Wektory rekombinowanego wirusa towarzyszącego adenowirusom (rAAVs) stają się coraz bardziej cenne w badaniach in vivo na zwierzętach. Opisujemy, w jaki sposób rAAVs mogą być produkowane w laboratorium oraz jak można oznaczać miano tych wektorów, aby uzyskać dokładny odczyt liczby wyprodukowanych cząstek zakaźnych.
Artykuł metodologiczny
Produkcja i miareczkowanie rekombinowanych wektorów wirusowych opartych na wirusie towarzyszącym adenowirusom (AAV)
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W ostatnich latach rekombinowane wektory adeno-zależne (AAV) stały się coraz bardziej cenne w badaniach in vivo na zwierzętach, a obecnie są również testowane w ludzkich badaniach klinicznych. AAV typu dzikiego jest niepatogennym członkiem rodziny parvoviridae i z natury wykazuje deficyt replikacyjny. Szeroki profil transdukcji, niska odpowiedź immunologiczna, a także silna i trwałe ekspresja transgenu uzyskiwana dzięki tym wektorom sprawiły, że stały się one popularnym i wszechstronnym narzędziem do dostarczania genów in vitro oraz in vivo. rAAV można w łatwy i tani sposób wytwarzać w laboratorium i, w oparciu o ich korzystny profil bezpieczeństwa, są one zazwyczaj klasyfikowane jako niskie ryzyko. W niniejszej pracy opisujemy metodę produkcji i miareczkowania chimerycznych rAAV zawierających białka kapsydu zarówno AAV1, jak i AAV2. Zastosowanie tych tzw. wektorów chimerycznych łączy zalety obu serotypów rodzicielskich, takie jak wysokie miana zapasów (AAV1) i oczyszczanie za pomocą chromatografii powinowactwa (AAV2). Serotypy AAV są najlepiej przebadanymi spośród wszystkich serotypów AAV i indywidualnie wykazują szeroki wzorzec zakaźności. Opisane tutaj wektory chimeryczne powinny posiadać właściwości infekcyjne AAV1 i AAV2, a zatem można oczekiwać, że zainfekują one szeroki zakres tkanek, w tym między innymi neurony, mięśnie szkieletowe, trzustkę i nerki. Opisana metoda wykorzystuje oczyszczanie na kolumnie z heparyną, która – jak się uważa – pozwala na uzyskanie wyższego miana wirusa i czystszego preparatu wirusowego niż inne metody oczyszczania, takie jak wirowanie w gradiencie chlorku cezu. Dodatkowo opisujemy, w jaki sposób wektory te można szybko i łatwo miareczkować, aby uzyskać dokładny odczyt liczby wytworzonych cząstek zakaźnych.
Protokół
Rysunek 1 przedstawia schemat podsumowujący poniższy protokół.
Uwaga dotycząca bezpieczeństwa: Wszystkie materiały, które miały kontakt ze zmontowanymi cząsteczkami wirusowymi, muszą zostać zdezynfekowane roztworem Virkon lub innym odpowiednim środkiem dezynfekującym.
1. Przygotowanie zapasów plazmidowego DNA (~ 2 dni)
- Wymagane są następujące plazmidy 1:
- pRV1 – zawierający sekwencje Rep i Cap AAV2
- pH21 – zawierający sekwencje Rep i Cap AAV1
- pFdelta6 – pomocniczy plazmid adenowirusowy
- plazmid AAV zawierający rekombinującą kasetę ekspresyjną flankowaną sygnałami pakowania AAV2 (odwrócone powtórzenia końcowe, ITRs)
- Podczas gdy pFdelta6 należy hodować w kompetentnych komórkach Stbl2, aby zapobiec częściowym delecjom, pRV1 i pH21 można hodować w kompetentnych komórkach DH5alpha. Plazmidy AAV można hodować w komórkach Stbl2, jeśli w komórkach DH5alpha występują częściowe delecje.
