Opracowano i szczegółowo opisano nowatorski i wysoce wydajny dwuetapowy protokół chromatografii powinowactwa. Metoda ta opiera się na niewielkim znaczniku oczyszczającym o dwóch wrodzonych powinowactwach i jest możliwa do zastosowania w odniesieniu do szerokiego zakresu białek docelowych o różnych właściwościach.
Artykuł metodologiczny
Ortogonalne oczyszczanie białek wspomagane przez mały bispecyficzny znacznik powinowactwa
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ze względu na wysokie koszty związane z oczyszczaniem białek rekombinowanych, protokoły muszą zostać zracjonalizowane. W przypadku działań wysokoprzepustowych istnieje zapotrzebowanie na ogólne metody, które nie wymagają optymalizacji specyficznej dla konkretnego białka docelowego1. Aby to osiągnąć, powszechnie stosuje się znaczniki oczyszczające, które można genetycznie połączyć z genem zainteresowania2. Najczęściej wykorzystywanym uchwytem powinowactwa jest znacznik heksa-histydynowy, który nadaje się do oczyszczania zarówno w warunkach natywnych, jak i denaturujących3. Obciążenie metaboliczne związane z produkcją tego znacznika jest niskie, jednak nie zapewnia ono tak wysokiej specyficzności, jak konkurencyjne strategie oparte na chromatografii powinowactwa1,2.
Opracowano bispecyficzny znacznik oczyszczający z dwoma różnymi miejscami wiązania w obrębie niewielkiej domeny białkowej składającej się z 46 aminokwasów. Domena wiążąca albuminy pochodzi z białka G paciorkowców i wykazuje silne naturalne powinowactwo do ludzkiej albuminy surowiczej (HSA). Jadenastu aminokwasów wyeksponowanych na powierzchni, które nie uczestniczą w wiązaniu albumin4, poddano randomizacji genetycznej w celu stworzenia biblioteki kombinatorycznej. Biblioteka białek z nową, losowo ułożoną powierzchnią wiążącą (Rysunek 1) została wyekspresowana na cząsteczkach fagów, aby ułatwić selekcję wiązaczy za pomocą technologii phage display. Poprzez kilka rund biopanningu przeciwko dimerycznej domenie Z pochodzącej z białka A gronkowców5, zidentyfikowano małą, bispecyficzną cząsteczkę wykazującą powinowactwo zarówno do HSA, jak i do nowego celu6.
Nowa domena białkowa, określona jako ABDz1, została oceniona jako znacznik oczyszczający dla wybranego zestawu białek docelowych o różnej masie cząsteczkowej, rozpuszczalności i punkcie izoelektrycznym. Trzy białka docelowe wyeksprymowano w Escherishia coli z nowym znacznikiem połączonym z ich końcami N-końcowymi, a następnie oczyszczono metodą powinowactwa. Wstępne oczyszczanie na kolumnie z unieruchomionym HSA lub domeną Z doprowadziło do uzyskania względnie czystych produktów. Dwustopniowe oczyszczanie powinowactwa z zastosowaniem znacznika bispecyficznego skutkowało znaczną poprawą czystości białek. Nośniki chromatograficzne z unieruchomioną domeną Z, na przykład MabSelect SuRe, są powszechnie dostępne do oczyszczania przeciwciał, a HSA można łatwo sprzęgać chemicznie z nośnikami w celu stworzenia drugiej matrycy.
Metoda ta jest szczególnie korzystna w przypadku wysokich wymagań dotyczących czystości odzyskanego białka docelowego. Bifunkcyjność znacznika pozwala na zastosowanie dwóch różnych etapów chromatograficznych, podczas gdy obciążenie metaboliczne gospodarza ekspresyjnego jest ograniczone ze względu na niewielki rozmiar znacznika. Stanowi ona konkurencyjną alternatywę dla tzw. znakowania kombinatoryjnego, w którym stosuje się kombinację wielu znaczników1,7.
