Przedstawiamy metodę wizualizacji kutykuli u żywych C. elegans z wykorzystaniem czerwonego fluorescencyjnego barwnika lipofilowego DiI (perchloran 1,1'-dioctadecylo-3,3,3',3'-tetrametyloindokarbocyjaniny), który jest powszechnie stosowany u C. elegans do wizualizacji neuronów eksponowanych na działanie czynników zewnętrznych. Dzięki temu zoptymalizowanemu protokołowi alae oraz pierścieniowe struktury kutykularne zostają zabarwione przez DiI i poddane obserwacji przy użyciu mikroskopu złożonego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wizualizacja struktur kutykularnych Caenorhabditis elegans z użyciem lipofilowego barwnika witalnego DiI
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Kutikula C. elegans jest wysoce odporną strukturą otaczającą zewnętrzną część organizmu1-4. Kutikula nie tylko chroni zwierzę przed wpływem środowiska, ale także determinuje kształt ciała i odgrywa rolę w motyliczności4-6. Kutikula składa się z kilku warstw wydzielanych przez komórki epidermy, w tym z zewnętrznej warstwy lipidowej7.
Obwodowe fałdy w kutykuli, nazywane pierścieniami (annuli), tworzą wzór wzdłuż ciała zwierzęcia i są obecne na wszystkich etapach rozwoju8. Alae to fałdy podłużne, które występują w określonych fazach rozwoju, w tym w stadium L1, dauer oraz w stadium dorosłym2,9. Mutacje w genach wpływających na organizację kolagenu kutykularnego mogą zmieniać strukturę kutykuli oraz morfologię ciała zwierzęcia5,6,10,11. Chociaż obrazowanie kutykuli przy użyciu mikroskopii złożonej z optyką DIC jest możliwe, obecne metody uwydatniające struktury kutykularne obejmują ekspresję fluorescencyjnych transgenów12, barwienie przeciwciałami13 oraz mikroskopię elektronową1. Do wizualizacji glikoprotein kutykularnych stosowano również znakowaną aglutyninę z zarodków pszenicy (WGA), jednak ma ona ograniczone możliwości w rozdzielaniu drobniejszych struktur kutykularnych14. Obserwowano barwienie powierzchni kutykuli przy użyciu barwników fluorescencyjnych, lecz nigdy nie zostało ono szczegółowo scharakteryzowane15. Przedstawiamy metodę wizualizacji kutykuli u żywych C. elegans przy użyciu czerwonego fluorescencyjnego lipofilnego barwnika DiI (perchloran 1,1'-dioctadecylo-3,3,3',3'-tetrametyloindokarbocyjaniny), który jest powszechnie stosowany u C. elegans do wizualizacji neuronów eksponowanych na środowisko. Ten zoptymalizowany protokół barwienia DiI jest prostą i niezawodną metodą wysokorozdzielczej fluorescencyjnej wizualizacji pierścieni, alae, wulwy, ogona samca oraz kolca ogona hermafrodyty u C. elegans.
Protokół
1. Przygotowanie barwnika DiI
- Przygotować roztwór zapasowy DiI (Biotium, Inc., Hayward, CA) o stężeniu 20 mg/mL w DMF. DiI jest światłoczuły, dlatego należy chronić go przed światłem, owijając naczynie folią aluminiową.
- Przygotować roztwór roboczy DiI, dodając 0,6 μL roztworu zapasowego DiI do 399,4 μL M9 dla każdej populacji. Powinno to zapewnić końcowe stężenie robocze 30 μg/mL DiI w M9. Procedurę tę można przeskalować w celu jednoczesnego barwienia wielu populacji. Należy chronić DiI przed światłem, owijając probówkę lub probówki folią aluminiową.
2. Przygotowanie nicieni
- Należy użyć szalki 60 mm ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiona tutaj metoda barwienia DiI umożliwia stosunkowo szybką i wygodną wizualizację kutykuli u C. elegans. Dzięki adaptacji i optymalizacji metody powszechnie stosowanej do obrazowania sensorycznych neuronów eksponowanych na środowisko zewnętrzne15,17, DiI może być wykorzystywane do fluorescencyjnego barwienia zarówno skrzydełek (alae), jak i struktur pierścieniowatych (ryciny 1 i 2), a także sromsika, ogona samca oraz kolca ogonowego hermafrodyty (rycina 3). Stwierdziliśmy, że skład roztworu .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie mamy nic do ujawnienia.
Podziękowania
Pragniemy podziękować S. Taneja-Bageshwar, K. Beifuss, S. Kedroske oraz H-C. Hsiao za pomocne dyskusje. Praca ta została sfinansowana z funduszy startowych Departamentu Medycyny Molekularnej i Komórkowej TAMHSC. Mikroskop konfokalny typu compound scope oraz tarcza wirująca zostały zakupione ze środków udostępnionych przez departament oraz Biuro Dziekana TAMHSC. Niektóre szczepy zostały dostarczone przez Caenorhabditis Genetics Center, które jest finansowane przez National Center for Research Resources. Szczep pRF4 (rol-6(su1006)) był darem od A. Fire.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| DiI (1,1’-dioctadecylo-3,3,3’,3’-tetrametylindokarbocyjaninę nadchlorczanową) | Biotium, Inc. | 60010 | Rozcieńczenie roztworu zapasowego: 20 mg/mL w DMF rozcieńczenie robocze: 30 mg/mL |
| DMF (Dimetyloformamid) | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| Triton X-100 (Oktylofenoksy-polyetoksyetanol) | VWR international | EM-9410 | |
| M9 (22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 86mM NaCl, 1mM MgSO4) | |||
| NGM (Pożywka do wzrostu nicieni) | IPM Scientific, Inc. | 11006-501 | Można przygotować zgodnie z protokołem agaru NGM18 |
| Agar-agar | EMD Millipore | 1.01614 | 4% w wodzie |
| Lewamizol (Wodorochlorek lewamizolu) | Sigma-Aldrich | 31742 | 100 μM - 1 mM lewamizolu, zależnie od potrzeb |
| Przedmiotowe szkiełka mikroskopowe | VWR international | 16005-106 | |
| Osłonki do szkiełek mikroskopowych | VWR international | 16004-302 | |
| Mikroskop złożony | Carl Zeiss, Inc. | A1m | Stosować obiektywy dostosowane do potrzeb eksperymentu |
| Filtr TRITC lub inny kompatybilny filtr | Chroma Technology Corp. | 49005 | Zestaw filtrów napylanych ET - DSRed (TRITC/Cy3) |
Bibliografia
- Cox, G. N., Kusch, M., Edgar, R. S. Cuticle of Caenorhabditis elegans: its isolation and partial characterization. The Journal of Cell Biology. 90, 7-17 (1981).
- Cox, G. N., Staprans, S., Edgar, R. S.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
