jest na przykład obrazowanie przejściowego stężenia Ca2+ związanego ze skokiem 200 ms od -70 do 0 mV w małych wyrostkach telodendriów terminala Mb (Rysunek 3a,b). Zintegrowaliśmy nasz mikroskop pionowy Olympus z systemem konfokalnego mikroskopu laserowego z dyskiem obrotowym (CSU-X1, Yokogawa). Mikroskop konfokalny wykorzystuje linie laserowe 488 nm i 561 nm, które są modulowane przez akusto-optyczny filtr strojony. Dane są pozyskiwane za pomocą oprogramowania Slidebook (3i; Intelligent Imaging Instruments). Dalsze szczegóły dotyczące technik obrazowania wapnia w neuronach siatkówki złotych rybek znajdują się w 24, 17, 3.

Rozwiązywanie problemów:

Jeśli wielokrotnie nie udaje się uzyskać konfiguracji whole-cell, nawet po utworzeniu stabilnego uszczelnienia GΩ, pomocne może być zmniejszenie podciśnienia stosowanego do przebicia membrany terminalnej. Możliwe jest również, że optymalne ciśnienie ssania dla ustanowienia konfiguracji whole-cell zmienia się w zależności od krzywizny błony (soma > terminal). Można również zastosować protokół zap (Amplituda: 400 mV, Czas trwania: 100 μs), aby wejść w konfigurację whole-cell, samodzielnie lub w połączeniu z gwałtownym impulsem podciśnienia. Stwierdziliśmy, że protokół zap jest szczególnie przydatny podczas break-in, gdy końcówka pipety posiada oporność w kąpieli przekraczającą 12 MΩ.

6. Reprezentatywne wyniki

Obrazy mikroskopowe neuronów w siatkówce, zaznaczone obszary w warstwach INL, IPL, GCL; analiza fluorescencji.
Rycina 1. Identyfikacja zakończeń komórek bipolarnych Mb w skrawkach siatkówki złotej rybki. (a-c) Obrazy IR-DIC zakończeń komórek bipolarnych Mb. Na obrazie IR-DIC możemy zidentyfikować prawdopodobnie aksonotomizowane (przecięte w obrębie aksonu) i nienaruszone zakończenia. Zakończenie aksonotomizowane ma kształt okrągły i kolisty, jak pokazano w c, podczas gdy zakończenie nienaruszone częściej ma kształt eliptyczny, jak pokazano w a i b. Klasyfikację tę można potwierdzić za pomocą pomiaru pojemności przejściowej (patrz Rycina 2) lub metodą wypełniania barwnikiem (d-f). Czerwone strzałki wskazują miejsce przecięcia aksonu z zakończeniem aksonalnym dla zakończeń nienaruszonych w a i b. Czerwona przerywana linia wskazuje kontur zakończeń komórek bipolarnych Mb. (d-f). Obrazy fluorescencyjne zakończeń komórek bipolarnych Mb z nienaruszonym aksonem (d), częściowo przeciętym aksonem (e) lub całkowicie usuniętym aksonem (f). Fluorescencyjny barwnik Alexa 555 (A20501MP, Invitrogen) dodano do roztworu wewnętrznego przed rejestracją. Bezpośrednio po rejestracji metodą patch-clamp skrawki siatkówki przeniesiono do 4% (mas/obj) paraformaldehydu (P6148, Sigma) w roztworze buforu fosforanowego (70013, GIBCO) i inkubowano przez 30 min. Skrawki zamontowano na szkiełkach Superfrost (Fisher Scientific) w wodnym medium montażowym z dodatkiem środków zapobiegających blaknięciu (Biomeda corp). Zakończenia komórek bipolarnych Mb zawierające Alexa 555 obrazowano linią lasera 555 nm (czerwona) przy użyciu obiektywu imersyjnego wodnego 40x w konfokalnym skaningowym mikroskopie laserowym (LSM 710, Carl Zeiss). Zwróć uwagę na obecność małych wyrostków telodendriów wystających z zakończeń aksonalnych (niebieskie strzałki). Pasek skali oznacza 10 μm (a-f). INL: wewnętrzna warstwa jądrowa, IPL: wewnętrzna warstwa splotowa, GCL: warstwa komórek zwojowych.

