Organotypowe hodowle plastrów embrionalnego brzusznego śródmózgowia: system do badania rozwoju neuronów dopaminergicznych in vitro

Podsumowanie

Opisano metodę przygotowania organotypowych skrawków z embrionalnego śródmózgowia myszy w stadium E12.5. Organotypowe hodowle skrawków mogą być wykorzystywane do obserwacji zachowania neuronów dopaminergicznych lub innych neuronów z brzusznej części śródmózgowia.

Streszczenie

Mysz jest doskonałym organizmem modelowym do badania rozwoju mózgu ssaków ze względu na obfitość danych molekularnych i genetycznych. Jednak rozwijający się mózg myszy nie nadaje się do łatwych manipulacji i obrazowania in vivo, ponieważ embrion myszy jest niedostępny i nieprzezroczysty. W związku z tym w badaniach rozwoju mózgu myszy in vitro szeroko stosuje się organotypowe hodowle plastrów mózgu embrionalnego. Manipulacje ex vivo lub wykorzystanie myszy transgenicznych pozwalają na modyfikację ekspresji genów, dzięki czemu subpopulacje komórek neuronalnych lub glejowych mogą być znakowane białkami fluorescencyjnymi. Zachowanie oznakowanych komórek można następnie obserwować za pomocą obrazowania poklatkowego (time-lapse). Obrazowanie poklatkowe okazało się szczególnie skuteczne w badaniu zachowań komórkowych leżących u podstaw rozwoju kory mózgowiej na późnych etapach embrionalnych ^1-2. Systemy organotypowych hodowli plastrów embrionalnych w regionach mózgu poza przedmózowiem są mniej rozwinięte. W związku z tym bogactwo danych z obrazowania poklatkowego opisujących migrację komórek neuronalnych ogranicza się do przedmózowia ^3,4. Wciąż nie wiadomo, czy zasady odkryte dla grzbietowej części mózgu obowiązują również w obszarach brzusznych. W brzusznej części mózgu neurony są zorganizowane w skupiska neuronalne, a nie w warstwy, i często muszą przebyć skomplikowane trajektorie migracyjne, aby dotrzeć do swojej docelowej pozycji. Brzuszna część śródmózowia jest nie tylko dobrym systemem modelowym dla rozwoju brzusznej części mózgu, ale zawiera również populacje neuronalne, takie jak neurony dopaminergiczne, które mają znaczenie w procesach chorobowych. Podczas gdy funkcje i degeneracja neuronów dopaminergicznych były szczegółowo badane w mózgu dorosłym i starzejącym się, niewiele wiadomo o zachowaniu tych neuronów podczas fazy ich różnicowania i migracji ⁵. Opisujemy tutaj tworzenie hodowli plastrów z brzusznej części śródmózowia myszy w 12,5 dniu embrionalnym (E12.5). Hodowle te są potencjalnie odpowiednie do monitorowania rozwoju neuronów dopaminergicznych przez kilka dni in vitro. Podkreślamy krytyczne kroki w przygotowywaniu plastrów mózgu na tych wczesnych etapach rozwoju embrionalnego i omawiamy warunki niezbędne do utrzymania prawidłowego rozwoju neuronów dopaminergicznych in vitro. Przedstawiamy również wyniki eksperymentów z obrazowania poklatkowego. W eksperymentach tych prekursory brzusznej części śródmózowia (w tym prekursory dopaminergiczne) oraz ich potomstwo zostały oznakowane w sposób mozaikowy przy użyciu indukowalnego systemu mapowania linii komórkowych opartego na systemie Cre/loxP ⁶.

Protokół

Niektóre części niniejszego protokołu zostały zmodyfikowane na podstawie pracy Daza et al., 2007 ⁷.

