Przedstawiamy metodę wizualizacji kutykuli u żywych C. elegans z wykorzystaniem czerwonego fluorescencyjnego barwnika lipofilowego DiI (perchloran 1,1'-dioctadecylo-3,3,3',3'-tetrametyloindokarbocyjaniny), który jest powszechnie stosowany u C. elegans do wizualizacji neuronów eksponowanych na działanie czynników zewnętrznych. Dzięki temu zoptymalizowanemu protokołowi alae oraz pierścieniowe struktury kutykularne zostają zabarwione przez DiI i poddane obserwacji przy użyciu mikroskopu złożonego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wizualizacja struktur kutykularnych Caenorhabditis elegans z użyciem lipofilowego barwnika witalnego DiI
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Kutikula C. elegans jest wysoce odporną strukturą otaczającą zewnętrzną część organizmu1-4. Kutikula nie tylko chroni zwierzę przed wpływem środowiska, ale także determinuje kształt ciała i odgrywa rolę w motyliczności4-6. Kutikula składa się z kilku warstw wydzielanych przez komórki epidermy, w tym z zewnętrznej warstwy lipidowej7.
Obwodowe fałdy w kutykuli, nazywane pierścieniami (annuli), tworzą wzór wzdłuż ciała zwierzęcia i są obecne na wszystkich etapach rozwoju8. Alae to fałdy podłużne, które występują w określonych fazach rozwoju, w tym w stadium L1, dauer oraz w stadium dorosłym2,9. Mutacje w genach wpływających na organizację kolagenu kutykularnego mogą zmieniać strukturę kutykuli oraz morfologię ciała zwierzęcia5,6,10,11. Chociaż obrazowanie kutykuli przy użyciu mikroskopii złożonej z optyką DIC jest możliwe, obecne metody uwydatniające struktury kutykularne obejmują ekspresję fluorescencyjnych transgenów12, barwienie przeciwciałami13 oraz mikroskopię elektronową1. Do wizualizacji glikoprotein kutykularnych stosowano również znakowaną aglutyninę z zarodków pszenicy (WGA), jednak ma ona ograniczone możliwości w rozdzielaniu drobniejszych struktur kutykularnych14. Obserwowano barwienie powierzchni kutykuli przy użyciu barwników fluorescencyjnych, lecz nigdy nie zostało ono szczegółowo scharakteryzowane15. Przedstawiamy metodę wizualizacji kutykuli u żywych C. elegans przy użyciu czerwonego fluorescencyjnego lipofilnego barwnika DiI (perchloran 1,1'-dioctadecylo-3,3,3',3'-tetrametyloindokarbocyjaniny), który jest powszechnie stosowany u C. elegans do wizualizacji neuronów eksponowanych na środowisko. Ten zoptymalizowany protokół barwienia DiI jest prostą i niezawodną metodą wysokorozdzielczej fluorescencyjnej wizualizacji pierścieni, alae, wulwy, ogona samca oraz kolca ogona hermafrodyty u C. elegans.
Protokół
1. Przygotowanie barwnika DiI
- Przygotować roztwór zapasowy DiI (Biotium, Inc., Hayward, CA) o stężeniu 20 mg/mL w DMF. DiI jest światłoczuły, dlatego należy chronić go przed światłem, owijając naczynie folią aluminiową.
- Przygotować roztwór roboczy DiI, dodając 0,6 μL roztworu zapasowego DiI do 399,4 μL M9 dla każdej populacji. Powinno to zapewnić końcowe stężenie robocze 30 μg/mL DiI w M9. Procedurę tę można przeskalować w celu jednoczesnego barwienia wielu populacji. Należy chronić DiI przed światłem, owijając probówkę lub probówki folią aluminiową.
2. Przygotowanie nicieni
- Należy użyć szalki 60 mm zawierającej populację niekontaminowanych nicieni. Zwierzęta z szalki należy wypłukać roztworem 0,5% Triton X-100 w buforze M9, delikatnie mieszając płyn ruchem okrężnym po powierzchni szalki, aby odczepić wszystkie larwy i osobniki dorosłe. Wypłuczyny należy przenieść do sterylnej probówki 1,5 mL.
- Zwierzęta należy natychmiast odwirować przy 2000 rpm przez 30 sec. Należy usunąć i odrzucić jak największą ilość supernatantu, uważając, aby nie zaburzyć osadu zwierząt na dnie probówki.
- Aby zmniejszyć ilość pozostałego Triton X-100, należy wypłukać zwierzęta buforem M9, odwirować i usunąć supernatant. Krok ten należy powtórzyć raz.
- Do probówki należy dodać 400 μL roboczego roztworu DiI w buforze M9 i krótko wymieszać na wirówce vortex, aby resuspenderć zwierzęta w roztworze.
