Ilościowe porównanie cisAktywności cis-elementów regulacyjnych (CRE) w organizmach transgenicznych Drosophila melanogaster

Podsumowanie

Zróżnicowanie fenotypowe cech może wynikać z mutacji w sekwencjach elementów cis-regulatorowych (CRE), które kontrolują wzorce ekspresji genów. Metody opracowane do zastosowania u Drosophila melanogaster pozwalają na ilościowe porównanie poziomów przestrzennych i czasowych wzorców ekspresji genów pośredniczonych przez zmodyfikowane lub naturalnie występujące warianty CRE.

Streszczenie

Wzorce ekspresji genów są określane przez cis-sekwencje elementów regulacyjnych (CRE), nazywane również enhancerami lub modułami cis-regulacyjnymi. Typowy CRE posiada układ miejsc wiązania dla kilku białek czynników transkrypcyjnych, które nadają logikę regulacyjną określającą, kiedy, gdzie i na jakim poziomie ekspresowany jest regulowany gen (lub geny). Pełny zestaw CRE w genomie zwierzęcia koduje organizm′program rozwoju¹a badania empiryczne oraz teoretyczne wskazują, że mutacje w CRE odgrywały istotną rolę w ewolucji morfologicznej^2-4Ponadto badania asocjacyjne całego genomu u ludzi wskazują, że zmienność genetyczna w elementach regulacyjnych (CRE) w znacznym stopniu przyczynia się do zmienności fenotypowej.^5,6Zatem zrozumienie logiki regulacyjnej oraz wpływu mutacji na tę logikę stanowi centralny cel genetyki.

Transgeny reporterowe stanowią potężną metodę badania in vivo funkcja elementów regulacyjnych cis (CRE). W tym przypadku znana lub przypuszczana sekwencja CRE jest łączona z heterologicznym promotorem oraz sekwencjami kodującymi gen reporterowy, który koduje łatwo obserwowalny produkt białkowy. Po wprowadzeniu transgenu reporterowego do organizmu gospodarza, CRE′aktywność staje się widoczna w postaci zakodowanego białka reporterowego. Transgeneza za pomocą elementu P u gatunku muszka owocowa Drosophila (D.) melanogaster⁷ od dziesięcioleci stosuje się w celu wprowadzenia transgenów reporterowych do tego organizmu modelowego, choć miejsce ich integracji w genomie jest przypadkowe. W związku z tym aktywność genu reporterowego jest silnie uzależniona od lokalnej chromatyny i otoczenia genowego, co ogranicza porównania elementów regulacyjnych CRE do analiz jakościowych. W ostatnich latach system integracji oparty na phiC31 został zaadaptowany do zastosowań w D. melanogaster w celu wprowadzenia transgenów do specyficznych miejsc lądowania w genomie^8-10Możliwość ta umożliwiła ilościowy pomiar aktywności genu, a w niniejszym przypadku aktywności CRE^11-13 wykonalne. Produkcja transgenicznych muszek owocowych może zostać zlecona na zewnątrz, w tym integracja oparta na phiC31, co eliminuje konieczność zakupu kosztownego sprzętu i/lub posiadania biegłości w specjalistycznych protokołach mikroiniekcji transgenów.

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy ogólny protokół służący do ilościowej oceny CRE′aktywność i wykazać, w jaki sposób podejście to można wykorzystać do pomiaru wpływu wprowadzonej mutacji na element odpowiedzi cis (CRE)′aktywności oraz w celu porównania aktywności ortologicznych elementów regulacyjnych (CRE). Choć podane przykłady dotyczą CRE aktywnego podczas metamorfozy muszki owocówki, podejście to można zastosować do innych etapów rozwoju, gatunków muszek owocówek lub organizmów modelowych. W ostateczności szersze zastosowanie tej metody w badaniu CRE powinno przyczynić się do lepszego zrozumienia logiki regulacyjnej oraz tego, jak logika ta może się różnić i ewoluować.

Protokół

Przegląd:

Niniejszy film prezentuje protokół umożliwiający ilościowy pomiar aktywności regulacyjnej genów dla sekwencji elementów cis-regulatorowych (CRE) u Drosophila (D.) melanogaster. Protokół ten może być wykorzystany do porównania aktywności regulacyjnej posiadanej przez: formy CRE typu dzikiego i zmutowane, naturalnie występujące allele CRE w obrębie gatunku lub ortologiczne CRE między gatunkami rozdzielonymi ewolucyjnie.