1. Przygotowania

1. Można przygotować z jednodniowym wyprzedzeniem
   1. Przygotować bufor Krebsa 1X (1,5 L): 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,2 mM NaH₂PO₄:H₂O, 1,2 mM MgCl₂, 2,5 mM CaCl₂, 11 mM glukozy, 25 mM NaHCO₃; dostosować pH do 7,4. Sterylizować przez filtrację (rozmiar porów 0,22 μm) i przechowywać w temperaturze 4°C.
   2. Przygotować pożywkę hodowlaną (20 mL): 5 mL HBSS, 9 mL DMEM z wysoką zawartością glukozy, 850 μL 30% glukozy, 5 mL surowicy konia (25%). Dodać 200 μL 100X penicyliny/streptomycyny. Przechowywać w temperaturze 4°C.
2. Przygotować przed rozpoczęciem sekcji
   1. Przygotować 100 mL 4% agarozy niskotopliwej (agaroza LMP) w buforze Krebsa 1X: podgrzewać roztwór w kuchence mikrofalowej, aż agaroza całkowicie się rozpuści, a następnie umieścić agarozę w kąpieli wodnej o temperaturze 45 °C.
   2. Napełnić kuwetę buforową wibratomu lodowatym buforem Krebsa 1X i uruchomić element chłodzący (utrzymać w temperaturze 4°C). Zamocować żyletkę w uchwycie i przygotować obszar roboczy wibratomu, wyposażając go w skalpel, cienki pędzelek oraz miniłyżeczkę perforowaną do pobierania skrawków. Przygotować sterylne szalki Petriego (35 x 10 mm) z buforem Krebsa 1X do zbierania skrawków. Przechowywać w lodzie.
   3. Przygotować obszar sekcji, wyposażając go w sterylne szalki Petriego (100 x 15 mm) do sekcji oraz mniejsze sterylne szalki Petriego (35 x 10 mm) do zatapiania, małe nożyczki, dwie precyzyjne pęsety (Dumont 5), miniłyżeczkę perforowaną, szklaną pipetę Pasteura wypalaną z okrągłą, zamkniętą końcówką oraz 1 L buforu Krebsa 1X w lodzie. Przetrzeć wszystkie narzędzia do sekcji 70% etanolem.
   4. Dodać pożywkę hodowlaną do dołków płytki sześciodołkowej (1,5 mL/dołek) i umieścić ją w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
   5. Przygotować płytkę sześciodołkową z 1,5 mL/dołek sterylnego buforu Krebsa 1X i 15 μL Penicyliny/Streptomycyny (100X)/dołek. W warunkach sterylnych umieścić wkłady hodowlane Millicell w dołkach. Postawić płytkę sześciodołkową obok wibratomu, aby skrawki mózgu można było przenieść na membrany filtrujące natychmiast po sekcjonowaniu.

2. Disekcja i zatapianie mózgów embrionalnych

1. Zanurz ciężarną myszkę w znieczuleniu izofluranem, a następnie uśmierć ją poprzez zwichnięcie stawów szyjnych (embriony powinny być w stadium E12.5). Wypreparuj macicę myszy, wyciągając ją pęsetą. Używając drugiej pęsety, oddziel krezkę od macicy. Umieść macicę w lodowatym buforze Krebsa 1X. Za pomocą precyzyjnej pęsety oddziel ścianę mięśniową macicy, błonę Reicherta oraz trzewny worek żółtkowy od embrionu. Wyjmij embriony z macicy. Umieść wypreparowane embriony w osobnej szalce Petriego z jałowym buforem Krebsa 1X.
2. Wypreparuj mózg pod stereomikroskopem. Aby to zrobić, najpierw odetnij głowę embrionu. Unieruchom głowę, przebijając ją precyzyjną pęsetą (na wysokości oczu). Używając drugiej pęsety, ostrożnie usuń skórę i czaszkę. Za pomocą pęsety delikatnie wyjmij mózg i przenieś go do szalki Petriego z jałowym buforem Krebsa 1X. Bardzo ważne jest zachowanie integralności całego mózgu podczas preparacji, ponieważ uszkodzenia tkanki mózgowej spowodują problemy (np. rwanie tkanki) podczas krojenia na wibratomie.
3. Przepłucz mózgi raz w 4% agarozie o niskiej temperaturze topnienia (LMP). Osadź po 2-3 mózgi jednocześnie w świeżej 4% agarozie LMP. Umieść naczynia z osadkami na lodzie, starając się, aby stały jak najrówniej. Użyj pipety Pasteura z wypalonym, okrągłym końcem, aby unosić mózgi, dopóki dno agarozy nie zastygnie. Mózgi powinny osiąść w płaskiej pozycji, równolegle do dna bloku agarozy.
4. Po całkowitym zastygnięciu agarozy (po około 3 min), przytnij agarozę wokół mózgów i przyklej blok agarozy do stolika przedmiotowego wibratomu. Podczas przyklejania bloków upewnij się, że strona brzuszna mózgu jest równoległa do platformy, ponieważ mózgi powinny być cięte w poziomym płaszczyźnie przekroju.