- Probówkę należy inkubować w temperaturze 20°C, potrząsając poziomo przez 3 godziny przy 350 rpm w warunkach ochrony przed światłem. W razie potrzeby zwierzęta można inkubować do 16 godzin w celu barwienia.
- Aby zmniejszyć ilość niezwiązanego barwnika, należy odwirować zwierzęta przy 2000 rpm przez 20 sec. Należy usunąć i odrzucić jak największą ilość supernatantu, nie zaburzając osadu zwierząt.
- Zwierzęta należy resuspenderć w 400 μL buforu M9 i wylać płyn na wolną od bakterii część szalki z agarem NGM zaszczepionej E. coli OP50. Należy pozwolić zwierzętom na regenerację przez co najmniej 30 minut. W czasie regeneracji zwierzęta powinny oddalić się od płynu barwiącego DiI i przejść na pożywkę. Krok ten redukuje fluorescencję tła pochodzącą od wolnego DiI.
3. Montowanie i obserwacja preparatów
- Rozpuścić 4% agar w wodzie, używając autoklawu lub kuchenki mikrofalowej.
- Przygotować wielorazowe dystanse, które zapewnią jednorodną grubość podkładki agarowej, nakładając dwie warstwy taśmy laboratoryjnej na szkiełko przedmiotowe. Przygotować łącznie dwa takie szkiełka z dystansami.
- Umieścić czyste szkiełko przedmiotowe pomiędzy dwoma szkiełkami z dystansami. Nanieść pipetą około 150 μL (cztery krople) roztopionego 4% agaru na środek czystego szkiełka. Szybko przykryć roztopiony agar dodatkowym szkiełkiem, aby utworzyć podkładkę agarową. Ostrożnie zdjąć szkiełko przykrywowe, dbając o to, by podkładka pozostała wycentrowana na górnej powierzchni szkiełka montażowego.
- Nanieść pipetą około 5 μL środka znieczulającego dla nicieni (na przykład lewamisol w stężeniu 100 μM – 1 mM) na podkładkę.
- Umieścić 8 – 12 zwierząt w środku znieczulającym i przykryć szkiełkiem cover slip.
- Obserwować zwierzęta przy użyciu mikroskopu złożonego lub konfokalnego wyposażonego w obiektyw o powiększeniu co najmniej 40x oraz filtr DSRed/TRITC (lub inny kompatybilny). Maksimum wzbudzenia fluorescencji DiI wynosi 549 nm, a maksimum emisji dla związanego barwnika wynosi 565 nm (Biotium, Inc., Hayward, CA).
4. Reprezentatywne wyniki
DiI barwi kutykulę dzikich oraz zmutowanych C. elegans. Powierzchnia kutykuli zawiera pierścienie oddzielone bruzdami obwodowymi, a w niektórych stadiach grzbietami podłużnymi zwanymi alae. Każde stadium rozwojowe posiada struktury kutykularne o odmiennym składzie2. Grbiety lub bruzdy zarówno alae, jak i pierścieni barwią się fluorescencyjnie, w zależności od składu powierzchni, przez wszystkie stadia larwalne i dorosłe i pozostają widoczne do jednego dnia po regeneracji przy użyciu tej metody. Czasami obserwuje się fluorescencyjne plamki w tle (Rycina 2F, G), lecz nie dzieje się to rutynowo (Rycina 1, Rycina 2A-E, H, I). Wszystkie obrazy zostały wykonane za pomocą konfokalnego mikroskopu z dyskiem obrotowym lub, gdzie zaznaczono, szerokopolowego (wf) mikroskopu złożonego.
Rycina 1. DiI barwi kutykulę oraz neurony eksponowane na środowisko. Zwierzę w stadium L2. Powiększenie 630x. Części obrazu mozaikowego zostały zarejestrowane przy użyciu oprogramowania iVision-Mac (BioVision Technologies, Exton, PA). Obrazy połączono w programie Adobe Photoshop CS3 (Adobe Systems, Inc., San Jose, CA). Pasek skali = 10 μm. DiI barwi również fluorescencyjnie neurony sensoryczne amfid i fazmid odpowiednio w głowie i ogonie (strzałki zaznaczają niektóre z nich).
