Śledzenie losów komórek E. coli po infekcji fagiem lambda

Podsumowanie

Niniejszy artykuł opisuje procedurę przygotowania znakowanej fluorescencyjnie wersji bakteriofaga lambda, zakażania bakterii E. coli, obserwowania efektów zakażenia pod mikroskopem oraz analizy wyników infekcji.

Streszczenie

System składający się z bakteriofaga (faga) lambda oraz bakterii E. coli od dawna służy jako paradygmat określania losów komórki^1,2. Po jednoczesnym zainfekowaniu komórki przez liczbę fagów wybierana jest jedna z dwóch ścieżek: lityczna (wirulentna) lub lizogenna (utajona)^3,4. Niedawno opracowaliśmy metodę fluorescencyjnego znakowania pojedynczych fagów, co pozwoliło nam badać decyzję podejmowaną po infekcji w czasie rzeczywistym pod mikroskopem, na poziomie pojedynczych fagów i komórek⁵. W niniejszej pracy opisujemy pełną procedurę przeprowadzania eksperymentów z infekcją przedstawionych w naszej wcześniejszej pracy⁵. Obejmuje ona tworzenie fluorescencyjnych fagów, infekcję komórek, obrazowanie pod mikroskopem oraz analizę danych. Fluorescencyjny fag jest „hybrydą”, koekspresującą wersje białka kapsydu gpD typu dzikiego oraz fuzji z YFP. W pierwszej kolejności uzyskuje się surowy lizat fagowy poprzez indukcję lizogenu faga gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein), zawierającego plazmid ekspresujący gpD typu dzikiego. Następnie przeprowadza się szereg etapów oczyszczania, a po nich znakowanie DAPI i obrazowanie pod mikroskopem. Jest to wykonywane w celu zweryfikowania jednorodności, wydajności pakowania DNA, sygnału fluorescencji oraz stabilności strukturalnej zapasu fagów. Wstępna adsorpcja fagów do bakterii odbywa się w lodzie, a następnie następuje krótka inkubacja w 35°C w celu zainicjowania wstrzyknięcia wirusowego DNA⁶. Mieszaninę fagów i bakterii przenosi się następnie na powierzchnię cienkiej płytki z agarem odżywczym, przykrywa szkiełkiem podstawowym i obrazuje pod mikroskopem epifluorescencyjnym. Proces po infekcji jest śledzony przez 4 hr w odstępach 10 min. Śledzonych jest wiele pozycji sceny, tak aby w jednym eksperymencie można było prześledzić infekcje ok. 100 komórek. W każdej pozycji i punkcie czasowym obrazy są pozyskiwane w kanale kontrastowym oraz czerwonym i zielonym kanale fluorescencyjnym. Obraz kontrastowy jest wykorzystywany później do automatycznego rozpoznawania komórek, natomiast kanały fluorescencyjne służą do charakterystyki wyniku infekcji: produkcji nowych fluorescencyjnych fagów (zielony) z następującą po tym lizą komórki lub ekspresji czynników lizogennych (czerwony) z następującym po tym wznowieniem wzrostu i podziału komórki. Pozyskane filmy time-lapse są przetwarzane przy użyciu kombinacji metod manualnych i automatycznych. Analiza danych prowadzi do identyfikacji parametrów infekcji dla każdego zdarzenia infekcyjnego (np. liczby i pozycji infekujących fagów) oraz wyniku infekcji (liza/lizogenia). W razie potrzeby można wyekstrahować dodatkowe parametry.

Protokół

1. Przygotowanie surowego lizatu fagowego (Rycina 1)

1. W kolbie o pojemności 50 ml zaszczep świeżą kolonię szczepu LE392(λ_LZ1)[pPLate*D] (szczegóły w Tabeli 1) do 6 ml pożywki LB⁷ uzupełnionej o 10 μg/ml kanamycyny i 100 μg/ml ampicyliny. Inkubować przez noc w temperaturze 30°C przy łagodnym wytrząsaniu (180 rpm).
2. Rozcieńczyć kulturę w stosunku 1:100 w pożywce LBM (LB uzupełniona o 10 mM MgSO₄) i hodować w 30°C przy łagodnym wytrząsaniu (180 rpm). Aby zoptymalizować wydajność fagów, należy upewnić się, że objętość kultury nie przekracza jednej dziesiątej pojemności kolby. Zazwyczaj przygotowujemy dwie kolby o pojemności 2 litrów lub 2,5 litra, dodając 2,5 ml kultury nocnej do 250 ml pożywki LBM w każdej kolbie.
3. Gdy gęstość komórek osiągnie OD₆₀₀ ≈ 0,6 (~ 2,5 - 3 h), indukować lizogen, przenosząc kulturę do wytrząsarki z kąpielą wodną w temperaturze 42°C na 18 min przy łagodnym wytrząsaniu (180 rpm), a następnie inkubować w 37°C przy łagodnym wytrząsaniu (180 rpm), aż do zauważenia lizy (kultura staje się klarowna, w ciągu ~ 60 - 90 min).
4. Dodać 2% chloroformu do kultury, wymieszać ręcznie poprzez wstrząsanie, a następnie inkubować przez 15 min w temperaturze pokojowej. Uwaga: Podczas pracy z chloroformem należy używać rękawicz i unikać wdychania jego oparów.
5. Przenieść kulturę do dwóch butelek wirówek o pojemności 250 ml i odwirować w rotorze Sorvall GSA przy 10 000 rpm przez 15 min w 4°C. Zebrać supernatant zawierający cząstki fagowe, a osad z zanieczyszczeń odrzucić. Przeprowadzić drugie wirowanie, aby upewnić się, że usunięto wszystkie widoczne zanieczyszczenia.
6. Zastosować standardowy protokół miareczkowania fagów⁸, aby zmierzyć stężenie fagów. Miano fagów powinno wynosić ~ 5-10 x 10⁹ pfu/ml. Jako szczep wskaźnikowy należy użyć szczepu z supF, takiego jak LE392, ze względu na mutację Sam7 w genotypie faga fluorescencyjnego; należy użyć agaru powierzchniowego oraz szalek z bogatą pożywką NZYM, aby uzyskać większe plamy lizy (Rycina 2).