1. Integracja transgenów reporterowych w określone miejsce genomu Drosophila melanogaster

A. Konstrukcja transgenu reporterowego

1. W pierwszym kroku każdy oceniany CRE musi zostać osobno sklonowany do wektora reporterowego, który zawiera (1) sekwencję miejsca przyłączenia bakteryjnego attB stosowaną do miejsce-specyficznej integracji transgenu^8-11, (2) wielomiejscowy klonowy obszar (MCS) powyżej (3) promotora heterologicznego, za którym następuje (4) sekwencja kodująca białko fluorescencyjne (takie jak EGFP lub DsRed).
2. Chociaż każdy wektor można dostosować do miejsce-specyficznej integracji zapośredniczonej przez phiC31 poprzez wprowadzenie sekwencji attB do szkieletu wektora, wektor pS3aG12-14 można uzyskać z repozytorium plazmidów Addgene (http://www.addgene.org/pgvec1). pS3aG jest zmodyfikowaną wersją wektora transformacyjnego opartego na P15, w której jeden z dwóch izolatorów gypsy został zastąpiony izolatorem SfIb; zawiera on rozszerzony wielomiejscowy klonowy obszar oraz sekwencję o długości 250 par zasad zawierającą miejsce przyłączenia attB. Interesujące CRE są wstawiane do wielomiejscowego klonowego obszaru powyżej minimalnego promotora hsp70 i genu EGFP, który koduje ulepszoną wersję zielonego białka fluorescencyjnego lokalizującego się w jądrze komórkowym.

B. Specyficzna dla miejsca integracja transgenów reporterowych

1. W przypadku zestawu CRE, których aktywności mają zostać porównane jako część wektorów transgenów reporterowych, utworzone wektory są oddzielnie integrowane w to samo miejsce lądowania w genomie. W tym procesie białko integrazy faga phiC31 katalizuje jednokierunkową rekombinację pomiędzy bakteryjnym miejscem przyłączenia (attB) w wektorze transgenu a genomowo zlokalizowanym miejscem przyłączenia faga (attP)⁹. Kilka grup^8-11 stworzyło różnorodne linie transgeniczne zawierające miejsce attP (tzw. miejsca lądowania) oraz genomowe źródło⁸ phiC31, które wykazuje ekspresję tego białka w komórkach linii zarodkowej. Linie much te można łatwo pozyskać z centrum zasobów Drosophila w Bloomington (http://flystocks.bio.indiana.edu/).
2. Istnieje opublikowany protokół szczegółowo opisujący sposób tworzenia transgenicznych Drosophila w sposób specyficzny dla danej lokalizacji przy użyciu integrazy phiC31¹⁶. Wyposażenie i wiedza techniczna niezbędna do tworzenia linii transgenicznych Drosophila nie są już wymagane, ponieważ istnieje kilku dostawców (Tabela 1), do których można zlecić tę usługę.
3. Zachowanie transgenu może się znacznie różnić w zależności od tkanki¹¹. W związku z tym pojedyncze miejsce lądowania attP nie jest optymalne dla analizy wszystkich CRE, stadiów rozwojowych i/lub badanych tkanek. Zaleca się ocenę aktywności interesującego CRE w kilku różnych miejscach lądowania, aby znaleźć miejsce, w którym aktywność CRE jest reprezentatywna dla wzorca ekspresji endogennego(ych) genu(ów) docelowego(ych).
4. W przypadku uzyskanych linii transgenicznych zaleca się doprowadzenie ich do stanu homozygotyczności pod względem transgenu. Aktywność CRE jest zazwyczaj silniejsza u osobników posiadających dwie kopie transgenu, a w przypadku pomiarów ilościowych niezbędne jest przeprowadzanie porównań między osobnikami o tej samej liczbie kopii transgenu. Osobniki homozygotyczne można uzyskać przy użyciu chromosomów balancerowych. Jednak w przypadku dobrze scharakteryzowanych miejsc lądowania często prostsze jest zbieranie dziewiczych samców i samic i krzyżowanie tych z bardziej intensywnym fenotypem koloru oczu nadanym przez gen mini-white (Rys. 1), ponieważ ratowanie mutantu white zapewnione przez zintegrowany wektor transgenu jest bardziej wyraźne u osobników z dwiema kopiami wektora.

