Wykorzystanie plazmonicznych i fotonicznych nanostruktur krystalicznych do usprawnionej manipulacji mikro- i nanocząsteczkami

Podsumowanie

Wykazano, że pęsety plazmoniczne oraz nanostruktury kryształów fotonicznych zapewniają istotną poprawę wydajności i kontroli orientacji w optycznym chwytaniu mikro- i nanocząstek.

Streszczenie

Metoda nieniszczącej manipulacji pozycją i orientacją cząstek submikronowych byłaby niezwykle użytecznym narzędziem w podstawowych badaniach biologicznych. Być może najszerzej stosowaną siłą fizyczną służącą do nieinwazyjnej manipulacji małymi cząstkami jest dielektroforeza (DEP).¹ Jednak sama DEP nie zapewnia wszechstronności i precyzji pożądanej przy manipulowaniu komórkami, ponieważ tradycyjnie wykorzystuje ona elektrody stacjonarne. Pęsety optyczne, które wykorzystują trójwymiarowy gradient pola elektromagnetycznego do wywierania sił na małe cząstki, zapewniają tę pożądaną wszechstronność i precyzję.² Główną wadą tego podejścia jest jednak wysoka intensywność promieniowania wymagana do uzyskania siły niezbędnej do uwięzienia cząstki, co może uszkodzić próbki biologiczne.³ Rozwiązaniem umożliwiającym pułapkowanie i sortowanie przy niższych intensywnościach optycznych są optoelektroniczne pęsety (OET), lecz OET mają ograniczenia w zakresie precyzyjnej manipulacji małymi cząstkami; fakt, że jest to technologia oparta na DEP, nakłada również ograniczenia na właściwości roztworu.^4,5

Niniejszy artykuł wideo opisuje dwie metody zmniejszające natężenie promieniowania niezbędnego do optycznej manipulacji żywymi komórkami, a także opisuje metodę kontroli orientacji. Pierwszą metodą są pęsety plazmoniczne, które wykorzystują losową macierz nanocząsteczek złota (AuNP) jako podłoże dla próbki, co przedstawiono na rysunku 1. Macierz AuNP przekształca padające fotony w zlokalizowane plazmony powierzchniowe (LSP), które składają się z rezonansowych momentów dipolowych promieniujących i generujących ustrukturyzowane pole promieniowania o dużym gradiencie w roztworze komórek. Wstępne prace nad pułapkami wspomaganymi plazmonami powierzchniowymi przeprowadzone przez Righini i współpracowników oraz nasze własne modelowanie wykazały, że pola generowane przez podłoże plazmoniczne zmniejszają wymagane początkowe natężenie poprzez wzmocnienie pola gradientowego, które więzi cząsteczkę.^6,7,8 Podejście plazmoniczne pozwala na precyzyjną kontrolę orientacji cząsteczek i komórek o kształcie elipsoidy przy niskich natężeniach optycznych dzięki wydajniejszej konwersji energii optycznej na energię mechaniczną oraz polu promieniowania zależnemu od dipola. Pola te przedstawiono na rysunku 2, a szczegółowe informacje na temat niskich natężeń pułapkujących znajdują się na rysunkach 4 i 5. Głównymi problemami pęset plazmonicznych są fakt, że LSP generują znaczną ilość ciepła oraz że pułapkowanie jest tylko dwuwymiarowe. Ciepło to generuje przepływy konwekcyjne i termoforezę, które mogą być wystarczająco silne, aby wypchnąć cząsteczki submikronowe z pułapki.^9,10 Drugim podejściem, które opiszemy, jest wykorzystanie okresowych nanostruktur dielektrycznych do bardzo wydajnego rozpraszania padającego światła w mody dyfrakcyjne, jak pokazano na rysunku 6.¹¹ Idealnie struktura ta powinna być wykonana z materiału dielektrycznego, aby uniknąć problemów z nagrzewaniem występujących w przypadku pęset plazmonicznych, jednak w naszym podejściu jako jednowymiarowa okresowa nanostruktura dielektryczna zastosowano siatkę dyfrakcyjną powlekaną aluminium. Mimo że nie jest ona półprzewodnikiem, nie odnotowano w niej znaczącego nagrzewania i skutecznie więziła ona małe cząsteczki przy niskich natężeniach pułapkujących, co przedstawiono na rysunku 7. Dopasowanie cząsteczek do podłoża z siatką koncepcyjnie potwierdza tezę, że dwuwymiarowy kryształ fotoniczny mógłby umożliwić precyzyjną rotację niesferycznych cząsteczek o rozmiarach mikronowych.¹⁰ Wydajność tych pułapek optycznych wzrasta dzięki wzmocnionym polom generowanym przez nanostruktury opisane w niniejszej pracy.