Rycina 2. DiI fluorescencyjnie barwi kutykulę C. elegans na wszystkich etapach rozwoju pozazarodkowego. Powiększenie 630x. Pasek skali = 10 μm. Barwienie zwierząt typu dzikiego w stadiach A) L1; B) L2; C) dauer; D) L3; E) L4; oraz F) dorosłych. Alae oraz grzebienie pierścieniowate są zabarwione fluorescencyjnie u zwierząt w stadium L1 i dauer (A, C). DiI barwi grzebienie pierścieniowate u zwierząt w stadium L2 (B). Rowki pierścieniowate są zabarwione u zwierząt w stadiach L3 i L4 (D, E). Rowki alae i pierścieni są zabarwione u zwierząt dorosłych (F-H). Alae składają się z dwóch, pięciu lub trzech grzebieni (odpowiednio u zwierząt w stadium L1, dauer lub dorosłych), które biegną wzdłuż ciała zwierzęcia (strzałki)16. Pierścienie tworzą obwodowe grzebienie wokół zwierzęcia (groty strzałek, F i J). Kutykula dorosłych zwierząt mutantów wykazuje umiarkowane defekty organizacji kutykularnej (G-H). G) Grzebienie alae są nieciągłe (wf). H) Nadliczbowe grzebienie alae są zrośnięte i rozgałęzione lub dwudzielne (wf). Mutanty genów kolagenu wykazują defekty organizacji alae i pierścieni (I-J). I) U zwierząt transgenicznych nadekspresujących pRF4 (rol-6(su1006)) grzebienie alae przebiegają pod kątem do długości ciała zwierzęcia. J) Pierścienie u zwierząt transgenicznych nadekspresujących pRF4 (rol-6(su1006)) wykazują nieregularny wzór.
Rycina 3. Zewnętrzne struktury morfologiczne wybarwione barwnikiem DiI. Powiększenie 630x. Paski skali = 10 μm. DiI uwidacznia również inne cechy zewnętrzne, w tym A) srom vulva dorosłego hermafrodyty, B) promienie i wachlarz ogona dorosłego samca oraz C) kolec ogona hermafrodyty (rozwidlony w tym tle mutacyjnym).
Rycina 4. Kutykula barwi się DiI dłużej niż neurony eksponowane na środowisko zewnętrzne. Powiększenie 630x. Pasek skali = 10 μm. Po dwóch godzinach barwienia neurony sensoryczne amfidu (nie pokazano) i fazmidu (strzałki) są odpowiednio zabarwione. W przeciwieństwie do nich, kutykula młodszych osobników jest zabarwiona tylko częściowo, w formie plam (grot strzałki).
| Płukanie | Roztwór barwiący (+ DiI) | Czas inkubacji | Kutikula zabarwiona |
| M9 + 0.5% Triton X-100 | M9 + 0.5% Triton X-100 | 2 hrs | nie |
| M9 + 0.5% Triton X-100 | M9 + 0.5% Triton X-100 | 3 hrs | nie |
| M9 + 0.5% Triton X-100 | M9 | 2 hrs | częściowo |
| M9 + 0.5% Triton X-100 | M9 | 3 hrs | tak |
| M9 + 0.5% Triton X-100 | H20 | 2 hrs | częściowo |
| M9 + 0.5% Triton X-100 | H20 | 3 hrs | tak |
Tabela 1. Barwienie kutykuli w różnych warunkach. Przetestowano różne roztwory i czasy inkubacji w celu optymalizacji barwienia kutykuli u zwierząt. H20, sterylna woda destylowana. Barwienie częściowe oznacza niejednorodne barwienie kutykuli larwalnej (Rycina 4), podczas gdy kutykula osobników dorosłych barwi się konsekwentnie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiona tutaj metoda barwienia DiI umożliwia stosunkowo szybką i wygodną wizualizację kutykuli u C. elegans. Dzięki adaptacji i optymalizacji metody powszechnie stosowanej do obrazowania sensorycznych neuronów eksponowanych na środowisko zewnętrzne15,17, DiI może być wykorzystywane do fluorescencyjnego barwienia zarówno skrzydełek (alae), jak i struktur pierścieniowatych (ryciny 1 i 2), a także sromsika, ogona samca oraz kolca ogonowego hermafrodyty (rycina 3). Stwierdziliśmy, że skład roztworu ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie mamy nic do ujawnienia.
