Neurony powstałe w wieku dorosłym w opalfaktorycznej cebulce mogą być kontrolowane optogenetycznie poprzez wstrzyknięcie lentiwirusa wykazującego ekspresję Channelrhodopsin2 do przedniego strumienia migracyjnego oraz przewlekłą fotostymulację za pomocą wszczepionej miniaturowej diody LED.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Selektywna transdukcja wirusowa neuronów węchowych pochodzenia dorosłego w celu chronicznej optogenetycznej stymulacji in vivo
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Lokalne interneurony są stale regenerowane w opuszce węchowej dorosłych gryzoni1-3. W procesie tym, zwanym neurogenezą u osobników dorosłych, komórki macierzyste neuronów w ścianach komory bocznej dają początek neuroblastom, które migrują przez kilka milimetrów wzdłuż rostralnego strumienia migracyjnego (RMS), aby dotrzeć do opuszki węchowej i zostać w niej włączone. Aby zbadać poszczególne etapy oraz wpływ integracji nowo powstałych neuronów w istniejące obwody węchowe, konieczne jest selektywne znakowanie i manipulowanie aktywnością tej specyficznej populacji neuronów. Niedawny rozwój technologii optogenetycznych stwarza możliwość wykorzystania światła do precyzyjnej aktywacji tej konkretnej kohorty neuronów bez wpływania na neurony otaczające4,5. W niniejszej pracy przedstawiamy serię procedur pozwalających na wirusową ekspresję Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP w kohorcie neuroblastów w RMS ograniczonych czasowo, zanim dotrą one do opuszki węchowej i staną się neuronami powstałymi u osobników dorosłych. Dodatkowo pokazujemy, jak implantować i kalibrować miniaturową diodę LED do chronicznej stymulacji in vivo neuronów wykazujących ekspresję ChR2.
Protokół
1. Iniekcje stereotaksyczne
- Wirus użyty w tych eksperymentach to pozbawiony zdolności do replikacji wektor lentiwirusowy oparty na wirusie HIV, służący do ekspresji konstruktu fuzyjnego Channelrhodopsine2-YFP (żółtego białka fluorescencyjnego) pod kontrolą promotora synapsyny6. Plazmid został hojnie udostępniony przez grupę badawczą K. Deisserotha (http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/index.html). Lentiwirusy można pozyskać z komercyjnych źródeł lub wyprodukować w laboratorium zgodnie z ustalonymi protokołami7. Średnie miana wektora wynosiły rzędu 1010 jednostek transdukcyjnych/ml. Alikwoty wirusa przechowuje się w temperaturze -80°C i należy je rozmrozić tuż przed napełnieniem pipety. Należy unikać wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania. Nigdy nie wystawiać roztworu wirusa bezpośrednio na działanie suchego lodu.
- Przygotować pipety szklane, wykorzystując kapilary z borokrzemianowego szkła w standardowym wyciągaczu do pipet (Sutter P-97 pipette puller). Ustawienia wyciągania powinny być odpowiednio skalibrowane, aby uzyskać długą i sztywną pipetę. Następnie odciąć końcówkę pipety za pomocą nożyczek, aby uzyskać średnicę otworu wynoszącą 30-40 μm. Wyciągnięte pipety przechowywać w pudełku wolnym od kurzu.
- Skonfigurować mikroinkektor Nanoject II zgodnie z instrukcjami producenta w celu podawania 50 nL. Przygotować pipetę do iniekcji, napełniając ją od tyłu olejem mineralnym, a następnie włożyć ją w tłok mikroinkektora. Przymocować mikroinkektor do ramy stereotaktycznej. Częściowo opróżnić olej z szklanej pipety przed napełnieniem jej roztworem wirusa.
- Za pomocą mikropipety przenieść 2 μl roztworu wirusa na sterylny fragment Parafilmu. Ostrożnie zanurzyć szklaną pipetę w kropli roztworu wirusa i napełnić ją ilością 1-2 μl. Upewnić się, że w pipecie nie ma pęcherzyków powietrza.
