Organotypowe hodowle plastrów embrionalnego brzusznego śródmózgowia: system do badania rozwoju neuronów dopaminergicznych in vitro

Podsumowanie

Opisano metodę przygotowania organotypowych skrawków z embrionalnego śródmózgowia myszy w stadium E12.5. Organotypowe hodowle skrawków mogą być wykorzystywane do obserwacji zachowania neuronów dopaminergicznych lub innych neuronów z brzusznej części śródmózgowia.

Streszczenie

Mysz jest doskonałym organizmem modelowym do badania rozwoju mózgu ssaków ze względu na obfitość danych molekularnych i genetycznych. Jednak rozwijający się mózg myszy nie nadaje się do łatwych manipulacji i obrazowania in vivo, ponieważ embrion myszy jest niedostępny i nieprzezroczysty. W związku z tym w badaniach rozwoju mózgu myszy in vitro szeroko stosuje się organotypowe hodowle plastrów mózgu embrionalnego. Manipulacje ex vivo lub wykorzystanie myszy transgenicznych pozwalają na modyfikację ekspresji genów, dzięki czemu subpopulacje komórek neuronalnych lub glejowych mogą być znakowane białkami fluorescencyjnymi. Zachowanie oznakowanych komórek można następnie obserwować za pomocą obrazowania poklatkowego (time-lapse). Obrazowanie poklatkowe okazało się szczególnie skuteczne w badaniu zachowań komórkowych leżących u podstaw rozwoju kory mózgowiej na późnych etapach embrionalnych ^1-2. Systemy organotypowych hodowli plastrów embrionalnych w regionach mózgu poza przedmózowiem są mniej rozwinięte. W związku z tym bogactwo danych z obrazowania poklatkowego opisujących migrację komórek neuronalnych ogranicza się do przedmózowia ^3,4. Wciąż nie wiadomo, czy zasady odkryte dla grzbietowej części mózgu obowiązują również w obszarach brzusznych. W brzusznej części mózgu neurony są zorganizowane w skupiska neuronalne, a nie w warstwy, i często muszą przebyć skomplikowane trajektorie migracyjne, aby dotrzeć do swojej docelowej pozycji. Brzuszna część śródmózowia jest nie tylko dobrym systemem modelowym dla rozwoju brzusznej części mózgu, ale zawiera również populacje neuronalne, takie jak neurony dopaminergiczne, które mają znaczenie w procesach chorobowych. Podczas gdy funkcje i degeneracja neuronów dopaminergicznych były szczegółowo badane w mózgu dorosłym i starzejącym się, niewiele wiadomo o zachowaniu tych neuronów podczas fazy ich różnicowania i migracji ⁵. Opisujemy tutaj tworzenie hodowli plastrów z brzusznej części śródmózowia myszy w 12,5 dniu embrionalnym (E12.5). Hodowle te są potencjalnie odpowiednie do monitorowania rozwoju neuronów dopaminergicznych przez kilka dni in vitro. Podkreślamy krytyczne kroki w przygotowywaniu plastrów mózgu na tych wczesnych etapach rozwoju embrionalnego i omawiamy warunki niezbędne do utrzymania prawidłowego rozwoju neuronów dopaminergicznych in vitro. Przedstawiamy również wyniki eksperymentów z obrazowania poklatkowego. W eksperymentach tych prekursory brzusznej części śródmózowia (w tym prekursory dopaminergiczne) oraz ich potomstwo zostały oznakowane w sposób mozaikowy przy użyciu indukowalnego systemu mapowania linii komórkowych opartego na systemie Cre/loxP ⁶.

Protokół

Część tego protokołu została zmodyfikowana na podstawie pracy Daza et al., 207 ⁷.