2. Pozyskiwanie okazów lub tkanek na odpowiednim etapie rozwoju

Należy pozyskać materiał do analizy w momencie rozwoju, w którym endogennie występuje interesujący nas wzór ekspresji genów, a zatem w czasie, gdy badany element regulacyjny (CRE) powinien aktywować ekspresję genu reporterowego. W przypadku Drosophila mogą to być stadia embrionalne, larwalne, pociwkowe lub imago. Poniżej opisujemy metodę określania stadiów rozwoju much dorosłych oraz w trakcie metamorfozy; ta druga zachodzi wewnątrz puparium, czyli twardej skórki larwalnej, w której znajduje się nieruchomy okaz aż do momentu wyklucia się w postaci imago.

1. Rozmnażaj linie transgeniczne, aby zapewnić dostępność okazów we właściwym stadium rozwoju w momencie rozpoczęcia analizy ekspresji genu reporterowego za pomocą mikroskopii konfokalnej. Przygotuj dwie fiolki, w każdej z kilkoma (˜5- 10) muchami samcami i samicami. Co drugi dzień przenosź muchy z jednej z fiolek do nowej, nieużywanej fiolki. Powtarzaj tę czynność przez tydzień. Po dwóch tygodniach dostępne będą transgeniczne muszki owocowe na różnych etapach rozwoju, od stadiów larwalnych po dorosłe.
2. Określanie wieku dorosłych much: Czas przebywania w puparium wynosi 98 godzin dla samic i 102 godziny dla samców przy hodowli w temperaturze 25°C. Dorosłe muchy można łatwo zebrać w momencie wyjścia z puparium (tzw. eklozja). Ten punkt czasowy można uznać za 0 godzin po eklozji. Dorosłe muchy można hodować aż do wymaganego punktu czasowego analizy. Na przykład element regulacyjny (CRE) o nazwie mel-oe1, który kontroluje ekspresję genu desatF w dorosłych oenocytach samic D. melanogaster, nie jest aktywny bezpośrednio po eklozji, a jego aktywność włącza się po jednym dniu¹⁴. Po osiągnięciu właściwego stadium znieczul muchy, umieść je w kropli oleju halocarbonowego na szkiełku i przystąp do oceny konfokalnej.
3. Określanie wieku okazów podczas metamorfozy: Pod koniec trzeciego stadium larwalnego tworzy się puparium. Chociaż na tym etapie zwierzę technicznie wciąż jest larwą trzeciego stadium, etap ten jest łatwo identyfikowalny, ponieważ okaz jest nieruchomy, puparium jest miękkie i białe, a przetchlinki są wyewaginowane (Rys. 2A). Ten punkt czasowy można uznać za 0 godzin po uformowaniu puparium (hAPF). Na tym etapie samce można odróżnić od samic po obecności symetrycznie rozmieszczonych gonad w pobliżu środka ciała, które wyglądają jak półprzezroczyste kółka (obramowane na Rys. 2A i wskazane czarną strzałką na 2A").

1. Wyznaczanie stadium na podstawie czasu trwania przeobrażenia:

W 0 hAPF okazy można przenieść do nowej fiolki lub cdeployedczarki Petriego za pomocą zwilżonego pędzla. Aby zapobiec wysychaniu okazów, należy dodać kawałek chusteczki Kimwipe i zwilżyć go wodą. Fiolkę lub czarkę należy przenieść do inkubatora z temperaturą 25°C aż do osiągnięcia pożądanej wartości hAPF.

2. Określanie stadium na podstawie widocznych cech morfologicznych:

Często analizowanie próbek pod kątem aktywności CRE w konkretnym punkcie czasowym po pobraniu próbek w 0 hAPF jest niepraktyczne. Alternatywnie można zidentyfikować prawidłowo stadiowane próbki w dogodnym momencie analizy, opierając się na obecności i położeniu kilku markerów morfologicznych (szczegóły poniżej), które są widoczne przez puparium lub po jego usunięciu (Rys. 2).