Protokół

1. Fabrykacja losowej macierzy nanocząsteczek Au ^8,10,12,14

1. Układ nanocząstek Au tworzy się poprzez najpierw przygotowanie szablonu składającego się z gęstej warstwy losowo zaadsorbowanych sfer lateksowych o średnicy 454 nm. W tym celu na szkiełku podstawowym napylane jest złoto o grubości 20 nm, stosując chrom jako warstwę adhezyjną.
2. Monowarstwa sfer polistyrenowych jest następnie samoorganizowana poprzez wystawienie podłoża pokrytego złotem na mieszaninę chlorku 1-etylo-3-(3-dimetylaminopropylo)karbodiimidu (EDC), zawiesiny sfer lateksowych oraz wody dejonizowanej.
3. Proces adsorpcji trwa około jednej godziny, a sfery niezadsorbowane są wypłukiwane obfitą ilością wody.
4. Utworzoną monowarstwę pozostawia się do wyschnięcia na powietrzu.
5. Na koniec, na monowarstwę sfer lateksowych napyla się kolejne 20 nm złota, aby utworzyć losowy układ nanocząstek złota.
6. W przypadku dostępności SEM, układ AuNP można obejrzeć pod SEM, aby zweryfikować zgodność z rysunkiem 1; schemat procesu przedstawiono na rysunku 8.

2. Przygotowanie próbek biologicznych^9,11

1. Przedstawiono przygotowanie próbki do optycznego chwytania jąder komórek mysich.
2. Jądra komórek mysich 3T3 znakowane barwnikiem pomarańczową akrydyną zostały otrzymane od grupy Tewari z Fred Hutchinson Cancer Research Center.
3. Do jąder komórek mysich dodaje się 10% albuminę wołową (BSA) w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) w stosunku około 1 : 10 (BSA : jądra komórek mysich). BSA pomaga zapobiec przywieraniu jąder do podłoża.
4. Roztwór należy wymieszać za pomocą sonikacji.
5. Na szkiełko nakrywkowe z aluminiową siecią dyfrakcyjną nanosi się 5 µL roztworu. Zaleca się wykonanie tego kroku, gdy aluminiowa sieć dyfrakcyjna znajduje się już na stole mikroskopu, aby uniknąć konieczności transportowania próbki po nałożeniu roztworu.
6. Do podparcia piątego szkiełka nakrywkowego, przez które obserwowana jest próbka, stosuje się dwa stosy po dwa szkiełka nakrywkowe o wymiarach 1" x 1".
7. Próbkę należy ustawić pod mikroskopem w celu obserwacji.

3. Metoda odłowu

1. Pinceta optyczna jest skonstruowana poprzez przeprowadzenie wiązki lasera helowo-neonowego o mocy 35 mW przez mikroskop Zeiss Axio Imager.D1M wyposażony w zestaw filtrów GFP 17, zmodyfikowany w celu umożliwienia dotarcia promieniowania laserowego o długości fali 633 nm do próbki.
2. Do obrazowania jąder komórkowych, których średnica wynosi około 5 micron, wykorzystuje się obiektyw Zeiss LD EC Epiplan - NEOFLUAR 50x.
3. Po umieszczeniu próbki pod obiektywem należy ustawić ostrość mikroskopu na matrycy nanocząstek złota lub siatce dyfrakcyjnej.
4. Przesuń mikroskop w pionie, aż do uzyskania ostrości na jądrach, które mają zostać uwięzione.
5. Ustaw punkt pułapki laserowej nad cząstką; cząstka powinna wówczas utrzymać swoją pozycję w punkcie lasera, nawet podczas przesuwania stolika.

4. Reprezentatywne wyniki:

Procedury tworzenia losowej macierzy nanocząsteczek złota powinny skutkować osadzeniem monowarstwy AuNP, która w obrazowaniu SEM powinna wyglądać jak na Rysunku 1. Siła pułapkowania generowana przez te pęsety plazmoniczne może być 10-20 razy większa od siły generowanej przez standardowe pęsety optyczne. Minimalne natężenia wymagane przez pęsety plazmoniczne do osiągnięcia uwięzienia cząstek dla różnych rozmiarów cząstek przedstawiono na Rysunku 4.^9,10 Dzięki zastosowaniu kratki dyfrakcyjnej uzyskano wyrównanie i pułapkowanie z wydajnością 20 razy wyższą niż w przypadku nanokropek złota, przy czym pułapkowanie można było osiągnąć już przy mocy 17 uW/um² (Rysunek 7).¹¹