2. Oczyszczanie fagów (Rysunek 1)

1. Przelej lizat do dużej kolby (np. 2-litrowej), dodaj do lizatu DNazę I oraz RNazę (po 1 μg/ml każdej), aby strawić kwasy nukleinowe uwolnione z lizowanych bakterii, i inkubuj przez 1 hr w temperaturze pokojowej.
2. Dodaj do lizatu NaCl 1M, przelej lizat do butelek wirówek o pojemności 250 ml i inkubuj przez 3 hr na lodzie. Odwiruj lizat w wirówce Sorvall GSA przy 10 000 rpm przez 15 min w temperaturze 4°C. Zbierz nadsącz. Miano faga powinno być zbliżone do miana surowego lizatu, które wynosi ~ 5-10 x 10⁹ pfu/ml. Dodatek NaCl sprzyja dysocjacji cząsteczek faga z resztek bakteryjnych i jest niezbędny do wydajnego wytrącania cząsteczek faga przez PEG⁸.
3. Przelej lizat do dużej kolby, np. 2-litrowej, dodaj do lizatu 10% (w/v) PEG8000, powoli mieszaj lub potrząsaj, aby rozpuścić PEG8000 w temperaturze pokojowej. Przelej lizat do butelek wirówek o pojemności 250 ml, a następnie inkubuj przez noc (~ 16 hr) w temperaturze 4°C. Odwiruj lizat w rotorze Sorvall GSA przy 10 000 rpm przez 15 min w temperaturze 4°C. Usuń nadsącz.
4. Zwilż osad (cząsteczki faga wytrącone przez PEG8000) buforem SM dla faga (4 ml buforu SM na 250 ml początkowego lizatu faga). Inkubuj przy bardzo delikatnym wstrząsaniu lub bez wstrząsania przez 16 hr w temperaturze 4°C.
5. Ostrożnie przelej lizat (bufor SM z cząsteczkami faga) do probówki wirówkowej Eppendorf o pojemności 50 ml, a następnie przemyj pozostały osad 0,5 - 1 ml buforu SM.
6. Dodaj do lizatu równą objętość chloroformu. Delikatnie wymieszaj lizat z chloroformem, odwracając probówkę kilka razy góra-dół. Odwiruj przy 4 000 rpm przez 15 min w temperaturze 4°C w wirówce Eppendorf 5804R lub podobnej wirówce naktowej.
7. Powtórz krok 2.6, aby uzyskać klarowniejszy lizat. Miano faga powinno wynosić ~ 1-2 x 10¹¹ pfu/ml.
8. Przygotuj roztwory SM/CsCl o trzech różnych gęstościach (ρ): 1,3 g/ml, 1,5 g/ml i 1,7 g/ml. Zmierz współczynnik załamania światła (η), aby uzyskać dokładniejszy odczyt gęstości. Przelicznik gęstości⁹ to ρ = 10,8601 η - 13,4974 w temperaturze 25°C. Szczegóły znajdują się w Tabeli 3.
9. Użyj strzykawki z długą igłą, aby nanieść roztwór do 14 ml ultraklarownej probówki do ultrawirówki Beckman 40Ti. Aby uniknąć mieszania i utworzyć lepszy gradient gęstości, należy zastosować warstwowanie roztworów (tj. nakładanie roztworów o rosnącej gęstości jeden na drugi) – ostrożnie nanieś po 2 ml roztworów SM/CsCl w kolejności 1,3 g/ml, 1,5 g/ml i 1,7 g/ml, wprowadzając igłę strzykawki 3 ml do dna probówki.
10. Ostrożnie nanieś 8 ml lizatu faga, nakładając go od góry do 14 ml probówki do ultrawirówki. Przygotuj probówkę równoważącą. Odwiruj w rotorze Beckman SW40Ti przy 24 000 rpm przez 4 hr w temperaturze 4°C.
11. Ostrożnie wyjmij probówkę w ciemni i oświetl ją z góry latarką na tle czarnego ekranu. Prążek faga powinien być wyraźnie widoczny na granicy warstw SM/CsCl 1,3 g/ml i 1,5 g/ml (Rysunek 3A). Przebij bok probówki nieco poniżej prążka igłą o rozmiarze 21,5 G za pomocą strzykawki 3 ml. Ostrożnie zbierz ~ 500 μl zawiesiny faga. Miano faga powinno wynosić ~ 5-10 x 10¹¹ pfu/ml.
12. Przenieś zawiesinę faga do 4 ml ultraklarownej probówki do rotora ultrawirówki Beckman SW60Ti. Wypełnij probówkę roztworem SM/CsCl 1,5 g/ml. Przygotuj probówkę równoważącą. Odwiruj w rotorze Beckman SW60Ti przy 35 000 rpm przez 24 hr w temperaturze 4°C.
13. Powtórz procedurę opisaną w kroku 2.11, aby zebrać faga z widocznego prążka. Prążek powinien być widoczny tak, jak pokazano na Rysunku 3B.
14. Wprowadź zawiesinę faga do kasety z membraną dializacyjną (Tabela 2) i dializuj trzykrotnie przeciwko 1000-krotnej objętości buforu SM w temperaturze 4°C przez 3 hr, 3 hr i przez noc (~ 16 hr). Celem dializy jest usunięcie CsCl obecnego w zawiesinie faga. Końcowe miano faga powinno wynosić ~ 5-10 x 10¹¹ pfu/ml.