Protokół
1. Klonowanie genu docelowego/konstruktu fuzyjnego z tagiem ABDz1
- Przygotować fragmenty PCR genu ABDz1 z odpowiednimi miejscami restrykcyjnymi, umożliwiającymi ligację N-końcową genu docelowego w plazmidzie ekspresyjnym (plazmid zawierający ABDz1 jest dostępny bezpłatnie na podstawie umowy o przekazaniu materiału).
- Przetrawić oczyszczony wektor ekspresyjny oraz fragmenty PCR wybranymi enzymami restrykcyjnymi w odpowiednim buforze reakcyjnym. Produkty oczyścić przed ligacją.
- Zligować przetrawiony fragment ABDz1 do wektora ekspresyjnego zawierającego interesujący gen i transformować produkt ligacji do E. coli (w oryginalnej metodzie zastosowano szczep RR1ΔM158). Rozsiać transformowane komórki na płytki agarowe z dodatkiem odpowiednich antybiotyków w celu selekcji.
- Przeprowadzić screening PCR kilku kolonii i zweryfikować sekwencję otrzymanej kasety ekspresyjnej za pomocą sekwencjonowania DNA.
- Wyizolować plazmid z hodowli nocnej kolonii zweryfikowanej sekwencją i transformować do preferowanego szczepu ekspresyjnego (w oryginalnej metodzie zastosowano E. coli Rosetta (DE3) z plazmidem pRARE w celu zwiększenia produkcji białek kodowanych przez geny ludzkie).
2. Ekspresja białka
- Pojedynczą kolonię bakterii zaszczepić do 10 ml bulionu sojowego z trypsyną z dodatkiem 5 g/l ekstraktu drożdżowego i odpowiednich antybiotyków. Inkubować przy 150 rpm w temperaturze 37 °C przez noc.
- 1 ml kultury nocnej zaszczepić do 100 ml świeżego medium i indukować ekspresję białka (pierwotnie 1 mM izopropyl-β-D-thiogalaktosyd w przypadku wykorzystania operonu lac), gdy komórki osiągną logarytmiczną fazę wzrostu.
- Inkubować przy 150 rpm w temperaturze 25 °C przez noc, a następnie zebrać komórki poprzez wirowanie.
3. Ortogonalna puryfikacja powinowactwa
- Resuspenduj osad w 25 ml buforu roboczego (25 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,05% (w/v) Tween 20, pH 8,0) i zniszcz komórki poprzez sonikację przy amplitudzie 60% i impulsach 1,0/1,0 przez 3 min. Odwiruj próbkę i przefiltruj supernatant zawierający białko docelowe (0,45 μm) przed dalszym oczyszczaniem.
- Równoważ kolumnę HSA Sepharose 1 ml lub kolumnę aktywowaną NHS, uprzednio sprzężoną z HSA zgodnie z zaleceniami dostawcy, przy użyciu 10 objętości kolumny (CV) buforu roboczego z przepływem 1 ml/min w odpowiednim systemie do oczyszczania białek. Nałóż lizat bakteryjny przy przepływie 0,5 ml/min, a następnie przywróć szybkość przepływu do 1 ml/min.
- Przemyj kolumnę 5 CV buforu roboczego, a następnie 5 CV buforu piorącego (5 mM NH4Ac, pH 5,5).
- Eluuj próbkę buforem elucyjnym (0,5 M HAc, pH 2,5) przy przepływie 1 ml/min i zbieraj frakcje; monitoruj absorbancję przy 280 nm, aby wybrać frakcje z piku elucyjnego do dalszego oczyszczania.
- Połącz frakcje o najwyższym stężeniu białka, rozcieńcz je dwukrotnie w buforze roboczym SuRe (20 mM fosforan, 150 mM NaCl, pH 7,2) i upewnij się, że pH jest bliskie neutralnemu. W razie potrzeby dodaj 1 M Tris-HCl pH 8, aby podnieść pH.
- Nałóż próbkę z przepływem 0,5 ml/min na kolumnę HiTrap MabSelect SuRe 1 ml, która została zrównoważona 10 CV buforu roboczego SuRe przy przepływie 1 ml/min. Po nałożeniu próbki przywróć szybkość przepływu do 1 ml/min.
