Neurony powstałe w wieku dorosłym wykazujące ekspresję ChR2 mogą być manipulowane w preparatach elektrofizjologicznych w plastrach tkankowych w celu zbadania ich wkładu w funkcjonowanie węchowych obwodów neuronalnych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykorzystanie przystępnych cenowo mat LED do fotostymulacji neuronów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Standardowa elektrofizjologia preparatów skrawkowych pozwoliła badaczom na analizę poszczególnych komponentów obwodów neuronalnych poprzez rejestrację odpowiedzi elektrycznych pojedynczych komórek w odpowiedzi na manipulacje elektryczne lub farmakologiczne1,2. Dzięki opracowaniu metod optycznej kontroli genetycznie ukierunkowanych neuronów (optogenetyka), badacze dysponują obecnie bezprecedensowym poziomem kontroli nad konkretnymi grupami neuronów w standardowym preparacie skrawkowym. W szczególności światłoczuła kanałorodopsyna-2 (ChR2) umożliwia aktywację neuronów za pomocą światła3,4. Łącząc staranną kalibrację fotostymulacji ChR2 opartej na diodach LED ze standardową elektrofizjologią skrawków, jesteśmy w stanie z większą szczegółowością zbadać rolę interneuronów powstałych w wieku dorosłym w opuszce węchowej, która stanowi pierwszy centralny przekaźnik systemu węchowego. Wykorzystując ekspresję wirusową ChR2-YFP specyficznie w neuronach powstałych w wieku dorosłym, możemy selektywnie kontrolować młode neurony powstałe w wieku dorosłym w otoczeniu neuronów starszych i dojrzałych. Nasza kontrola optyczna wykorzystuje prosty i niedrogi system LED; pokazujemy, w jaki sposób system ten można skalibrować, aby określić ilość światła niezbędną do wywołania aktywności impulsowej w pojedynczych neuronach. W ten sposób krótkie błyski niebieskiego światła mogą zdalnie sterować wzorcem wyładowań nowo powstałych komórek transdukowanych ChR2.
Protokół
1. Kalibracja optyczna: Pomiar mocy diod LED
- Przymocuj matrycę LED do radiatora aktywnie chłodzonego wentylatorem, a następnie połącz ten zestaw LED/radiator z soczewką kolimującą.
- Zastąp lampę używaną w oświetleniu w jasnym polu zestawem LED/radiator/wentylator/soczewka. Aparaturę tę należy starannie ustawić tak, aby skolimowana wiązka LED biegła wzdłuż prostej ścieżki optycznej w stronę soczewki kondensora. Upewnij się, że radiator/wentylator jest prawidłowo uziemiony do wspólnej masy systemu.
- Zasilaj matrycę LED za pomocą zasilacza zdolnego do generowania szybkich, prostokątnych impulsów prądu. Zasilacz ten może być sterowany impulsem 5V TTL pochodzącym z generatora impulsów.
- Wycentruj skolimowaną wiązkę wzdłuż ścieżki świetlnej zdefiniowanej pomiędzy przysłoną pola a soczewką kondensora. W idealnym przypadku wiązka LED powinna lekko przekraczać obszar w pełni otwartej przysłony pola. Zazwyczaj silniej skolimowana wiązka LED wypełnia tę aperturę w mniejszym stopniu i generuje większą moc kosztem jednorodności. W naszej konfiguracji zwiększyliśmy jednorodność światła, wybierając soczewkę kolimującą, która rzutowała lekko powiększony obraz matrycy LED na jej płaszczyznę sprzężoną przy przysłonie kondensora.
- Uzyskaj oświetlenie Koehlera, ustawiając ostrość kondensora tak, aby obraz przysłony pola (przysłony położonej najbliżej źródła światła) był ogniskowany na komorze z plastrem (rys. 1). Cienki arkusz papieru do soczewek może służyć jako ekran projekcyjny do wizualizacji ogniskowanego obrazu przysłony pola na innych głębokościach.