3. Przygotowanie jednej płyty żelu agarozowego (Rysunek 4)

1. Oczyścić 6 szkiełek przedmiotowych (75 x 50 mm, grubość 1 mm) za pomocą 70% etanolu.
2. Ułożyć 5 szkiełek i przymocować je taśmą, zgodnie z rysunkiem 4.
3. W małym zlewce przykrytej folią spożywczą zmieszać 0,09 g agarozy z 6 ml pożywki (uzyskując stężenie 1,5% agarozy). Podgrzewać na płycie grzejnej, aż roztwór stanie się klarowny.
4. Wylać roztwór agarozy na przymocowane szkiełka.
5. Położyć na wierzchu ostatnie szkiełko, uważając, aby nie powstały pęcherzyki powietrza. Położyć na górze obciążnik i pozostawić do ostygnięcia na ok. 30 min.
6. Zdjąć 4 boczne szkiełka, a powstały blok wraz z górnym i dolnym szkiełkiem owinąć folią spożywczą. Blok można przechowywać w temperaturze 4°C do 3 dni.

4. Testowanie oczyszczonego zapasu fagów

1. Przygotuj płytkę żelu PBS-agarozowego zgodnie z opisem powyżej (Sekcja 3).
2. Przebarw fagowy preparat oczyszczony barwnikiem DAPI. Wymieszaj 10 μl fagów (~ 1 x 10¹⁰ pfu/ml) z 10 μl roztworu DAPI o stężeniu 10 μg/ml (końcowe stężenie DAPI wyniesie 5 μg/ml) i inkubuj przez 30 min w temperaturze 4°C lub przez 10 min w temperaturze pokojowej.
3. Nanieś 1 μl mieszaniny fagów i DAPI na środek szkiełka podstawowego nr 1 o wymiarach 24 x 50 mm, a następnie przykryj małym fragmentem (~ 10 x 10 mm) wcześniej przygotowanej płytki PBS-agarozowej. Mały fragment płytki agarozowej należy wyciąć żyletką po zdjęciu górnego szkiełka z żelu ułożonego metodą kanapkową. Obrazuj próbkę pod mikroskopem epifluorescencyjnym w kanałach YFP i DAPI. Pojedyncze fagi powinny być widoczne jako fluorescencyjne „punkty” ograniczone dyfrakcyjnie w obu kanałach (Rysunek 5). Użyj tych samych ustawień mikroskopu i kamery, co w kroku 6.2 poniżej.