- Przemyj kolumnę 5 CV buforu roboczego SuRe (krok 5) i eluuj białka za pomocą 0,2 M HAc, pH 2,7. W przypadku wrażliwych białek docelowych eluat można neutralizować bezpośrednio podczas zbierania poprzez dodanie Tris-HCl.
Jeśli kolejność etapów chromatograficznych zostanie odwrócona, eluat z kolumny MabSelect SuRe można rozcieńczyć w buforze prowadzącym (krok 3.1), a pH podnieść do około 8 poprzez dodanie 1 M Tris-HCl. Zazwyczaj w przypadku zastosowania matrycy SuRe w drugim etapie obserwuje się węższe piki.
4. Ocena czystości za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE)
- Naniesione oczyszczone frakcje na redukującą elektroforezę SDS-PAGE a następnie, w razie potrzeby, przeanalizuj masę cząsteczkową oczyszczonego produktu za pomocą spektrometrii mas. Ważne jest całkowite zredukowanie próbki, ponieważ wolna cysteina w ABDz1 może powodować dimeryzację produktu w warunkach nieredukujących.
5. Reprezentatywne wyniki:
W celu dowiedzenia zasady działania, ortogonalną puryfikację powinowactwa wspomaganą znacznikiem ABDz1 oceniono dla trzech ludzkich białek docelowych reprezentujących różne klasy rozpuszczalności, masy cząsteczkowe i punkty izoelektryczne (Tabela 1). Gen ABDz1 połączono genetycznie z genami docelowymi, a konstrukty wyeksprymowano w E. coli; Rysunek 2 przedstawia schemat blokowy wszystkich kolejnych etapów metody. Po oczyszczaniu zgodnie z protokołem ortogonalnym, próbki pobrane w różnych punktach przeanalizowano za pomocą SDS-PAGE (Rysunek 3). Wyniki wyraźnie wykazują użyteczność podwójnego znacznika i dwóch wysoce specyficznych etapów oczyszczania. Chociaż, jak widać na żelach, po pierwszym etapie oczyszczania uzyskano zadowalającą czystość, kolejny etap pozwala na otrzymanie bardzo czystego produktu, odpowiedniego do zastosowań o wysokich wymaganiach.
Rycina 1. Projekt biblioteki kombinatorycznej wykorzystanej do selekcji bispecyficznego znacznika ABDz1.
46-aminokwasowa domena wiążąca albuminę zwija się w stabilny pęczek trzech helis i zawiera miejsce wiązania dla ludzkiej albuminy surowiczej, zlokalizowane głównie w drugiej helisie. Poprzez genetyczną randomizację jedenastu aminokwasów wystawionych na powierzchnię, znajdujących się w pierwszej i trzeciej helisie, zaprojektowano nową powierzchnię wiążącą. Jedenaście pozycji jest zaznaczonych na rycinie i ponumerowanych zgodnie z Kraulis et al.9 . Po biopanningu przeciwko dimerowi domeny Z białka A gronkowca z wykorzystaniem biblioteki kombinatorycznej ekspresowanej na fagach, zidentyfikowano bispecyficzną cząsteczkę ABDz1.
Rysunek 2. Uproszczony schemat blokowy protokołu ortogonalnego oczyszczania powinowactwa.
Fragment PCR zawierający sekwencję ABDz1 jest ligowany (na końcu N) z genem docelowym w odpowiednim wektorze ekspresyjnym. Produkt ligacji jest transformowany do E. coli w celu weryfikacji sekwencji i przygotowania plazmidu. Po transformacji do gospodarza ekspresyjnego, na podstawie wstępnej hodowli nocnej, przygotowywana jest wielkoskalowa hodowla do ekspresji białka rekombinowanego. Bakterie są zbierane przez wirowanie i lizowane za pomocą sonikacji w celu uzyskania lizatu bakteryjnego zawierającego białko docelowe. Po etapie filtracji w celu usunięcia pozostałych cząstek stałych, lizat poddawany jest ortogonalnemu oczyszczaniu powinowactwa w systemie do obsługi cieczy, przechodząc dwa kolejne etapy oczyszczania. Pik elucji z obu etapów oczyszczania są pobierane i oceniane za pomocą SDS-PAGE w celu określenia czystości oraz porównywane z lizatem przed oczyszczaniem.