- Wywierć w nieprzezroczystym materiale serię otworów zwanych pinholes o znanej średnicy. Umieść jeden z tych małych otworów nad sensorem optycznego watomierza. Umieść watomierz na stoliku z preparatem i wycentruj go nad ogniskowanym obrazem przysłony pola, przesuwając urządzenie do momentu uzyskania maksymalnego odczytu. Przymocuj watomierz w tej pozycji.
- W pełni otwórz wszystkie apertury (przysłonę apertury i przysłonę pola). Systematycznie przesuwaj przymocowaną komorę z plastrem/watomierz względem optycznej ścieżki światła i oblicz jednorodność mocy optycznej w obrębie obszaru oświetlonego. Sporządź wykres jednorodności dla swojego systemu. Jeśli mikroskop jest prawidłowo ustawiony z oświetleniem Koehlera wycentrowanym w ognisku obiektywu, maksymalna moc powinna znajdować się bezpośrednio pod obiektywem, a obszary poza tym ogniskiem powinny otrzymywać znaną ilość mocy zgodnie z wykresem jednorodności.
- Dla każdego rozmiaru otworu sporządź krzywą wzorcową mocy optycznej w funkcji powierzchni otworu. Regulując prąd wejściowy matrycy LED, wygeneruj tę krzywą dla wielu poziomów mocy, a z każdej krzywej oblicz moc na mm2. Jeśli matryca LED ma być używana do oświetlenia podczas patchingu, upewnij się, że wprowadziłeś elementy optyczne niezbędne do patchingu (kondensory, otwory pinhole i filtry), aby wiedzieć, ile światła jest transmitowane podczas oświetlenia patchingu.
- Odwracając watomierz w stronę obiektywu, oblicz natężenie oświetlenia przy 470nm po włączeniu lampy rtęciowej.
- Włóż żywy plaster do komory i ponownie sporządź krzywe wzorcowe, aby określić moc światła transmitowaną przez rozpraszającą tkankę mózgową.
2. Procedura krojenia i elektrofizjologia
Część A: Przygotowanie skrawków
- Zanurz mysz w narkozie (60 mg/kg ketaminy i 2 mg/kg ksylazyny), a następnie dokonaj dekapitacji. Wypreparuj mózg w sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym (ACSF, w mM: 124 NaCl, 3 KCl, 1,3 MgSO4, 26 NaHCO3, 1,25 NaHPO4, 20 glukozy, 2 CaCl2; ~310 mOsm, pH 7,4 podczas napowietrzania mieszaniną 95% O2 i 5% CO25,1), dbając o to, aby nie uszkodzić opuszek węchowych. Rozdziel obie półkule i umieść je na agarze tak, aby powierzchnia brzuszna była wyrównana z krawędzią (w przypadku przekrojów poziomych).
- Przyklej agar oraz powierzchnię grzbietową każdej półkuli kory do uchwytu wibratomu i powoli napełnij wannę lodowatym ACSF. Wykonuj przekroje od strony brzusznej o grubości 300 μm, przenosząc każdy przekrój do ogrzanego (34-36°C) i napowietrzonego ACSF, aby umożliwić im regenerację przez 30-45 minut.
Część B: Pomiar progu wyzwalania potencjału czynnościowego metodą loose-patch
- Po pozostawieniu plastrów w temperaturze pokojowej przez 30 minut, delikatnie umieść plaster w komorze rejestracyjnej mikroskopu przy stałej perfuzji natlenionym ACSF.
Aby uniknąć nadmiernej stymulacji neuronów zakażonych ChR2, obecność EYFP-ChR2 można potwierdzić w trybie epifluorescencji (ryc. 2a) - Wytwórz szklane elektrody za pomocą wyciągarki do pipet (Sutter P-97). Napełnij elektrodę ACSF. Po umieszczeniu w kąpieli ACSF rezystancja końcówki powinna wynosić od 7-10 MOhms.
- W oświetleniu fluorescencyjnym zlokalizuj w plastrze zdrowy neuron ChR2-EYFP o dojrzałej morfologii. Zlokalizuj również somę tego neuronu w optyce do patch-clampu.