1. Przygotowania

1. Można przygotować z jednodniowym wyprzedzeniem
   1. Przygotować bufor Krebsa 1X (1,5 L): 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,2 mM NaH₂PO₄:H₂O, 1,2 mM MgCl₂, 2,5 mM CaCl₂, 1 mM glukozy, 25 mM NaHCO₃; dostosować pH do 7,4. Sterylizować przez filtrowanie (pory 0,2 μm) i przechowywać w temperaturze 4°C.
   2. Przygotować pożywkę hodowlaną (20 mL): 5 mL HBSS, 9 mL DMEM z wysoką zawartością glukozy, 850 μL 30% glukozy, 5 mL surowicy koni (25%). Dodać 20 μL 100X penicyliny/streptomycyny. Przechowywać w temperaturze 4°C.
2. Przygotować przed rozpoczęciem sekcji
   1. Przygotować 10 mL 4% agarozy niskotopliwej (agarozy LMP) w buforze Krebsa 1X: podgrzewać roztwór w kuchence mikrofalowej aż do całkowitego rozpuszczenia agarozy, a następnie umieścić agarozę w kąpieli wodnej o temperaturze 45°C.
   2. Napełnić tackę na bufor w wibratomie lodowatym buforem Krebsa 1X i uruchomić element chłodzący (utrzymać 4°C). Zamocować żyletkę w uchwycie i przygotować obszar roboczy wibratomu, zapewniając skalpel, cienki pędzel oraz miniaturową łyżeczkę perforowaną do pobierania skrawków. Przygotować sterylne szalki Petriego (35 x 10 mm) z buforem Krebsa 1X do zbierania skrawków. Przechowywać w lodzie.
   3. Przygotować obszar sekcji z sterylnymi szalkami Petriego (10 x 15 mm) do sekcji oraz mniejszymi sterylnymi szalkami Petriego (35 x 10 mm) do zatapiania, małymi nożyczkami, dwiema precyzyjnymi pincetami (Dumont 5), miniaturową łyżeczką perforowaną, szklaną pipetą Pasteura wypalaną z okrągłą zamkniętą końcówką oraz 1 L buforu Krebsa 1X w lodzie. Przetrzeć wszystkie narzędzia do sekcji 70% etanolem.
   4. Dodać pożywkę hodowlaną dołków płytki sześcio-dołkowej (1,5 mL/dołek) i umieścić ją w inkubatorze w temperaturze 37°C.
   5. Przygotować płytkę sześcio-dołkową z 1,5 mL/dołek sterylnego buforu Krebsa 1X oraz 15 μL penicyliny/streptomycyny (100X)/dołek. W warunkach sterylnych umieścić wkłady do hodowli komórkowych Millicell w dołkach. Postawić płytkę sześcio-dołkową obok wibratomu, aby skrawki mózgu można było przenieść na membrany filtrujące bezpośrednio po cięciu.

2. Disekcja i zatapianie mózgów embrionalnych

1. Zanurzyć ciężarną samicę myszy w narkozie przy użyciu izofluranu, a następnie uśmiercić zwierzę poprzez zwichnięcie stawów szyjnych (embriony powinny być w stadium E12.5). Wypreparować macicę myszy, wyciągając ją pęsetą. Za pomocą innej pęsety oddzielić mesometrium od macicy. Umieścić macicę w lodowatym buforze Krebsa 1X. Używając cienkiej pęsety, oddzielić ścianę mięśniową macicy, błonę Reicherta oraz wisceralny worek żółtkowy od embrionu. Wyjąć embriony z macicy. Umieścić wypreparowane embriony w osobnej szalce Petriego z jałowym buforem Krebsa 1X.
2. Wypreparować mózg pod stereomikroskopem. Aby wypreparować mózg, należy najpierw odciąć głowę embrionu. Unieruchomić głowę, przebijając ją cienką pęsetą (na poziomie oczu). Używając drugiej pęsety, ostrożnie usunąć skórę i czaszkę. Za pomocą pęsety delikatnie wyjąć mózg i przenieść go do szalki Petriego z jałowym buforem Krebsa 1X. Bardzo ważne jest zachowanie integralności całego mózgu podczas preparacji, ponieważ uszkodzenia tkanki mózgowej spowodują problemy (takie jak szarpanie tkanki) podczas cięcia na wibrotomie.
3. Przepłukać mózgi raz w 4 % agarozie o niskiej temperaturze topnienia (LMP). Osadzić 2-3 mózgi jednocześnie w świeżej 4 % agarozie LMP. Umieścić naczynia do osadzania na lodzie, dbając o ich jak największe wyrównanie. Użyć pipety Pasteura z wypaloną, okrągłą końcówką do podnoszenia mózgów, aż do momentu zastygnięcia dna agarozy. Mózgi powinny osiąść w płaskiej pozycji, równolegle do dna bloku agarozy.
4. Po całkowitym zastygnięciu agarozy (po około 3 min), przyciąć agarozę wokół mózgów i przykleić blok agarozy do stolika z preparatem wibrotomu. Podczas przyklejania bloków należy upewnić się, że strona brzuszna mózgu jest równoległa do platformy, ponieważ mózgi powinny być cięte w horyzontalnej płaszczyźnie przekroju.

