Ortogonalne oczyszczanie białek wspomagane przez mały bispecyficzny znacznik powinowactwa

Podsumowanie

Opracowano i szczegółowo opisano nowatorski i wysoce wydajny dwuetapowy protokół chromatografii powinowactwa. Metoda ta opiera się na niewielkim znaczniku oczyszczającym o dwóch wrodzonych powinowactwach i jest możliwa do zastosowania w odniesieniu do szerokiego zakresu białek docelowych o różnych właściwościach.

Streszczenie

Ze względu na wysokie koszty związane z oczyszczaniem białek rekombinowanych, protokoły muszą zostać zracjonalizowane. W przypadku działań wysokoprzepustowych istnieje zapotrzebowanie na ogólne metody, które nie wymagają optymalizacji specyficznej dla konkretnego białka docelowego¹. Aby to osiągnąć, powszechnie stosuje się znaczniki oczyszczające, które można genetycznie połączyć z genem zainteresowania². Najczęściej wykorzystywanym uchwytem powinowactwa jest znacznik heksa-histydynowy, który nadaje się do oczyszczania zarówno w warunkach natywnych, jak i denaturujących³. Obciążenie metaboliczne związane z produkcją tego znacznika jest niskie, jednak nie zapewnia ono tak wysokiej specyficzności, jak konkurencyjne strategie oparte na chromatografii powinowactwa^1,2.

Opracowano bispecyficzny znacznik oczyszczający z dwoma różnymi miejscami wiązania w obrębie niewielkiej domeny białkowej składającej się z 46 aminokwasów. Domena wiążąca albuminy pochodzi z białka G paciorkowców i wykazuje silne naturalne powinowactwo do ludzkiej albuminy surowiczej (HSA). Jadenastu aminokwasów wyeksponowanych na powierzchni, które nie uczestniczą w wiązaniu albumin⁴, poddano randomizacji genetycznej w celu stworzenia biblioteki kombinatorycznej. Biblioteka białek z nową, losowo ułożoną powierzchnią wiążącą (Rysunek 1) została wyekspresowana na cząsteczkach fagów, aby ułatwić selekcję wiązaczy za pomocą technologii phage display. Poprzez kilka rund biopanningu przeciwko dimerycznej domenie Z pochodzącej z białka A gronkowców⁵, zidentyfikowano małą, bispecyficzną cząsteczkę wykazującą powinowactwo zarówno do HSA, jak i do nowego celu⁶.

Nowa domena białkowa, określona jako ABDz1, została oceniona jako znacznik oczyszczający dla wybranego zestawu białek docelowych o różnej masie cząsteczkowej, rozpuszczalności i punkcie izoelektrycznym. Trzy białka docelowe wyeksprymowano w Escherishia coli z nowym znacznikiem połączonym z ich końcami N-końcowymi, a następnie oczyszczono metodą powinowactwa. Wstępne oczyszczanie na kolumnie z unieruchomionym HSA lub domeną Z doprowadziło do uzyskania względnie czystych produktów. Dwustopniowe oczyszczanie powinowactwa z zastosowaniem znacznika bispecyficznego skutkowało znaczną poprawą czystości białek. Nośniki chromatograficzne z unieruchomioną domeną Z, na przykład MabSelect SuRe, są powszechnie dostępne do oczyszczania przeciwciał, a HSA można łatwo sprzęgać chemicznie z nośnikami w celu stworzenia drugiej matrycy.

Metoda ta jest szczególnie korzystna w przypadku wysokich wymagań dotyczących czystości odzyskanego białka docelowego. Bifunkcyjność znacznika pozwala na zastosowanie dwóch różnych etapów chromatograficznych, podczas gdy obciążenie metaboliczne gospodarza ekspresyjnego jest ograniczone ze względu na niewielki rozmiar znacznika. Stanowi ona konkurencyjną alternatywę dla tzw. znakowania kombinatoryjnego, w którym stosuje się kombinację wielu znaczników^1,7.

