Wysokoprzepustowa krystalizacja białek błonowych metodą lipidową Bicelle

Summary

Bicele to mieszaniny lipidowo-amfifilowe, które utrzymują białka błonowe (MPs) w dwuwarstwie lipidowej, ale mają unikalne zachowanie fazowe, które ułatwia wysokoprzepustowe badania przesiewowe przez roboty krystalizacyjne. Technika ta z powodzeniem pozwoliła na wytworzenie szeregu struktur o wysokiej rozdzielczości, zarówno ze źródeł prokariotycznych, jak i eukariotycznych. Ten film opisuje protokoły generowania lipidowej mieszaniny bicellów, włączania MP do mieszaniny bicelle, ustawiania prób krystalizacji (zarówno ręcznie, jak i robotycznie) oraz zbierania kryształów z pożywki.

Abstract

Białka błonowe (MPs) odgrywają kluczową rolę w wielu procesach fizjologicznych, takich jak pompowanie określonych cząsteczek przez nieprzepuszczalną dwuwarstwę błony, która otacza wszystkie komórki i organelle. Zmiany w funkcjonowaniu MP skutkują wieloma chorobami i zaburzeniami u ludzi; W związku z tym dogłębne zrozumienie ich struktury pozostaje kluczowym celem badań biologicznych. Istotnym wyzwaniem pozostaje jednak określenie struktury MP, często wynikającego z ich hydrofobowości.

MP mają znaczne hydrofobowe regiony osadzone w dwuwarstwie. Detergenty są często używane do rozpuszczania tych białek z dwuwarstwy, tworząc micelę białkowo-detergentową, którą można następnie manipulować w podobny sposób, jak białkami rozpuszczalnymi. Tradycyjnie próby krystalizacji przebiegają przy użyciu mieszaniny białka i detergentu, ale często są one odporne na krystalizację lub wytwarzają kryształy o niskiej jakości. Problemy te wynikają z niezdolności detergentu do odpowiedniego naśladowania dwuwarstwy, co skutkuje słabą stabilnością i niejednorodnością. Ponadto detergent osłania hydrofobową powierzchnię MP, zmniejszając powierzchnię dostępną dla styków kryształowych. Aby obejść te wady, MPs mogą być krystalizowane w pożywkach lipidowych, co bardziej symuluje ich endogenne środowisko, a ostatnio stało się techniką de novo krystalizacji MP.

Lipidowa faza sześcienna (LCP) to trójwymiarowa dwuwarstwa lipidowa, przez którą przenika połączony system kanałów wodnych¹. Chociaż monooleina jest lipidem z wyboru, pokrewne lipidy, takie jak monopalmityoleina i monowakcenina, są również używane do wytwarzania LCP². MP są włączone do LCP, gdzie dyfundują w trzech wymiarach i zasilają jądra kryształów. Dużą zaletą LCP jest to, że białko pozostaje w bardziej natywnym środowisku, ale metoda ma szereg wad technicznych, w tym wysoką lepkość (wymagającą specjalistycznej aparatury) oraz trudności w wizualizacji i manipulacji kryształami^3,4. Ze względu na te trudności techniczne zastosowaliśmy inne podłoże lipidowe do krystalizacji - bicele^5,6 (ryc. 1). Dwucele to mieszaniny lipidowo-amfifilowe powstałe w wyniku zmieszania lipidu fosfatydylocholiny (DMPC) z amfifilem (CHAPSO) lub lipidem krótkołańcuchowym (DHPC). W obrębie każdego krążka bicelle cząsteczki lipidów wytwarzają dwuwarstwę, podczas gdy cząsteczki amfifilu wyściełają niebiegunowe krawędzie, zapewniając korzystne właściwości zarówno dwuwarstw, jak i detergentów. Co ważne, poniżej temperatury przejścia, mieszaniny białkowo-bikielowe mają obniżoną lepkość i są manipulowane w podobny sposób jak rozpuszczone w detergentach MP, dzięki czemu dwucele są kompatybilne z robotami krystalizacyjnymi.

Bicele zostały z powodzeniem użyte do krystalizacji kilku białek błonowych^5,7-11 (Tabela 1). Ta rosnąca kolekcja białek pokazuje wszechstronność biceli w krystalizacji zarówno alfa helisów, jak i arkuszy beta MP ze źródeł prokariotycznych i eukariotycznych. Ze względu na te sukcesy i prostotę wdrożenia o wysokiej przepustowości, dwucele powinny być częścią arsenału każdego krystalografa białek błonowych. W tym filmie opisujemy metodologię bicelle i przedstawiamy krok po kroku protokół konfiguracji wysokoprzepustowych prób krystalizacji oczyszczonych MP przy użyciu standardowej robotyki.