2a. Kryteria morfologiczne do przybliżonej oceny stadium metamorfozy:

• 0 hAPF: Biały etap przepoczwarki, w którym larwa przestaje się poruszać; przedsionkowe przetchawice wywinięte (strzałka na Ryc. 2A); boczne tchawiki widoczne; miękkie białe puparium (Ryc. 2A).
• ˜14 hAPF: Puparium brunatne i stwardniałe; worek głowy wywinięty; boczne tchawiki i gonady mniej wyraźne; odnóża i skrzydła całkowicie wyciągnięte wzdłuż odwłoka; cewki Malpighiego nie są jeszcze wyraźne i zielone (obszar w przerywanej ramce na Ryc. 2B); oczy są bezbarwne (Ryc. 2B').
• ˜25 hAPF: Dwie równoległe cewki Malpighiego wyraźne i zielone (obszar w przerywanej ramce na Ryc. 2C).
• ˜40 hAPF: Ciemnozielono-żółte ciało umiejscowione między przednimi końcami cewek Malpighiego (czerwony grot strzałki na Ryc. 2D).
• ˜50 hAPF: Żółte ciało umiejscowione w połowie długości cewek Malpighiego (obszar w ramce na Ryc. 2E i powiększony na 2E''), a oczy mają bursztynowy kolor w przypadku typu dzikiego dla genu white (niezbędnego dla czerwonego koloru oczu). Kolor oczu nie występuje na tym etapie, gdy fenotyp mutanta white jest ratowany przez gen mini-white, który jest częścią zintegrowanego wektora transgenu reporterowego (Ryc. 2E').
• ˜70 hAPF: Widoczne grzbietowe mikrochaety i makrochaety klatki piersiowej (Ryc. 2F, strzałka); żółte ciało umiejscowione w tylnej części cewek Malpighiego (obszar w ramce na Ryc. 2F i powiększony na 2F''); kolor oczu jest bladoróżowy w przypadku ratowania przez gen mini-white (Ryc. 2F').
• ˜80 hAPF: Końcówki skrzydeł szare; cewki Malpighiego znajdują się przed połową długości odwłoka (obszar w ramce na Ryc. 2G i powiększony na 2G"); widoczne są fałdy między segmentami odwłoka oraz szczecinki na tergitach odwłoka (Ryc. 2G i 2G"); a ratowany kolor oczu jest jaskrawoczerwony (Ryc. 2G').
• ˜90 hAPF: Skrzydła ściemniałe do czerni; cewki Malpighiego i żółte ciało przysłonięte przez brunatnienie tergitów; szczecinki klatki piersiowej (strzałka) i odwłoka są dojrzałe i ściemniałe (Ryc. 2H); na grzbietowym tylnym końcu odwłoka pojawia się zielone mekonium (Ryc. 2H'').

Uwagi:

1. W późnych etapach metamorfozy płeć okazów można określić na podstawie morfologii narządów płciowych (groty strzałek na rys. 2I i 2J) lub obecności ciemnych grzebieni płciowych na pierwszej parze nóg samców.
2. Większą precyzję w określaniu stadiów można osiągnąć, biorąc pod uwagę dodatkowe markery morfologiczne, opisane wcześniej¹⁷.

D. Kroki w celu usunięcia okazu z puparium:

1. Używając taśmy laboratoryjnej, przyklej kawałek taśmy pakowej do deski sekcyjnej stroną klejącą do góry.
2. Zmocz pędzel i zwilż preparaty w pupariach. Za pomocą pędzla przenieś preparaty na chusteczkę Kimwipe.
3. Używając pęsety lub pędzla, przenieś preparaty na taśmę pakową i przyklej je stroną grzbietową do góry (zakrzywiona strona puparium).
4. Pozostaw preparaty do wyschnięcia na około 15 minut. Suche puparia są znacznie łatwiejsze do otwarcia niż wilgotne. Na tym etapie można dokonać wstępnej oceny stadium rozwoju preparatów na podstawie markerów morfologicznych widocznych przez puparium.
5. Używając pęsety, stopniowo otwieraj puparium, zaczynając od przedniego operculum i kierując się w stronę końca tylnego. Jeśli wymagana jest bardziej precyzyjna sekcja w celu wyizolowania konkretnej tkanki, można ją przeprowadzić w szkiełku zegarkowym z roztworem PBS. W przeciwnym razie przenieś poczwarki do kropli lepkiego oleju halokarbonowego HC700 (Sigma-Aldrich) na szkiełku mikroskopowym.
6. Umieść preparaty na szkiełku i korzystając ze stereomikroskopu oraz opisanych powyżej kryteriów (sekcja 2a), określ stadium rozwoju preparatu.