- Zanestetyzować mysz przy użyciu 100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny, rozcieńczonych w sterylnym roztworze soli fizjologicznej. Usunąć sierść ze skóry głowy zwierzęcia za pomocą trymiera dla gryzoni, brzytwy, nożyczek lub chemicznego środka do depilacji. Zdezynfekować skórę głowy, trzykrotnie aplikując naprzemiennie 70% etanol i betadynę. Wszystkie instrumenty chirurgiczne powinny zostać poddane autoklawowaniu, a następnie zdezynfekowane 70% etanolem. Umieścić zwierzę w ramie stereotaktycznej z prętami usznymi i prętem nosowym, upewniając się, że głowa jest stabilnie unieruchomiona. Nałożyć maść do oczu, aby zapobiec wysychaniu rogówek.
- Skalpelem naciąć skórę głowy od miejsca między oczami do miejsca między uszami. Odsunąć skórę, aby odsłonić czaszkę, i przymocować ją klamrami. Oczyścić powierzchnię czaszki. Aparaturę stereotaktyczną zeruje się, ustawiając końcówkę szklanej pipety w punkcie bregma. Następnie końcówkę ustawia się w miejscu iniekcji (Antero-Posterior, 3.30; Medio-Lateral, ±0.82, odpowiednio dla prawej i lewej półkuli). Położenie pręta nosowego musi zostać dostosowane zgodnie z obliczeniami współrzędnych stereotaktycznych. W naszym eksperymencie pręt nosowy jest regulowany do momentu, aż punkt bregma i miejsce iniekcji znajdą się na tej samej wysokości.
- Zidentyfikować miejsce iniekcji. Za pomocą chirurgicznej wiertarki wysokich obrotów ostrożnie wywiercić otwory w czaszce. Przy użyciu zagiętej igły strzykawki z haczykiem na końcówce usunąć pozostałości cienkiej kości, aby odsłonić oponę twardą. Sprawdzić, czy otwór znajduje się dokładnie w odpowiedniej pozycji. Podczas wiercenia uważać, aby nie uszkodzić naczyń krwionośnych na powierzchni mózgu. W przypadku przerwania naczyń krwionośnych, delikatnie docisnąć powierzchnię mózgu małym patyczkiem bawełnianym lub chusteczką przez kilka sekund, aż krwawienie ustanie.
- Obniżyć pipetę i wyzerować wysokość Dorso-Ventral w momencie, gdy końcówka pipety dotknie powierzchni mózgu. Następnie obniżyć ją do odpowiedniej głębokości Dorso-Ventral (Dorso-Ventral, 2.9 od powierzchni mózgu) i odczekać 30 sekund w celu wyrównania ciśnień. Wstrzyknąć 4 razy po 50 nl wirusa, co daje łącznie 200 nl. Odczekać 30 sekund między każdą iniekcją.
- Minutę po ostatniej iniekcji powoli wycofać pipetę. Powtórzyć kroki 1.6-1.8 dla drugiej półkuli. Wyjąć zwierzę z aparatu stereotaktycznego, oczyścić nacięcie i zszyć rozciętą skórę za pomocą nici chirurgicznych. Pozostawić zwierzę na podkładce grzewczej do czasu wybudzenia przed powrotem do klatki. Dodatkowo zwierzętom można podać niesteroidowy lek przeciwzapalny (np. karprofen 4mg/kg) bezpośrednio po zabiegu oraz 3 dni po operacji.
2. Przewlekła implantacja diod LED do optogenetycznej stymulacji in vivo w opuszce węchowej
- Zwierzęta, którym obustronnie wstrzyknięto cząstki lentiwirusowe, zostają następnie poddane chronicznej implantacji miniaturowej niebieskiej diody LED (Osram, LED CMS 4.6W blue). Przylutuj piny diody LED do żeńskiego miniaturowego złącza elektrycznego w taki sposób, aby złącze znajdowało się po przeciwnej stronie niż dioda. Sprawdź, czy nie występuje zwarcie elektryczne i zidentyfikuj pin dodatni oraz ujemny w złączu. Przetestuj diodę LED, podłączając ją za pomocą odpowiedniego kabla do kontrolera prądu dla diod LED.
- Aby zmierzyć i/lub ustawić bezwzględną moc świetlną diody LED, należy zamocować diodę na mikromanipulatorze i umieścić ją w bezpośrednim kontakcie z fotodetektorem miernika mocy o szczytowej intensywności światła przy 470 nm. W nieprzezroczystej płycie z PVC należy wywiercić otwór o średnicy 3 mm. Otwór ten należy przymocować do miernika mocy, a następnie wyznaczyć krzywą wzorcową zależności mocy optycznej od prądu wejściowego, aby obliczyć moc na mm².2.