Wykres elektrofizjologiczny zakończeń aksonotomizowanych w porównaniu z nienaruszonymi, pokazujący odpowiedzi prądowe w metodzie voltage-clamp.
Rycina 2. Właściwości elektryczne zakończeń komórek dwubiegunowych Mb aksonotomizowanych i nienaruszonych. (a,c) Przejściowa odpowiedź prądowa aktywowana skokową hiperpolaryzacją w metodzie voltage-clamp z potencjału spoczynkowego -60 mV do -70 mV. Krótka odpowiedź prądowa na skok napięcia o -10 mV w metodzie voltage-clamp może skutkować: 1) pojedynczym, szybkim wykładniczym spadkiem prądu przy wysokiej rezystancji wejściowej przy -70 mV (wskazującym na zakończenie aksonotomizowane; panel a), lub 2) podwójnym spadkiem wykładniczym przy niskiej rezystancji wejściowej przy -70 mV (wskazującym na zakończenie nienaruszone; panel c; patrz również 12, 14, 15). (b,d) Prądy Ca2+ oraz skoki pojemności błony zostały wywołane skokową depolaryzacją od -70 do 0 mV. Pomiary pojemności błony w rozdzielczości czasowej wykorzystują bodziec sinusoidalny o częstotliwości 2 kHz nałożony na spoczynkowy potencjał utrzymujący wynoszący -70 mV 6. Czerwona linia przedstawia uśrednioną wartość punktów danych pojemności. Należy zauważyć, że skok pojemności na Rycini 2b i 2d wynosi w obu przypadkach około 200 fF.

Schemat elektrofizjologiczny; metoda patch-clamp, odpowiedź na depolaryzację, analiza komórek dwubiegunowych.
Rycina 3. Bezpośrednie pomiary sygnałów obrazowania Ca2+, egzocytozy i sprzężenia zwrotnego hamującego w terminalu komórki dwubiegunowej Mb. (a) Przejściowy wzrost stężenia Ca2+ w telodendriach terminalu Mb został aktywowany przez skokową depolaryzację w układzie voltage-clamp od -70 do 0 mV przez 200 ms (strzałka). Do pipety patch włączono Oregon Green 488 BAPTA-1 (100 μM), barwnik wskaźnikowy Ca2+. (b) Odpowiadający temu obraz fluorescencyjny telodendriów Mb (obszar zainteresowania zaznaczony czerwoną linią przerywaną). (c) Krótkotrwała depresja synaptyczna uwalniania neurotransmitera (egzocytoza). Prądy Ca2+ (środkowy ślad) i pojemność błony (dolny ślad) wywołane parą depolaryzacji do 0 mV trwających 20 ms (górny ślad; 200 ms odstępu między impulsami). Strzałka wskazuje wpływ protonów uwalnianych podczas egzocytozy na prąd Ca2+, a także GABAergiczne wzajemne hamowanie sprzężenia zwrotnego z sąsiednich komórek amacrine 15, 21. Należy zauważyć, że hamowanie prądu Ca2+ za pośrednictwem protonów oraz GABAergiczne wzajemne hamowanie sprzężenia zwrotnego występują tylko w pierwszej odpowiedzi depolaryzacyjnej, która wykazuje również skok pojemności wynikający z egzocytozy pęcherzyków synaptycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Krytycznym i trudnym etapem naszego protokołu jest przeniesienie fragmentu siatkówki do roztworu agaru (protokół 3.4). Konieczne jest staranne usunięcie ciała szklistego oraz pozostałości roztworu do plastrów z fragmentu siatkówki i przeniesienie go bez deformacji lub zagięć. Aby to osiągnąć, używamy małej szpatułki (21-401-25B, Fisherbrand) z końcówką zagiętą pod kątem 90°, a także pęsety z zakrzywioną końcówką (11251-35, Fine Science Tools), aby pozycjonować fragment siatkówki w roztworze do plastrów p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie mamy żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy dr. Fredowi Rieke za uprzejme wyjaśnienia dotyczące przygotowania przekrojów siatkówki zatopionych w agarozie, gdy zaczęliśmy stosować ten protokół w naszym laboratorium. Dziękujemy również Lori Vaskalis za ilustrację schematu ogólnego oraz dr. Veeramuthu Balakrishnanowi i dr Soyoun Cho za pomocne uwagi do tekstu i filmu. Praca ta była finansowana z grantu NEI-NIH RO1, a także częściowo wspierana przez grant Korea Research Foundation finansowany przez rząd Korei [KRF-2008-357-E00032].