Protokół

1. Klonowanie genu docelowego/konstruktu fuzyjnego z tagiem ABDz1

1. Przygotować fragmenty PCR genu ABDz1 flankowane odpowiednimi miejscami restrykcyjnymi dla ligacji N-końcowej genu docelowego w plazmidzie ekspresyjnym (plazmid zawierający ABDz1 jest dostępny bezpłatnie w ramach umowy o przekazaniu materiałów).
2. Przetrawić oczyszczony wektor ekspresyjny oraz fragmenty PCR wybranymi enzymami restrykcyjnymi w odpowiednim buforze reakcyjnym. Oczyścić produkty przed ligacją.
3. Zligować przetrawiony fragment ABDz1 z wektorem ekspresyjnym zawierającym gen zainteresowania i przekształcić produkt ligacji do E. coli (w oryginalnej metodzie zastosowano szczep RR1ΔM15⁸). Wysiać przekształcone komórki na płytki agarowe z dodatkiem odpowiednich antybiotyków do selekcji.
4. Przeprowadzić screening PCR kilku kolonii i zweryfikować sekwencję otrzymanej kasety ekspresyjnej za pomocą sekwencjonowania DNA.
5. Wypreparować plazmid z nocnej hodowli zweryfikowanej sekwencyjnie kolonii i przekształcić do preferowanego szczepu ekspresyjnego (w oryginalnej metodzie zastosowano E. coli Rosetta (DE3), zawierający plazmid pRARE w celu zwiększenia produkcji białek kodowanych przez geny ludzkie).

2. Ekspresja białka

1. Zaszczep pojedynczą kolonię bakterii do 10 ml bulionu sojowego z trypsyną z dodatkiem 5 g/l ekstraktu drożdżowego i odpowiednich antybiotyków. Inkubować przy 150 rpm w temperaturze 37 °C przez noc.
2. Zaszczep 1 ml nocnej kultury do 100 ml świeżego medium i indukowanie ekspresję białka (pierwotnie 1 mM izopropyl-β-D-tiogalaktosyd w przypadku wykorzystania operonu lac), gdy komórki osiągną logarytmiczną fazę wzrostu.
3. Inkubować przy 150 rpm w temperaturze 25 °C przez noc, a następnie zebrać komórki poprzez wirowanie.

3. Ortogonalna puryfikacja powinowactwem

1. Resuspender osad w 25 ml buforu do prowadzenia (25 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,05 % (w/v) Tween 20, pH 8,0) i rozbić komórki poprzez sonikację przy amplitudzie 60 % i impulsach 1,0/1,0 przez 3 min. Odwirować próbkę i przefiltrować supernatant zawierający białko docelowe (0,45 μm) przed dalszym oczyszczaniem.
2. Równoważyć kolumnę HSA Sepharose o pojemności 1 ml lub kolumnę aktywowaną NHS, wcześniej sprzężoną z HSA zgodnie z zaleceniami dostawcy, za pomocą 10 objętości kolumny (CV) buforu do prowadzenia przy przepływie 1 ml/min w odpowiednim systemie do oczyszczania białek. Nałożyć lizat bakteryjny przy przepływie 0,5 ml/min, a następnie przywrócić prędkość przepływu do 1 ml/min.
3. Płukać kolumnę 5 CV buforu do prowadzenia, a następnie 5 CV buforu płuczącego (5 mM NH₄Ac, pH 5,5).
4. Eluować próbkę buforem elucyjnym (0,5 M HAc, pH 2,5) przy przepływie 1 ml/min i zbierać frakcje, monitorując absorbancję przy 280 nm w celu wyboru frakcji z piku elucyjnego do dalszego oczyszczania.
5. Połączyć frakcje o najwyższym stężeniu białka, rozcieńczyć dwukrotnie w buforze do prowadzenia SuRe (20 mM fosforan, 150 mM NaCl, pH 7,2) i upewnić się, że pH jest zbliżone do obojętnego. W razie potrzeby dodać 1 M Tris-HCl pH 8, aby zwiększyć pH.
6. Nałożyć próbkę przy przepływie 0,5 ml/min na kolumnę HiTrap MabSelect SuRe o pojemności 1 ml, która została zrównoważona 10 CV buforu do prowadzenia SuRe przy przepływie 1 ml/min. Po nałożeniu próbki przywrócić prędkość przepływu do 1 ml/min.
7. Płukać kolumnę 5 CV buforu do prowadzenia SuRe (krok 5) i eluować białka za pomocą 0,2 M HAc, pH 2,7. W przypadku wrażliwych białek docelowych eluat można neutralizować bezpośrednio po zebraniu poprzez dodanie Tris-HCl.

Jeśli kroki chromatograficzne zostaną odwrócone, eluat z kolumny MabSelect SuRe można rozcieńczyć w buforze roboczym (krok 3.1), a pH podnieść do około 8 poprzez dodanie 1 M Tris-HCl. Co do zasady, przy zastosowaniu macierzy SuRe w drugim kroku obserwuje się węższe piki.

4. Ocena czystości za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE)

1. Naniesieniu oczyszczone frakcje na redukujące SDS-PAGE i, w razie potrzeby, przeanalizuj masę cząsteczkową oczyszczonego produktu za pomocą spektrometrii mas. Ważne jest całkowite zredukowanie próbki, ponieważ wolna cysteina w ABDz1 może powodować dimeryzację produktu w warunkach nieredukujących.

