Osy pasożytnicze stanowią główną grupę naturalnych wrogów wielu owadów, w tym Drosophila melanogaster. Przedstawimy techniki rozmnażania tych pasożytów w gatunkach Drosophila spp. oraz zademonstrujemy sposób analizy ich wpływu na tkanki odpornościowe larw Drosophila.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wprowadzenie do os w pasożytach Drosophila i odpowiedzi immunologicznej przeciwpasożytniczej
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Większość znanych gatunków os bleskotnic atakuje stadia larwalne lub poczwarki Drosophila. Podczas gdy Trichopria drosophilae infekują stadia poczwarki gospodarza (Rys. 1A-C), samice z rodzaju Leptopilina (Rys. 1D, 1F, 1G) oraz Ganaspis (Rys. 1E) atakują stadia larwalne. Wykorzystujemy te pasożyty do badania molekularnych podstaw biologicznego wyścigu zbrojeń. Pasożytnicze osy mają ogromną wartość jako środki biologicznej kontroli. Większość z nich przenosi czynniki wirulencji i inne elementy, które modyfikują fizjologię i odporność gospodarza. Analiza os Drosophila dostarcza wiedzy na temat tego, w jaki sposób interakcje specyficzne dla gatunków kształtują struktury genetyczne społeczności naturalnych. Badania te służą również jako model do zrozumienia fizjologii odporności gospodarzy oraz tego, w jaki sposób skoordynowane reakcje immunologiczne są przełamywane przez tę klasę pasożytów.
Kutikula larwy/poczwarki służy jako pierwsza linia obrony. Wykładzina jajowa osy jest ostrą, igłową strukturą, która efektywnie wprowadza jaja do hemocoel gospodarza. Po złożeniu jaj następuje reakcja gojenia rany w obrębie kutikuli (Ryc. 1C, groty strzał). Niektóre osy potrafią wprowadzić dwa lub więcej jaj do tego samego gospodarza, choć udaje się rozwinąć tylko jedno z nich. Nadmiarowe jaja lub rozwijające się larwy są eliminowane w procesie, który nie jest jeszcze w pełni zrozumiały. Z tego powodu osy te określa się mianem parazytoidów samotniczych.
W zależności od szczepu muchy i gatunku osy, jaja osy spotyka jeden z dwóch losów. Są one albo enkapsulowane, co blokuje ich rozwój (wykluwa się gospodarz; Ryc. 2 lewa); albo jajo osy wykluwa się, rozwija, przechodzi liniecie i przekształca się w dorosłego owada (wykluwa się osa; Ryc. 2 prawa). L. heterotoma jest jednym z najlepiej przebadanych gatunków os pasożytniczych z rodzaju Drosophila. Jest to „generalista”, co oznacza, że może wykorzystywać większość gatunków Drosophila jako gospodarzy1. L. heterotoma i L. victoriae są gatunkami siostrzanymi i produkują cząsteczki przypominające wirusy, które aktywnie zakłócają odpowiedź enkapsulacyjną2. W przeciwieństwie do L. heterotoma, L. boulardi jest pasożytem specjalistycznym, a zakres wykorzystywanych przez nią gatunków Drosophila jest stosunkowo ograniczony1. Szczepy L. boulardi również produkują cząsteczki przypominające wirusy3, choć znacząco różnią się zdolnością do skutecznego rozmnażania na D. melanogaster1. Niektóre z tych szczepów L. boulardi są trudne w hodowli na D. melanogaster1, ponieważ gospodarz często skutecznie enkapsuluje ich jaja. Dlatego w konkretnych protokołach eksperymentalnych istotna jest wiedza na temat obu partnerów.
Oprócz tkanek barierowych (kutykuli, jelita i tchawki), larwy Drosophila posiadają systemowe odpowiedzi immunologiczne komórkowe i humoralne, które wynikają odpowiednio z funkcji komórek krwi oraz ciała tłuszczowego. Składanie jaj przez L. boulardi aktywuje oba ramiona odpornościowe1,4. Komórki krwi znajdują się w krwiobiegu, w populacjach osiadłych pod segmentową kutykulą oraz w gruczole limfatycznym. Gruczół limfatyczny jest niewielkim organem krwiotwórczym znajdującym się na grzbietowej stronie larwy. Zgrupowania komórek krwiotwórczych, zwane płatami, są rozmieszczone segmentowo w parach wzdłuż naczynia grzbietowego, które biegnie wzdłuż osi przednio-tylnej zwierzęcia (Rys. 3A). Ciało tłuszczowe jest dużym, wielofunkcyjnym organem (Rys. 3B). Wydziela ono peptydy przeciwdrobnoustrojowe w odpowiedzi na infekcje mikrobiologiczne i metazoiczne.
