Ilościowe porównanie aktywności elementu cis-regulatorowego (CRE) u transgenicznej Drosophila melanogaster

Podsumowanie

Zmienność fenotypowa cech może wynikać z mutacji w sekwencjach elementów cis-regulatorowych (CRE), które kontrolują wzorce ekspresji genów. Metody uzyskane do stosowania u Drosophila melanogaster mogą ilościowo porównywać poziomy przestrzennych i czasowych wzorców ekspresji genów, w których pośredniczą zmodyfikowane lub naturalnie występujące warianty CRE.

Streszczenie

Wzorce ekspresji genów są określane przez sekwencje elementów cis-regulatorowych (CRE), które są również nazywane wzmacniaczami lub modułami cis-regulatorowymi. Typowy CRE posiada układ miejsc wiązania dla kilku białek czynnika transkrypcyjnego, które nadają logikę regulacyjną określającą, kiedy, gdzie i na jakim poziomie regulowany gen (geny) ulega ekspresji. Pełny zestaw CRE w genomie zwierzęcym koduje program rozwoju organizmu¹, a badania empiryczne i teoretyczne wskazują, że mutacje w CRE odegrały znaczącą rolę w ewolucji morfologicznej^2-4. Co więcej, badania asocjacyjne całego genomu ludzkiego wskazują, że zmienność genetyczna w CRE w znacznym stopniu przyczynia się do zmienności fenotypowej^5,6. Tak więc zrozumienie logiki regulacyjnej i tego, jak mutacje wpływają na taką logikę, jest głównym celem genetyki.

Transgeny reporterowe stanowią potężną metodę badania funkcji in vivo CRE. W tym przypadku znana lub podejrzewana sekwencja CRE jest sprzężona z heterologicznymi sekwencjami promotorowymi i kodującymi gen reporterowy kodujący łatwo obserwowalny produkt białkowy. Kiedy transgen reporterowy jest wprowadzany do organizmu gospodarza, aktywność CRE staje się widoczna w postaci zakodowanego białka reporterowego. Transgeneza za pośrednictwem elementu P u muszki owocowej Drosophila (D.) melanogaster⁷ była stosowana przez dziesięciolecia do wprowadzania transgenów reporterowych do tego organizmu modelowego, chociaż umiejscowienie transgenów w genomie jest losowe. W związku z tym na aktywność genu reporterowego duży wpływ ma lokalna chromatyna i środowisko genów, co ogranicza porównania CRE do jakościowych. W ostatnich latach system integracji oparty na phiC31 został przystosowany do stosowania u D. melanogaster w celu wprowadzania transgenów do określonych miejsc lądowania genomu^8-10. Ta zdolność umożliwiła ilościowy pomiar genu i, co jest istotne, aktywność CRE^11-13. Produkcja transgenicznych muszek owocowych może być zlecana na zewnątrz, w tym integracja oparta na phiC31, eliminując potrzebę zakupu drogiego sprzętu i/lub biegłości w specjalistycznych protokołach wstrzykiwania transgenów.

Tutaj prezentujemy ogólny protokół do ilościowej oceny aktywności CRE i pokazujemy, jak to podejście może być wykorzystane do pomiaru wpływu wprowadzonej mutacji na aktywność CRE i do porównania aktywności ortologicznych CRE. Chociaż podane przykłady dotyczą CRE aktywnego podczas metamorfozy muszki owocowej, podejście to można zastosować do innych etapów rozwojowych, gatunków muszek owocowych lub organizmów modelowych. Ostatecznie, szersze zastosowanie tego podejścia do badania CRE powinno przyczynić się do lepszego zrozumienia logiki regulacyjnej oraz tego, jak logika może się zmieniać i ewoluować.

Protokół

Przegląd:

Ten film demonstruje protokół zdolny do ilościowego pomiaru aktywności regulatora genów dla sekwencji cis-regulatorowych elementów (CRE) u Drosophila (D.) melanogaster. Protokół ten może być wykorzystany do porównania aktywności regulacyjnej posiadanej przez: dzikie i zmutowane formy CRE, naturalnie występujące allele CRE znalezione w obrębie gatunku lub ortologiczne CRE między rozbieżnymi gatunkami.

1. Specyficzna dla miejsca integracja transgenów reporterowych z genomem Drosophila melanogaster

A. Reporter transgenu budowy

1. W pierwszym kroku każdy oceniany CRE musi zostać oddzielnie sklonowany do wektora reporterowego, który zawiera (1) sekwencję miejsca przyczepiania bakterii attB używaną do specyficznej dla miejsca integracji transgenu^8-11, (2) wielokrotne miejsce klonowania przed (3) heterologicznym promotorem, po którym następuje (4) sekwencja kodująca dla białka fluorescencyjnego (takiego jak EGFP lub DsRed).
2. Podczas gdy każdy wektor może być kompatybilny z integracją specyficzną dla miejsca za pośrednictwem phiC31 poprzez wprowadzenie sekwencji attB do szkieletu wektora, wektor pS3aG12-14 można uzyskać z repozytorium plazmidów addgene (http://www.addgene.org/pgvec1) pS3aG jest dostosowaną wersją wektora transformacji opartego na P15, w którym jeden z dwóch izolatorów cygańskich został zastąpiony izolatorem SfIb, zawiera ulepszone miejsce wielokrotnego klonowania i posiada sekwencję 250 par zasad zawierającą miejsce przyłączenia attB. Interesujące CRE są umieszczane w wielu miejscach klonowania przed minimalnym promotorem hsp70 i genem EGFP, który koduje ulepszoną wersję białka zielonej fluorescencji, które lokalizuje się w jądrze.