5. Zakażenie (Rysunek 6)

1. W probówce Falcon 14 ml zaszczep świeżą kolonię LE392[pP_RE-mCherry] (szczegóły w Tabeli 1) do 2 ml pożywki LB uzupełnionej o 100 μg/ml ampicyliny, 10 mM MgSO₄ oraz 0,2% maltozy. Inkubować przez noc w 37°C przy umiarkowanym wytrząsaniu (265 rpm).
2. Rozcieńczyć kulturę 1:1000 w LBMM (LB uzupełnione o 10 mM MgSO₄ i 0,2% maltozy), tj. dodać 5 μl kultury nocnej do 5 ml pożywki LBMM w kolbie 50 ml. Hodować do osiągnięcia OD₆₀₀ ≈ 0,4 w 37°C przy umiarkowanym wytrząsaniu (265 rpm).
3. Użyć pożywki LBM do przygotowania bloku żelu LBM-agarozy zgodnie z opisem w Rozdziale 3 powyżej.
4. Odwirować 1 ml komórek przy 2 000g w mikrocentry fudze stołowej przez 2 min w temperaturze pokojowej. Usunąć nadsadewkę i delikatnie resuspendować komórki w 20 μl lodowatego LBMM, aby uzyskać OD₆₀₀ ≈ 20.
5. Podczas manipulowania oczyszczonym zapasem fagów należy używać szerokiego końcówki do pipety lub odciąć standardową końcówkę, aby poszerzyć jej otwór i uniknąć rozrywania cząsteczek fagów³. Delikatnie wymieszać 20 μl komórek z 20 μl oczyszczonych fagów, aby uzyskać średni stosunek fagów do komórek w zakresie 0,1 - 5. Inkubować na lodzie przez 30 min w celu adsorpcji fagów, a następnie inkubować w kąpieli wodnej w 35°C przez 5 min, aby wywołać wstrzyknięcie DNA faga⁶.
6. Kilka razy pobrać i wypuścić ciecz pipetą, aby rozbić ewentualne agregaty komórkowe. Ponownie należy użyć szerokiej końcówki do pipety, aby uniknąć rozrywania fagów. Rozcieńczyć mieszaninę 1:10 w LBMM, np. 5 μl mieszaniny w 45 μl LBMM.
7. Umieścić fragment bloku LBM-agarozy (~ 10 x 10 mm) na szkiełku nakrywce No.1 22 x 22 mm. Wcześniej przygotowany blok LBM-agarozy powinien pozostawać w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 h przed użyciem, aby zapewnić osiągnięcie przez niego temperatury pokojowej. Nanieść 1 μl mieszaniny fagów/komórek na blok agarowy i odczekać 1 min, aż mieszanina wniknie w blok agarozy. Delikatnie położyć szkiełko nakrywkowe No.1 24 x 50 mm na wierzchu bloku agarowego. Procedura ta ma na celu uniknięcie rozrywania fagów z zainfekowanej komórki (Rycina 6).

6. Śledzenie losów komórek pod mikroskopem

1. Ostrożnie zamocuj szkiełko nakrywkę na stole mikroskopu. Do obrazowania użyj obiektywu o dużym powiększeniu (np. 100x) (patrz System mikroskopowy w sekcji Dyskusja poniżej).
2. Nabyj zestaw obrazów dla początkowego przedziału czasowego. Zestaw ten zostanie wykorzystany do określenia początkowej liczby i pozycji wszystkich infekujących fagów. Wykonaj serię 15 obrazów w odstępach 200 nm wzdłuż osi z (pionowo). Obrazuj w kanale YFP. Dodatkowo wykonaj pojedynczy, ostry obraz w kanałach kontrastu fazowego i mCherry. Zoptymalizuj intensywność światła oraz czas ekspozycji, aby uzyskać wystarczający sygnał przy jednoczesnym zminimalizowaniu blaknięcia i uszkodzeń komórek (patrz Nabywanie obrazów w sekcji Dyskusja poniżej).
3. Nabyj film time-lapse przedstawiający los komórek po infekcji. Obrazuj próbkę w kanałach kontrastu fazowego, YFP i mCherry w odstępach czasowych 10 min przez około 4 hr. Podczas rejestracji filmu time-lapse wykonuj pojedynczy obraz w jednej pozycji z dla każdego kanału w każdym punkcie czasowym, aby uniknąć niepotrzebnej ekspozycji próbki, co mogłoby prowadzić do blaknięcia i fototoksyczności.

7. Analiza obrazów

1. Ręcznie policz liczbę fagów oraz odnotuj położenie fagów i długość komórki w początkowym przedziale czasowym. Można to wykonać przy użyciu oprogramowania takiego jak MetaMorph lub ImageJ. Odtwarzając film z odstupami czasowymi (time-lapse), odnotuj losy komórek (lityczne, lizogenne lub niezainfekowane), czas lizy oraz wszelkie inne pożądane informacje. W celu zidentyfikowania różnych losów komórek należy zapoznać się z sekcją Film time-lapse w części Reprezentatywne wyniki poniżej.
2. Oprócz powyższej analizy manualnej, można uzyskać bardziej ilościowe informacje (np. poziom fluorescencji w czasie w poszczególnych komórkach), stosując zautomatyzowane algorytmy rozpoznawania komórek i śledzenia linii komórkowych. Do śledzenia linii komórkowych i poziomów fluorescencji wykorzystujemy własny program w środowisku Matlab wraz z kodem Matlab Schnitzcell do segmentacji komórek (stworzonym przez grupę Elowitza w Caltech).

8. Reprezentatywne wyniki:

Wysiewanie fagów:

Plaque powstałe z fagi znakowanych fluorescencyjnie (w kroku 1.6 oraz sekcji 2) są znacznie mniejsze niż te od typu dzikiego (Rysunek 2). Dlatego inkubujemy płytki przez co najmniej 12 hr w inkubatorze w temperaturze 37°C, aby plaque były widoczne.