3. Przecinanie w wibrotomie

1. Do pobierania przekrojów należy użyć żyletki. Aby uzyskać nieuszkodzone plastry, bardzo ważne jest utrzymanie temperatury 4°C podczas sekcjonowania.
2. Należy wykonać poziome przekroje o grubości 30 μm przy częstotliwości 50 Hz, amplitudzie ostrza 1,1 mm i prędkości 25 mm/sec.
3. Za pomocą cienkiego pędzla należy przesunąć plaster do miniaturowej dziurkowanej łyżki, aby zebrać przekroje mózgu i przenieść je do naczynia ze sterylnym, lodowatym buforem Krebsa 1X. Wybrać plaster zawierający tkankę brzusznej części śródmózwia (patrz Rysunek 1). W mózgu myszy w stadium E12.5 istnieje tylko jeden poziomy przekrój o grubości 30 μm, który zawiera tkankę brzusznej części śródmózwia, w tym neurony dopaminergiczne.

4. Hodowla skrawków tkankowych

Kroki 4.2-4.5 należy przeprowadzić w warunkach sterylnych.

1. Przenieś skrawki mózgu na wkładkę z membraną do hodowli komórkowej Millicell w płytce sześciodołkowej zawierającej 1x bufor Krebsa (patrz punkt 1.2.5). Do przeniesienia skrawka użyj małej łyżki perforowanej (Fine Science Tools) oraz cienkiego pędzla. Na jednej membranie można umieścić do 3 skrawków.
2. Przenieś membranę ze skrawkiem do płytki sześciodołkowej z pożywką hodowlaną (patrz punkt 1.2.5). Górna powierzchnia membrany nie powinna być zakryta pożywką. Skrawki mózgu otrzymują pożywkę od dołu, a dopływ powietrza od góry.
3. Umieść płytkę sześciodołkową w inkubatorze z 5 % CO₂ w temperaturze 37 °C. Bardzo ważne jest, aby skrawki zostały umieszczone w inkubatorze w ciągu 2 godzin od pierwszego etapu sekcji. Przedłużony czas przygotowania może skutkować niską przeżywalnością skrawków.
4. Skrawki mogą być utrzymywane in vitro do 3 dni. W 2^nd dniu wymień 50% pożywki hodowlanej.

5. Obrazowanie poklatkowe

1. Pozostaw plastry w inkubatorze na 4-5 godzin w celu regeneracji przed rozpoczęciem obrazowania time-lapse.
2. Do obrazowania time-lapse pozostaw plastry na wkładzie membranowym i przenieś wkład do 35 mm szalki Ibidi μ-dish (dno szalki wykonane jest z materiału o wysokiej jakości optycznej).
3. Do szalki dodaj 1 mL pożywki hodowlanej oraz 1,5 μL kwasu askorbinowego (20 mM). Kwas askorbinowy chroni plastry przed fototoksycznością.
4. Podczas obrazowania time-lapse inkubuj plastry w komorze środowiskowej w temperaturze 37 °C przy 5 % CO2.

6. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1 przedstawia przygotowanie organotypowych hodowli plastrów z mózgu myszy w stadium E12.5. Rysunek 2 pokazuje poziome plastry organotypowe (ostre oraz po kilku dniach hodowli) pobrane z mózgu myszy w stadium E12.5. Dla porównania przedstawiono mrożone przekroje mózgu na równoważnych etapach rozwoju. Neurony dopaminergiczne śródmózgowia zwizualizowano za pomocą immunohistochemii przeciwko tyrozynowej hydroksylazie (TH). Neurony dopaminergiczne śródmózgowia wysyłają projekcje do obszarów docelowych w przedmózgowiu. Projekcje te zaczynają się tworzyć w stadium E12.5 i rozciągają się w stronę przedmózgowia w kolejnych dniach. Rozwój projekcji do przedmózgowia uznajemy za dobry wskaźnik prawidłowego rozwoju neuronów dopaminergicznych w hodowli. W plastrach poziomych neurony dopaminergiczne śródmózgowia wysyłają projekcje w kierunku ich właściwego obszaru docelowego w przedmózgowiu. Po 3 DIV (dniach in vitro) lub w przypadku uszkodzenia obszarów docelowych w przedmózgowiu, aberracyjne projekcje rozciągają się w stronę grzbietowej części śródmózgowia. Przykłady czołowych przekrojów śródmózgowia E12.5 przedstawiono na Rysunku 3. Neurony dopaminergiczne zwizualizowane za pomocą immunobarwienia na TH wysyłają aberracyjne projekcje do grzbietowej części śródmózgowia. Rysunek 4 przedstawia analizę komórek proliferujących, nekrotycznych i apoptycznych w organotypowych hodowlach plastrów. Immunobarwienie BrdU w celu wizualizacji komórek proliferujących wykazuje, że komórki proliferują w warunkach hodowli po 1 DIV. Proliferacja jest zmniejszona po 4 DIV. Po 3 DIV wiele komórek w brzusznej części śródmózgowia ulega nekrozie (barwienie jodkiem propidyny) i apoptozie (immunobarwienie na rozszczepioną kaspazę-3). Rysunek 5 pokazuje drogi migracji neuronów znakowanych YFP monitorowane w eksperymencie obrazowania time-lapse w ostrym plastrze.

Rysunek 1. Schemat ilustrujący przygotowanie organotypowych kultur plastrów. 300 μm Poziome skrawki mózgu przygotowuje się poprzez sekcjonowanie mózgu w stadium E12.5 za pomocą wibratomu. (A) Schematyczny widok strzałkowy mózgu myszy w stadium E12.5. Wyznaczono poziomy sekcji. Obszar zawierający neurony dopaminergiczne zaznaczono kolorem różowym, projekcje wskazano kolorem niebieskim. (B) Schematy trzech skrawków, które można uzyskać w przekroju od grzbietowej do brzusznej części, zawierających zarówno przedmózgowie (Fb), jak i śródmózgowie (Mb). Należy zwrócić uwagę, że tylko jeden skrawek zawiera neurony dopaminergiczne (skrawku b). Odpowiedni skrawek można zidentyfikować na podstawie położenia komór oraz ciągłości tkanki śródmózgowia i przedmózgowia (strzałki, porównać sekcję b z sekcjami a i c). Obszar zawierający neurony dopaminergiczne zaznaczono kolorem różowym, obszar zawierający prekursory dopaminergiczne przedstawiono kolorem zielonym, niebieskie strzałki wskazują rozwijające się projekcje. (C) Skrawek zawierający neurony dopaminergiczne jest hodowany na wkładkach membranowych. Skróty: vMb, brzuszne śródmózgowie; dMb, grzbietowe śródmózgowie; Hyp, podwzgórze; Hb, rombencephalon.