Infekcja osy aktywuje sygnalizację immunologiczną (Ryc. 4)4. Na poziomie komórkowym wywołuje ona podziały i różnicowanie komórek krwi. W ramach samoobrony w hemocelu zainfekowanych zwierząt powstają agregaty i kapsuły (Ryc. 5)5,6. Aktywowane komórki krwi migrują w stronę jaja (lub larwy) osy i zaczynają tworzyć wokół niego kapsułę (Ryc. 5A-F). Niektóre komórki krwi agregują, tworząc guzki (Ryc. 5G-H). Dokładna analiza wykazuje, że infekcja osy indukuje rozproszenie obrzeży najbardziej przednich płatów gruczołu limfy (Ryc. 6C, D).
Przedstawiamy reprezentatywne dane dotyczące komponentów szlaku transdukcji sygnału Toll: Dorsal i Spätzle (Rys. 4,5,7), oraz jego celu Drosomycin (Rys. 6), aby zilustrować, w jaki sposób można badać specyficzne zmiany w gruczole limfy i hemoceli po infekcji osą. Opisane tutaj protokoły sekcji pozwalają również na wyizolowanie jaj os (lub rozwijających się stadiów os) z hemolimfy gospodarza (Rys. 8).
Protokół
Cały protokół eksperymentu podzielono na cztery etapy (Rys. 9). (1) Hodowla os w larwach much; (2) Wywoływanie infekcji i przygotowanie zwierząt do sekcji; (3) Izolacja i utrwalanie struktur gospodarza/pasożyta; (4) Analiza tkanek odpornościowych.
1. Hodowla os w larwach Drosophila
Utrzymanie kultur os w wymaga starannego planowania. W porównaniu z hodowlą much jest ono dość pracochłonne. Kolonie os utrzymujemy w laboratorium na larwach lub poczwarkach y w szczep Muszka owocówka w 24 °CHodowla os w wymaga zapewnienia ciągłego źródła gospodarzy w odpowiednim stadium rozwoju oraz usuwania z „zainfekowanych” fiolek much, które wykluwają się przed osami. Osy wykazują haplodiploidalny system determinacji płci, dlatego istotne jest, aby samice zostały zapłodnione przed zainfekowaniem gospodarzy.
- W dniu 1. dodaj niewielką ilość świeżo przygotowanej pasty drożdżowej (sporządzonej poprzez wymieszanie 1 ml wody z około 1 g aktywnych drożdży suchych) do nowej fiolki z pożywką dla muszek. Przepis na pożywkę nie jest krytyczny; hodujemy muszki na podłożu z mąki kukurydzianej, sacharozy i agaru. Umieść 50-60 młodych (2-4 dniowych) dorosłych muszek y w (lub innego szczepu w zasadzie typu dzikiego), aby znosiły jaja przez 48 godzin w temperaturze 24 °C.
- W dniu 3. usuń muszki z fiolek. Zamknij fiolkę korkiem typu „buzz plug”, nakładając kroplę miodu na wewnętrzną stronę korka. Miód należy rozcieńczyć w wodzie destylowanej w stosunku 2:1.
- Używając CO2, znieczul osy i odsortuj 6-8 samic oraz 6-8 samców w wieku około 2-3 dni. Przenieś je do fiolki zawierającej gospodarzy w wieku 0-48 godzin. Należy pamiętać, że osy są bardziej wrażliwe na CO2 niż muszki, dlatego może być konieczna kalibracja czasu ekspozycji na gaz. Badacze Drosophila nie stosują standardowej konstrukcji stacji znieczulającej dla Drosophila. Dobrym punktem wyjścia przy znieczulaniu os jest ustawienie ciśnienia CO2 na około połowę wartości wymaganej do znieczulenia muszek.
- Ponownie zamknij fiolkę korkiem „buzz plug” (z miodem). Ostrożnie połóż fiolkę na boku, aż osy się obudzą.
- Umieść fiolki z larwami muszek i osami w inkubatorze w temperaturze 24 °C.
- Udane infekcje spowodują lekkie opóźnienie pupariacji. Gospodarze, którzy zostali zaatakowani przez osy, ale zdołali się obronić (lub nie zostali zainfekowani), kontynuują rozwój zgodnie z normalnym harmonogramem, a dorosłe muszki wykluwają się z tych pupariów znacznie wcześniej niż osy.
- W zależności od gatunku osy i temperatury, osy wykluwają się w ciągu 25-30 dni.
- Usuń dorosłe muszki z fiolek, w których rozwijają się osy.
2. Wykonywanie infekcji i przygotowanie zainfekowanych zwierząt do sekcji
Przed rozpoczęciem pracy należy przygotować kilka czystych szalek Petriego ze szkła lub tworzywa sztucznego, Pyrexowską korytko do sekcji z 9 wgłębieniami, chusteczki Kimwipes, wodę destylowaną (w butelce z rozpylaczem), 70% etanol (w butelce z rozpylaczem), 1X PBS (w butelce z rozpylaczem), szkiełka przedmiotowe oraz małą, czystą szpatułkę.
- Aby przygotować infekcje, należy postępować zgodnie z krokami 1-5 opisanymi powyżej. W zależności od eksperymentu konieczne może być użycie gospodarzy znajdujących się na podobnym etapie rozwoju. W tym celu do infekcji można wykorzystać jaja zniesione od 2 do 6 godzin wcześniej.
