Wytwarzanie mikrosfer alginianowych do zastosowań biomedycznych

Podsumowanie

W następnych sekcjach przedstawiamy procedury przygotowania mikrosfer alginianowych do zastosowań biomedycznych. W szczególności ilustrujemy technikę tworzenia wielowarstwowych mikrosfer alginianowych w celu jednoczesnej enkapsulacji komórek i białek jako potencjalnej metody leczenia cukrzycy typu 1.

Streszczenie

Materiały na bazie alginianu zyskały znaczną uwagę w zastosowaniach biomedycznych ze względu na swoją hydrofilową naturę, biokompatybilność i architekturę fizyczną. Zastosowania obejmują enkapsulację komórek, dostarczanie leków, hodowlę komórek macierzystych oraz rusztowania do inżynierii tkankowej. W rzeczywistości obecnie prowadzone są badania kliniczne, w których wyspy trzustkowe są enkapsulowane w mikrokulkach alginianowych powlekanych PLO jako metoda leczenia cukrzycy typu I. Jednak ze względu na niską przeżywalność po transplantacji, do osiągnięcia skuteczności wymagana jest duża liczba wysp. Zdolność do lokalnej stymulacji tworzenia sieci mikro naczyniowej wokół enkapsulowanych komórek może zwiększyć ich żywotność poprzez poprawę transportu tlenu, glukozy i innych niezbędnych składników odżywczych. Czynnik wzrostu fibroblastów-1 (FGF-1) jest naturalnie występującym czynnikiem wzrostu, który jest w stanie stymulować tworzenie naczyń krwionośnych i poprawiać poziom tlenu w tkankach niedokrwiennych. Skuteczność FGF-1 jest zwiększona, gdy jest on dostarczany w sposób przedłużony, a nie w formie pojedynczej, dużej dawki bolusa. Lokalna, długoterminowa uwalnianie czynników wzrostu z systemów enkapsulacji wysp mogłoby stymulować wzrost naczyń krwionośnych bezpośrednio w kierunku przeszczepionych komórek, potencjalnie poprawiając funkcjonalne wyniki przeszczepu. W niniejszym artykule przedstawiamy procedury przygotowania mikrosfer alginianowych do zastosowań biomedycznych. Dodatkowo opisujemy opracowaną przez nas metodę generowania wielowarstwowych mikrokulek alginianowych. Komórki mogą zostać zamknięte w wewnętrznym rdzeniu alginianowym, a białka angiogenne w zewnętrznej warstwie alginianowej. Uwalnianie białek z tej zewnętrznej warstwy stymulowałoby tworzenie lokalnych sieci mikro naczyniowych bezpośrednio w kierunku przeszczepionych wysp.

Protokół

Niniejszy protokół opisuje trzyetapową procedurę wytwarzania wielowarstwowych alginianowych mikrokulek (Rysunek 1). W pierwszej kolejności formowane są alginianowe mikrokulki (Rysunek 2A). Procedura ta została opisana w sekcji 1 poniżej. Na tym etapie do mikrokulek można dodać komórki lub białka, aby służyły one jako system dostarczania. Kolejny krok obejmuje tworzenie warstwy permselektywnej na mikrokulkach i został opisany w sekcji 2. Ostatnim etapem jest utworzenie dodatkowej warstwy alginianowej, opisane w sekcji 3. Warstwa ta tworzy się na zewnętrznej powierzchni kulek (Rysunek 2B) i może być wykorzystana do enkapsulacji oraz dostarczania cząsteczek terapeutycznych (Rysunek 2C>) w celu ukierunkowania odpowiedzi komórkowej na system po transplantacji.