- DNA plazmidowe powinno być wysokiej jakości i wolne od zanieczyszczeń RNA. Integralność plazmidów można sprawdzić za pomocą następujących trawień:
- pRV1 – trawienie XbaI w celu uzyskania prążków 7,5 kb i 3,8 kb
- pH21 – trawienie EcoRI w celu uzyskania prążków 4,5 kb, 2,8 kb i 0,2 kb
- pFdelta6 – trawienie HindIII w celu uzyskania prążków 5,5 kb, 3 kb, 3 kb, 2,3 kb i 1,5 kb
2. Przygotowanie ludzkich komórek embrionalnej nerki 293 (Hek293) do transfekcji (2 - 3 dni)
- Przenieś komórki Hek293 z dwóch kolb o powierzchni 150 cm2 przy 80% konfluencji do pięciu naczyń hodowlanych Nunc o średnicy 15 cm. Przed transfekcją komórki powinny osiągnąć 70 - 80% konfluencji (około 48 godzin po wysianiu). Hoduj komórki w standardowej pożywce Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) z niską zawartością glukozy, zawierającej 10% płodowej surowicy cielęcej oraz 100 U/ml penicyliny / 100 μg/ml streptomycyny.
- Na 3 godziny przed transfekcją usuń DMEM i zastąp go pożywką Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) zawierającą 5% płodowej surowicy cielęcej.
3. Transfekcja plazmidów wirusowych (~1 godzina na transfekcję, 3 dni na inkubację)
- Przygotuj następujące składniki dla jednej partii wirusa (5 płytek hodowlanych 15 cm):
- 62.5 μg plazmidu AAV
- 125 μg pFdelta6
- 31.25 μg pRV1
- 31.25 μg pH21
- 1650 μl 2.5 M CaCl2
- 12 ml dH2O
- W dygestorium do hodowli tkankowej klasy 2 przefiltruj sterylnie mieszaninę do transfekcji do probówki 50 ml.
- Podczas mieszania roztworu na wortexie szybko dodaj 13 ml 2 x soli HEPES (pH 7.05). Zamknij probówkę 50 ml i kontynuuj mieszanie na wortexie przez 15 sekund. Odstaw na 1 minutę i 45 sekund; powinien powstać drobny biały osad.
- Ostrożnie dodaj 5 ml roztworu do transfekcji do każdej płytki hodowlanej 15 cm. Zakręć płytkami w celu wymieszania i przełóż do inkubatora.
- 16 godzin po transfekcji usuń pożywkę IMDM i zastąp ją pożywką DMEM.
4. Lizowanie komórek i pozyskiwanie rAAV (2 godziny)
- 72 godziny po transfekcji usunąć medium z płytek hodowlanych i zutylizować. Wszystkie odpady należy poddać działaniu roztworu Virkon lub innego odpowiedniego środka dezynfekującego.
- Komórki delikatnie przemyć ciepłym 1x roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS; pH 7.4).
- Do każdej płytki dodać 25 ml ciepłego PBS i delikatnie zebrać komórki za pomocą skrobaka do komórek. Zawiesinę zebrać do probówek o pojemności 50 ml.
- Komórki zwirować w celu otrzymania osadu przy 800 x g przez 10 minut.
- Usunąć nadsącz i zawiesić osad w roztworze 150 mM NaCl, 20 mM Tris pH 8.0, stosując 10 ml na każdą płytkę hodowlaną. Rozdzielić zawiesinę do dwóch probówek 50 ml.
- Przygotować świeży 10% roztwór deoksycholanu sodu w dH2O. Do każdej probówki dodać 1,25 ml tego roztworu, aby uzyskać stężenie końcowe 0,5%. Dodać nukleazę benzonazę do stężenia końcowego 50 jednostek na ml. Dokładnie wymieszać zawartość probówek.
- Inkubować w temperaturze 37°C przez 1 godzinę.
- Usunąć resztki komórkowe poprzez wirowanie przy 3000 x g przez 15 minut. Przenieść materiał do nowej probówki 50 ml, upewniając się, że wszystkie resztki komórkowe zostały usunięte, aby zapobiec zapchaniu kolumn z heparyną (patrz krok 5). Na tym etapie próbki można przechowywać w temperaturze -20°C przed kontynuacją procedury. Próbki przechowywane przez nas w temperaturze -20°C przez kilka tygodni nie wykazały spadku zakaźności.