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Agar o niskiej temperaturze żelowaniaSigma-AldrichA0701Agaroza typu VII-A
Pipeta do patch-clampWorld Precision Instruments, Inc.1B150F-4Grubościenne szkło borokrzemowe (średnica zewnętrzna 1,5 mm)
Pionowa wyciągarkaNarishige InternationalPP830
Wosk dentystycznyCavex
Nożyczki sprężynoweFine Science Tools15003-08
Pinceta z cienkim czubkiem pod kątem 45°Fine Science Tools11251-35
ŻyletkaPersonna Medical CareDwustronna, oczyszczona 70% etanolem i H2O
Probówka cylindrycznaFisher Scientific03-338-1BPolietylenowe fiolki na próbki 2,5 ml
HialuronidazaSigma-AldrichH6254
WibratomLeica MicrosystemsVT1000S lub VT1200S
Mikroskop pionowyOlympus CorporationBX51WI
Obiektyw imersyjny wodny 60xOlympus CorporationLUMPlanFlNA 0,90
Kamera CCDSony CorporationXC-75
Kontroler kameryHamamatsu Corp.C2400
MonitorSony CorporationMonitor czarno-biały 13”
Filtr strzykawkowyNalge Nunc international0,2 μm
MikromanipulatorSutter Instrument Co.MPC-200
Wzmacniacz lock-inHEKA InstrumentsWzmacniacze EPC-9/10 posiadają emulację programową
Konfokalny mikroskop laserowy z dyskiem wirującymYokogawaCSU-X1Obrazowanie żywych komórek po rejestracji whole-cell metodą patch-clamp
Oprogramowanie SlidebookIntelligent Imaging Instruments (3i)Pozyskiwanie i analiza danych obrazowania
ParaformaldehydSigma-AldrichP6148
Roztwór buforu fosforanowegoGIBCO, by Life Technologies70013
Lasteczka SuperfrostFisher ScientificSzkło przedmiotowe
Odczynniki przeciwwyblakanioweBiomeda corp.
Konfokalny skaningowy mikroskop laserowyCarl Zeiss, Inc.LSM 710Obrazowanie utrwalonej tkanki
SpatułkaFisher Scientific21-401-25B
Ręczny przecinacz pionowyNarishige InternationalST-20
Oregon Green 488 BAPTA-1InvitrogenO-6806Fluorescencyjny barwnik czuły na Ca2+
Hydrazyd Alexa Fluor 555InvitrogenA-20501MPBarwnik fluorescencyjny