1. Przygotowanie alginianowych mikrokulek

1. Przygotuj 1,5% (w/v) roztwór alginianu LVM, rozpuszczając 15 gramów alginianu LVM w 1 mL roztworu alginianu warstwy wewnętrznej (bufor HEPES 25 mM, NaCl 118 mM, KCl 5,6 mM i MgCl₂ 2,5 mM w wodzie DI, z pH dostosowanym do 7,4). Mieszaj na wstrząsarce Vortex do całkowitego rozpuszczenia proszku alginianu i utworzenia klarownego, lepkiego roztworu. Uwaga: Niniejszy protokół opisuje warunki optymalne dla enkapsulacji wysepek w mikrokapsułkach alginianowych. ¹ Stężenie i skład mikrosfer alginianowych można zmieniać w celu dostosowania właściwości do innych zastosowań (np. dostarczania leków, inżynierii tkankowej itp.). Uwaga: W przypadku enkapsulacji wysepek można je dodać do roztworu alginianu na tym etapie, przed załadowaniem do mikroenkapsulatora.
2. Przygotuj roztwór sieciujący (CaCl₂ 22 mM w wodzie DI), rozpuszczając CaCl₂ 100 mM i bufor HEPES 10 mM w wodzie DI, a następnie dostosowując pH do 7,4. Uwaga: Zależnie od pożądanego charakteru żelowania alginianu, zamiast Ca²⁺ można zastosować inne kationy dwuwartościowe, takie jak Br²⁺, Sr²⁺ itp.
3. Przygotuj dwukanałowy mikroenkapsulator alginianowy z osłoną powietrzną, mocując igłę G25 do strzykawki; dostosuj zawory po obu stronach, aby upewnić się, że igła znajduje się w centrum osłony powietrznej. Na tym etapie można użyć igieł o różnych rozmiarach, w zależności od pożątej wielkości mikrokulek alginianowych.
   Krok ten można również przeprowadzić za pomocą zwykłej strzykawki, jeśli mikroenkapsulator jest niedostępny. Należy nalać roztwór alginianu do strzykawki i dobrać rozmiar igły na podstawie pożądanej wielkości mikrokulek.
4. Umieść kolbę zawierającą 10 mL roztworu sieciującego bezpośrednio pod igłą. Wprowadź do roztworu mieszadło magnetyczne.
5. Wtryskuj krople bezpośrednio do roztworu CaCl₂, aby przeprowadzić sieciowanie alginianu i utworzyć mikrokulki. Inkubuj kulki w roztworze sieciującym przez co najmniej piętnaście minut przy ciągłym mieszaniu, aby utrwalić strukturę.
6. Przenieś kulki do probówki wirówkowej o pojemności 15 mL. Usuń pozostały roztwór i przeprowadź trzy przemycia 0,2% roztworem CaCl₂ w soli fizjologicznej, po dwie minuty każde.

2. Powlekanie mikrokulek poli-L-ornityną

1. Przygotuj 3 mL 0,1% (w/v) roztworu poli-L-ornityny (PLO) w soli fizjologicznej. Mieszaj roztwór na wortexie do całkowitego rozpuszczenia, aż powstanie klarowny roztwór. W tym kroku zamiast PLO można użyć poli-L-lizyny (PLL), co daje podobny poziom permselektywności.
2. Przenieś alginianowe mikrokulki do roztworu PLO. Mieszaj na wortexie przez 30 minut, aby zapewnić PLO wystarczający czas na oddziaływanie z alginianem i utworzenie kompleksu polikationowo-polianionowego. Po 30 minutach wokół alginianowych mikrokulek powinna być wyraźnie widoczna biała powłoka.
3. Usuń roztwór PLO i przeprowadź trzy płukania 0,2% CaCl₂ w soli fizjologicznej, po dwie minuty każde.

3. Tworzenie zewnętrznej warstwy alginianowej

1. Przygotować roztwór alginianu o pożądanej koncentracji, który zostanie użyty do stworzenia warstwy zewnętrznej. Roztwór przygotowuje się zgodnie z opisem w punkcie (1.1) powyżej. Wielkość warstwy zewnętrznej zależy od składu i stężenia użytego alginianu (Rysunek 3).
2. Przenieść mikrokulki alginianowe na sitko do komórek. Użyć chusteczki Kimwipe do wchłonięcia nadmiaru roztworu, aby maksymalnie osuszyć mikrokulki.
3. Przenieść mikrokulki na powierzchnię Parafilmu. W razie potrzeby Parafilm można zastąpić innymi gładkimi powierzchniami, takimi jak szkło lub plastikowa szalka Petriego.
4. Nanieść roztwór alginianu przygotowany w punkcie (3.1) na mikrokulki alginianowe. Objętość roztworu alginianu powinna całkowicie zakrywać mikrokulki. Pozostawić mikrokulki w roztworze alginianu na 45 minut.
5. Za pomocą pipety usunąć nadmiar roztworu alginianu, który nie związał się z mikrokulkami.
6. Przenieść mikrokulki do roztworu 22mM CaCl₂. Powoduje to sieciowanie roztworu alginianu wokół mikrokulek, co prowadzi do powstania wyraźnej zewnętrznej warstwy alginianu.
7. Przeprowadzić trzy przemycia 22 mM CaCl₂ w soli fizjologicznej, po dwie minuty każde. Obserwacja mikrokulek pod mikroskopem powinna pozwolić na dostrzeżenie wyraźnej zewnętrznej warstwy alginianu uformowanej wokół rdzenia mikrokulki.