Ultrawirowanie fagów:

Po ultrawirowaniu próbki fagów w gradientem skokowym CsCl (Krok 2.10), powinny być widoczne dwa prążki (Rycina 3A). Górny prążek, znajdujący się na granicy między zawiesiną fagów a warstwą SM/CsCl 1,3 g/ml, zawiera szczątki komórkowe i puste kapsydy fagowe. Dolny prążek, na granicy między warstwami SM/CsCl 1,3 g/ml i 1,5 g/ml, stanowi prążek fagowy. W przypadku fluorescencyjnego faga λ_LZ2 prążek ten ma zielonkawy kolor. Prążek dla faga typu dzikiego λ_IG2903 ma kolor niebieskawy⁵. Po ultrawirowaniu w gradientcie równowagowym CsCl opisanym w Kroku 2.12, w środkowej części probówki powinien być widoczny jeden prążek fagowy (Rycina 3B). Ponieważ fluorescencyjny fag λ_LZ2 zawiera mieszaninę kapsydów gpD-EYFP i gpD, stosunek białka do DNA jest wyższy niż w przypadku typu dzikiego. W związku z tym prążek fluorescencyjnego faga λ_LZ2 jest nieco lżejszy (znajduje się nieco wyżej w probówce) niż prążek typu dzikiego λ_IG290310.

Barwienie DAPI:

Rysunek 5 przedstawia typowe obrazy uzyskane po znakowaniu fagów barwnikiem DAPI (Sekcja 4). Sygnały YFP i DAPI w przypadku pomyślnie oczyszczonego faga powinny wykazywać niemal 100% zgodności. Zazwyczaj obserwujemy, że mniej niż 1% punktów YFP nie zawiera DAPI (co odpowiada kapsydom pozbawionym genomu wirusowego). Mniej niż 1% punktów DAPI nie zawiera YFP (co odpowiada fagom niefluorescencyjnym)⁵.

Film poklatkowy:

Komórki lityczne rozpoznaje się po akumulacji fluorescencji YFP (kanał zielony) wewnątrz komórki, a następnie po lizie komórkowej. Komórki lizogenne rozpoznaje się po akumulacji jednolitej fluorescencji mCherry (czerwona) wewnątrz komórki oraz wznowieniu normalnego wzrostu i podziałów komórkowych. Komórki niezakażone (lub komórki, w których infekcja nie powiodła się) nie będą wykazywać żadnego z powyższych fenotypów i będą rosnąć oraz dzielić się normalnie. Rysunek 7 przedstawia kilka zestawów obrazów z kanałów kontrastu fazowego, YFP i mCherry, a także odpowiadające im obrazy nałożone z tych trzech kanałów, pochodzące z typowego filmu time-lapse (Sekcja 6). Poszczególne fagi (zielone plamki) są wyraźnie widoczne w początkowej klatce czasowej (Rysunek 7A). Zazwyczaj na powierzchni komórki widocznych jest kilka fagów (prawdopodobnie infekujących te komórki), podczas gdy inne fagi nie są zaadsorbowane, co pokazano na Rysunku 7B (lewy panel). Wynik infekcji staje się rozróżnialny w czasie. Cykl lityczny jest sygnalizowany przez wewnątrzkomórkową produkcję nowych fagów (zielone, Rysunek 7C), a następnie przez lizę komórkową (rozpadnięte komórki z uwolnionymi zielonymi fagami, Rysunek 7D). Lizogenia jest sygnalizowana przez produkcję mCherry z promotora P_RE (czerwone, Rysunek 7C) oraz wznowienie wzrostu i podziałów komórkowych (czerwone, Rysunek 7D).

Rysunek 1. Schemat blokowy opisujący tworzenie fagów fluorescencyjnych. W pierwszej kolejności uzyskuje się surowy lizat fagowy poprzez indukcję lizogenu faga gpD-EYFP, zawierającego plazmid wykazujący ekspresję białka gpD typu dzikiego (panele A-B). Fagi są następnie oczyszczane w serii etapów (panele C-L).

Rysunek 2. Plaki fagowe. Plaki faga fluorescencyjnego (po lewej) są mniejsze niż plaki typu dzikiego (po prawej) po inkubowaniu płytek przez 12 hr w 37°C.

Rycina 3. Prążki fagowe po ultrecentryfugacji. A) Po ultrecentryfugacji w gradientcie skokowym CsCl widoczne są dwa prążki. Górny odpowiada szczątkom komórkowym i pustym kapsydom fagowym; dolny prążek zawiera poszukiwanego faga. Po lewej: fag fluorescencyjny, po prawej: typ dziki. B) Po ultrecentryfugacji w gradiencie równowagowym CsCl widoczny jest pojedynczy prążek fagowy. Prążek faga fluorescencyjnego (po lewej) ma kolor zielonkawy, w porównaniu do prążka o barwie niebieskawej dla faga typu dzikiego (po prawej).

Rysunek 4. Procedura przygotowania płytek żelu agarozowego.