5. Oczyszczanie rAAV na kolumnie z heparyną (2 - 3 godziny)
- Przygotować kolumny HiTrap heparin, używając pompy perystaltycznej w taki sposób, aby roztwory przepływały przez kolumnę z prędkością 1 ml na minutę w krokach od 5.2 do 5.4. Ważne jest, aby dopilnować, by do kolumny heparynowej nie dostały się pęcherzyki powietrza.
- Równoważyć kolumnę za pomocą 10 ml 150 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0.
- Nanieść na kolumnę 50 ml roztworu wirusa i pozwolić mu przepłynąć.
- Przemyć kolumnę za pomocą 20 ml 100 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0.
- Używając strzykawki 5 ml, kontynuować płukanie kolumny za pomocą 1 ml 200 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0, a następnie 1 ml 300 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0. Odciek należy odrzucić.
- Używając strzykawek 5 ml i delikatnego nacisku, eluować wirusa z kolumny, aplikując:
- 1.5 ml 400 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0
- 3.0 ml 450 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0
- 1.5 ml 500 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0
- Zebrać te frakcje do probówki wirówkowej 15 ml.
6. Zagęszczanie i sterylna filtracja rAAV (1 godzina)
- Skoncentrować wektor, korzystając z jednostek filtracyjnych do wirowania Amicon ultra-4 z granicą odcięcia masy cząsteczkowej 100 000. Nanieść 4 ml eluatu z kolumny do koncentratora i wirować przy 2000 x g przez 2 minuty (w temperaturze pokojowej). Odrzucić filtrat, ponownie nanieść pozostały roztwór wirusa do koncentratora i powtórzyć wirowanie. Objętość stężonego roztworu powinna wynosić około 250 μl. Jeśli objętość stężonego roztworu jest znacznie większa, należy odrzucić filtrat i kontynuować wirowanie w odstępach jednominutowych, aż objętość wyniesie około 250 μl.
- Dodać 250 μl PBS do wirusa, aby uzyskać objętość końcową 500 μl, a następnie przenieść roztwór z koncentratora.
- Przefiltrować wektor przez filtr strzykawkowy o średnicy 13 mm i wielkości porów 0.2 μm. Wektor należy podzielić na alikwoty i przechowywać w temperaturze -80°C do momentu użycia.
7. Oznaczanie miana zapasów wirusa (3 dni)
Wymaga to promotora aktywnego w komórkach Hek293, który steruje genem reporterowym lub produktem genowym wykrywalnym immunocytochemicznie. W przypadku tworzenia wektora niekompatybilnego z komórkami Hek293 można zastosować inne linie komórkowe lub pierwotne kultury komórkowe.
- Przygotować 18 szkiełek zakrywek pokrytych poli-L-lizyną lub 18 studzienek szkiełek komorowych Nunc, wysiewając komórki Hek293 tak, aby osiągnęły 40 - 50% konfluencji. Do miareczkowania wektorów rAAV zależnych od Cre należy użyć komórek Hek293 stabilnie eksponujących rekombinazę Cre 2.
- Każdą studzienkę zainfekować seryjnymi rozcieńczeniami wektora AAV (Rys. 2A). Użyć 3 studzienek na każde rozcieńczenie. Wirus dodajemy rutynowo bezpośrednio do każdej studzienki.
- Po 72 godzinach utrwalić komórki Hek293, dodając do medium równą objętość 4% paraformaldehydu (PFA) (uzyskując końcowe stężenie 2% PFA) na dziesięć minut w temperaturze pokojowej.
- Przemyć komórki trzykrotnie w PBS, wypłukać w dH2O i nałożyć szkiełko zakrywkę.