Podziękowania
Pragniemy podziękować S. Taneja-Bageshwar, K. Beifuss, S. Kedroske oraz H-C. Hsiao za pomocne dyskusje. Praca ta została sfinansowana z funduszy startowych Departamentu Medycyny Molekularnej i Komórkowej TAMHSC. Mikroskop konfokalny typu compound scope oraz tarcza wirująca zostały zakupione ze środków udostępnionych przez departament oraz Biuro Dziekana TAMHSC. Niektóre szczepy zostały dostarczone przez Caenorhabditis Genetics Center, które jest finansowane przez National Center for Research Resources. Szczep pRF4 (rol-6(su1006)) był darem od A. Fire.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| DiI (1,1’-dioctadecylo-3,3,3’,3’-tetrametylindokarbocyjaninę nadchlorczanową) | Biotium, Inc. | 60010 | Rozcieńczenie roztworu zapasowego: 20 mg/mL w DMF rozcieńczenie robocze: 30 mg/mL |
| DMF (Dimetyloformamid) | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| Triton X-100 (Oktylofenoksy-polyetoksyetanol) | VWR international | EM-9410 | |
| M9 (22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 86mM NaCl, 1mM MgSO4) | |||
| NGM (Pożywka do wzrostu nicieni) | IPM Scientific, Inc. | 11006-501 | Można przygotować zgodnie z protokołem agaru NGM18 |
| Agar-agar | EMD Millipore | 1.01614 | 4% w wodzie |
| Lewamizol (Wodorochlorek lewamizolu) | Sigma-Aldrich | 31742 | 100 μM - 1 mM lewamizolu, zależnie od potrzeb |
| Przedmiotowe szkiełka mikroskopowe | VWR international | 16005-106 | |
| Osłonki do szkiełek mikroskopowych | VWR international | 16004-302 | |
| Mikroskop złożony | Carl Zeiss, Inc. | A1m | Stosować obiektywy dostosowane do potrzeb eksperymentu |
| Filtr TRITC lub inny kompatybilny filtr | Chroma Technology Corp. | 49005 | Zestaw filtrów napylanych ET - DSRed (TRITC/Cy3) |
Bibliografia
- Cox, G. N., Kusch, M., Edgar, R. S. Cuticle of Caenorhabditis elegans: its isolation and partial characterization. The Journal of Cell Biology. 90, 7-17 (1981).
- Cox, G. N., Staprans, S., Edgar, R. S. The cuticle of Caenorhabditis elegans. II. Stage-specific changes in ultrastructure and protein composition during postembryonic development. Dev. Biol. 86, 456-470 (1981).
- Hall, D., Altun, Z. C. elegans Atlas. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
- Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. The C. elegans Research Community. , WormBook. (2007).
- Kramer, J. M., Johnson, J. J., Edgar, R. S., Basch, C., Roberts, S. The sqt-1 gene of C. elegans encodes a collagen critical for organismal morphogenesis. Cell. 55, 555-565 (1988).
- Mende, N. von, Bird, D. M., Albert, P. S., Riddle, D. L. dpy-13: a nematode collagen gene that affects body shape. Cell. 55, 567-576 (1988).
- Blaxter, M. L. Cuticle surface proteins of wild type and mutant Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 268, 6600-6609 (1993).
- Costa, M., Draper, B. W., Priess, J. R. The role of actin filaments in patterning the Caenorhabditis elegans cuticle. Dev. Biol. 184, 373-384 (1997).
- Sapio, M. R., Hilliard, M. A., Cermola, M., Favre, R., Bazzicalupo, P. The Zona Pellucida domain containing proteins, CUT-1, CUT-3 and CUT-5, play essential roles in the development of the larval alae in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol.. 282, 231-245 (2005).
- Johnstone, I. L. Cuticle collagen genes. Expression in Caenorhabditis elegans. Trends Genet. 16, 21-27 (2000).
- Kramer, J. M., French, R. P., Park, E. C., Johnson, J. J. The Caenorhabditis elegans rol-6 gene, which interacts with the sqt-1 collagen gene to determine organismal morphology, encodes a collagen. Mol. Cell Biol. 10, 2081-2089 (1990).
- Thein, M. C. Caenorhabditis elegans exoskeleton collagen COL-19: an adult-specific marker for collagen modification and assembly, and the analysis of organismal morphology. Dev. Dyn. 226, 523-539 (2003).
- McMahon, L., Muriel, J. M., Roberts, B., Quinn, M., Johnstone, I. L. Two sets of interacting collagens form functionally distinct substructures within a Caenorhabditis elegans extracellular matrix. Molecular Biology of the Cell. 14, 1366-1378 (2003).
- Link, C. D., Ehrenfels, C. W., Wood, W. B. Mutant expression of male copulatory bursa surface markers in Caenorhabditis elegans. Development. 103, 485-495 (1988).
- Tong, Y. G., Burglin, T. R. Conditions for dye-filling of sensory neurons in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. Methods. 188, 58-61 (2010).
- Singh, R. N., Sulston, J. E. Some observations on moulting in Caenorhabditis elegans. Nematologica. 24, 63-71 (1978).
- Collet, J., Spike, C. A., Lundquist, E. A., Shaw, J. E., Herman, R. K. Analysis of osm-6, a gene that affects sensory cilium structure and sensory neuron function in Caenorhabditis elegans. Genetics. 148, 187-200 (1998).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