5. Reprezentatywne wyniki:

W ramach dowodu koncepcji oceniono ortogonalne oczyszczanie powinowactwa wspomagane znacznikiem ABDz1 dla trzech ludzkich białek docelowych, reprezentujących różne klasy rozpuszczalności, masy cząsteczkowe i punkty izoelektryczne (Tabela 1). Gen ABDz1 połączono genetycznie z genami docelowymi, a konstrukcje wyeksponowano w E. coli; Rysunek 2 przedstawia schemat blokowy wszystkich kolejnych etapów metody. Po oczyszczeniu zgodnie z protokołem ortogonalnym próbki pobrane w różnych punktach przeanalizowano metodą SDS-PAGE (Rysunek 3). Wyniki wyraźnie wykazują użyteczność podwójnego znacznika i dwóch wysoce specyficznych etapów oczyszczania. Choć, jak wynika z żeli, po pierwszym etapie oczyszczania uzyskano zadowalającą czystość, kolejny etap pozwala otrzymać bardzo czysty produkt, odpowiedni do zastosowań o wysokich wymaganiach.

Rysunek 1. Projekt biblioteki kombinatorycznej wykorzystanej do selekcji bispecyficznego tagu ABDz1.
46-aminokwasowa domena wiążąca albuminy zwija się w stabilny wiązek trzech helis i zawiera miejsce wiązania albuminy surowicy ludzkiej zlokalizowane głównie w drugiej helisie. Poprzez genetyczną randomizację jedenastu aminokwasów eksponowanych na powierzchni, zlokalizowanych w pierwszej i trzeciej helisie, zaprojektowano nową powierzchnię wiążącą. Jedenaste pozycji jest wskazane na rysunku i ponumerowane zgodnie z Kraulis et al.⁹ . Po przeprowadzeniu biopanningu przeciwko dimerowi domeny Z białka A gronkowca przy użyciu biblioteki kombinatorycznej eksprymowanej na fagach, zidentyfikowano bispecyficzną cząsteczkę ABDz1.

Rysunek 2. Uproszczony schemat blokowy protokołu ortogonalnego oczyszczania powinowactwem.
Fragment PCR zawierający sekwencję ABDz1 jest ligowany (na końcu N) z genem docelowym w odpowiednim wektorze ekspresyjnym. Produkt ligacji jest transformowany do E. coli w celu weryfikacji sekwencji i przygotowania plazmidu. Po transformacji do gospodarza ekspresyjnego, z początkowej kultury nocnej przygotowywana jest wielkoskalowa hodowla do ekspresji białka rekombinowanego. Bakterie są zbierane przez wirowanie i lizowane za pomocą sonikacji w celu uzyskania lizatu bakteryjnego zawierającego białko docelowe. Po etapie filtracji w celu usunięcia pozostałych cząsteczek stałych, lizat poddawany jest ortogonalnemu oczyszczaniu powinowactwem w systemie do obsługi cieczy poprzez dwa następujące po sobie etapy oczyszczania. Szczyty elucji z obu etapów oczyszczania są pobierane i analizowane za pomocą SDS-PAGE w celu oceny czystości oraz porównywane z lizatem przed oczyszczaniem.

Rycina 3. Analiza SDS-PAGE białek docelowych ekspresowanych i oczyszczanych w fuzji z ABDz1.
Próbki pobrane z lizatu bakteryjnego trzech białek ekspresowanych w fuzji z ABDz1, reprezentujących różne właściwości, oraz samej etykiety ABDz1 zostały zebrane wraz z próbkami z odpowiadających im pików po oczyszczaniu na kolumnie HSA, a następnie na kolumnie MabSelect SuRe (A). Ścieżki 1-4 reprezentują próbki z lizatów przed oczyszczaniem, ścieżki 5-8 z oczyszczania na HSA (pierwszy etap), a ścieżki 9-12 z oczyszczania na MabSelect SuRe (drugi etap). Próbki naniesiono w następującej kolejności: ABDz1-141377, ABDz1-HT875, ABDz1-HT2375 oraz ABDz1. Dodatkowo przeanalizowano próbki pobrane z tych samych lizatów, oczyszczane w odwrotnej kolejności na tych samych kolumnach (B). Ścieżki 1-3 reprezentują próbki z lizatów przed oczyszczaniem, ścieżki 4-6 z oczyszczania na MabSelect SuRe (pierwszy etap), a ścieżki 7-9 z oczyszczania na HSA (drugi etap). Próbki naniesiono w tej samej kolejności co w (A), jednak bez samej etykiety. Z tych wyników jasno wynika, że ta dwuetapowa metoda pozwala uzyskać białka o wysokim stopniu czystości, niezależnie od kolejności stosowania poszczególnych etapów.