- Policzyć liczbę przetransdukowanych komórek w trzech studzienkach o najwyższym stopniu rozcieńczenia, w których nadal występują zainfekowane komórki, obliczyć ich średnią i pomnożyć przez czynnik rozcieńczenia, aby uzyskać liczbę jednostek zakaźnych na mikrolitr (Rys. 2B).
8. Przewidywane wyniki
Komórki Hek293 transdukowane wirusem kodującym ulepszone zielone białko fluorescencyjne (eGFP) przedstawiono na rysunku 2B. Zazwyczaj uzyskujemy stabilne miana na poziomie około 6 x 106 cząstek zakaźnych na mikrolitr. Wektorów tych rutynowo używamy do wstrzykiwań stereotaktycznych do mózgu dorosłych gryzoni. Stanowi to potężną technikę umożliwiającą regionowo specyficzną ekspresję genów 2. Aby połączyć tę specyficzność regionalną z selektywną ekspresją genów w konkretnych typach komórek, wstrzykujemy rAAV zależne od rekombinazy Cre do obszarów docelowych u myszy transgenicznych Cre 2. Rysunki 2C-E przedstawiają przykłady wstrzykiwań stereotaktycznych rAAV zależnych od Cre kodujących eGFP do różnych obszarów mózgu dorosłych myszy transgenicznych parvalbumin-Cre 3.
Rycina 1. Schematyczny opis protokołu produkcji rAAV. 1.) Komórki Hek293 są wysiewane i hodowane do osiągnięcia 70 - 80% konfluencji. 2.) Plazmidy AAV i pomocnicze są przygotowywane i transfekowane do komórek Hek293. 3.) 16 godzin po transfekcji medium jest zmieniane z powrotem na DMEM, a komórki Hek293 są hodowane przez kolejne 56 godzin. 4.) Komórki Hek293 są zbierane i lizowane. Wektory rAAV są oddzielane od szczątków komórkowych poprzez wirowanie. 5.) Cząsteczki wirusowe są oczyszczane na kolumnach z hepariną przed zagęszczeniem i sterylizacją. 6.) Komórki Hek293 są hodowane na płytkach 24-dołkowych i infekowane seryjnymi rozcieńczeniami wektora AAV w celu określenia liczby jednostek zakaźnych.
Rycina 2. Miareczkowanie i aplikacja in vivo rAAV1/2. (A) Przygotowanie komórek Hek293 do pomiaru miana wirusa. Komórki Hek293 są transdukowane seryjnymi rozcieńczeniami rAAVs. C, kontrola niezainfekowana; N, 1 μl nierozcieńczonego roztworu wirusa. (B) Komórki Hek293 zainfekowane rAAVs wykazującymi ekspresję eGFP. (C-E) Ekspresja wirusowej eGFP jest ograniczona do neuronów wykazujących ekspresję Cre w różnych regionach docelowych u myszy transgenicznych parvalbumin-Cre po stereotaktycznym wstrzyknięciu Cre-aktywowanych rAAVs. Przykładowe obrazy pokazują immunoreaktywność GFP w (C) wzgórzu siateczkowatym i gałce bladej, (D) zakręcie zębatym oraz (E) obszarze CA1 hipokampa. DG, zakręt zębaty; RT, jądro siateczkowate wzgórza; GP, gałka blada. Paski skali: B, 500 μm; C, 100 μm; D, 100 μm; E, 500 μm.
Dyskusja
Wektory rAAV stają się coraz bardziej wartościowe w badaniach in vivo na zwierzętach. W niniejszym materiale opisaliśmy prosty i niedrogi protokół produkcji rAAV, który może ułatwić powszechne zastosowanie tego użytecznego wektora, eliminując kosztowne zlecanie produkcji wirusów firmom zewnętrznym. Protokół (oparty na referencji 1) opisuje produkcję chimerycznych wektorów rAAV1/2 zawierających białka kapsydu obu serotypów rodzicielskich w równych proporcjach 4. Oczyszczanie wektorów rAAV poprzez wiązanie do kolumn z heparyną opiera się na ekspresji białek kapsydu AAV2, ale może być łączone z serotypami innymi niż opisany tutaj AAV1. Dodatkowo zgłoszono, że AAV6 wiąże się z heparyną, choć z mniejszym powinowactwem, i potencjalnie mógłby być oczyszczany za pomocą kolumn z heparyną przy użyciu tej procedury 5,6. Należy jednak zauważyć, że inne serotypy będą wymagały różnych stężeń NaCl do elucji z kolumny z heparyną 5,7.