Protocol

Krystalizacja na bazie Bicelle składa się z czterech podstawowych etapów (Rysunek 2): i) przygotowanie mieszaniny lipidowo-amfifilowej tworzącej bicelle; ii) wprowadzenie oczyszczonego białka do pożywki Bicelle; iii) próby krystalizacji (ręcznie lub zrobotyzowanej); oraz iv) wizualizacja, ekstrakcja kryształów i zamrażanie. Kroki te zostały szczegółowo opisane poniżej

1. Przygotowanie biceli

Dwucele mogą powstawać w różnych kombinacjach lipidowo-amfifilowych i w szerokim zakresie stężeń. W związku z tym zaleca się wstępny skład – oparty na wcześniejszych pomyślnych warunkach – (tabela 1). Najbardziej udaną mieszaniną jest preparat DMPC:CHAPSO bicelle, który można nabyć na rynku jako wstępnie zmieszany preparat gotowy do użycia (patrz tabela odczynników poniżej) lub przygotowany w laboratorium zgodnie z opisem. Do tego ćwiczenia przygotujemy 1 ml 35% mieszaniny DMPC:CHAPSO w stosunku molowym 2,8:1.

1. Odważyć 0,26 g DMPC (Mr 677,9 g/mol), 0,09 g CHAPSO (Mr 630,9 g/mol) i dodać wodę dejonizowaną do końcowej objętości 1,0 ml.
   • Procent dwuzębów może wahać się od 10% do 40%, przy stosunku molowym DMPC:CHAPSO w zakresie 2,6-3,0:1 (Tabela 1).
   • Uwaga: Im wyższe stężenie bicellu, tym trudniej jest rozpuścić lipid, co skutkuje wyższą lepkością roztworu. Jednak skoncentrowany preparat bicelle może być korzystny, gdy stężenie białka jest niskie.
2. Rozpuszczanie lipidu w celu uzyskania jednorodnego roztworu wymaga znacznego wysiłku, co czyni ten etap najbardziej czasochłonnym w metodzie bicelle. Wykonaj następujące kroki, aż DMPC zostanie całkowicie wymieszany:
   1. Podgrzej mieszaninę do temperatury ~40°C za pomocą łaźni wodnej lub inkubatora i wiruj przez ~1 minutę.
      • Uwaga: W miarę przeprowadzania kolejnych cykli podgrzanie mieszaniny spowoduje uzyskanie żelowej konsystencji, co utrudni wirowanie.
   2. Ostudzić mieszaninę na lodzie i wirować przez kilka minut. Chłodzenie pomaga upłynnić roztwór, ułatwiając wirowanie.
      • Uwaga: W miarę wykonywania kolejnych cykli mieszanina może stać się mętna po schłodzeniu.
   3. Powtarzać czynności wymienione powyżej (1.2.1 i 1.2.2) aż do całkowitego rozpuszczenia lipidów.
      • Uwaga: Ten proces może potrwać kilka godzin. Powstawanie Bicelle jest wskazane przez zmiany w zachowaniu fazowym preparatu DMPC:CHAPSO. Po zakończeniu mieszanina będzie przezroczystym żelem o temperaturze pokojowej lub wyższej i lepką cieczą na lodzie.
3. Mieszanka bicelle jest teraz gotowa do użycia i może być przechowywana w temperaturze -20°C do długotrwałego przechowywania (do 5 lat). Ze względu na ryzyko hydrolizy fosfolipidowej grupy głównej, nie zaleca się przechowywania dwuceli w temperaturze pokojowej przez dłuższy czas.

2. Włączenie białka do dwukomórek

Większość struktur MP uzyskanych z biceli została skrystalizowana w DMPC:CHAPSO stężenie bicelle w zakresie od 2 do 8% przy użyciu stężenia białka od 8 do 12 mg/ml (Tabela 1). Jeśli to możliwe, wstępne badania przesiewowe powinny opierać się na tych wytycznych, a dodatkowe stężenia mogą być badane na etapie optymalizacji. W porównaniu z metodą LCP, inkorporacja białek z bicelami jest prostym procesem (ryc. 3), który powinien być wykonany tego samego dnia, co próby krystalizacji.