- Aby zmierzyć propagację światła przez mózg, należy wyciąć bloki świeżej tkanki mózgowej o grubości 300, 500, 1000, 1500 oraz 2500 μm grubość w przedziale 0-4°C ACSF z wykorzystaniem wibrotomu14Umieść fragment czaszki z kraniotomią identyczną z tą wykonaną u żywych myszy pod diodą LED. Najpierw zmierz moc światła bez tkanki wycentrowanej nad diodą LED. Następnie umieść każdy blok tkanki pomiędzy diodą LED a fotodetektorem miernika mocy i zmierz moc. Wykreśl krzywą zależności od grubości tkanki. kontra względny ułamek transmisji, obliczany jako stosunek mocy zmierzonej przez tkankę do mocy zmierzonej bez tkanki.
- Zanurzyć mysz w narkozie, podając 100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny rozpuszczonych w jałowej soli fizjologicznej. Oczyścić i zdezynfekować diodę LED 70% etanolem. Usunąć owłosienie ze skóry głowy zwierzęcia, a następnie zdezynfekować ten obszar, trzykrotnie aplikując naprzemiennie 70% etanol i betadynę. Następnie umieścić zwierzę w uchwycie stereotaksycznym. Nałożyć maść do oczu, aby zapobiec wysychaniu rogówek. Przymocować łącznik do uchwytu stereotaksycznego. Położenie wspornika nosowego należy dostosować tak, aby powierzchnia czaszki nad opuszkiem węchowym była idealnie pozioma i równoległa do powierzchni miniaturowej diody LED.
- Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie skóry głowy od 3 mm przed oczami do 3 mm za uszami. Odsuń skórę i przymocuj ją za pomocą klamer. Zeskrob błony z powierzchni czaszki, używając żyletki. Oczyść i osusz czaszkę. Nałóż cienką warstwę kleju cyjanoakrylowego, aby umożliwić późniejszą adhezję akrylu dentystycznego.
- Za pomocą szybkowirującej wiertarki chirurgicznej wykonaj prostokątną kraniotomię (1 mm ku dołowi i 3 mm bocznie; wycentrowaną 5,1 mm ku dołowi, 0 mm bocznie od bregmy) nad opuszkami węchowymi. W tym celu ostrożnie cień czaszkę, aż pozostanie jedynie cienka warstwa kości. Pozostałą kość delikatnie usuń przy pomocy zgiętej igły strzykawki. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie przebić opony twardej i nie przerwać głównych naczyń krwionośnych znajdujących się między dwiema półkulami oraz na tylnej krawędzi opuszek węchowych. Nagromadzenie i krzepnięcie krwi na powierzchni mózgu uniemożliwia optymalną penetrację światła w głąb tkanki. Przepłucz miejsce kraniotomii oraz powierzchnię mózgu sterylnym roztworem soli fizjologicznej, a następnie osusz czaszkę.
- Przytwierdź miniaturową diodę LED do złącza. Umieść miniaturową diodę LED na górnej powierzchni opuszki węchowej. Główna oś miniaturowej diody LED powinna być równoległa do osi rostralno-kaudalnej myszy. Oczyść czaszkę sterylną solą fizjologiczną i osusz ją. Następnie przymocuj diodę LED do czaszki za pomocą pierwszej warstwy akrylu (t.j., cement polikarboksylanowy), a następnie nanosi się drugą warstwę akrylu dentystycznego. W celu unieruchomienia diody LED może być wymagane dodanie dwóch małych śrub. Śruby należy wkręcić w czaszkę (za pozycją diody LED) i pokryć obiema warstwami akrylu. Gdy akryl jest jeszcze w stanie ciekłym, należy odciągnąć i przykleić wolne brzegi skóry głowy do powierzchni akrylu dentystycznego. Należy zadbać o to, aby nie nanieść akrylu na złącze. Po utwardzeniu akrylu zwierzę należy wyjąć z aparatu stereotaktycznego i pozostawić do regeneracji na podkładce grzewczej przed powrotem do klatki. Zwierzęta pozostawia się w izolacji w klatkach w celu rekonwalescencji po zabiegu przez co najmniej siedem dni. Dodatkowo, bezpośrednio po operacji oraz 3 dni po jej zakończeniu można podać zwierzętom niesteroidowy lek przeciwzapalny o działaniu przeciwbólowym (np. Carprofen 4 mg/kg). Diody LED należy przetestować przed implantacją oraz po zakończeniu eksperymentów.