Wykazano, że optymalny rozmiar pakowania genomów rAAV mieści się w przedziale od 4,1 do 4,9 kb, przy czym powyżej 5,2 kb następuje gwałtowny spadek wydajności pakowania 8. Limit ten można uznać za największą wadę systemu rAAV, ponieważ specyficzna dla typu komórek regulacja ekspresji transgenu jest zazwyczaj osiągana za pomocą dużych elementów cis-działających, których nie można pomieścić w małych cząsteczkach AAV. Aby zapobiec otrzymywaniu partii o niskim mianie, takich jak te wynikające z prób pakowania genów o rozmiarze bliskim limitowi pakowania AAV, łączymy oddzielne partie wirusa skoncentrowane do 250 μl w jedną partię o objętości 500 μl, zamiast dodawać PBS, jak opisano w kroku 6.3. Niezawodną transdukcję specyficzną dla typu komórek można osiągnąć poprzez połączenie myszy z driverem Cre i warunkowych kaset rAAV (patrz poniżej), aby uniknąć przekraczania limitu pakowania.
Należy zauważyć, że choć niniejszy protokół ma na celu dostarczenie łatwych do naśladowania instrukcji dotyczących produkcji rAAV o wysokim mianie, wymaga on obecności fragmentów białka kapsydu AAV2 w celu oczyszczania za pomocą chromatografii powinowactwa do heparyny. Serotypy inne niż AAV2 muszą być oczyszczane przy użyciu alternatywnych procedur 9. Jedną z zalet oczyszczania na kolumnie z heparyną jest przekonanie, że pozwala ono na otrzymanie wektorów AAV o większej zakaźności niż te otrzymane z użyciem gradientu chlorku cezu 10. Metoda ta ma jednak również pewne wady. Na przykład w oczyszczonym stoku wirusowym mogą znajdować się inne białka wiążące heparynę. Choć tropizm wektorów oczyszczonych heparyną może być zależny od miana wektora10, nasze podejście do specyficznego celowania w neurony pobudzające20 lub hamujące (Rys. 2) wykorzystuje aktywację ekspresji transgenu zapośredniczoną przez AAV indukowaną przez Cre i jest niezależne od miana. Alternatywą dla oczyszczania na kolumnie z heparyną jest zastosowanie gradientu gęstości jodiksanolu, który pozwala uzyskać wyższe miano wirusa i czystszą preparację niż w przypadku użycia gradientu chlorku cezu 10. Metodę tę można również połączyć z oczyszczaniem na kolumnie z heparyną, aby otrzymać wektor o czystości przekraczającej 99% 11. W związku z tym poszczególne grupy badawcze powinny starannie rozważyć, która metoda oczyszczania wirusów jest najlepsza dla ich konkretnej aplikacji końcowej.
Najczęstszym problemem związanym z tym protokołem jest niski miano wirusa. W naszym doświadczeniu wynika to zazwyczaj z niskiej wydajności transfekcji lub błędów podczas elucji wirusa z kolumn z heparyną. Wszystkie materiały do transfekcji powinny osiągnąć temperaturę pokojową przed rozpoczęciem procesu, a w każdym laboratorium należy przeprowadzić transfekcje testowe w celu znalezienia optymalnych warunków. Inne metody transfekcji, takie jak zastosowanie lipofektaminy, są bardzo wydajne, ale mogą być nadmiernie kosztowne. Ponadto stężenie i pH roztworów elucyjnych do kolumn z heparyną są krytyczne dla całkowitej elucji wirionów z kolumn bez ich uszkadzania. Kolejnym istotnym punktem jest to, że komórki opakowujące muszą dobrze przylegać do powierzchni naczyń hodowlanych. Jeśli komórki odkleją się na jakimkolwiek etapie procedury, zaleca się przerwanie eksperymentu i rozmrożenie nowej fiolki z komórkami.