Rycina 3. Analiza SDS-PAGE białek docelowych eksprymowanych i oczyszczonych w fuzji z ABDz1.
Próbki pobrane z lizatu bakteryjnego trzech białek eksprymowanych w fuzji z ABDz1, reprezentujących różne właściwości, oraz samej etykiety ABDz1 zostały zebrane wraz z próbkami z odpowiadających im pików po oczyszczaniu na kolumnie HSA, a następnie na kolumnie MabSelect SuRe (A). Ścieżki 1-4 przedstawiają próbki z lizatów przed oczyszczaniem, ścieżki 5-8 z oczyszczania HSA (pierwszy etap), a ścieżki 9-12 z oczyszczania MabSelect SuRe (drugi etap). Próbki naniesiono w następującej kolejności: ABDz1-141377, ABDz1-HT875, ABDz1-HT2375 oraz ABDz1. Dodatkowo przeanalizowano próbki pobrane z tych samych lizatów, oczyszczone w odwrotnej kolejności na tych samych kolumnach (B). Ścieżki 1-3 przedstawiają próbki z lizatów przed oczyszczaniem, ścieżki 4-6 z oczyszczania MabSelect SuRe (pierwszy etap), a ścieżki 7-9 z oczyszczania HSA (drugi etap). Próbki naniesiono w tej samej kolejności co w (A), z pominięciem samej etykiety. Z tych wyników jasno wynika, że ta dwuetapowa metoda pozwala na uzyskanie wysokiego stopnia czystości białek, niezależnie od kolejności zastosowania poszczególnych etapów.
| Nazwab | Białko docelowe Uniprotc | Masa molekularna (kDa) | Klasa rozpuszczalnościd | Masa molekularna produktu fuzyjnego (kDa) | Punkt izoelektryczny produktu fuzyjnego |
| 141377 | B7Z315 | 17.4 | 4 | 23.7 | 8.5 |
| HT875 | P01040 | 10.8 | 3 | 17.1 | 4.9 |
| HT2375 | P00740 | 8.9 | 5 | 15.2 | 6.8 |
- Masa cząsteczkowa samej etykiety ABDz1 wynosi 6.3 kDa, punkt izoelektryczny 6.7.
- Białko docelowe stanowi fragment białka z bazy Uniprot.
- http://www.uniprot.org.
- Klasa rozpuszczalności fragmentu białka z N-terminalnym His6ABP10.
Tabela 1. Białka docelowe i produkty fuzyjne z tagiem ABDz1a oceniane w badaniu dowodowym.
Do ekspresji i oczyszczania metodą ortogonalnego powinowactwa wybrano trzy unikalne białka ludzkie o różnej masie cząsteczkowej, rozpuszczalności i punkcie izoelektrycznym.
Dyskusja
Przedstawiony tutaj protokół ortogonalnego oczyszczania powinowactwa umożliwia efektywne oczyszczanie szerokiego zakresu białek docelowych. Poprzez połączenie wrodzonego miejsca wiązania domeny wiążącej albuminy z nową powierzchnią wiążącą opracowano niewielki bispecyficzny znacznik białkowy. Wykorzystanie tego znacznika jest bardzo proste, ponieważ można go po prostu sklonować i wyexprymować w fuzji z dowolnym białkiem zainteresowania w dowolnym preferowanym wektorze ekspresyjnym. Do dwuetapowego oczyszczania białek można wykorzystać standardowy sprzęt dostępny w większości laboratoriów. Ponieważ funkcja znacznika ABDz1 zależy od prawidłowego fałdowania domeny w celu efektywnego wyeksponowania obu powierzchni wiążących, metoda ta ogranicza się do białek eksprymowanych w formie rozpuszczalnej i nie nadaje się do oczyszczania w warunkach denaturujących. Należy również unikać środków redukujących, ponieważ zakłócają one wiązanie ABDz1 z domeną Z na matrycy MabSelect SuRe.