3. Ocena ekspresji genu reporterowego w próbce preparatu całkowitego za pomocą mikroskopii konfokalnej

1. W przypadku preparatów w całości (whole mount), należy użyć obiektywów 4X lub 10X. Wykorzystując fluorescencję wzbudzaną lampą rtęciową lub alternatywnie obserwując preparat w polu jasnym, należy ustawić stoły mikroskopu tak, aby umieścić preparat w polu optycznym, a następnie ustawić ostrość.
2. Za pomocą oprogramowania mikroskopu konfokalnego należy dostosować długość fali wzbudzenia dla EGFP (lub odpowiednią długość fali w przypadku użycia innego białka fluorescencyjnego).
3. Aby zapobiec fotobleachingowi preparatu, należy rozpocząć od intensywności lasera na poziomie 5-10%. Jeśli sygnał jest niewystarczający, należy zwiększyć intensywność w razie potrzeby.
4. W celu poprawy stosunku sygnału do szumu w obrazach konfokalnych należy włączyć w oprogramowaniu ustawienia uśredniające pomiary pikseli z powtórzonych skanów, takie jak uśrednianie Kalmana lub uśrednianie linii i stosów. Z naszego doświadczenia wynika, że uśrednianie Kalmana dla trzech skanów poprawia stosunek sygnału do szumu, nie wydłużając nadmiernie czasu zbierania obrazów.
5. Dla ilościowych porównań aktywności CRE kluczowe jest, aby intensywność fluorescencji preparatu nie spowodowała nasycenia wielu pikseli. Wykorzystując sekcję z (z-section), w której fluorescencja wydaje się najintensywniejsza, należy dostosować ustawienia tak, aby nasycona była niewielka liczba pikseli. Można to osiągnąć, przełączając się na tabelę wyszukiwania z ostrzeżeniem o nasyceniu (saturation-warning lookup table) i regulując napięcie kanału, wzmocnienie (gain) oraz przesunięcie (offset) do wartości, przy których nasycone jest niewiele pikseli. Na koniec, w celu zebrania wystarczającego sygnału z preparatu, często konieczne jest dostrojenie apertury konfokalnej.
6. Po ustaleniu optymalnych ustawień należy przeprowadzić skan z (z-scan).
7. Po zakończeniu skanowania należy przekształcić stos obrazów w projekcję i zapisać obraz w formacie Tagged Image File Format lub „TIFF”.

Uwaga:

1. Niezbędne jest stosowanie tych samych ustawień konfokalnych dla wszystkich powtórzeń próbek oraz linii z transgenem reporterowym, które zostaną uwzględnione w ilościowym porównaniu aktywności CRE.

4. Ilościowe określanie aktywności elementów cis-regulatorowych

Choć niektóre oprogramowania do akwizycji konfokalnej umożliwiają dalsze przetwarzanie obrazów projekcyjnych, preferujemy stosowanie bezpłatnego programu Image J do oceny obrazów konfokalnych¹⁸. Za pomocą programu Image J ¹⁸ zarejestrowane wzorce ekspresji GFP można skwantyfikować jako statystyki wartości pikseli w określonym obszarze. Chociaż obrazy nie muszą być w skali szarości, preferujemy taką formę.