Rysunek 2. Projekcje dopaminergicznych neuronów śródmózgowia w organotypowych kulturach skrawków są zależne od integralności przedmózgowia. Immunohistochemia tyrozynowej hydroksylazy (TH) w celu znakowania neuronów dopaminergicznych. (A) Skrawka świeża (0 DIV) pokazująca prawidłową lokalizację neuronów dopaminergicznych w brzusznej części śródmózgowia. Biała grot strzałki wskazuje obszar przedstawiony w większym powiększeniu na wstawce. Projekcje do przedmózgowia nie rozwinęły się jeszcze. Po 1 DIV zaczynają tworzyć się projekcje do przedmózgowia. W dniach 2-3 DIV projekcje rozszerzają się do przedmózgowia. Białe groty strzałek wskazują lokalizację ciał komórkowych przedstawionych w większym powiększeniu na wstawkach (biała ramka). Żółte strzałki wyróżniają prawidłowe projekcje w nienaruszonych skrawkach, pokazane w większym powiększeniu na wstawkach (żółta ramka). W skrawkach z uszkodzonym przedmózgowiem rozwijają się projekcje aberrantne. Czerwone strzałki wskazują aberrantne projekcje do grzbietowej części śródmózgowia, pokazane w większym powiększeniu na wstawkach (czerwona ramka). Uszkodzenie zaznaczono czerwonymi gwiazdkami. Po 3 DIV większość skrawków (n=5/7) wykazała aberrantne projekcje w kierunku grzbietowej części śródmózgowia. (B) Barwienie immunocytochemiczne TH na poziomych, mrożonych przekrojach mózgu na różnych etapach rozwoju, pokazujące rozwój projekcji dopaminergicznych. in vivoBiałe groty strzałek wskazują położenie ciał komórkowych przedstawionych w większym powiększeniu na wstawkach (biała ramka). Żółte strzałki wskazują położenie wypustek przedstawionych w większym powiększeniu na wstawkach (żółta ramka). Poziom przekrojów mrożonych dobrano tak, aby ściśle odpowiadał poziomowi organotypowych kultur plastrów. Należy zauważyć, że pojedynczy przekrój mrożony (12 μm) nie reprezentuje całego organotypowego skrawka (300 μm). W związku z tym projekcje widoczne w dniach E13,5 i E14,5 obserwowano na przekrojach 120 μm bardziej brzusznie niż przekrój zawierający ciała komórek (żółte gwiazdki).

Rysunek 3. Kultury cieni coronalnych śródmózgia barwione na tyrozynową hydroksylazę (TH) jako marker neuronów dopaminergicznych. (A-C) Przekroje po 1, 2 lub 3 dniach in vitro (DIV). Neurony dopaminergiczne rozwijają aberrantne projekcje w kierunku grzbietowej części śródmózgowia (czerwone strzałki). Grotami strzałek wskazano położenie ciał komórek dopaminergicznych.

Rycina 4. Proliferacja i żywotność komórek w organotypowych kulturach skrawków śródmózgowia. (A) Komórki proliferujące znakowano poprzez dodanie BrdU (50 ng/mL, Sigma) do pożywki hodowlanej na 18 h. Następnie skrawki poddano immunobarwieniu na BrdU. Po 1 DIV komórki znakowane BrdU znajdują się w strefach komorowych (czerwone strzałki). Po 4 DIV komórki proliferujące są bardziej rozproszone, a wyraźna strefa komorowa nie jest już utrzymywana. (B) Komórki nekrotyczne znakowano poprzez dodanie jodku propidium (1μg/μL, Sigma) do pożywki hodowlanej na 2 godziny, a następnie wizualizowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Po 1 DIV brzuszna część śródmózgowia (vMb) nie wykazuje martwicy, jednak w grzbietowej części śródmózgowia oraz w przedmózgowiu widocznych jest wiele komórek znakowanych jodkiem propidyny. Po 3 DIV żywotność komórek w brzusznej części śródmózgowia spada. Pasek skali: 500 μm (C) Immunobarwienie na rozszczepioną kaspazę-3 w celu wizualizacji komórek apoptotycznych. W 1. lub 2. dobie in vitro (DIV) tylko nieliczne neurony dopaminergiczne (TH) wykazują apoptozę. Po 3. dobie DIV neurony dopaminergiczne zaczynają przechodzić apoptozę. Panele w środku i po prawej stronie to powiększenia obszarów zaznaczonych ramkami w panelach po lewej. Obrazy o większym powiększeniu są maksymalnymi projekcjami intensywności stosów z (z-stacks) składających się z 14–16 klatek. Obrazy wykonano co 0.5 μm z wykorzystaniem zestawu Zeiss Apotome.