- Podając lekkie nadciśnienie przez końcówkę elektrody, opuść elektrodę patch w kierunku zidentyfikowanego fluorescencyjnego neuronu. W momencie kontaktu z błoną szybko zwolnij nadciśnienie i zastosuj krótkie, niewielkie podciśnienie przez końcówkę. Pomiędzy błoną plazmatyczną a ściankami elektrody patch powinno wytworzyć się uszczelnienie gigaohmowe (giga-seal).
- Nawet jeśli nie powstanie giga-seal, jeżeli elektroda znajduje się wystarczająco blisko fluorescencyjnego neuronu, aktywność impulsacyjna powinna wywołać mierzalny lokalny potencjał polowy. Aktywuj ChR2 w tym neuronie, stosując błyski światła o różnych dawkach. Ponieważ dawka światła jest funkcją zarówno mocy LED, jak i czasu trwania, oblicz, ile światła jest niezbędne do wywołania potencjału czynnościowego przy różnych mocach i czasach trwania (ryc. 2b). Obserwuj również intensywność impulsowania podczas oświetlania lampą rtęciową.
3. Reprezentatywne wyniki:
W naszym mikroskopie (Olympus BX51WI) dioda LED znajduje się w jednej linii z dwiema przysłonami i soczewką kondensora, co pozwala zachować oryginalną drogę światła zamontowanej fabrycznie lampy łukowej. Poprzez zamknięcie zarówno przysłony polowej, jak i przysłony apertury, możemy uzyskać kontrast pola jasnego wystarczający do rejestracji patch-clamp (rys. 1b). Przy całkowicie otwartych przysłonach wystawiamy skrawek na maksymalną moc światła w celu aktywacji channelropsyny (rys. 1a). W naszym mikroskopie taka konfiguracja patchingu generuje gęstość światła o około trzy rzędy wielkości niższą niż maksymalna gęstość pełnego pola (4.1 μW/mm2 w porównaniu do 6.88 mW/mm2).
Obserwujemy silne znakowanie nowo powstałych w dorosłym organizmie neuronów ziarnistych i periglomerularnych opuszki węchowej kilka tygodni po infekcji lentiwirusowej migrujących neuroblastów w rostralnym strumieniu migracyjnym (ryc. 2a). Rejestracja metodą loose-patch z pojedynczej, nowo powstałej w dorosłym organizmie komórki ziarnistej wykazującej ekspresję ChR2-EYFP wskazuje, że stymulacja trwająca 5 ms przy maksymalnej mocy (6,88 mW/mm2) jest wystarczająca do wywołania potencjałów czynnościowych (ryc. 2b). Ponieważ poziom ekspresji różni się między komórkami, ilość światła przekraczająca próg generowania impulsu będzie zróżnicowana i powinna zostać opisana statystycznie dla każdego badanego typu komórek.
Rycina 1. Układ matrycy LED do pełnopolowej fotostymulacji i elektrofizjologii plastrów metodą patch-clamp. Aby aktywować channelrodozynę (ChR2), rzutujemy skolimowany promień przez otwarte przysłony tylne i optykę kondensora (a). Konfigurację tę można zmienić w optykę do patchowania o wysokim kontraście poprzez całkowite zamknięcie przysłony pola i modulację szerokości przysłony pola (b). Skróty: a. wentylator, b. radiator, c. matryca LED, d. soczewka kolimująca, e. lustro, f. przysłona pola, g. przysłona apertury, h. soczewka kondensora, i. stolik z próbką, j. obiektyw.