1. Po uruchomieniu programu Image J otwórz obraz w formacie TIFF przeznaczony do oceny.
2. Kliknij przycisk zaznaczania ręcznego (freehand selection) i obrysuj obszar preparatu, dla którego pożądana jest kwantyfikacja; na przykład region na Rysunku 3 wewnątrz żółtej przerywanej linii. (patrz Uwaga a poniżej dotycząca wyboru obszaru do kwantyfikacji).
3. Aby uzyskać statystykę wartości pikseli, kliknij kartę Analyze, a następnie wybierz measure. Pojawi się okno wyników wyświetlające pole powierzchni oraz średnią, minimalną i maksymalną wartość pikseli. Zapisz średnią wartość pikseli i powtórz czynność, aby wygenerować statystyki wartości pikseli dla powtórzeń preparatów (patrz Uwaga b dotycząca liczby powtórzeń).
4. Zalecamy pobranie drugiej średniej wartości pikseli z regionu kontrolnego, w którym CRE nie jest aktywny; na przykład regionu na Rysunku 3 wewnątrz czerwonej przerywanej linii. Tę drugą wartość można odjąć od pierwszej, aby usunąć wpływ tła z pomiaru i uzyskać skorygowaną średnią wartość pikseli. W naszym doświadczeniu dodatkowo redukuje to zmienność między powtórzeniami preparatów (patrz Uwaga c dotycząca wyboru wielkości regionu kontrolnego).
5. Wykorzystaj skorygowane średnie wartości pikseli z powtórzeń preparatów do obliczenia średniej aktywności regulacyjnej dla CRE oraz błędu standardowego średniej. Tę wartość aktywności regulacyjnej i miarę błędu można porównać z innymi transgenami reporterowymi, w których sekwencja CRE jest inna (na przykład Rysunek 3).

Uwagi:

1. Program Image J umożliwia użytkownikowi wybór określonego kształtu i obszaru, dla którego zostanie wyznaczona średnia wartość pikseli. Jednakże, ponieważ rozmiar preparatów często się różni, preferujemy użycie narzędzia Freehand selection (wybór ręczny) do określenia obszaru podlegającego ocenie dla każdego preparatu.
2. Większa liczba powtórzeń (N) pozwala na lepsze oszacowanie średniej aktywności regulacyjnej dla danego CRE. Uznajemy, że wartość N w zakresie od 4 do 8 jest zazwyczaj wystarczająca.
3. W naszym doświadczeniu rozmiar wybranego obszaru kontrolnego ma niewielki wpływ na zmierzoną średnią wartość pikseli dla regionu kontrolnego. Zazwyczaj wybieramy obszar o rozmiarze proporcjonalnym do obszaru badanego.

5. Reprezentatywne wyniki:

Wersja typu dzikiego elementu regulacyjnego (CRE) D. melanogaster, nazwana Dimorphic Element¹³, napędza wysoki poziom ekspresji reportera EGFP w segmencie brzusznym A6 poczekuśników żeńskich (Ryc. 3A). Stwierdzono, że sekwencja o długości 13 par zasad w obrębie tego elementu jest miejscem wiązania czynnika transkrypcyjnego DSX, a znaczenie tej sekwencji in vivo można wykazać poprzez ilościowe określenie aktywności regulacyjnej tego CRE po zmutowaniu wspomnianego miejsca wiązania. Przyjmując aktywność regulacyjną typu dzikiego Dimorphic Element za 100±5%, mutacja miejsca DSX zredukowała aktywność regulacyjną do 28±3%. Podobne porównania aktywności regulacyjnej można przeprowadzić dla wewnątrzgatunkowych alleli CRE lub pomiędzy ortologicznymi CRE z różnych gatunków. Na przykład, przyjmując poziom EGFP w żeńskim segmencie A6 napędzany przez szczep D. melanogaster Canton S za aktywność regulacyjną na poziomie 100±4%, stwierdzono, że ortologiczne CRE dla gatunków D. simulans oraz D. willistoni wykazują aktywności regulacyjne odpowiednio równe 75±4% i 0±0% (Ryc. 3B).

Rycina 1. Wykorzystanie intensywności fenotypu oczu poyratowanego genem white do uzyskania linii transgenicznych homozygotycznych. W celu ilościowej oceny transgenów reporterowych ważne jest, aby każdy osobnik posiadał ten sam genotyp transgenu reporterowego. (A) Tło genetyczne mutanta genu white z sekwencją miejsca lądowania attP jest wykorzystywane do specyficznej integracji transgenu w danym miejscu. Osobniki transgeniczne (B) hemizygotyczne oraz (C) homozygotyczne pod względem zintegrowanego wektora można zazwyczaj odróżnić na podstawie intensywności uratowanego fenotypu koloru oczu, zależnej od liczby kopii zintegrowanego genu mini white. Linie homozygotyczne można ustanowić poprzez krzyżowanie (C) samców i samic wykazujących najciemniejszy fenotyp koloru oczu.