- Aby zebrać zainfekowane larwy (do sekcji tkanek odpornościowych lub pasożytów), należy przenieść zawartość fiolek z muchami do małej szklanej lub plastikowej szalki Petriego.
- Używając stereomikroskopu i precyzyjnej pęsety, należy ostrożnie i pojedynczo wybrać 6-10 larw i umieścić je w dołku z 1X PBS, a następnie kolejno przenieść je do wody, 70% etanolu, wody i 1X PBS. Celem tych etapów jest oczyszczenie zwierząt z pożywki dla much oraz dokładne oczyszczenie i sterylizacja ich powierzchni. Płukanie w wodzie rozcieńcza etanol, a końcowe płukanie w PBS usuwa etanol. W odniesieniu do kroku 3 poniżej, zaleca się, aby nie pozostawiać zwierząt w PBS dłużej niż przez 10 minut.
3. Izolacja i utrwalanie struktur gospodarz/pasożyt
Wprowadzenie
Larwalna gruczoł chłonny jest niewielkim organem krwiotwórczym7. W trzecim stadium larwalnym gruczoł chłonny zawiera dużą parę płatów przednich, które flankują naczynie grzbietowe (Ryc. 3A, 6B-C, 7A-D). Płaty przednie są dalej podzielone na wyspecjalizowane regiony o unikalnych właściwościach komórkowych7. W płatach przednich znajdują się progenitory trzech typów komórek: plazmocytów, lamellocytów oraz komórek kryształowych. Komórki osierdzia oddzielają płaty przednie od mniejszych płatów tylnych. Gruczoł chłonny Drosophila jest modelem dla hemopoezy owadów i ssaków8,9.
Ciało tłuszczowe jest funkcjonalnie podobne do wątroby ssaków. Odpowiedź humoralna jest wyzwalana w ciele tłuszczowym po infekcji mikrobiologicznej lub infekcji osami1,4,10. W rezultacie aktywowana jest unikalna kombinacja genów peptydów przeciwdrobnoustrojowych, a peptydy te są wydzielane do hemolimfy1. Ciało tłuszczowe jest również główną tkanką odpowiedzialną za produkcję i magazynowanie glikogenu oraz triglicerydów11. Ciało tłuszczowe larwy zajmuje znaczną objętość hemocelu i w przeciwieństwie do gruczołu limfatycznego jest łatwe do zlokalizowania. Przedstawimy teraz sposób preparacji gruczołu limfatycznego oraz ciała tłuszczowego z larw trzeciego stadium.
Przed rozpoczęciem
Wymagane są precyzyjne pęsety oraz oczyszczone etanolem szkiełka przedmiotowe.
Disekcja gruczołu chłonnego larwy
- Za pomocą precyzyjnej pęsety należy wybrać wędrującą larwę trzeciego stadium utrzymywaną w 1X PBS.
- Larwę należy umieścić na szkiełku przedmiotowym.
- Za pomocą pęsety należy ustawić zwierzę stroną brzuszną do góry.
- Używając dwóch pęset, należy utrzymać zwierzę po obu stronach końca tylnego (groty strzałek 1, Rys. 3A) i delikatnie pociągnąć kutykulę, aby wywołać niewielkie, powierzchowne przerwanie kutykuli.
- Hemolimfa zawierająca hemocyty, jelito i ciało tłuszczowe zacznie wypływać z jamy ciała. W razie potrzeby hemolimfę można pobrać za pomocą pipety automatycznej o objętości 10 μl w celu wykonania rozmazów.
- Umieszczając obie pęsety po prawej stronie zwierzęcia pod haczykami gębowymi (groty strzałek 2, Rys. 3A), należy delikatnie przerwać kutykulę.
- Obie pęsety należy przenieść na lewą stronę zwierzęcia pod haczyki gębowe (groty strzałek 2, Rys. 3A) i ostrożnie wykonać kolejne niewielkie przerwanie.
- Trzymając haczyki gębowe zwierzęcia, należy delikatnie pociągnąć kutykulę w dół w kierunku końca tylnego zwierzęcia (podobnie jak przy obieraniu).
- W miarę odciągania kutykuli odsłonią się mózg, ciało tłuszczowe, tarczki imaginalne, gruczoły ślinowe i przedżołądek. Oddzielona kutykula znajduje się teraz przy końcu tylnym, ale wciąż jest z nią połączone naczynie grzbietowe wraz z gruczołem limfatycznym.
- Należy przeciąć przedżołądek i odsunąć go od obszaru gruczołu limfatycznego. Gruczoł limfatyczny będzie znajdował się pod mózgiem, nawet jeśli nie będzie on widoczny.
- Należy ostrożnie oddzielić ciało tłuszczowe, jelito, gruczoły ślinowe i inne struktury, które mogą znajdować się na gruczole. Należy uważać, aby nie oddzielić gruczołu limfatycznego od gruczołu pierścieniowego i naczynia grzbietowego znajdującego się za mózgiem. Gruczoł limfatyczny będzie przylegać płasko do szkiełka przedmiotowego.