- Do przywiązania zwierzęcia do kontrolera prądu diody LED połączonego z generatorem impulsów (Master-8) służy lekki kabel elektryczny, który pozwala na kontrolowanie czasu i natężenia świecenia diody. Cienki kabel zapewnia pełną swobodę ruchów. Należy zwrócić uwagę na polaryzację złącza. Odwrócenie polaryzacji może doprowadzić do uszkodzenia diody LED.
3. Reprezentatywne wyniki:
ChR2-YFP ulega ekspresji w transdukowanych neuronach około 48 godzin po iniekcji i pozostaje stabilne przez kilka miesięcy7. Rycina 1 przedstawia reprezentatywny obraz przekroju strzałkowego zwierzęcia utrwalonego w paraformaldehydzie 15 dni po iniekcji. Należy zwrócić uwagę na gęste znakowanie oraz wielkość miejsca iniekcji w RMS. Liczne nowo powstałe komórki migrowały wzdłuż RMS, aby skolonizować różne warstwy opuszki węchowej (Ryc. 1). Białko fuzyjne jest eksponowane we wszystkich komponentach neuronu, w tym w somie, dendrytach i kolcach.
Implantacja miniaturowych diod LED umożliwia wielkoskalową i niedrogą stymulację optyczną szerokiego obszaru zainteresowania. Zwierzę jest połączone z kontrolerem LED lekkim kablem elektrycznym, który zapewnia pełną swobodę ruchów. Poprzez charakterystykę dyfuzji światła w tkance mózgowej oraz progu aktywacji ChR2, szacujemy, że aktywacja optyczna może zostać wywołana na głębokości ~2mm poniżej powierzchni diody LED (Rys. 2A). Aby monitorować funkcjonalną aktywację neuronów wykazujących ekspresję ChR2 in vivo, można przeanalizować ekspresję c-fos, markera aktywności neuronalnej, po powtarzającej się stymulacji światłem (Rys. 2B). Alternatywnie można przeprowadzić rejestrację elektrofizjologiczną in vitro neuronów wykazujących ekspresję ChR2 w połączeniu z ogniskową stymulacją światłem14. Wreszcie, celowane rejestracje metodą loose-patch z wykorzystaniem dwufotonowej mikroskopii były stosowane do badania funkcjonalnej aktywacji korowych neuronów wykazujących ekspresję ChR2 przy użyciu podobnych miniaturowych diod LED in vivo9.
Rysunek 1. Ekspresja ChR2-YFP po wstrzyknięciu lentiwirusa do rostralnego prądu migracyjnego. Reprezentatywne obrazy konfokalne przekrojów strzałkowych opuszki węchowej myszy 15 dni po wstrzyknięciach lentiwirusa do przedniego odcinka RMS. Zwróć uwagę na obecność rozproszonych nowo powstałych neuronów YFP migrujących z końca RMS do różnych warstw OB. Większość nowo powstałych komórek (95%) to komórki ziarniste, których ciała komórkowe znajdują się w warstwie ziarnistej (GCL), a dendryty tworzą drzewiaste rozgałęzienia w zewnętrznej warstwie splotowatej (EPL). Niewielka populacja nowo powstałych neuronów migruje do najbardziej powierzchownej warstwy OB, do warstwy kłębków (GL). Pasek skali, 100μmWstawka, duże powiększenie komórki ziarnistej noworodka, wykazujące ekspresję błonową ChR2-YFP w dendrytach oraz w kolcach. Pasek skali, 20μm.
Rysunek 2. Schemat implantacji LED na górnej części opłaty węchowej oraz wywołana światłem ekspresja c-fos w nowych komórkach ziarnistych wykazujących ekspresję ChR2-YFP.
A, Schematyczny rysunek implantowanej diody LED nad opłatami węchowymi.