Rycina 5. Obrazy fluorescencyjne fagów po barwieniu DAPI. Poszczególne fagi są łatwo rozróżnialne, a sygnały YFP i DAPI bardzo dobrze się kolokalizują.

Rysunek 6. Schematyczna getDescription infekcji fagowej i układu obrazowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić obraz w pełnym rozmiarze.

Rysunek 7. Typowe obrazy z filmu time-lapse przedstawiającego infekcję fagową. Przedstawiono kanały: kontrastowy, YFP i mCherry, a także nałożenie tych trzech kanałów. (A) Obrazy z kanału YFP z początkowego przedziału czasowego. Po lewej: suma obrazów YFP w różnych pozycjach z. Trzy obrazy po prawej to przykładowe obrazy YFP w różnych pozycjach z, odpowiadające różnym obszarom powierzchni komórki. (B), (C) i (D) Nałożone obrazy (lewo) kanału kontrastowego (środek-lewo), YFP (środek-prawo) i mCherry (prawo) w różnych przedziałach czasowych. (B) W t = 0 widoczne są dwie komórki, z których każda jest zainfekowana pojedynczym fagem (zielone punkty), oraz jedna komórka zainfekowana przez 3 fagi. Zaobserwowano również kilka niezaadsorbowanych fagów. (C) W t = 80 min dwie komórki zainfekowane pojedynczymi fagami weszły w cykl lityczny, co wskazuje wewnątrzkomórkowa produkcja nowych fagów (zielone). Komórka zainfekowana przez 3 fagi weszła w cykl lizogenny, co wskazuje produkcja mCherry z promotora PRE (czerwone). (D) W t = 2 hr cykl lityczny doprowadził do lizy komórki (komórka uległa rozpadnięciu), podczas gdy komórka lizogenna uległa podziałowi^§.

^§Lewe panele rysunku 7(C) i (D) zostały przedrukowane z Cell, 141, Lanying Zeng, Samuel O. Skinner, Chenghang Zong, Jean Sippy, Michael Feiss i Ido Golding, Decision Making at a Subcellular Level Determines the Outcome of Bacteriophage Infection, 682-691, Copyright (2010), za zgodą wydawnictwa Elsevier.

Nazwa szczepu	Istotny genotyp	Źródło/referencja
Szczepy bakteryjne
LE392	supF	John Cronan, University of Illinois
Szczepy fagów
λLZ1	gpD-EYFP, cI857 Sam7 D-eyfp b::kanR	Zeng et al.5
λLZ2	gpD-mosaic, ten sam genotyp co λLZ1	Zeng et al.5
Plazmidy
pPRE-mCherry	mCherry pod kontrolą PRE, ampR	Zeng et al.5
pPLate*D	gpD pod kontrolą późnego promotora λ, ampR	Zeng et al.5

Tabela 1. Szczepy bakteryjne, fagi i plazmidy wykorzystane w niniejszej pracy.

Gęstość ρ (g/ml)	CsCl (g)	SM (ml)	Współczynnik załamania światła η
1.30	39	86	1.3625
1.50	67	82	1.3815
1.70	95	75	1.3990

Tabela 3. Roztwory CsCl przygotowane w buforze SM (100 ml) do gradientów skokowych.

Dyskusja

Szczepy bakteryjne, fagi i plazmidy:

Szczep LE392 jest supF. Wybrano go w celu supresji mutacji Sam7 w genomie faga (szczegóły w Tabeli 1). W związku z tym indukowane lizogeny ostatecznie ulegną lizie i uwolnią cząstki fagowe, podobnie jak zainfekowane komórki, które wybrały ścieżkę lityczną. Komórki lizogenne hodowane są w temperaturze 30°C ze względu na obecność temperaturoczułego allelu cI857 w genomie faga. Po indukcji termicznej białka gpD-EYFP i gpD typu dzikiego są współekspresjonowane odpowiednio z genomu λ_LZ1 oraz plazmidu pPlate*D. W rezultacie kapsyd nowo powstałego faga λ_LZ2 zawiera mieszaninę białek gpD-EYFP i gpD. Ten mozaikowy fag jest stabilny strukturalnie i wystarczająco fluorescencyjny, aby umożliwić detekcję pojedynczych fagów⁵. pP_RE-mCherry jest plazmidem reporterowym używanym do wykrywania wyboru ścieżki lizogennej. Promotor P_RE jest aktywowany przez CII podczas ustanawiania lizogenii^1,11. pP_RE-mCherry⁵ został otrzymany z pE-gfp¹¹ poprzez zastąpienie gfp przez mCherry¹². Więcej szczegółów znajduje się w naszej wcześniejszej pracy⁵.