1. Rozmrozić mieszaninę DMPC:CHAPSO bicelle w temperaturze pokojowej, aż faza zmieni się w klarowny żel.
   • Uwaga: Wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie nie wpłynie na zachowanie bicelle.
2. Umieść mieszaninę na lodzie w celu upłynnienia i krótko zwiruj, aby przywrócić jednorodną fazę bicelle. Po umieszczeniu na lodzie mieszanina może stać się mętna.
3. Od tego momentu trzymaj mieszankę bicelle i oczyszczone białko na lodzie. Dzięki temu bicelle pozostanie w fazie ciekłej, dzięki czemu będzie można je pipetować.
4. Dodaj mieszaninę bicelle do oczyszczonego białka rozpuszczonego w detergentach w stosunku 1:4 (V/V).
   • Na przykład: 100 μl mieszanki białkowo-bicellowej otrzymuje się przez zmieszanie 80 μl białka z 20 μl bicelle. Jeśli stężenie białka wynosi 15 mg/ml, a stężenie bicelle wynosi 35%, otrzymamy mieszaninę białek z dodatkiem bicelle o stężeniu białka 12 mg/ml i stężeniu bicelle 7%.
5. Mieszać, delikatnie pipetując zawartość w górę i w dół, aż roztwór stanie się klarowny i jednorodny.
   • Uwaga: Jeśli pojawią się bąbelki, szybkie wirowanie (30-60 sekund, 13000 obr./min, 4°C) za pomocą wirówki stołowej może pomóc je usunąć.
6. Inkubować mieszaninę na lodzie przez co najmniej 30 minut, aby zapewnić całkowite włączenie białka do dwuceli. Mieszanina białkowo-bicellowa jest teraz gotowa do prób krystalizacji.

3. Przygotowanie prób krystalizacji

Inne techniki krystalizacji lipidów, takie jak LCP, wymagają specjalistycznego sprzętu ze względu na wysoką lepkość medium; ale unikalne zachowanie fazowe biceli pozwala na implementację w praktycznie każdym standardowym formacie krystalizacji, w tym w robotyce (Rysunek 3). Próby krystalizacji mogą być przeprowadzane w formie wiszącej lub siedzącej przy użyciu standardowych dostępnych na rynku ekranów.

1. Niezależnie od tego, czy ustawiasz tace ręcznie, czy używasz robota do krystalizacji, utrzymuj mieszaninę białka i bicelle na lodzie. Dzięki temu mieszanina białkowo-bicelle będzie zimna i zapewni, że lepkość roztworu będzie minimalna.
2. Próby ręcznej krystalizacji - Za pomocą standardowej pipety mieszaninę białko-bicelle można mieszać z roztworem zbiornikowym w taki sam sposób, jak zwykle stosuje się to w przypadku rozpuszczalnych lub rozpuszczalnych w detergentach białek błonowych.
   • Uwaga: Podczas prób należy przechowywać mieszaninę białkowo-bicellową na lodzie.
3. Próby krystalizacji robotycznej - Dostosowaliśmy te próby do robota krystalizacyjnego Mosquito, ale w zasadzie (przy zachowaniu tych samych środków ostrożności) technika powinna być kompatybilna ze wszystkimi robotami krystalizacyjnymi. Poniższe wskazówki zapewnią, że mieszanina białkowo-bicellowa pozostanie chłodna i dokładnie odpipetowana przez robota:
   1. Wstępnie schłodzić płytkę zawierającą mieszankę białkowo-bicellową, umieszczając ją na lodzie.
   2. Odpipetować mieszaninę białkowo-bicellową do płytki i nadal utrzymywać płytkę na lodzie. Ta płyta powinna być ostatnim elementem, który powinien trafić na robota przed rozpoczęciem biegu.
   3. Ustaw tacę zbiornika i pokrywy do krystalizacji odpowiednio na platformie 3 i 5 robota do komarów.
   4. Umieść płytkę zawierającą mieszaninę białkowo-bicellową na platformie 4 robota do zwalczania komarów. Dzięki temu mieszanina białkowo-bicellowa jest ostatnią zbieraną przez robota i jest natychmiast uwalniana.
   5. Aby zapobiec nagrzewaniu się i zwiększonej lepkości, nie mieszaj zbiornika z mieszaniną białkowo-bicelle.
   6. W przypadku wykonywania wielu badań przesiewowych natychmiast umieść płytkę białko-białkową w lodzie w celu schłodzenia, gdy tylko przebieg zostanie zakończony.
4. Objętość i stosunek kropli (białko:zbiornik) można wybrać tak, jak w przypadku konwencjonalnych prób krystalizacji. Na przykład wstępne próby kryształów przy użyciu robota Mosquito można skonfigurować przy użyciu 0,25 μl mieszaniny białko:bicelle i 0,25 μl zbiornika.
5. Próby kryształów należy inkubować w komorze w temperaturze 20 °C. Temperatura jest dobrym parametrem przesiewowym i optymalizacyjnym, ponieważ zachowanie fazowe biceli jest zależne od temperatury.
   • Wyższe temperatury indukują fazę^{blaszkową 12} (ryc. 1), która ma tę zaletę, że wstępnie organizuje białko w warstwy. Temperatury poniżej 20°C mogą być badane, ale nie należy schodzić poniżej 4°C, ponieważ może to spowodować wytrącanie się lipidów przez dłuższy czas.
6. W taki sam sposób, jak w przypadku tradycyjnych prób krystalizacji, próby bicelle powinny być regularnie monitorowane pod kątem wyglądu i wzrostu kryształów. Zalecamy sprawdzenie tac w 1. i 3. dniu po konfiguracji, a następnie cotygodniową kontrolę.
7. Optymalizację kryształów można przeprowadzić przy użyciu metod rutynowo stosowanych w przypadku kryształów na bazie detergentów, w tym przesiewania siatki, przesiewania dodatków, zmian temperatur itp. Dodatkowo procent bicelli i stosunek białka do bicelle mogą być różne. Co więcej, bicele mogą być domieszkowane specyficznymi lipidami, które mogą być niezbędne do stabilności lub funkcji białka.