Rysunek 5. Droga migracji neuronów znakowanych YFP w skrawku tkankowym. (A) Przekrój poziomy wykorzystany do obrazowania poklatkowego neuronów znakowanych YFP. Przekrój inkubowano przez 5 godzin przed obrazowaniem. Komórki znakowano przy użyciu indukowalnego systemu Cre/loxP.⁶. Shh^CreER myszy ⁸ i ROSA^{loxP-STOP-loxP-EYFP} myszy reporterowe ⁹ zastosowano. Rekombinacja allelu reporterowego ROSA (i ekspresja EYFP) jest indukowana w komórkach wykazujących ekspresję CreER (komórkach wykazujących ekspresję Shh), jednak wyłącznie po podaniu tamoksyfenu (Sigma). W niniejszym przykładzie tamoksyfen (3 mg/40 g masy ciała) podano ciężarnym myszom w dniu E8,5. Taki układ eksperymentalny prowadzi przede wszystkim do znakowania prekursorów neuronów dopaminergicznych oraz ich potomstwa w brzusznej części śródmózgowia.^10,11 Skala: 500 μm(B) Śledzenie drogi migracji neuronów znakowanych YFP w skrawku tkanek uzyskany metodą ostrego cięcia. Obrazy time-lapse neuronów znakowanych YFP w ramach mapowania losów komórek pozyskiwano co 30 min przez łącznie 5 h 30 min przy użyciu mikroskopu Zeiss Axio-Observer (obiektyw EC PlnN 10x /0,3). Skrawki inkubowano w komorze środowiskowej (inkubator XLS1 Pecon) w 37 °C i dostarczono 5% CO2₂ podczas obrazowania. Początkową pozycję komórek oznaczono czerwonymi strzałkami; pozycje migracji oznaczono czerwonymi gwiazdkami.

Dyskusja

Przedstawiona tutaj metoda organotypowej hodowli skrawków dostarcza systemu do krótkotrwałej analizy in vitro rozwijających się neuronów dopaminergicznych oraz ich dróg migracji i projekcji w embrionalnym brzusznej części śródmózwia. Stwierdziliśmy, że w protokole istnieje szereg krytycznych etapów, na które należy zwrócić szczególną uwagę, aby uzyskać skrawki umożliwiające prawidłowy rozwój neuronów dopaminergicznych brzusznej części śródmózwia. Najbardziej krytycznym etapem jest preparatyka mózgu embrionalnego...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Tabela specyficznych odczynników i sprzętu
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429
Glukoza 30%	Sigma-Aldrich	G7528-250
Surowica konia	Invitrogen	26050-088
DMEM (4,5g/L Glc., z L-Gln, Na Pyr, NaHCO3)	Sigma-Aldrich	D6429-500
Penicylina/Streptomycyna 100x	Sigma-Aldrich	P4333-20
Kwas L-askorbinowy	Sigma-Aldrich	A4403	przygotować roztwór stokowy 200mM i przechowywać w -20°C
Agaroza LMP UltraPure	Invitrogen	15517-022
Wkładniki Millicel	EMD Millipore	PICMORG50
μ-szalka 35 mm, niska	Ibidi	80136
Wibratom	Microm International	HM 650V
Żyletka	Plano GmbH	121-6
Klej Histoacryl	BRAU9381104	Braun Aesculap
Łyżka perforowana o średnicy 15 mm	Fine Science Tools	10370 -18
Pinceta 5 Dumoxel	Fine Science Tools	11252 - 30
Przeciwciała użyte do immunobarwień:
Królicze anty-tyrozynowa hydroksylaza	EMD Millipore	AB152	Rozcieńczenie 1:500
Mysie anty-tyrozynowa hydroksylaza	EMD Millipore	MAB318	Rozcieńczenie 1:500
Mysie anty-BrdU	BD Biosciences	555627	Rozcieńczenie 1:200
Królicze anty-rozszczepiona kaspaza 3	Cell Signaling Technology	9661	Rozcieńczenie 1:200
Osiołkowe anty-królicze IgG-Alexa 488	Invitrogen	A21206	Rozcieńczenie 1:500
Osiołkowe anty-mysie IgG-Cy3	Jackson ImmunoResearch	715-165-150	Rozcieńczenie 1:200