3. Krojenie w wibrotomie

1. Do krojenia użyć żyletki. Aby uzyskać nienaruszone skrawki, bardzo ważne jest utrzymanie temperatury 4°C podczas sekcjonowania.
2. Wyciąć poziome skrawki o grubości 300 μm przy częstotliwości 50 Hz, amplitudzie ostrza 1,1 mm i prędkości 25 mm/sec.
3. Za pomocą cienkiego pędzla przesunąć skrawki do mini łyżeczki z perforacjami, aby je zebrać, a następnie przenieść do naczynia ze sterylnym, lodowatym buforem Krebsa 1X. Wybrać skrawki zawierające tkankę brzusznej części śródmózgowia (patrz Rysunek 1). W mózgu myszy w stadium E12.5 tylko jeden poziomy skrawek o grubości 300 μm zawiera tkankę brzusznej części śródmózgowia, w tym neurony dopaminergiczne.

4. Hodowla plastrów

Kroki 4.2–4.5 należy przeprowadzić w warunkach sterylnych.

1. Przenieś skrawki mózgu na wkładkę z membraną do hodowli komórkowej Millicell w płytce sześciodołkowej z buforem Krebsa 1x (patrz punkt 1.2.5). Do przeniesienia skrawka należy użyć mini łyżeczki perforowanej (Fine Science Tools) oraz cienkiego pędzla. Na jednej membranie można umieścić do 3 skrawków.
2. Przenieś membranę ze skrawkiem do płytki sześciodołkowej z pożywką hodowlaną (patrz punkt 1.2.5). Górna część membrany nie powinna być zakryta pożywką. Skrawki mózgu otrzymują pożywkę od dołu i powietrze od góry.
3. Umieść płytkę sześciodołkową w inkubatorze z 5 % CO₂ w temperaturze 37 °C. Bardzo ważne jest, aby skrawki zostały umieszczone w inkubatorze w ciągu 2 godzin od początkowego etapu sekcji. Dłuższy czas przygotowania może skutkować niską przeżywalnością skrawków.
4. Skrawki mogą być utrzymywane in vitro do 3 dni. W 2^nd dniu wymień 50% pożywki hodowlanej.

5. Obrazowanie time-lapse

1. Pozostawć plastry do regeneracji w inkubatorze na 4-5 godzin przed rozpoczęciem obrazowania time-lapse.
2. Do obrazowania time-lapse pozostawić plastry na wkładzie membranowym, a następnie przenieść wkład do szalki Ibidi μ-dish o średnicy 35 mm (dno szalki wykonane jest z materiału o wysokiej jakości optycznej).
3. Do szalki dodać 1 mL pożywki hodowlanej oraz 1,5 μL kwasu askorbinowego (200 mM). Kwas askorbinowy chroni plastry przed fototoksycznością.
4. Podczas obrazowania time-lapse inkubować plastry w komorze środowiskowej w temperaturze 37 °C przy 5 % CO2.

6. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1 przedstawia przygotowanie organotypowych kultur plastrów z mózgu myszy w stadium E12.5. Rysunek 2 pokazuje poziome plastry organotypowe (świeże oraz po kilku dniach hodowli) uzyskane z mózgu myszy w stadium E12.5. Dla porównania przedstawiono zamrożone przekroje mózgu w odpowiadających im etapach rozwojowych. Neurony dopaminergiczne śródmózgowia zwizualizowano za pomocą immunohistochemii na hydroksylazę tyrozynową (TH). Neurony dopaminergiczne śródmózgowia rzutują do obszarów docelowych w przedmózgowiu. Projekcje te zaczynają tworzyć się w stadium E12.5 i rozciągają się w kierunku przedmózgowia w kolejnych dniach. Rozwój projekcji do przedmózgowia uznajemy za dobrą wskazanie prawidłowego rozwoju neuronów dopaminergicznych w hodowli. W plastrach poziomych neurony dopaminergiczne śródmózgowia wysyłają projekcje w kierunku ich właściwego obszaru docelowego w przedmózgowiu. Po 3 DIV (dniach in vitro) lub w przypadku uszkodzenia obszarów docelowych w przedmózgowiu, aberracyjne projekcje rozciągają się w kierunku grzbietowej części śródmózgowia. Przykłady przekrojów czołowych śródmózgowia w stadium E12.5 przedstawiono na Rysunku 3. Neurony dopaminergiczne zwizualizowane za pomocą immunobarwienia na TH wysyłają aberracyjne projekcje do grzbietowej części śródmózgowia. Rysunek 4 przedstawia analizę komórek proliferujących, nekrotycznych i apoptotycznych w organotypowych kulturach plastrów. Immunobarwienie BrdU w celu wizualizacji komórek proliferujących wykazuje, że komórki proliferują w warunkach hodowli po 1 DIV. Proliferacja jest ograniczona po 4 DIV. Po 3 DIV wiele komórek w brzusznej części śródmózgowia ulega nekrozie (barwienie jodkiem propidyny) i apoptozie (immunobarwienie na rozszczepioną kaspazę-3). Rysunek 5 pokazuje ścieżki migracji neuronów znakowanych YFP, monitorowane w eksperymencie obrazowania time-lapse w świeżym plastrze.

Rysunek 1. Schemat ilustrujący przygotowanie organotypowych kultur plastrów. Poziome plastry mózgu o grubości 300 μm są przygotowywane poprzez sekcjonowanie mózgu E12.5 przy użyciu wibratomu. (A) Schematyczny widok strzałkowy mózgu myszy E12.5. Oznaczono poziomy przekrojów. Obszar zawierający neurony dopaminergiczne przedstawiono na różowo, projekcje zaznaczono na niebiesko. (B) Schematy trzech plastrów, które można uzyskać w przekroju od grzbietowego do brzusznego, a które zawierają zarówno przedmózgowie (Fb), jak i śródmózgowie (Mb). Należy zauważyć, że tylko jeden plaster zawiera neurony dopaminergiczne (plaster b). Odpowiedni plaster można zidentyfikować na podstawie położenia komór oraz ciągłości tkanki śródmózgowia i przedmózgowia (strzałki, porównać sekcję b z sekcjami a i c). Obszar zawierający neurony dopaminergiczne zaznaczono na różowo, obszar zawierający prekursory dopaminergiczne przedstawiono na zielono, a niebieskie strzałki wskazują rozwijające się projekcje. (C) Plaster zawierający neurony dopaminergiczne jest hodowany na wkładkach membranowych. Skróty: vMb, brzuszne śródmózgowie; dMb, grzbietowe śródmózgowie; Hyp, podwzgórze; Hb, rombencefalon.