- Należy ostrożnie usunąć wszystkie dodatkowe tkanki z okolic gruczołu limfatycznego, aż cały gruczoł rozwinie się od płatów przednich do ostatniego zestawu komórek osierdziowych.
Uwaga: Prawidłowo wypreparowany gruczoł chłonny posiada jedną parę płatów przednich oraz dwa zestawy płatów tylnych wzdłuż naczynia grzbietowego (Rys. 6B). Płaty mogą zostać łatwo uszkodzone lub mogą oddzielić się od naczynia grzbietowego, dlatego z próbkami należy obchodzić się z wielką ostrożnością. Gruczoł ma również tendencję do kurczenia się lub obkurczania. Delikatne wyprostowanie narządu w jego tylnej części pozwala na właściwe wyeksponowanie wszystkich jego części i komórek, co jest szczególnie istotne w przypadku protokołów immunobarwienia.
Disekcja ciała Fay
- Na stole preparacyjnym mikroskopu stereoskopowego Zeiss 1000 (można użyć dowolnego mikroskopu stereoskopowego) umieść pulpit świetlny, który umożliwia przeświecanie próbki światłem padającym. Umieść larwę trzeciego stadium z kroku 2 na szkiełku przedmiotowym w 200 μl 1X PBS. Odchyl źródło światła od próbki tak, aby organizm stał się przezroczysty, co ułatwi wizualizację jego organów wewnętrznych.
- Za pomocą pęsety ustaw zwierzę tak, aby jego koniec przedni był skierowany z dala od badacza.
- Za pomocą pęsety chwyć kutykulę larwy po lewej stronie haczyków gębowych (grot strzałki 1, Rys. 3B). Drugą pęsetą ostrożnie rozdarzyj kutykulę aż do końca tylnego (grot strzałki 2, Rys. 3B). Nie odrywaj kutykuli od ciała w części tylnej.
- Bardzo delikatnie zacznij odsuwać przewód pokarmowy na jedną stronę.
- Ostrożnie usuń mózg, tarczki imaginalne oraz pierścień gruczołowy wraz z gruczołem limfatycznym przebiegającym przez naczynie grzbietowe.
- Nie usuwaj gruczołów ślinowych, ponieważ przylegają do nich tkanki ciała tłuszczowego.
- Ostrożnie usuń kutykulę, pozostawiając ciało tłuszczowe na szkiełku w 1X PBS.
Uwaga 1: Ciało tłuszczowe składa się tylko z jednej warstwy komórek, dlatego ważne jest, aby wszystkie komórki były spłaszczone w tej samej płaszczyźnie na szkiełku przedmiotowym. Komórki są endopoliploidalne i łatwe do zwizualizowania. Prawidłowo wypreparowana próbka ciała tłuszczowego powinna zachować naturalne kontakty międzykomórkowe i zawierać minimalną liczbę kropel tłuszczu wokół wypreparowanej próbki (Ryc. 6I, J).
Uwaga 2: Jeśli jaja osy nie zostaną zwalczone przez układ odpornościowy gospodarza, rozpoczną rozwój niemal natychmiast. Wczesne stadia rozwojowe pasożyta (z larwy gospodarza) są łatwo dostępne po rozcięciu hemocelu (Rys. 8). Jaja lub larwy pasożyta przylegają do ciała tłuszczowego lub innych organów albo po prostu przesuwają się na szkiełko przedmiotowe podczas sekcji.
4. Analiza tkanek odpornościowych
- Suszyć węzły chłonne na powietrzu przez 5-10 min i usunąć 1X PBS z preparatu z ciałem tłuszczowym przed utrwalaniem przez 5-10 minut w 4% paraformaldehydzie przygotowanym w PBS. Na każdym szkiełku może znajdować się kilka wypreparowanych węzłów chłonnych do barwienia. Przenieść szkiełka z utrwalonymi próbkami do domowej komory nawilżającej na kolejne etapy. Komorę tę przygotowuje się, umieszczając dwa kawałki złożonych, wilgotnych ręczników papierowych na dnie pustego pudełka na końcówki do mikropipety. Jedno lub więcej szkiełeczek z próbkami można położyć na wkładce służącej do utrzymywania końcówek.
- W związku z tym analiza tkanek odpornościowych jest przeprowadzana zgodnie ze standardowymi metodami łączącymi znakowanie komórek in vivo oraz pośrednią immunohistochemię4.