Parametry warunków hodowli:

Podczas indukcji lizogenów (Sekcja 1), łagodne wytrząsanie przy 180 rpm zapewnia dobrą wydajność wirusa¹³. Należy unikać stosowania glukozy w pożywce wzrostowej, ponieważ metabolizm glukozy generuje kwaśne produkty metaboliczne, a dojrzałe cząsteczki lambda są niestabilne przy niskim pH¹³. Dodatek MgSO₄ ma na celu stabilizację kapsydu faga³. W przypadku fagów niosących typ dziki cI (zamiast cI857), lizogeny można indukować za pomocą Mitomycyny C, czynnika uszkadzającego DNA³. W kroku 1.3 inkubacja w 37°C zazwyczaj nie powinna przekraczać 90 minut. Wskazane jest sprawdzanie gęstości komórek za pomocą OD₆₀₀ co 30 min. W przypadku dobrego lizatu wartość OD₆₀₀ spada do około 0,2 lub mniej, a pozostała wartość OD₆₀₀ wynika z obecności detrytusu komórkowego. Zbyt długa inkubacja może doprowadzić do niższej wydajności fagów, ponieważ nowo powstałe fagi mogą zacząć wstrzykiwać swoje DNA do detrytusu komórkowego. Aby uzyskać widoczne pasmo fagów (co najmniej 1 x 10¹¹ cząsteczek faga) w krokach 2.11 i 2.13, należy wyhodować co najmniej 500 ml kultury w kroku 1.2. Dodatek 0,2% maltozy do pożywki wzrostowej w krokach 5.1 i 5.2 ma na celu indukcję ekspresji LamB, receptora dla adsorpcji faga lambda^3,14. Zastosowanie 1000-krotnego zamiast 100-krotnego rozcieńczenia w kroku 5.2 ma na celu obniżenie poziomu tła mCherry z plazmidu reporterowego pP_RE-mCherry. W kroku 5.5, w celu wyzwolenia wstrzykiwania DNA faga, wybrano temperaturę 35°C, aby uniknąć indukcji temperaturoczułego allelu cI857.

Oczyszczanie fagów:

Etapy oczyszczania fagów (Kroki 2.1 do 2.11) można zastąpić innymi protokołami oczyszczania⁵, jednak końcowa ultrawirówka w gradiencie równowagowym CsCl (Kroki 2.12 i 2.13) jest niezbędna. W Krokach 2.10 i 2.12 wymagane są rotory z wahadłowymi koszykami, aby zapewnić uzyskanie wyraźnych, widocznych prążków fagowych. Uzyskanie czystego stoku fagów może zająć nawet tydzień, dlatego konieczne jest monitorowanie miana fagów na poszczególnych etapach, aby upewnić się, że podczas kroków pośrednich nie wystąpiły żadne błędy.

Postępowanie z fagami:

Podczas wszystkich procedur oczyszczania opisanych w sekcji 2 krytyczne jest delikatne obchodzenie się z lizatem fagowym, aby uniknąć odrywania ogonków fagowych od głów fagów. Podczas infekcji komórek w sekcji 5 (np. kroki od 5.5 do 5.7) równie ważne jest unikanie odrywania cząstek fagów od zainfekowanej komórki. Należy zauważyć, że jeśli fag zostanie oderwany od zainfekowanej komórki po wstrzyknięciu swojego DNA, nastąpi tzw. „ciemna” infekcja, co oznacza, że w eksperymencie zostanie zaobserwowany efekt infekcji, ale nie sam infekujący fag. Aby zminimalizować tego typu problemy, podczas pracy z fagami lub mieszaniną fagów i komórek używamy końcówek do pipet o szerokim wylocie.

Testowanie DAPI:

Barwienie zapasu fagów barwnikiem DAPI (Sekcja 4) jest szybką i wydajną metodą sprawdzania czystości zapasu fagów. Może być ona również wykorzystana do badania ewentualnej degradacji istniejącego zapasu fagów w czasie. W przypadku czystego zapasu ko-lokalizacja sygnałów YFP i DAPI pod mikroskopem fluorescencyjnym powinna wynosić blisko 100%. Zazwyczaj obserwujemy, że mniej niż 1% plamek YFP nie zawiera DAPI (co reprezentuje kapsydy bez genomu wirusowego), co wskazuje, że cząstki te nie zapakowały pomyślnie wirusowego DNA lub wstrzyknęły już swoje DNA w innym miejscu. Mniej niż 1% plamek DAPI nie zawiera YFP (co odpowiada fagom niefluorescencyjnym). Jeśli tak nie jest, kroki od 2.12 do 2.14 muszą zostać powtórzone w celu ponownego oczyszczenia. Jeśli chodzi o parametry obrazowania, ustawienia mikroskopu w kroku 4.3 nie są tak krytyczne jak w Sekcji 5, ponieważ nie jest tutaj wymagane długotrwałe obrazowanie żywych komórek. Jednak utrzymanie tych samych ustawień mikroskopowych co w Sekcji 5 jest przydatne, jeśli chce się skalibrować intensywność fluorescencji pojedynczej cząstki faga. Jeśli płytka z agarozy PBS nie jest wystarczająco czysta lub użyto zbyt dużej ilości barwnika DAPI, niektóre plamki DAPI odpowiadające DNA fagów mogą być otoczone „halo”. W przypadku użycia zbyt małej ilości barwnika DAPI sygnał z kanału DAPI może być bardzo słaby.