Rysunek 2. Projekcje neuronów dopaminergicznych śródmózgowia w organotypowych kulturach plastrów są zależne od integralności przedmózgowia. Immunohistochemia tyrozynohydroksylazy (TH) w celu znakowania neuronów dopaminergicznych. (A) Świeży plaster (0 DIV) pokazujący prawidłowe rozmieszczenie neuronów dopaminergicznych w brzusznej części śródmózgowia. Biała grot strzałki wskazuje obszar przedstawiony w większym powiększeniu na wstawce. Projekcje do przedmózgowia nie rozwinęły się jeszcze. Po 1 DIV zaczynają formować się projekcje do przedmózgowia. W 2-3 DIV projekcje rozciągają się do przedmózgowia. Białe groty strzałek wskazują położenie ciał komórkowych przedstawionych w większym powiększeniu na wstawkach (biała ramka). Żółte strzałki podkreślają prawidłowe projekcje w nieuszkodzonych plastrach przedstawione w większym powiększeniu na wstawkach (żółta ramka). Aberrantne projekcje rozwijają się w plastrach z uszkodzonym przedmózgowiem. Czerwone strzałki wskazują aberrantne projekcje do grzbietowej części śródmózgowia przedstawione w większym powiększeniu na wstawkach (czerwona ramka). Uszkodzenia zaznaczono czerwonymi gwiazdkami. Po 3 DIV większość plastrów (n=5/7) wykazywała aberrantne projekcje w kierunku grzbietowej części śródmózgowia. (B) Barwienie immunohistochemiczne TH na poziomych mrożonych przekrojach mózgu na różnych etapach rozwoju w celu pokazania rozwoju projekcji dopaminergicznych in vivo. Białe groty strzałek wskazują położenie ciał komórkowych przedstawionych w większym powiększeniu na wstawkach (biała ramka). Żółte strzałki podkreślają położenie projekcji przedstawionych w większym powiększeniu na wstawkach (żółta ramka). Poziom mrożonych przekrojów dobrano tak, aby ściśle odpowiadał poziomowi organotypowych kultur plastrów. Należy zauważyć, że pojedynczy mrożony przekrój (12 μm) nie reprezentuje całego organotypowego plastra (300 μm). Dlatego projekcje pokazane w E13.5 i E14.5 obserwowano na przekrojach o 120 μm bardziej brzusznych niż przekrój zawierający ciała komórkowe (żółte gwiazdki).

Rycina 3. Hodowle koronarnych skrawków śródmózgowia barwione na hydroksylazę tyrozynową (TH) jako marker neuronów dopaminergicznych. (A-C) Skrawki po 1, 2 lub 3 DIV. Neurony dopaminergiczne rozwijają aberracyjne projekcje w kierunku grzbietowej części śródmózgowia (czerwone strzałki). Groty strzałek wskazują położenie ciał komórek dopaminergicznych.

Rycina 4. Proliferacja i żywotność komórek w organotypowych kulturach skrawków śródmózgowia. (A) Komórki proliferujące oznakowano poprzez dodanie BrdU (50 ng/mL, Sigma) do pożywki hodowlanej na 18 h. Następnie skrawki poddano immunobarwieniu na BrdU. Po 1 DIV komórki oznakowane BrdU znajdują się w strefach komorowych (czerwone strzałki). Po 4 DIV komórki proliferujące są bardziej rozproszone, a wyraźna strefa komorowa nie jest już utrzymywana. (B) Komórki nekrotyczne oznakowano poprzez dodanie jodku propidyny (1μg/μL, Sigma) do pożywki hodowlanej na 2 h i uwidoczniono za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Po 1 DIV brzuszna część śródmózgowia (vMb) nie jest nekrotyczna, lecz wiele komórek oznakowanych jodkiem propidyny jest widocznych w grzbietowej części śródmózgowia i w przedmózgowiu. Po 3 DIV żywotność komórek w brzusznej części śródmózgowia spada. Pasek skali: 500 μm (C) Immunobarwienie na rozszczepioną kaspazę-3 w celu uwidocznienia komórek apoptotycznych. W 1 lub 2 DIV tylko nieliczne neurony dopaminergiczne (TH) wykazują apoptozę. Po 3 DIV neurony dopaminergiczne zaczynają ulegać apoptozie. Panele w środku i po prawej stronie stanowią powiększenia obszaru obramowanego w panelach po lewej stronie. Obrazy o większym powiększeniu są maksymalnymi projekcjami intensywności stosów z (z-stacks) 14-16 klatek. Obrazy wykonano co 0.5 μm przy użyciu zestawu Zeiss Apotome.