5. Reprezentatywne wyniki
- Infekcja osami aktywuje ekspresję reportera szlaku Toll Drosomycin-GFP (Ryc. 6G, J). W tym eksperymencie wpływ infestacji osami na ekspresję genów jest wizualizowany in vivo przy użyciu reportera GFP połączonego z promotorem Drs12. U niezinfekowanych zwierząt kontrolnych nie wykryto ekspresji GFP. Sygnał GFP jest wyraźnie widoczny w cytoplazmie i jądrach komórek ciała tłuszczowego wypreparowanego z zwierząt zainfekowanych L. victoriae. Aby uzyskać najlepsze wyniki, stosunek os do gospodarzy powinien wynosić 1:10. Infekcja powinna trwać co najmniej 2 godziny. Po infestacji sygnał Drs-GFP nasila się, a wiele komórek ciała tłuszczowego pozostaje dodatnich pod kątem GFP nawet do 72 godzin 1,4.
- Infekcja os indukuje różnicowanie lamellocytów w gruczole chłonnym (Ryc. 6D). Lamellocyty otaczają i blokują rozwój os (Ryc. 6H). Gruczoly chłonne są preparowane w celu wizualizacji zmian komórkowych indukowanych w płatach przednich po infekcji L. victoriae. Nowo zróżnicowane lamellocyty znajdują się na obwodzie wypreparowanych płatów; lamellocyty są znakowane transgenem GFP sterowanym przez enhancer misshapen (MSNF9-GFP). Wszystkie komórki są wizualizowane pod kątem aktyny filamentowej z użyciem faloidyny znakowanej rodamyną. Należy zauważyć, że integralność płatów przednich w tych gruczołach jest zaburzona, ponieważ błona podstawna, która normalnie otacza płat w sposób ciągły (Ryc. 6C), jest teraz nieciągła (Ryc. 6D). Z tych samych preparatów można również wizualizować lamellocyty w hemolimfie na rozmazach (Ryc. 6G); niektóre z nich są związane ze strukturą kapsuły utworzonej w celu zablokowania rozwoju pasożyta (Ryc. 6H).
- Białko Spätzle jest eksprymowane w większości komórek larwalnego gruczołu chłonnego (Ryc. 7C,D). Aby wykryć Spz w wypreparowanych gruczołach chłonnych, zastosowano standardowy protokół barwienia komórek gruczołu chłonnego poliklonalnymi przeciwciałami anty-Spz4. In vivo poziom Spz wzrasta w komórkach gruczołu chłonnego po infekcji osami (porównaj panele Ryc. 7C, E z 7G, I oraz panele 7D, F z 7H, J).
- Wczesne i późne stadia rozwoju os z larw i pociorek gospodarza (Ryc. 8). Aby zbadać stadia rozwojowe os, zainfekowane larwy są preparowane w różnych punktach czasowych po złożeniu jaj. Przedstawiono tutaj próbkę tych stadiów dla Leptopilina spp. z zainfekowanych gospodarzy D. melanogaster typu dzikiego.
Rycina 1. Różne gatunki os i składanie jaj przez osy. Wszystkie obrazy uzyskano za pomocą stereomikroskopu Leica. A Samica osy Trichopria drosophilae składa jajo do poczwarki D. melanogaster. B Powiększenie procesu składania jaj przez Trichopria drosophilae do poczwarki gospodarza. C Zmelanizowane plamki wskazują na gojenie rany w miejscu składania jaj. D Samiec L. boulardi. E Samica G. xanthopoda. F Samica L. victoriae. G Samiec (po lewej) i samica L. heterotoma.
Rysunek 2. Cykle życiowe obrazujące wyścig zbrojeń między muchą a osą. Owipozycja prowadzi do jednego z dwóch wyników. Albo reakcje odpornościowe gospodarza skutecznie blokują rozwój osy (po lewej), albo osa przełamuje odpowiedzi immunologiczne gospodarza i odnosi sukces (po prawej). Zmodyfikowano na podstawie: Melk and Govind, 199918.
Rycina 3. Larwy trzeciego stadium z zaznaczonymi organami przed sekcją. Wszystkie obrazy uzyskano za pomocą stereomikroskopu Leica. A Larwa Hml>GFP z fluorescencją GFP (zieloną) (strzałka) w poszczególnych komórkach gruczołu chłonnego, wskazująca ogólną lokalizację gruczołu chłonnego u nienaruszonego zwierzęcia. Larwę obrazowano przy użyciu optyki fluorescencyjnej i pola jasnego. Groty strzałek wskazują miejsca istotne dla protokołu sekcji gruczołu chłonnego opisanego w tekście. B Larwa Cg>GFP z ekspresją GFP w ciele tłuszczowym, wskazująca lokalizację tego organu u nienaruszonego zwierzęcia. Groty strzałek wskazują miejsca istotne dla protokołu sekcji ciała tłuszczowego opisanego w tekście.
Rycina 4. Obwód immunogenetyczny odpowiedzi odpornościowej gospodarza przeciwko atakowi parasitoidów. Przedstawiono główne komponenty szlaku Toll. Spätzle (Spz) jest aktywowany przez proteazę – enzym przetwarzający Spätzle (SPE). Aktywowany Spz służy jako ligand dla Toll. Sygnalizacja wewnątrzkomórkowa prowadzi do aktywacji czynników transkrypcyjnych NF-κB, Dorsal i Dif. Cactus pełni rolę inhibitora IκB w tym szlaku. Aktywację Drosomycin, kanonicznego genu docelowego szlaku Toll, można monitorować przy użyciu transgenicznych szczepów much z reporterem GFP (patrz Ryc. 6I, J).