Bibliografia

  1. Obeso, J. A., Olanow, C. W., Nutt, J. G. Levodopa motor complications in Parkinson's disease. Trends Neurosci. 23, S2-S7 (2000).
  2. Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).
  3. Obeso, J. A. The evolution and origin of motor complications in Parkinson's disease. Neurology. 55, S13-S20 (2000).
  4. WHO. Noncommunicable Diseases and Mental Health Cluster, Noncommunicable Disease Prevention and Health Promotion Department, Ageing and Life Course . Active ageing: a policy framework. , (2002).
  5. Schapira, A. H. Movement disorders: advances in cause and treatment. Lancet Neurology. 9, 6-7 (2010).
  6. Obeso, J. A., Rodriguez-Oroz, M. C., Rodriguez, M., DeLong, M. R., Olanow, C. W. Pathophysiology of levodopa-induced dyskinesias in Parkinson's disease: problems with the current model. Ann. Neurol. 47, 22-32 (2000).
  7. Cenci, M. A., Lee, C. S., Bjorklund, A. L-DOPA-induced dyskinesia in the rat is associated with striatal overexpression of prodynorphin- and glutamic acid decarboxylase mRNA. Eur. J. Neurosci. 10, 2694-2706 (1998).
  8. Andersson, M., Hilbertson, A., Cenci, M. A. Striatal fosB expression is causally linked with l-DOPA-induced abnormal involuntary movements and the associated upregulation of striatal prodynorphin mRNA in a rat model of Parkinson's disease. Neurobiol Dis. 6, 461-474 (1999).
  9. Hanrieder, J. Alterations of striatal neuropeptides revealed by imaging mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics. , (2011).
  10. Cornett, D. S., Reyzer, M. L., Chaurand, P., Caprioli, R. M. MALDI imaging mass spectrometry: molecular snapshots of biochemical systems. Nat. Methods. 4, 828-833 (2007).
  11. Ljungdahl, Imaging Mass Spectrometry Reveals Elevated Nigral Levels of Dynorphin Neuropeptides in L-DOPA-Induced Dyskinesia in Rat Model of Parkinson's Disease. PLoS ONE. 6, e25653-e25653 (2011).
  12. Groseclose, M. R., Andersson, M., Hardesty, W. M., Caprioli, R. M. Identification of proteins directly from tissue: in situ tryptic digestions coupled with imaging mass spectrometry. J. Mass. Spectrom. 42, 254-262 (2007).
  13. Andersson, M., Groseclose, M. R., Deutch, A. Y., Caprioli, R. M. Imaging mass spectrometry of proteins and peptides: 3D volume reconstruction. Nat. Methods. 5, 101-108 (2008).
  14. Deininger, S. -O. Imaging Mass Spectrometry. Setou, M. , Springer. Japan. 199-208 (2010).
  15. Norris, J. L. Processing MALDI Mass Spectra to Improve Mass Spectral Direct Tissue Analysis. Int. J. Mass. Spectrom. 260, 212-221 (2007).
  16. Ihaka, R., Gentleman, R. R. A Language for Data Analysis and Graphics. Journal of Computational and Graphical Statistics. 5, 299-314 (1996).
  17. Li, H., Chen, S., Hong, D., Li, M., Shyr, Y. Mass Spectrometry Binning Software GAB. , (2012).
  18. Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 5116-5121 (2001).
  19. Bergstrom, L., Christensson, I., Folkesson, R., Stenstrom, B., Terenius, L. An ion exchange chromatography and radioimmunoassay procedure for measuring opioid peptides and substance P. Life. Sci. 33, 1613-1619 (1983).
  20. Falth, M. Neuropeptidomics strategies for specific and sensitive identification of endogenous peptides. Mol. Cell. Proteomics. 6, 1188-1197 (2007).
  21. Falth, M. a database designed for endogenous peptides and mass spectrometry. Mol. Cell. Proteomics. 5, 998-1005 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

pojemność błonyobrazowanie wapniaterminale komórek bipolarnychsynapsy wstążkowekrojenie w wibratomiezatapianie w agarozierejestracja whole-cellegzocytoza pęcherzyków synaptycznych
Pomiary pojemności metodą patch-clamp oraz obrazowanie Ca2+ w pojedynczych zakończeniach nerwowych w skrawkach siatkówki
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.