4. Wizualizacja, ekstrakcja kryształów i zamrażanie

Ponieważ próby kryształów z mieszaniną białko-bicelle mają lepkość podobną do kropli białkowo-detergentowych, wizualizacja i ekstrakcja kryształów jest rutynowa i przeprowadzana jak tradycyjne ustawienia.

1. Wizualizacja: W przeciwieństwie do mediów LCP, które często wymagają wysokiej jakości oświetlenia w normalnym i spolaryzowanym świetle do wykrywania kryształów, wizualizacja nie jest utrudniona przez dwucele. Kolorowe i bezbarwne krople kryształów białka można łatwo analizować za pomocą standardowych mikroskopów i nie jest wymagany żaden specjalny sprzęt.
2. Idele, podobnie jak inne pożywki lipidowe, mają tendencję do wytwarzania wysokiego odsetka wyników fałszywie dodatnich. Mikroskop UV znacznie pomaga w odróżnianiu białka od kryształów soli (ryc. 4).
3. Ekstrakcja i zamrażanie: Ekstrakcja i zamrażanie kryształów jest stosunkowo proste i nie wymaga rozpuszczania otaczających pożywek bicellowych. Dodatkowo sama faza bicelle zapewnia umiarkowaną ochronę przed krioizolacją.

5. Reprezentatywne wyniki:

Zazwyczaj potrzeba 2-3 dni, aby kryształy się pojawiły, a około tygodnia lub więcej zanim urosły do swoich maksymalnych rozmiarów. Tak było w przypadku bakteriorodopsyny i mysich kryształów kanału anionowego 1 zależnego od napięcia (mVDAC1)^4,8. W przypadku innych białek błonowych wzrost kryształów może trwać kilka tygodni, dlatego ważne jest, aby kontynuować monitorowanie prób z kryształami długo po pierwszych tygodniach.

Podobnie jak w przypadku innych mediów lipidowych, dwucele mają tendencję do tworzenia kształtów, które mogą wydawać się krystaliczne. Zaobserwowano również, że prowadzą one do wyższego procentu kryształów soli i detergentów. Mikroskop UV, który wykrywa fluorescencję tryptofanu, może znacznie pomóc w wyeliminowaniu takich fałszywie dodatnich wyników bez białka. Rysunek 4 przedstawia kształty lipidów, kryształy soli i białek widziane w świetle widzialnym i UV, aby pomóc w rozróżnieniu różnych wyników, które można zaobserwować.