Rysunek 5. Enkapsulacja w odpowiedzi na infestację L. victoriae u gospodarzy Serpent>GFP-dl Drosophila. Enhancer w genie Serpent jest eksprymowany w komórkach krwi13. Gdy ten enhancer steruje ekspresją białka fuzyjnego GFP-Dorsal w transgenie, białko Dorsal jest wykrywane poprzez zieloną fluorescencję GFP w niektórych plazmatocytach i lamelocytach tworzących kapsuły i agregaty. Wszystkie obrazy uzyskano za pomocą konfokalnego mikroskopu Zeiss LSM. A Jajo L. victoriae. B-D Lamelocyty (białe strzałki) na tylnym końcu jaja wykazują ekspresję GFP-Dorsal. C-D Większe powiększenia próbki z panelu B. E-H Próbki zostały przeciwbarwione faloidyną znakowaną rodaminą w celu wizualizacji aktyny filamentowej (F-aktyna, czerwony) oraz Hoechst 33258 w celu wizualizacji DNA (niebieski). E Enkapsulowane jajo L. victoriae. F Zmelanizowana kapsuła L. victoriae. G-H Infekcja L. victoriae indukuje agregację komórek krwi (plazmatocytów i lamelocytów).
Rycina 6. Odpowiedzi immunologiczne przeciwko infekcji osami. Obrazy w panelach A i B uzyskano za pomocą mikroskopu Zeiss Axio Scope. Obrazy w panelach C-J uzyskano za pomocą konfokalnego mikroskopu Zeiss LSM. A Larwa gospodarza wykazująca zmielinizowane, zamknięte w kapsule jajo osy (grot strzałki) widoczne przez przezroczystą kutykulę. B Reprezentatywny gruczoł chłonny larwy trzeciego stadium barwiony Hoechst 33258 ujawnia komórki wszystkich płatów i interspersed komórki osierdzia. Pasek skali reprezentuje 100 μ. C-J Wszystkie próbki poddano przeciwbarwieniu Hoechst 33258 (w celu oznakowania jąder) i rodaminą falloidyną (w celu oznakowania F-aktyny). C-D Przednie płaty gruczołu chłonnego zwierząt MSNF9-GFP z grupy kontrolnej (C) oraz zainfekowanych L. victoriae (D). U zwierząt zainfekowanych ekspresja enhancera MSNF, specyficzna dla lamellocytów14, jest wykrywana za pomocą jądrowego reportera GFP. E Plazmocyty wyizolowane z niezinfekowanych zwierząt nie wykazują ekspresji GFP. Zwierzęta te mają bardzo mało lamellocytów lub nie posiadają ich wcale. F Plazmocyty (GFP-ujemne, krótka strzałka) i nowo zróżnicowane, większe lamellocyty (długie strzałki) ze słabą jądrową ekspresją GFP z larwy MSNF9-GFP zainfekowanej L. victoriae. G Wolne i zagregowane plazmocyty oraz lamellocyty z hemocelu larwy Drs-GFP zainfekowanej L. victoriae. Ekspresja reportera Drs-GFP zostaje aktywowana w niektórych plazmocytach (krótka strzałka), ale nie w lamellocytach (długie strzałki) po infekcji. H Zamknięta w kapsule i zmielinizowana larwa osy z larwy gospodarza MSNF9-GFP zainfekowanej L. boulardi. Liczne lamellocyty MSNF9-GFP-dodatnie otaczają larwę osy (ciemna struktura; gruba strzałka) i wykazują silną jądrową ekspresję GFP (długie strzałki). Panel ten został wcześniej opublikowany w PLoS One15. I-J Komórki ciała tłuszczowego wypreparowane z niezinfekowanej (I) i zainfekowanej L. victoriae (J) larwy Drs-GFP. GFP znajduje się w jądrze i cytoplazmie komórek ciała tłuszczowego zainfekowanych zwierząt. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną rycinę.
Rycina 7. Ekspresja Spätzle po zakażeniu błoniczką pasożytniczą. A-J Próbki poddano barwieniu kontrastowemu Hoechst 33258 w celu wizualizacji DNA. Wszystkie obrazy uzyskano przy użyciu konfokalnego mikroskopu Zeiss LSM. A-F Płaty przednie wypreparowane z niezakażonych larw y w. Próbki poddano pośredniemu barwieniu immunocytochemicznemu bez przeciwciała pierwszorzędowego (A i B) lub z przeciwciałem przeciwko Spz (kolor czerwony; C, D, E, F) i barwieniu kontrastowemu Alexa Flour-falloidyną w celu znakowania F-aktyny w komórkach (kolor zielony; B, D, F). G-J Płaty przednie wypreparowane z zakażonych larw y w i zabarwione przeciwciałem przeciwko Spz (kolor czerwony; G, H, I, J) oraz Alexa Fluor-falloidyną (kolor zielony; panele H, J). E-F Większe powiększenia próbek odpowiednio z paneli C i D. I-J Większe powiększenia próbek odpowiednio z paneli G i H. Paski skali w panelach A-D, G, H odpowiadają 50 μm.