Ortogonalna oczyszczanie powinowactwem stanowi przydatną alternatywę dla tradycyjnych metod w celu zaspokojenia zapotrzebowania na wysoką czystość białek w wielu wymagających zastosowaniach. Jednocześnie metoda ta eliminuje konieczność stosowania tagowania kombinatorycznego, gdy kolejne strategie oczyszczania są używane sekwencyjnie. W zastosowaniach wymagających natywnego białka docelowego można wprowadzić miejsce cięcia proteazy, aby umożliwić enzymatyczne usunięcie tagu ABDz111. Ponadto tag ABDz1 jest pierwszą opisaną do tej pory bispecyficzną, małą i pofałdowaną domeną białkową. Jest on wyjątkowy, ponieważ zapewnia strategię oczyszczania opartą na dwóch specyficznych oddziaływaniach powinowactwa do celu. W przyszłości interesujące byłoby rozwinięcie tej koncepcji poprzez opracowanie nowych tagów bispecyficznych z nowymi powierzchniami wiążącymi, które byłyby kompatybilne z łatwo dostępnymi i niedrogimi żywicami chromatograficznymi. Na przykład poprzez zastąpienie aminokwasów zaangażowanych w wiązanie z albuminą resztami zasadowymi można uzyskać tag kompatybilny z chromatografią wymiany jonowej. Podobna koncepcja okazała się skuteczna w przypadku inżynierii ładunku domeny Z w celu wygenerowania tagów znanych jako Zacid12 oraz Zbasic13, które są odpowiednio kompatybilne z wymianą anionową i kationową.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Projekt ten był finansowany przez Fundację Knuta i Alice Wallenberga oraz Szwedzką Radę Badawczą.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| *E. coli* RR1ΔM15 | American Type Culture Collection | 35102 | |
| *E. coli* Rosetta (DE3) | Novagen, EMD Millipore | 70954 | |
| Bulion sojowo-kazeinowy | Difco Laboratories | 211822 | |
| Ekstrakt z drożdży | Difco Laboratories | 212720 | |
| Sonikator do komórek Vibra cell | Sonics and Materials, Inc. | - | |
| HSA Sepharose | Pharmacia Corporation (Pfizer) | Poprzedni produkt | |
| HiTrap MabSelect SuRe | GE Healthcare | 11-0034-93 | |
| kolumna HiTrap NHS-activated HP | GE Healthcare | 17-0716-01 |
Bibliografia
- Waugh, D. S. Making the most of affinity tags. Trends Biotechnol. 23, 316-320 (2005).
- Hedhammar, M. Protein engineering strategies for selective protein purification. CET. 28, 1315-1325 (2005).
- Porath, J. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 258, 206-213 (1975).
- Linhult, M. Mutational analysis of the interaction between albumin-binding domain from streptococcal protein G and human serum albumin. Protein Sci. 11, 206-213 (2002).
- Nilsson, B. A synthetic IgG-binding domain based on staphylococcal protein. A. Protein Eng. 1, 107-113 (1987).
- Alm, T. A small bispecific protein selected for orthogonal affinity purification. Biotechnol. J. 5, 605-617 (2010).
- Nilsson, J. Multiple affinity domains for the detection, purification and immobilization of recombinant proteins. J. Mol. Recognit. 9, 585-594 (1996).
- Rüther, U. pUR 250 allows rapid chemical sequencing of both DNA strands of its inserts. Nucleic Acids Res. 10, 5765-5772 (1982).
- Kraulis, P. J. The serum albumin-binding domain of streptococcal protein G is a three-helical bundle: a heteronuclear NMR study. FEBS Lett. 378, 190-194 (1996).
- Hedhammar, M. Novel flow cytometry-based method for analysis of expression levels in E coli giving information about precipitated and soluble protein. J. Biotechnol. 119, 133-146 (2005).
- Carter, P. Site-specific proteolysis of fusion proteins. ACS Sympos. Ser. 427, 181-193 (1990).
- Hedhammar, M. Negatively charged purification tags for selective anion-exchange recovery. PEDS. 17, 779-786 (2004).
- Gräslund, T. Charge engineering of a protein domain to allow efficient ion-exchange recovery. Protein Eng. 13, 703-709 (2000).
Przedruki i uprawnienia