Przestrzenną i czasową kontrolę ekspresji transgenu u gryzoni można łatwo osiągnąć poprzez precyzyjne celowanie anatomiczne oraz dobór stadium rozwojowego zwierzęcia. Wykazano, że efektywny transfer genów za pomocą AAV jest możliwy in utero 12,13. W dorosłym mózgu obszar zainfekowany cząsteczkami rAAV po wstrzyknięciu stereotaktycznym może być dostosowany od bardzo małych, ukierunkowanych regionów do znacznie większych obszarów, nie tylko poprzez zmiany miana wirusa, ale także poprzez modyfikację parametrów wstrzykiwania. Obejmują one objętość i prędkość wstrzykiwań oraz dodatek poliolu mannitolu do zawiesiny wirusowej 14. Mannitol może być również stosowany w celu zwiększenia infekcji różnych tkanek po systemowym wstrzyknięciu rAAV 15.
Pojemność pakowania rAAV (około 4,7 kb) jest prawdopodobnie najbardziej ograniczającym czynnikiem pod względem genów, które mogą być eksprymowane z tych wektorów wirusowych. Jednakże niedawne badania wykazały, że można to częściowo obejść poprzez podział większych genów lub kaset ekspresyjnych na oddzielne wektory rAAV i wprowadzenie sekwencji mostkującej, która inicjuje ekspresję genu w momencie, gdy wiriony zainfekują tę samą komórkę. 16Poziomy ekspresji genów przenoszonych przez wektory rAAV można również znacznie zwiększyć, stosując samouzupełniające się wektory rAAV. 17Stereotaktyczne wstrzykiwanie wektorów rAAV stanowi szybką, niedrogą i skuteczną metodę indukcji ekspresji genów w sposób regionowo specyficzny. W połączeniu z 2nd strategie generowania interferencji RNA 18 Wektory rAAV mogą być również wykorzystywane do regionowo swoistego wyciszania genów. rAAV można łączyć z myszami transgenicznymi Cre lub promotorami swoistymi dla danego typu komórek, aby uzyskać ekspresję genów swoistą dla konkretnego obwodu i typu komórek, co umożliwia manipulacje genetyczne o wysokiej rozdzielczości przestrzennej. 2,19-21podczas gdy wyposażenie rAAV-ów np. w system tet zapewnia kontrolę czasową nad wirusową ekspresją genów 22,23Przykłady te ilustrują ogromny potencjał kombinatoryczny tych wektorów i pozwalają przewidywać gwałtowny wzrost liczby badań opartych na rAAV w nadchodzących latach.
Oświadczenia
Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Wirówki membranowe Amicon Ultra | EMD Millipore | UFC810024 | 100,000 MWCO |
| Nukleaza Benzonase | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Pożywka DMEM (Dulbeco’s modified Eagle medium) | Invitrogen | 10567014 | Uzupełnić o 10% FCS oraz 10 units/ml penicyliny/100 μg/ml streptomycyny |
| Komórki Hek293 | American Type Culture Collection | CRL-1573 | Stosować przy pasażu poniżej 30 |
| Sól fizjologiczna z buforem HEPES | Sigma-Aldrich | 51558 | |
| Kolumienka HiTrap Heparin | Sigma-Aldrich | 54836 | |
| Pożywka Iscove’s modified Dulbecco’s medium | Invitrogen | 12440-053 | Uzupełnić o 5% FCS |
| Deoksycholan sodu | Sigma-Aldrich | D5670 | Przygotować świeży roztwór dla każdej partii |
| Szkła hodowlane 15 cm | Fisher Scientific | 157150 | |
| Komórki kompetentne Stbl2 | Invitrogen | 10268-019 | |
| Roztwór Virkon | Fisher Scientific | NC9821357 | Pozostawić do dezynfekcji na noc przed wylaniem do odpływu |
| Tabela 1. Specyficzne odczynniki wymagane do protokołu |
Bibliografia
- Klugmann, M. AAV-mediated hippocampal expression of short and long Homer 1 proteins differentially affect cognition and seizure activity in adult rats. Molecular and Cellular Neurosciences. 28, 347-360 (2005).