Rycina 8. Stadia larwalne i poczwarki L. heterotoma oraz L. boulardi. poszczególne stadia wyizolowano z larwalnych lub poczwarkowych żywicieli much po infekcji, zgodnie z oznaczeniami. Wszystkie obrazy uzyskano przy użyciu mikroskopu Zeiss Axio Scope. Górny rząd A-F stadia L. heterotoma, 1–6 dni po infekcji. Dolny rząd A-F stadia postembrionalne L. boulardi, od 4 do 12 dni po infekcji.
Rycina 9. Schemat protokołu eksperymentalnego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Zainteresowanie osami pasożytniczymi Drosophila gwałtownie rośnie w miarę, jak techniki molekularne służące do sekwencjonowania całych genomów stają się wydajne i opłacalne. Jednak w porównaniu z wyjątkowo dobrze zbadanymi gospodarzami, wiele fascynujących aspektów biologii os pozostaje niejasnych. Obejmują one kwestie związane z zakresem gospodarzy, supresją odporności, superpasożytnictwem oraz zachowaniem. Celem niniejszej prezentacji było zademonstrowanie wpływu infekcji na tkanki odpornościowe muchy. Przedst...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Jesteśmy wdzięczni prof. Toddowi Schlenke za Trichopria drosophilae, prof. Tony'emu Ip za transgeniczne linie much oraz prof. Carlowi Hashimoto za przeciwciała anty-Spätzle. Dziękujemy obecnym i byłym członkom laboratorium za ich wkład w tę prezentację. Praca ta była finansowana z następujących grantów: NIH (S06 GM08168, RISE 41399-009 oraz G12-RR03060), USDA (NRI/USDA CSREES 2006-03817 oraz 2009-35302-05277) oraz PSC-CUNY.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Drożdże | Fisher Scientific | S80245-3 | Aktywne suszenie |
| Pożywka dla much | Własnego wyrobu | Mąka kukurydziana, cukier | Standard |
| Miód | Dutch Gold | Ze sklepu | Koniczyna |
| Fiolki | Fisher Scientific | AS514 | |
| Korek bawełniany/Korek piankowy | Fisher Scientific | 14-127-40A | |
| Szpatułka | Fisher Scientific | 21-401-15 | |
| płaska korytko sekcyjne Pyrex | Fisher Scientific | 50-930-382 | 9-dołkowa |
| Wstępnie oczyszczone szkiełka przedmiotowe | Fisher Scientific | 7101 | 25,4 mm x 76,2 mm |
| Szkiełka podstawowe | Perła | D12544 | 22 x 50 |
| Szkiełka nakrywki | Perła | G12544 | 22 x 60 |
| Pipeta Pasteura | J H Berge | 71-5200-05 | |
| Pinceta 100 mm | Sigma-Aldrich | T-4662 | Styl nr 5 |
| Butelka z atomizerem | Fisher Scientific | 03-409-22A | Fisherbrand |
| Kim Wipess | Fisher Scientific | 34155 | Kimberly Clark |
| Ręcznik papierowy | Fisher Scientific | Fisher X-101-C | 1/8 x 13 1/8 cala |
| stereomikroskop Leica | Empire Imaging Systems, INC. | 10446208 | MZFLIII |
| Stereomikroskop Zeiss | Carl Zeiss, Inc. | 000000-1006-126 | "STEMI (zawał serca z uniesieniem odcinka ST)" 1000 lub 2000-C |
| Źródło światła – oświetlacz LED z gęsim szyją | Fisher Scientific | 12563501 | |
| Etap | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Skanujący mikroskop konfokalny Zeiss Laser 510 | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Inkubator | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 815 | |
| Dulbecco’1X roztwór soli buforowanej fosforanowo (PBS) | Fisher Scientific | MT-21-030-CM Mediatech | |
| Etanol | Fisher Scientific | 64-17-5 | 99.5 % |
| Formaldehyd (37% m/m) | Fisher Scientific | F79-1 | |
| H–chst 33258 | Sondy molekularne, Life Technologies | H-1398 | 0.2 μg/ml wzbudzenie 352 nm; emisja 461 nm |
| Falloidyna z rodamyną | Sondy molekularne, Life Technologies | R415 | 200 j/ml (6,6 μM) Pobudzenie 546 nm; Emisja 565 nm |
| faloidyna z Alexa Fluor 488 | Sondy molekularne, Life Technologies | A22289 | Wzbudzenie 495 nm; Emisja 518 nm 300 jednostek/ml |
| CO2 zbiornik | TW Smith | ||
| Przeciwciało anty-Spz | Podarunek dla dr. C. Hashimoto (Yale) | ||
| Przeciwciało wtórne osioł przeciwko królikowi sprzężone z TRITC, stężenie 1:50. | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | Wykrywanie przy pobudzeniu 546 nm; emisji 565 nm |
| Środek przeciwblaknięciu | MP Biomedicals | ICN10274790 | 0,08 mg galianu N-propylowego w 20 ml 50% glicerolu w 1X PBS |
| Szczepy os | Szczepy much | ||
| L. victoriae16 | y w | ||
| L. boulardi 171 | UAS-GFP-Dorsal17 | ||
| *L. heterotoma*2 | SerpentHemoGal413 | ||
| L. heterotoma 141 | MSNF9-moCherry14 | ||
| *Trichopria drosophilae* | MSNF-GFP15 | ||
| *G. xanthopoda*18 | y w Serpent-Gal4 UAS GFP-Dorsal/Basc4 | ||
| y w ; Drosomycin-GFP/CyO y+12 |
Bibliografia
- Schlenke, T. A., Morales, J., Govind, S., Clark, A. G. Contrasting infection strategies in generalist and specialist wasp parasitoids of Drosophila melanogaster. PLoS Pathog. 3, 1486-1501 (2007).