System mikroskopowy:

Do obrazowania w Sekcji 6 używamy komercyjnego odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego (Eclipse TE2000-E, Nikon) z obiektywem 100x (Plan Fluo, apertura numeryczna 1,40, imersja olejowa) i standardowymi zestawami filtrów (Nikon). Źródłem światła fluorescencyjnego jest lampa łukowa z kontrolą natężenia światła. Następujące funkcje są sterowane komputerowo: pozycja x, y i z; migawki pola jasnego i fluorescencji; oraz wybór filtra fluorescencyjnego. Wymagana jest funkcja automatycznego ustawiania ostrości. W przeciwnym razie ostrość może łatwo ulec rozregulowaniu podczas rejestracji filmu time-lapse (trwającego zazwyczaj 4 godziny). Przydatna jest możliwość pozyskiwania obrazów z wielu pozycji (x,y) w każdym punkcie czasowym, co pozwala na równoległe śledzenie wielu zdarzeń infekcji. Zazwyczaj rejestrujemy 8 pozycji stolika w każdym filmie, śledząc do 100 zdarzeń infekcji. Stosowana przez nas kamera to chłodzona kamera CCD 512x512 z pikselami 16x16 μm i zakresem dynamicznym 16 bitów (Cascade512, Photometrics). Akwizycja jest wykonywana przy użyciu oprogramowania MetaMorph (Molecular Devices). Mikroskop powinien znajdować się w pomieszczeniu z kontrolowaną temperaturą; alternatywnie stolik mikroskopu powinien być otoczony komorą z kontrolowaną temperaturą.

Nabywanie obrazów:

W przypadku obrazowania żywych komórek kluczowe jest unikanie zbędnej ekspozycji próbki, która mogłaby prowadzić do blaknięcia fluorescencji i fototoksyczności. Dlatego najlepiej jest najpierw scharakteryzować system, aby znaleźć optymalną ekspozycję na światło, która umożliwia detekcję fluorescencji, nie prowadząc jednocześnie do nadmiernego blaknięcia ani nie hamując wzrostu komórek. Aby uzyskać wysokiej jakości obraz fluorescencyjny, należy dostosować natężenie światła wzbudzenia, czas ekspozycji oraz wzmocnienie kamery. W krokach 6.2-6.3 wybrano 10 min odstępu między klatkami w celu zminimalizowania ekspozycji na światło. W każdej klatce wymagany jest tylko pojedynczy obraz w ostrości w kanale kontrastu fazowego (do rozpoznawania komórek) oraz w kanałach fluorescencyjnych (do określania losów komórek). Jednak w pierwszym punkcie czasowym konieczne jest wykonanie wielu obrazów w różnych pozycjach z w kanale YFP, aby uchwycić wszystkie fag i infekujące powierzchnię komórki. Czas ekspozycji YFP w początkowej klatce może również wymagać zwiększenia w porównaniu do czasu stosowanego w późniejszych klatkach filmu time-lapse.

Analiza obrazu:

Należy bardzo starannie policzyć cząsteczki fagów wokół powierzchni komórki w kroku 7.1. Jak wspomniano powyżej, w kroku 6.2 wykonujemy serię obrazów w osi z (z-stacks) w kanale YFP. Niemniej jednak, niektóre fluorescencyjne cząsteczki fagów mogą nadal pozostać poza ogniskową, co utrudnia ich zliczanie. Długość komórki w początkowym przedziale czasowym jest mierzona przy użyciu oprogramowania Metamorph. Długość komórki można mierzyć również za pomocą ImageJ lub innych narzędzi programistycznych. Ponadto bardzo przydatny w uzyskiwaniu takich informacji, jak zmiana fluorescencji w czasie wzdłuż linii komórkowych, może być automatyczny, autorski program w środowisku Matlab.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Chloroform	Fisher Scientific	C298-500
NaCl	Fisher Scientific	S271-3
DNase I	Sigma-Aldrich	D4527-10KU
RNase	Sigma-Aldrich	R4642-10MG
PEG8000	Fisher Scientific	BP233-1
Bufor SM	TEKnova, Inc.	S0249
NZYM	TEKnova, Inc.	N2062
CsCl	Sigma-Aldrich	C3011-250G
Strzykawka	BD Biosciences	309585
Igła	BD Biosciences	305176
Kaseta do dializy	Thermo Fisher Scientific, Inc.	66333
Przedmiot szkiełko	Corning	2947-75x50
Agaroza	Fisher Scientific	BP160-100
Probówka ultra-clear SW40Ti	Beckman Coulter Inc.	344060
Probówka ultra-clear SW60Ti	Beckman Coulter Inc.	344062
Rotor SW40Ti	Beckman Coulter Inc.	331302
Rotor SW60Ti	Beckman Coulter Inc.	335649
Refraktometr	Fisher Scientific	13-947
Mikroskop epifluorescencyjny	Nikon Instruments	Eclipse TE2000-E
Tabela 2. Odczynniki i sprzęt.