B, Reprezentatywne obrazy konfokalne przedstawiające podwójnie znakowane komórki ziarniste ChR2-YFP+ c-fos+ jedną godzinę po stymulacji światłem opłaty węchowej. Ekspresję c-fos wykazano przy użyciu króliczego przeciwciała pierwszorzędowego przeciwko c-fos (Calbiochem, 1:5000) oraz przeciwciała drugorzędowego anty-króliczego koniugowanego z A568 (Invitrogen, 1:1000). Pasek skali, 10μm.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Narzędzia optogenetyczne zwiększyły w ostatnim czasie naszą kontrolę nad selektywnymi populacjami neuronów, w tym nad neuronami powstałymi w wieku dorosłym w układzie węchowym. W niniejszej pracy opisujemy sposób wykonania stereotaktycznego wstrzyknięcia wektora lentiwirusowego wykazującego ekspresję ChR2-YFP do konkretnej populacji neuronów powstałych w wieku dorosłym. Dzięki dokładnemu monitorowaniu okresu po wstrzyknięciu jesteśmy w stanie analizować i manipulować aktywnością grupy neuronów powstałych w wieku dorosłym...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez firmę ubezpieczeniową na życie „Novalis-Taitbout”, Ecole des Neurosciences de Paris (ENP), Agence Nationale de la Recherche „ANR-09-NEUR-004” w ramach projektu „ERA-NET NEURON” programu FP7 Komisji Europejskiej, „Foundation pour la Recherche Medicale”, Letten Foundation oraz Pasteur Foundation.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Ketamina | Merial | Imalgène 1000 | |
| Ksylyzyna | Bayer AG | Rompum 0,2% | |
| Wyciągarka do pipet | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Kapilary szklane (3.5") | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Mikrowtryskiwacz Nanoject II | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Szybkoobrotowe wiertło chirurgiczne | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| Stalowe wiertła mikrochirurgiczne o średnicy końcówki 0,7mm | Fine Science Tools | 19008-07 | |
| LED CMS niebieski 4,6 W | OSRAM | LBW5SN | |
| Konektor elektryczny żeński (2,54 mm) | Fisher Scientific | BL5.36Z | |
| Sterownik prądu dla LED (max: 1A) | A1W Electronik | HKO-KL50-1000 | |
| Generator impulsów | AMPI | Master-8 | |
| Optyczny miernik mocy | Thorlabs Inc. | PM100 | |
| Klej cyjanoakrylowy | Loctite | 454 | |
| Cement polikarboksylanowy (cement pierwszej warstwy) | Septodont | Selfast (#0068Q) | |
| Cement metakrylowy (cement drugiej warstwy) | GC International | Unifast Trad – Liquid (#339292) Unifast Trad – Powder (#339114) | |
| Karprofen | Pfizer Pharma GmbH | Rimadyl |
Bibliografia
- Lledo, P. M. Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).
- Alonso, M. Turning astrocytes from the rostral migratory stream into neurons: a role for the olfactory sensory organ. J. Neurosci. 28, 11089-11102 (2008).
- Mouret, A. Learning and survival of newly generated neurons: when time matters. J. Neurosci. 28, 11511-11516 (2008).
- Bardy, C. How, when, and where new inhibitory neurons release neurotransmitters in the adult olfactory bulb. J. Neurosci. 30, 17023-17034 (2010).
- Haubensak, W. Genetic dissection of an amygdala microcircuit that gates conditioned fear. Nature. 468, 270-276 (2010).
- Zhang, F. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446, 633-639 (2007).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus Production. J. Vis. Exp. (32), e1499-e1499 (2009).
- Cardin, J. A. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nature protocols. 5, 247-254 (2010).
- Huber, D. Sparse optical microstimulation in barrel cortex drives learned behaviour in freely moving mice. Nature. 451, 61-64 (2010).
- Arenkiel, B. R. In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2. Neuron. 54, 205-218 Forthcoming.
- Albeanu, D. F. LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy. PLoS ONE. 3, 2146-2146 (2008).
- Slotnick, B., Bodyak, N. Odor Discrimination and Odor Quality Perception in Rats with Disruption of Connections between the Olfactory Epithelium and Olfactory Bulbs. J. Neurosci. 22, 4205-4216 (2002).
- Gradinaru, V. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141, 154-165 (2010).
- Valley, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons. J. Vis. Exp. (57), e3379-e3379 (2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