- Chiu, H., Morales, J., Govind, S. Identification and immuno-electron microscopy localization of p40, a protein component of immunosuppressive virus-like particles from Leptopilina heterotoma, a virulent parasitoid wasp of Drosophila. J. Gen. Virol. 87, 461-470 (2006).
- Gueguen, G., Rajwani, R., Paddibhatla, I., Morales, J., Govind, S. VLPs of Leptopilina boulardi share biogenesis and overall stellate morphology with VLPs of the heterotoma clade. Virus Res. 160, 159-165 (2011).
- Paddibhatla, I., Lee, M. J., Kalamarz, M. E., Ferrarese, R., Govind, S. Role for sumoylation in systemic inflammation and immune homeostasis in Drosophila larvae. PLoS Pathog. 6, e1001234(2010).
- Sorrentino, R. P., Carton, Y., Govind, S. Cellular immune response to parasite infection in the Drosophila lymph gland is developmentally regulated. Dev. Biol. , 243-265 (2002).
- Sorrentino, R. P., Melk, J. P., Govind, S. Genetic analysis of contributions of dorsal group and JAK-Stat92E pathway genes to larval hemocyte concentration and the egg encapsulation response in Drosophila. Genetics. 166, 1343-1356 (2004).
- Jung, S. H., Evans, C. J., Uemura, C., Banerjee, U. The Drosophila lymph gland as a developmental model of hematopoiesis. Development. 132, 2521-2533 (2005).
- Krzemien, J., Crozatier, M., Vincent, A. Ontogeny of the Drosophila larval hematopoietic organ, hemocyte homeostasis and the dedicated cellular immune response to parasitism. Int. J. Dev. Biol. 54, 1117-1125 (2010).
- Martinez-Agosto, J. A., Mikkola, H. K., Hartenstein, V., Banerjee, U. The hematopoietic stem cell and its niche: a comparative view. Genes Dev. 21, 3044-3060 (2007).
- Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annu. Rev. Immunol. 25, 697-743 (2007).
- Schlegel, A., Stainier, D. Y. Lessons from "lower" organisms: what worms, flies, and zebrafish can teach us about human energy metabolism. PLoS Genet. 3, e199(2007).
- Ferrandon, D., Jung, A. C., Criqui, M., Lemaitre, B., Uttenweiler-Joseph, S., Michaut, L., Reichhart, J., Hoffmann, J. A. A drosomycin-GFP reporter transgene reveals a local immune response in Drosophila that is not dependent on the Toll pathway. EMBO J. 17, 1217-1227 (1998).
- Bruckner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C. M., Rorth, P., Perrimon, N. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Dev. Cell. 7, 73-84 (2004).
- Tokusumi, T., Shoue, D. A., Tokusumi, Y., Stoller, J. R., Schulz, R. A. New hemocyte-specific enhancer-reporter transgenes for the analysis of hematopoiesis in Drosophila. Genesis. 47, 771-774 (2009).
- Tokusumi, T., Sorrentino, R. P., Russell, M., Ferrarese, R., Govind, S., Schulz, R. A. Characterization of a lamellocyte transcriptional enhancer located within the misshapen gene of Drosophila melanogaster. PLoS One. 4, e6429(2009).
- Morales, J., Chiu, H., Oo, T., Plaza, R., Hoskins, S., Govind, S. Biogenesis, structure, and immune-suppressive effects of virus-like particles of a Drosophila parasitoid, Leptopilina victoriae. J. Insect Physiol. 51, 181-195 (2005).
- Bettencourt, R., Asha, H., Dearolf, C., Ip, Y. T. Hemolymph-dependent and -independent responses in Drosophila immune tissue. J. Cell Biochem. 92, 849-863 (2004).
- Melk, J. P., Govind, S. Developmental analysis of Ganaspis xanthopoda, a larval parasitoid of Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 202, 1885-1896 (1999).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