Rysunek 5. Droga migracji neuronów znakowanych YFP w skrawku świeżym. (A) Skrawek poziomy użyty do obrazowania time-lapse neuronów znakowanych YFP. Skrawek inkubowano przez 5 h przed obrazowaniem. Komórki znakowano przy użyciu indukowalnego systemu Cre/loxP⁶. Wykorzystano myszy Shh^{CreER 8} oraz myszy reporterowe ROSA^{loxP-STOP-loxP-EYFP 9}. Rekombinacja allelu reporterowego ROSA (i ekspresja EYFP) jest indukowana w komórkach wykazujących ekspresję CreER (komórkach exprimujących Shh), ale tylko po podaniu Tamoksyfenu (Sigma). W tym przykładzie Tamoksyfen (3 mg/40 g masy ciała) podano ciężarnym myszom w dniu E8.5. Taki układ eksperymentalny prowadzi głównie do znakowania prekursorów neuronów dopaminergicznych i ich potomstwa w brzusznej części śródmózgowia^10,11 . Pasek skali: 500 μm. (B) Śledzenie drogi migracji neuronów znakowanych YFP w skrawku świeżym. Obrazy time-lapse neuronów znakowanych YFP w mapowaniu losów pozyskiwano co 30 min przez łączny czas 5 h 30 min przy użyciu mikroskopu Zeiss Axio-Observer (obiektyw EC PlnN 10x /0.3). Skrawki inkubowano w komorze środowiskowej (inkubator XLS1 Pecon) w temperaturze 37 °C i zasilano 5 % CO₂ podczas obrazowania. Początkowa pozycja komórek jest zaznaczona czerwonymi strzałkami; pozycje migracji są zaznaczone czerwonymi gwiazdkami.

Dyskusja

Przedstawiona tutaj metoda organotypowej hodowli skrawków dostarcza systemu do krótkotrwałej analizy in vitro rozwijających się neuronów dopaminergicznych oraz ich dróg migracji i projekcji w embrionalnym brzusznej części śródmózwia. Stwierdziliśmy, że w protokole istnieje szereg krytycznych etapów, na które należy zwrócić szczególną uwagę, aby uzyskać skrawki umożliwiające prawidłowy rozwój neuronów dopaminergicznych brzusznej części śródmózwia. Najbardziej krytycznym etapem jest preparatyka mózgu embrionalnego...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Tabela specyficznych odczynników i sprzętu
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429
Glukoza 30%	Sigma-Aldrich	G7528-250
Surowica konia	Invitrogen	26050-088
DMEM (4,5g/L Glc., z L-Gln, Na Pyr, NaHCO3)	Sigma-Aldrich	D6429-500
Penicylina/Streptomycyna 100x	Sigma-Aldrich	P4333-20
Kwas L-askorbinowy	Sigma-Aldrich	A4403	przygotować roztwór stokowy 200mM i przechowywać w -20°C
Agaroza LMP UltraPure	Invitrogen	15517-022
Wkładniki Millicel	EMD Millipore	PICMORG50
μ-szalka 35 mm, niska	Ibidi	80136
Wibratom	Microm International	HM 650V
Żyletka	Plano GmbH	121-6
Klej Histoacryl	BRAU9381104	Braun Aesculap
Łyżka perforowana o średnicy 15 mm	Fine Science Tools	10370 -18
Pinceta 5 Dumoxel	Fine Science Tools	11252 - 30
Przeciwciała użyte do immunobarwień:
Królicze anty-tyrozynowa hydroksylaza	EMD Millipore	AB152	Rozcieńczenie 1:500
Mysie anty-tyrozynowa hydroksylaza	EMD Millipore	MAB318	Rozcieńczenie 1:500
Mysie anty-BrdU	BD Biosciences	555627	Rozcieńczenie 1:200
Królicze anty-rozszczepiona kaspaza 3	Cell Signaling Technology	9661	Rozcieńczenie 1:200
Osiołkowe anty-królicze IgG-Alexa 488	Invitrogen	A21206	Rozcieńczenie 1:500
Osiołkowe anty-mysie IgG-Cy3	Jackson ImmunoResearch	715-165-150	Rozcieńczenie 1:200