Rysunek 1. Schemat Bicelle. Dwuwarstwy składają się z dwuwarstwy tworzącej cząsteczkę lipidową, taką jak DMPC (niebieska) i amfifilu, takiego jak CHAPSO (zielona), która chroni hydrofobowe krawędzie dwuwarstwy. Wraz ze wzrostem temperatury bicele przypominające dyski ulegają przemianie fazowej w perforowaną blachę blaszkową¹².

Rysunek 2. Schemat blokowy metody krystalizacji bicelle przedstawiający cztery podstawowe kroki.

Rysunek 3. Schemat konfiguracji prób kryształowych. Oczyszczone, rozpuszczone w detergentach białka błonowe można bezpośrednio mieszać z bicelami na lodzie, po prostu pipetując zawartość. Po inkubacji mieszaniny białko/bicelle na lodzie przez ~30 minut, próby krystalizacji można przeprowadzić przy użyciu dowolnego standardowego formatu, w tym robotyki.

Rysunek 4. Wizualizacja prób kryształów. Widoczny obraz (górny panel) i obraz UV (dolny panel) (A) Kryształy w kształcie igieł obserwowane w stanie zawierającym tylko sól. Z kryształów nie można wykryć fluorescencji, co wskazuje na fałszywie dodatni wynik. (B) Kryształ w kształcie pręta uformowany w stanie MPD. Kryształ fluoryzował słabo, ale za pomocą dyfrakcji rentgenowskiej okazało się, że nie jest białkowy. (C) Crystal zaobserwowano około czterech tygodni po rozpoczęciu prób. Silna fluorescencja w świetle UV potwierdza, że jest to kryształ białka.

Nie. białko źródło Preparat Bicelle Stężenie białka Detergent¹ Rozdzielczość (Å) odniesienie 1 Bakteriorodopsyna² Halobacterium salinarum (Halobacterium salinarum) 8% DMPC:CHAPSO (2,8:1) 8 mg/ml   2.0 Faham i Bowie, 2002       8% DTPC:CHAPSO (3:1) 8 mg/ml   1.8 Faham i wsp., 2005 cyfra arabska Receptor β2-adrenergiczny/kompleks Fab Homo sapiens (Homo sapiens) 8,3% DMPC:CHAPSO (3:1) 10 mg/ml Język DDM 3,4/3,7 Rasmussen i wsp., 2007 3 Zależny od napięcia kanał anionowy 1 Mus musculus 7% DMPC:CHAPSO (2,8:1) 12 mg/ml LDAO (Biblioteka LDAO) 2.3 Ujwal i wsp., 2008 4 Ksantorodopsyna Salinibacter ruber 4,2% DMPC, 5% NM 4 mg/ml Język DDM Pytanie 1.9 Luecke i wsp., 2009 5 Proteaza rombowa Escherichia coli (Escherichia coli) 2% DMPC:CHAPSO (2,6:1) 9 mg/ml Glukozyd nonylowy Pytanie 1.7 Vinothkumar, 2011

1 Detergent używany do oczyszczania białek błonowych
2 Natywne lipidy z fioletowych błon mogą być przenoszone podczas oczyszczania

Tabela 1. Podsumowanie warunków krystalizacji błonowych struktur białkowych rozwiązanych przy użyciu biceli.

Discussion

Wodorocele są unikalnymi pożywkami lipidowymi, które oferują natywne środowisko przypominające dwuwarstwę, a jednocześnie zachowują się tak, jakby były rozpuszczone przez detergenty. Ta właściwość daje bicelom wyraźną przewagę nad innymi metodami krystalizacji na bazie lipidów, ponieważ do tej techniki nie jest wymagana krzywa uczenia się ani specjalistyczny sprzęt. Gdy wodorocele są już dostępne, zarówno komercyjne, jak i przygotowane w laboratorium, można je bezpośrednio mieszać z oczyszczonym białkiem i od tego moment...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMPC	Affymetrix	D514
CHAPSO	Affymetrix	C317
Gotowe do użycia Bicele	MemX Biosciences	MX201001/MX201002
Ekrany krystalizacji	Qiagen, Hamptop Research, Molecular Dimensions, Emerald Biosystems, Jena Bioscience		Standardowe dostępne na rynku sita mogą być używane do wstępnych badań przesiewowych
		krystalizacji	Można użyć standardowej konfiguracji ręcznej i/lub zrobotyzowanej dostępnej w laboratorium.