4. Reprezentatywne wyniki

Rycina 1. Schemat procedury tworzenia wielowarstwowych alginianowych mikrokulek. Przedruk za zgodą Khanna et al. J Biomed Mater Res A. Nov; 95(2), 632-40 (2010).

Rysunek 2. (A) i (B) przedstawiają obrazy alginianowych mikrokulek w kontraście fazowym. (A) pokazuje mikrokuleczkę po etapie syntezy (1.7), natomiast (B) ukazuje wyraźną zewnętrzną warstwę alginianu obecną po zakończeniu etapu (3.7). (C) przedstawia obraz FITC białka BSA znakowanego fluorescencyjnie, zamkniętego w zewnętrznej warstwie. Powielono za zgodą Khanna et al. J Biomed Mater Res A. Nov;95(2), 632-40 (2010).

Rycina 3. Rozmiar zewnętrznej warstwy alginianu może być zmienny w zależności od składu i stężenia użytego alginianu. Nasze wyniki pokazują, że w przypadku alginianu LVM i LVG rozmiar zewnętrznej warstwy zwiększa się wraz ze wzrostem stężenia alginianu oraz że alginian LVG tworzy grubsze warstwy zewnętrzne niż alginian LVM przy równych stężeniach. Odtworzone za zgodą Khanna et al. J Biomed Mater Res A. Lis; 95(2), 632-40 (2010).

Rysunek 4. Uwalnianie FGF-1, angiogennego białka czynnika wzrostu, z zewnętrznej warstwy alginianu różniło się w zależności od zastosowanego stężenia alginianów LVM i LVG. (A) i (B) przedstawiają procent uwalniania, a (C) i (D) oznaczają odpowiadającą im masę uwolnionego FGF-1 w funkcji czasu dla różnych formulacji warstwy zewnętrznej. Dla wszystkich warunków zaobserwowano gwałtowne uwalnianie początkowe (burst release) w ciągu pierwszych 5 h (A i C) oraz ciągłe uwalnianie niskich dawek przez okres do 30 dni (B i D). Reprodukowano za zgodą Khanna et al. J Biomed Mater Res A. Nov; 95(2), 632-40 (2010). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Dyskusja

Alginian jest naturalnym, kwasowym polisacharydem ekstrahowanym z alg, składającym się z jednostek kwasu 1,4'-β-D-mannuronowego (M) oraz kwasu α-L-guluronowego (G) ^2,3. Prosta żelacja zachodzi, gdy kationy dwuwartościowe, takie jak Ca²⁺, Sr²⁺ lub Ba²⁺, oddziałują z monomerami G, tworząc mostki jonowe między sąsiednimi łańcuchami alginianu. Mikrokule alginianowe były wykorzystywane do dostarczania różnych białek, w tym czynnika wzrostu fibroblastów-1 (FGF-1), czynnika wzrostu ne...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Alginian Pronova Ultrapure LVG	Nova-Matrix	4200006	Dostępnych jest wiele formulacji alginianu. Wybór alginianu wpływa na końcowe właściwości mikrokulek, w tym na ich rozmiar, właściwości mechaniczne oraz transport. Stosowany skład powinien zostać zoptymalizowany pod kątem konkretnego zastosowania.
Alginian Pronova Ultrapure LVM	Nova-Matrix	4200206	Dostępnych jest wiele formulacji alginianu. Wybór alginianu wpływa na końcowe właściwości mikrokulek, w tym na ich rozmiar, właściwości mechaniczne oraz transport. Stosowany skład powinien zostać zoptymalizowany pod kątem konkretnego zastosowania.
Hydrochlorowodorek poli-L-ornityny	Sigma-Aldrich	P2533