Wizualizacja struktur kutykularnych Caenorhabditis elegans za pomocą lipofilowego barwnika witalnego DiI

Summary

Prezentujemy metodę wizualizacji naskórka u żywych C. elegans za pomocą czerwonego fluorescencyjnego barwnika lipofilowego DiI (nadchloran 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetrametyloindokarbocyjaniny), który jest powszechnie stosowany u C. elegans do wizualizacji neuronów narażonych na działanie środowiska. Dzięki temu zoptymalizowanemu protokołowi alae i pierścieniowe struktury kutykularne są barwione za pomocą DiI i obserwowane za pomocą mikroskopii złożonej.

Abstract

Naskórek C. elegans to wysoce odporna struktura, która otacza zewnętrzną część zwierzęcia^1-4. Naskórek nie tylko chroni zwierzę przed środowiskiem, ale także decyduje o kształcie ciała i odgrywa rolę w ruchliwości^4-6. Naskórek składa się z kilku warstw wydzielanych przez komórki naskórka, w tym najbardziej zewnętrznej warstwy^{lipidowej 7}.

Obwodowe grzbiety w naskórku zwane pierścieniami wzorują się na długości zwierzęcia i są obecne na wszystkich etapach rozwoju⁸. Alae to podłużne grzbiety, które są obecne na określonych etapach rozwoju, w tym L1, dauer i dorosłe^2,9. Mutacje w genach, które wpływają na organizację kolagenu kutykularnego, mogą zmieniać strukturę kutykularną i morfologię ciała zwierzęcia^5,6,10,11. Podczas gdy obrazowanie kutykularne przy użyciu mikroskopii złożonej z optyką DIC jest możliwe, obecne metody, które uwydatniają struktury kutykularne, obejmują fluorescencyjną ekspresję transgenu¹², barwienie przeciwciał¹³ i mikroskopię elektronową¹. Znakowana aglutynina z kiełków pszenicy (WGA) była również używana do wizualizacji glikoprotein kutykularnych, ale jest ograniczona w rozpoznawaniu drobniejszych struktur kutykularnych¹⁴. Zaobserwowano barwienie powierzchni kutykularnej za pomocą barwnika fluorescencyjnego, ale nigdy nie scharakteryzowano go szczegółowo¹⁵. Przedstawiamy metodę wizualizacji naskórka u żywych C. elegans przy użyciu czerwonego fluorescencyjnego barwnika lipofilowego DiI (nadchloran 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetrametyloindokarbocyjaniny), który jest powszechnie stosowany u C. elegans do wizualizacji neuronów narażonych na działanie środowiska. Ten zoptymalizowany protokół barwienia DiI jest prostą, solidną metodą fluorescencyjnej wizualizacji pierścieni, alae, sromu, męskiego ogona i kolca ogona hermafrodyty w wysokiej rozdzielczości u C. elegans.

Protocol

1. Przygotowanie bejcy DiI

1. Przygotować roztwór podstawowy 20 mg/ml DiI (Biotium, Inc., Hayward, CA) w DMF. DiI jest wrażliwy na światło, więc chroń DiI przed światłem, zawijając w folię.
2. Stwórz robocze rozcieńczenie DiI, dodając 0,6 μl DiI do 399,4 μl M9 dla każdej populacji. Powinno to dać końcowe rozcieńczenie robocze 30 μg/ml DiI w M9. Można to przeskalować w górę w celu jednoczesnego barwienia wielu populacji. Osłoń DiI przed światłem, owijając rurkę (rurki) folią.

2. Przygotowanie nicieni

1. Użyć płytki o średnicy 60 mm zawierającej populację nieskażonych nicieni. Umyć zwierzęta z płytki roztworem ....

Discussion

Przedstawiona tu metoda barwienia DiI pozwala na stosunkowo szybki i wygodny sposób uwidocznienia naskórka u C. elegans. Zmieniając przeznaczenie i optymalizując metodę powszechnie stosowaną do obrazowania neuronów czuciowych narażonych na działanie środowiska^15,17, DiI można wykorzystać do fluorescencyjnego barwienia zarówno struktur alae, jak i pierścieniowych (ryc. 1 i 2), a także sromu, męskiego ogona i kolca ogona hermafrodyty (ryc. 3). Odkryliśmy, że roztwór inkubacyjny i czas inkubacji wpływają.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DiI (nadchloran 1,1'-dioktadecylo-3,3,3',3'-tetrametyloindokarbocyjaniny)	Biotium, Inc.	60010	Rozcieńczenie zapasów: 20 mg / ml w DMF rozcieńczenie robocze: 30 mg / ml
DMF (dimetyloformamid)	Sigma-Aldrich	D4551
Triton X-100 (oktylofenoksyetoksyetanol)	VWR international	EM-9410
M9 (22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 86mM NaCl, 1mM MgSO4)
NGM (pożywka wzrostu nicieni)	IPM Scientific, Inc.	11006-501	Może być przygotowany zgodnie z protokołem agarowym NGM18
Agar-agar	EMD Millipore	1.01614	4% w wodzie
Lewamizol (chlorowodorek lewamizolu)	Sigma-Aldrich	31742	100 μ M - 1 mM lewamizol w zależności od wymagań
Szkiełka mikroskopowe	VWR international	16005-106
Okulary nakrywkowe do mikroskopu	VWR international	16004-302
Zakres złożony	Carl Zeiss, Inc.	A1m	Użyj celów, aby dopasować je do potrzeb eksperymentu
TRITC lub innego kompatybilnego filtra	Chroma Technology Corp.	49005	ET - Zestaw filtrów napylanych DSRed (TRITC/Cy3)