Rysunek 1¹⁰ (a) Mikrografia SEM samoorganizujących się nanocząsteczek złota. Średnica poszczególnych nanocząsteczek złota wynosi około 450 nm. (b) Obraz NSOM podłoża plazmonicznego o rzadkim rozkładzie nanocząsteczek, przedstawiający promieniowanie bliskiego pola. Długość fali lasera wzbudzającego wynosi 633 nm. (c) Powiększony widok obszaru zaznaczonego czerwonym kwadratem na (b). (d) Widmo wydajności rozpraszania podłoża plazmonicznego, wykazujące piki przy 624 nm. (e) Widmo wydajności absorpcji podłoża plazmonicznego, wykazujące piki przy 668 nm.

Rycina 2¹³ (a) Nanosfery Au rozmieszczone losowo w domenie 2D o wymiarach 1 x 1 μm². Każda niebieska kropka reprezentuje środek nanosfery (a = 60 nm). Rozkłady pola rozproszenia w płaszczyznach obserwacyjnych równoległych do losowej macierzy nanosfer przedstawiono na panelach (b) - (e). Macierz nanosfer jest równomiernie oświetlona falą płaską o długości fali 540 nm. Współczynnik załamania światła otaczającego ośrodka wynosi 1,33. Kierunek polaryzacji fali płaskiej jest skierowany wzdłuż osi X (poziomo na panelu (a)). Przyjęto, że wartość natężenia padającego pola elektrycznego w obliczeniach wynosi 1. Odległość między płaszczyzną obserwacyjną a macierzą nanosfer zdefiniowano jako h. b) h = a. c) h = 2a. d) h = λ. e) h = 2λ.

Rycina 3⁹ Schemat dostosowanej konfiguracji mikroskopu fluorescencyjnego, obejmujący pominięty filtr wzbudzenia oraz wymieniony dichroiczny dzielnik wiązki. Jest to konfiguracja zastosowana do jednoczesnego pułapkowania i obrazowania fluorescencyjnego.

Rysunek 4¹⁰ Minimalna intensywność lasera niezbędna do utrzymania pułapki w funkcji szybkości przepływu otaczającego płynu z wykorzystaniem pułapkowania plazmonicznego. Wszystkie intensywności optyczne zostały zmierzone w płaszczyźnie próbki pod obiektywem mikroskopu. (a) - (f) przedstawiają wyniki pomiarów dla pojedynczych kulek polistyrenowych o średnicach odpowiednio 7.3, 6.3 (niesferycznych), 5.0, 3.9, 2.5 i 1.1 μm. Wstawki zawierają odpowiadające im obrazy mikroskopowe cząstek. Paski skali na wszystkich obrazach reprezentują długość 5 μm.

Rycina 5¹⁰ Nachylenie dopasowanej prostej przechodzącej przez początek układu współrzędnych z Ryc. 4 w funkcji rozmiaru cząstek dla pułapkowania plazmonicznego. Słupki błędów przedstawiają odchylenia standardowe dopasowań liniowych. Nachylenie dopasowanej prostej (stosunek progu intensywności optycznej do szybkości przepływu) na Ryc. 4 wykazuje w przybliżeniu liniową zależność od rozmiaru cząstek, co pokazano na tej rycinie, wskazując na przewagę pułapkowania plazmonicznego, zwłaszcza w przypadku mniejszych cząstek.

Rysunek 6¹¹ (a) Schematyczna ilustracja wzmocnionego pułapkowania optycznego z wykorzystaniem jednowymiarowych periodycznych nanostruktur. Wiązka padająca ulega dyfrakcji na periodycznej nanostrukturze w polu dalekim. (b) Rozkład natężenia światła dla dwóch ortogonalnych polaryzacji na powierzchni aluminiowej kratki o okresie 417 nm uzyskany za pomocą symulacji FDTD. Rozkład został znormalizowany do natężenia na płaskiej powierzchni aluminiowej. (c) i (d) Potencjał pułapkowania dla cząstek znajdujących się bezpośrednio nad powierzchnią kratki w zależności od położenia cząstki dla (c) kulki polistyrenowej o rozmiarze 350 nm oraz (d) kulki polistyrenowej o rozmiarze 1 μm. Białe okręgi ilustrują rozmiary cząstek. Wstawki przedstawiają potencjał pułapkowania nad płaską powierzchnią aluminiową dla tej samej wielkości cząstek w ramach porównania. Wartości zostały znormalizowane dla każdego rozmiaru cząstki. Dla wszystkich rysunków z symulacji FDTD pole widzenia wynosi 10 x 8 μm².