Rysunek 2. Wykorzystanie markerów morfologicznych do określenia stadium metamorfozy u Drosophila. Podczas metamorfozy z larwy w dorosłą muszkę owocówkę, okaz przechodzi przez serię stereotypowych form morfologicznych, które można wykorzystać do określenia płci oraz przybliżonego etapu rozwoju. Okazy na panelach B-H zostały usunięte z pupariów. Ramki na panelach A, E, F, G i H wskazują odpowiednio powiększone obszary dla paneli A", E", F", G" i H".

Rycina 3. Ilościowe porównanie aktywności elementów regulacyjnych cis. Dla wszystkich próbek ekspresję genu reporterowego EGFP pośredniczoną przez konkretny element dymorficzny oceniano u samic w 80 godzinie po utworzeniu puparium. Liczba u góry każdego obrazu to poziom ekspresji EGFP dla danego osobnika, obliczony jako średnia wartość piksela dla segmentu brzusznego A6 (wskazanego dla obrazu w lewym górnym rogu jako obszar wewnątrz żółtej przerywanej ramki) pomniejszona o średnią wartość piksela dla segmentu A4 (korekcja tła; wskazana dla obrazu w lewym górnym rogu jako obszar wewnątrz czerwonej przerywanej ramki). Dla każdego transgenu reporterowego oceniono cztery powtórzenia, aby obliczyć średnią wartość piksela segmentu A6. Aktywność regulacyjną przedstawiono jako % średniej wartości piksela u samic (A) typu dzikiego lub (B) szczepu Canton S ±SEM. (A) Ekspresja GFP u samic posiadających allel typu dzikiego elementu dymorficznego oraz wersję zmutowaną, w której usunięto pojedyncze miejsce wiązania dla czynnika transkrypcyjnego DSX. To zmutowane miejsce wiązania zredukowało aktywność elementu dymorficznego do 28±3% aktywności sekwencji typu dzikiego. (B) Porównanie aktywności regulacyjnej sekwencji ortologicznych do elementu dymorficznego D. melanogaster (szczep Canton S). Przyjmując ekspresję GFP pośredniczoną przez allel elementu dymorficznego D. melanogaster za 100%, sekwencje ortologiczne z pokrewnych gatunków D. simulans i D. willistoni wykazują odpowiednio aktywności na poziomie 75±4% i 0±0%.

6. Materiały

Materiał Nazwa	Typ	Firma	Numer katalogowy	Komentarz
Integracja transgenu w określonym miejscu genomu	Usługa	Najlepszy gen	Plan H	Wybierz miejsce integracji, odbierz linie transformowane
Olej halowęglowy	Odczynnik	Sigma-Aldrich	H8898	Stosowane do montowania preparatów do obrazowania konfokalnego
Pinceta Dumont nr 5	Narzędzie	Fine Science Tools	11252-40	Precyzyjnie zaostrzone i trwałe, odpowiednie do sekcji
SZ61 Stereomikroskop z zoomem	Narzędzie	Olympus	Konfigurowalny	Doskonała optyka do pracy z muszkami owocowymi
Mikroskop konfokalny FluoView	Narzędzie	Olympus	Konfigurowalny	Zapewnia wysokorozdzielcze obrazy konfokalne

Dyskusja

cis-elementy regulacyjne kodują program genomiczny określający wzorce ekspresji genów, a tym samym proces rozwoju¹, i stanowią kluczowe miejsca zarówno dla mutacji leżących u podstaw ewolucji morfologicznej^2-4, jak i zmienności fenotypowej cech ludzkich^5,6,19. Pomimo tego znaczenia, logika regulacyjna CRE pozostaje słabo poznana. Główną przyczyną tego deficytu wiedzy był brak odpowiednich metod do ilościowego porównywania funkcjonalnych sekwencji CRE. W niniejszym opracowaniu prz...