- Murray, A. J. Parvalbumin-positive CA1 interneurons are required for spatial working but not for reference memory. Nature Neuroscience. 14, 297-299 (2011).
- Hippenmeyer, S. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biology. 3, e159-e159 (2005).
- Hauck, B. Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors. Molecular Therapy. 7, 419-425 (2003).
- Halbert, C. L., Allen, J. M., Miller, A. Adeno-associated virus type 6 (AAV6) vectors mediate efficient transduction of airway epithelial cells in mouse lungs compared to that of AAV2 vectors. Journal of Virology. 75, 6615-6615 (2001).
- Blankinship, M. J. Efficient transduction of skeletal muscle using vectors based on adeno-associated virus serotype 6. Molecular Therapy. 10, 671-678 (2004).
- Wu, Z. Single amino acid changes can influence titer, heparin binding, and tissue tropism in different adeno-associated virus serotypes. Journal of Virology. 80, 11393-11397 (2006).
- Dong, J. Y., Fan, P. D., Frizzell, R. A. Quantitative analysis of the packaging capacity of recombinant adeno-associated virus. Human gene therapy. 7, 2101-2112 (1996).
- Zolotukhin, S. Production and purification of serotype 1, 2, and 5 recombinant adeno-associated viral vectors. Methods. 1, 158-167 (2002).
- Burova, E., Loffe, E. Chromatographic purification of recombinant adenoviral and adeno-associated viral vectors: methods and implications. Gene Therapy. 12, 5-17 (2005).
- Zolotukhin, S. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene Therapy. 6, 973-985 (1999).
- Bilbao, R. Patterns of gene expression from in utero delivery of adenoviral-associated vector serotype 1. Human Gene Therapy. 16, 678-684 (2005).
- Pilpel, N. reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain. Journal of Neuroscience Methods. 182, 55-63 (2009).
- Mastakov, M. Y. Combined injection of rAAV with mannitol enhances gene expression in the rat brain. Molecular Therapy. 3, 225-232 (2001).
- Fu, H. Self-complementary adeno-associated virus serotype 2 vector: global distribution and broad dispersion of AAV-mediated transgene expression in mouse brain. Molecular Therapy. 8, 911-917 (2003).
- Ghosh, A., Yue, Y., Duan, D. Efficient Transgene Reconstitution with Hybrid Dual AAV Vectors Carrying the Minimized Bridging Sequences. Human Gene Therapy. 22, 77-83 (2011).
- McCarty, D. M. Self-complementary AAV vectors; advances and applications. Molecular Therapy. 16, 1648-1656 (2008).
- Georgiadis, A. AAV-mediated knockdown of peripherin-2 in vivo using miRNA-based hairpins. Gene Therapy. 17, 486-493 (2010).
- Atasoy, D. A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping. The Journal of Neuroscience. 28, 7025-7030 (2008).
- Guggenhuber, S. AAV Vector-Mediated Overexpression of CB1 Cannabinoid Receptor in Pyramidal Neurons of the Hippocampus Protects against Seizure-Induced Excitoxicity. PLoS One. 5, e15707-e15707 (2010).
- Lawlor, P. A. Efficient gene delivery and selective transduction of glial cells in the mammalian brain by AAV serotypes isolated from nonhuman primates. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17, 1692-1702 (2009).
- Chtarto, A. Tetracycline-inducible transgene expression mediated by a single AAV vector. Gene Therapy. 10, 84-94 (2003).
- Han, Y. Lack of humoral immune response to the tetracycline (Tet) activator in rats injected intracranially with Tet-off rAAV vectors. Gene Therapy. 17, 616-625 (2010).
Przedruki i uprawnienia