Rysunek 7¹¹ (a) Wydajność pułapkowania i minimalna intensywność pułapkowania zmierzone dla kulek polistyrenowych o różnych rozmiarach przy polaryzacji wiązki prostopadłej do linii siatki. Wstawka pokazuje asymetrię pułapki w wydajności pułapkowania podczas przemieszczania kulki polistyrenowej o rozmiarze 3.87 µm prostopadle i równolegle do linii siatki. Linia ciągła (duża asymetria) została uzyskana przy świetle padającym spolaryzowanym prostopadle do siatki, a linia przerywana (mała asymetria) przy świetle padającym spolaryzowanym równolegle do siatki. Jednostka to (pN[mW/μm²]^-1). (b)-(d) Demonstracja pułapkowania fluorescencyjnej kulki polistyrenowej o rozmiarze 590 nm. Czerwone koło wskazuje pozycję plamki laserowej, ponieważ światło lasera było zbyt słabe, aby było widoczne. Początkowo cząstka jest uwięziona w plamce przy wyższej mocy; w miarę obniżania mocy ruchy Browna cząstki przezwyciężają siłę pułapkowania, co pozwala cząstce na ucieczkę. (e)-(g) Demonstracja pułapkowania fluorescencyjnego jądra komórki raka jajnika. Minimalna intensywność wymagana do zainicjowania pułapkowania wynosiła 16 μW/μm², uzyskana przy użyciu obiektywu 20x.

Rysunek 8¹⁴ Procedura wytwarzania nanocząsteczek złota w kształcie czepka: a) Odparowanie cienkiej warstwy Cr i Au na szklanym szkiełku nakrywkowym. b) Ekspozycja na zawiesinę sfer polistyrenowych i adsorpcja sfer przez 1 godzinę. c) Usunięcie niezaadsorbowanych sfer polistyrenowych i suszenie powierzchni. d) Odparowanie kolejnej warstwy Au na wierzchołek sfer szablonowych. e) Schemat macierzy nanocząsteczek Au w kształcie czepka, w której Au pokrywa jedynie górną stronę sfer szablonowych.

Dyskusja

Znaczenie tych metod pułapkowania polega na tym, że obniżają one intensywność optyczną niezbędną do utrzymania pułapkowania z poziomu rzędu 10³ μW/μm² do poziomu rzędu 10 μW/μm².^10,11 Ograniczeniem tych technik jest fakt, że matryca nanocząsteczek złota ulega przegrzaniu, co musi zostać wyeliminowane. Aby rozwiązać ten problem, można zastosować dwuwymiarową strukturę kryształu fotonicznego wykonaną z materiału dielektrycznego. Taka struktura mogłaby teoretycznie zapewniać pułap...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Nazwa materiału	Firma	Numer katalogowy	Komentarz
Mikroskop Axio Imager (D1M)	Carl Zeiss, Inc.	D1M	Zeiss Axio Imager.D1M
Obiektyw mikroskopu (50x/0,55)	Carl Zeiss, Inc.		LD EC Epiplan - NEOFLUAR 50x/0.55 HD DIC
Kamera do mikroskopu Zeiss (AxioCam MRc)	Carl Zeiss, Inc.
Laser helowo-neonowy (35 mW)	Badania nad elektrooptyką
Tłumik o płynnie regulowanym stopniu tłumienia	Thorlabs Inc.	NDC-100C-4M	Do regulacji natężenia światła mikroskopu
Zestaw filtrów Zeiss nr 17	Carl Zeiss, Inc.	488017-9901-000	Zestaw filtrów nr 17
Przedmiotowe szkiełka mikroskopowe, grubość 0,5 mm	VWR international
jądra komórek mysich 3T3	Fred Hutchinson Cancer Research Center		Przechowywać w jak najniższej temperaturze
Barwnik pomarańcz akrydynowy	Fred Hutchinson Cancer Research Center
albumina surowicy bydlęcej, stosunek od 1 do 10 w PBS	Fred Hutchinson Cancer Research Center
polistyrenowe kulki lateksowe 454 nm	Polysciences, Inc.
chlorowodorek 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropyl)karbodiimidu (EDC)	G-Biosciences	BC25-1
złoto (do napylania)
Refleksyjna ryta siatka dyfrakcyjna	Edmund Scientific
Dulbecco’fosforanowo-buforowy roztwór soli (D-PBS) (1X)	Invitrogen	14190-144