Nazwab	Białko docelowe Uniprotc	Masa molekularna (kDa)	Klasa rozpuszczalnościd	Masa molekularna produktu fuzyjnego (kDa)	Punkt izoelektryczny produktu fuzyjnego
141377	B7Z315	17.4	4	23.7	8.5
HT875	P01040	10.8	3	17.1	4.9
HT2375	P00740	8.9	5	15.2	6.8

1. Masa cząsteczkowa samego znacznika ABDz1 wynosi 6.3 kDa, a punkt izoelektryczny 6.7.
2. Białko docelowe stanowi fragment białka z bazy Uniprot.
3. http://www.uniprot.org.
4. Klasa rozpuszczalności fragmentu białka z N-końcowym His₆ABP¹⁰.

Tabela 1. Białka docelowe i produkty fuzji z tagiem ABDz1^a ocenione w badaniu potwierdzającym zasadę działania.

Do ekspresji i oczyszczania metodą ortogonalnego powinowactwa wybrano trzy unikalne białka ludzkie o różnej masie cząsteczkowej, rozpuszczalności i punkcie izoelektrycznym.

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół ortogonalnego oczyszczania powinowactwa umożliwia efektywne oczyszczanie szerokiego zakresu białek docelowych. Poprzez połączenie wrodzonego miejsca wiązania domeny wiążącej albuminy z nową powierzchnią wiążącą opracowano niewielki bispecyficzny znacznik białkowy. Wykorzystanie tego znacznika jest bardzo proste, ponieważ można go po prostu sklonować i wyexprymować w fuzji z dowolnym białkiem zainteresowania w dowolnym preferowanym wektorze ekspresyjnym. Do dwuetapowego oczyszczania białek można wykorzystać standardowy sprzęt dostępny w większości laboratoriów. Ponieważ funkcja znacznika ABDz1 zależy od prawidłowego fałdowania domeny w celu efektywnego wyeksponowania obu powierzchni wiążących, metoda ta ogranicza się do białek eksprymowanych w formie rozpuszczalnej i nie nadaje się do oczyszczania w warunkach denaturujących. Należy również unikać środków redukujących, ponieważ zakłócają one wiązanie ABDz1 z domeną Z na matrycy MabSelect SuRe.

Ortogonalna oczyszczanie powinowactwem stanowi przydatną alternatywę dla tradycyjnych metod w celu zaspokojenia zapotrzebowania na wysoką czystość białek w wielu wymagających zastosowaniach. Jednocześnie metoda ta eliminuje konieczność stosowania tagowania kombinatorycznego, gdy kolejne strategie oczyszczania są używane sekwencyjnie. W zastosowaniach wymagających natywnego białka docelowego można wprowadzić miejsce cięcia proteazy, aby umożliwić enzymatyczne usunięcie tagu ABDz1¹¹. Ponadto tag ABDz1 jest pierwszą opisaną do tej pory bispecyficzną, małą i pofałdowaną domeną białkową. Jest on wyjątkowy, ponieważ zapewnia strategię oczyszczania opartą na dwóch specyficznych oddziaływaniach powinowactwa do celu. W przyszłości interesujące byłoby rozwinięcie tej koncepcji poprzez opracowanie nowych tagów bispecyficznych z nowymi powierzchniami wiążącymi, które byłyby kompatybilne z łatwo dostępnymi i niedrogimi żywicami chromatograficznymi. Na przykład poprzez zastąpienie aminokwasów zaangażowanych w wiązanie z albuminą resztami zasadowymi można uzyskać tag kompatybilny z chromatografią wymiany jonowej. Podobna koncepcja okazała się skuteczna w przypadku inżynierii ładunku domeny Z w celu wygenerowania tagów znanych jako Z_acid¹² oraz Z_basic¹³, które są odpowiednio kompatybilne z wymianą anionową i kationową.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
*E. coli* RR1ΔM15	American Type Culture Collection	35102
*E. coli* Rosetta (DE3)	Novagen, EMD Millipore	70954
Bulion sojowo-kazeinowy	Difco Laboratories	211822
Ekstrakt z drożdży	Difco Laboratories	212720
Sonikator do komórek Vibra cell	Sonics and Materials, Inc.	-
HSA Sepharose	Pharmacia Corporation (Pfizer)	Poprzedni produkt
HiTrap MabSelect SuRe	GE Healthcare	11-0034-93
kolumna HiTrap NHS-activated HP	GE Healthcare	17-0716-01