Rycina 2. Obraz poziomego skrawka cebulki węchowej o grubości 300μm do rejestracji patch-clamp i fotostymulacji całopolowej (a). Widoczne są zainfekowane lentiwirusowo komórki ziarniste powstałe w wieku dorosłym, wykazujące ekspresję ChR2-EYFP, promieniujące z centrum cebulki węchowej. Dawkę światła wymaganą do wywołania potencjałów czynnościowych można wyznaczyć, zwiększając czas trwania błysku diody LED (b). Próg dla tej komórki ziarnistej wynosił 5ms przy pełnej intensywności LED (2,43mW/mm2). Skala w (a) = 500μm, skala w (b) = 50ms.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W ostatnich latach nastąpił gwałtowny wzrost popularności narzędzi optogenetycznych w badaniach nad neuronauką6. W związku z tym coraz ważniejsze staje się obniżenie bariery wejścia dla laboratoriów pragnących rozpocząć korzystanie z tych nowych narzędzi. W niniejszej pracy opisujemy, jak przeprowadzić prostą i niskokosztową modernizację oraz kalibrację konwencjonalnego zestawu do techniki patch-clamp, aby umożliwić pełnopolową stymulację optyczną neuronów wykazujących ekspresję channelrhodopsyny. W szczególno...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez firmę ubezpieczeniową na życie „AG2R-La-Mondiale”, Ecole des Neurosciences de Paris (ENP), Agence Nationale de la Recherche „ANR-09-NEUR-004” w ramach „ERA-NET NEURON” programu FP7 Komisji Europejskiej oraz Fundację Pasteura. Sebastien Wagner otrzymał wsparcie z Fundacji Letten.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Ketamina | Imalgène 1000 | 100 mg/ml | |
| Ksylazyna | Rompun | 2% | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | &nbps; |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| NaHPO4 | Sigma-Aldrich | S5011 | |
| Glukoza | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Agaroza | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Wytwornica pipet | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Kapilary szklane | Harvard Apparatus | GC150T-10 | 1,5 mm O.D./1,17 mm I.D. |
| Matryca LED | Bridgelux | BXRA-C2000 | |
| Soczewka kolimująca | Thorlabs Inc. | LEDC1 | średnica wiązki 40 mm |
| Zasilacz | A1W Electronik | HKO2800 | 2,8 A |
| Optyczny miernik mocy | Thorlabs Inc. | PM 100 | |
| Radiator | Thermaltake | A1838 | Silent Boost K8 |
| Wentylator | Thermaltake | A1838 | Silent Boost K8 |
| Wibratom | Leica Microsystems | VT1200S |
Bibliografia
- Nissant, A. Adult neurogenesis promotes synaptic plasticity in the olfactory bulb. Nature Neuroscience. 12, 728-730 (2009).
- Apicella, A. Pyramidal Cells in Piriform Cortex Receive Convergent Input from Distinct Olfactory Bulb Glomeruli. Journal of Neuroscience. 30, 14255-14260 (2010).
- Boyden, E. S. genetically targeted optical control of neural activity. Nature. 8, 1263-1263 (2005).
- Bardy, C. where new inhibitory neurons release neurotransmitters in the adult olfactory bulb. The Journal of Neuroscience. 30, 17023-17034 (2010).
- Grubb, M. S. Functional maturation of the first synapse in olfaction: development and adult neurogenesis. The Journal of neuroscience. 28, 2919-2932 (2008).
- Zhang, F. Circuit-breakers: optical technologies for probing neural signals and systems. Nature reviews. Neuroscience. 8, 577-581 (2007).
- Grossman, N. Multi-site optical excitation using ChR2 and micro-LED array. Journal of neural engineering. 7, 16004-16004 (2010).
- Dhawale, A. K. Non-redundant odor coding by sister mitral cells revealed by light addressable glomeruli in the mouse. Nature neuroscience. 13, 1404-1412 (2010).
- Weick, J. P. Functional control of transplantable human ESC-derived neurons via optogenetic targeting. Stem cells. 28, 2008-2016 (2010).
- Toni, N. Neurons born in the adult dentate gyrus form functional synapses with target cells. Nature Neuroscience. 11, 901-907 (2008).
- Grubb, M. S., Burrone, J. Channelrhodopsin-2 Localised to the Axon Initial Segment. PLoS ONE. 5, e13761-e13761 Forthcoming.
- Tye, K. M. Amygdala circuitry mediating reversible and bidirectional control of anxiety. Nature. 471, 358-362 (2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