B. Specyficzna dla miejsca integracja transgenów reporterowych

1. W przypadku zbioru CRE, których działania mają być porównywane jako część reporterowych wektorów transgenowych, utworzone wektory są oddzielnie integrowane z tym samym genomowym miejscem lądowania. W tym przypadku białko integrazy fagowej phiC31 katalizuje jednokierunkową rekombinację między miejscem przyłączenia bakterii (attB) w wektorze transgenu a zlokalizowanym genomowo miejscem przyłączenia faga (attP)⁹. Kilka grup^8-11 wytworzyło różne linie transgeniczne, które obejmują miejsce attP (tak zwane miejsca lądowania) i zawierają źródło genomowe⁸ phiC31, które wyraża to białko w komórkach rozrodczych. Te stada much można łatwo uzyskać w centrum stada Bloomington Drosophila (http://flystocks.bio.indiana.edu/).
2. Istnieje opublikowany protokół szczegółowo opisujący, w jaki sposób tworzyć transgeniczne miejsce Drosophila specyficznie dla miejsca przy użyciu integrazy phiC31¹⁶. Sprzęt i wiedza techniczna do produkcji transgenicznych linii Drosophila nie są już potrzebne, ponieważ istnieje kilku dostawców (tabela 1), którym można zlecić tę usługę.
3. Zachowanie transgenu może się znacznie różnić w zależności od jednej tkanki do następnych. W związku z tym pojedyncze miejsce lądowania attP nie jest optymalne do analizy wszystkich CRE, etapów rozwoju i/lub badanych tkanek. Wskazane jest dokonanie oceny aktywności CRE będącego przedmiotem zainteresowania w kilku różnych miejscach lądowania w celu znalezienia miejsca, w którym aktywność CRE jest reprezentatywna dla endogennego wzorca ekspresji docelowego genu (genów docelowych).
4. W przypadku otrzymanych linii transgenicznych wskazane jest, aby były one homozygotyczne dla transgenu. Aktywność CRE jest na ogół silniejsza u osób z dwiema kopiami transgenu, a w przypadku pomiarów ilościowych konieczne jest dokonywanie porównań między osobami z tą samą liczbą kopii transgenu. Osobniki homozygotyczne można uzyskać poprzez zastosowanie chromosomów równoważących. Jednak w przypadku dobrze scharakteryzowanych miejsc lądowania często łatwiej jest zebrać dziewicze samce i samice oraz skrzyżować te z bardziej intensywnym fenotypem koloru oczu nadanym przez gen mini-biały (ryc. 1), ponieważ ratunek dla białych mutantów zapewniany przez zintegrowany wektor transgenu jest bardziej dramatyczny u osób z dwiema kopiami wektorów.

2. Pobieranie próbek lub tkanek w odpowiednim stadium rozwoju

Zdobądź próbki do analizy w momencie rozwoju, kiedy interesujące nas wzorce ekspresji genów występują endogennie, stąd czas, w którym badany CRE powinien aktywować ekspresję genu reporterowego. W przypadku Drosophila może to być stadium embrionalne, larwalne, poczwarkowe lub dorosłe. Poniżej opisujemy metodę inscenizacji much dorosłych i metamorficznych; To ostatnie ma miejsce wewnątrz poczwarki, twardej skóry larwalnej, która zawiera nieruchomy okaz, dopóki nie zamknie się jako osoba dorosła.

1. Rozszerz linie transgeniczne, aby zapewnić dostępność próbek w odpowiednim stadium, gdy będą gotowe do analizy ekspresji genu reporterowego za pomocą mikroskopii konfokalnej. Ustaw dwie fiolki, każda z kilkoma ( ̃5-10) samcami i samicami much. Co drugi dzień należy przebić muchy z jednej z fiolek do niewykorzystanej fiolki. Powtarzaj to przez tydzień. Pod koniec dwóch tygodni dostępne będą transgeniczne muszki owocowe, które wahają się od stadium larwalnego do dorosłego rozwoju.
2. Inscenizacja dorosłych much: Czas spędzony w poczwarce wynosi 98 godzin dla samic i 102 godziny dla samców w przypadku hodowli w temperaturze 25°C. Dorosłe muchy można łatwo zebrać, gdy wyjdą z poczwarki (tzw. ekluzja). Ten punkt czasu można uznać za 0 godzin po zamknięciu. Dorosłe muchy mogą być hodowane do wymaganego punktu czasowego do analizy. Na przykład CRE o nazwie mel-oe1, który kontroluje ekspresję genu desatF w dorosłych enocytach samic D. melanogaster, nie jest aktywny natychmiast po eklozji, ale aktywność CRE włącza się po jednym dniu¹⁴. Po uzyskaniu prawidłowego etapu znieczulenie muchy i umieszczenie w kropli oleju Halocarbon na szkiełku i przystąp do oceny konfokalnej.
3. Klasyfikacja okazów podczas metamorfozy: Pod koniec stadium larwalnego w trzecim stadium rozwojowym tworzy się poczwarka. Chociaż na tym etapie zwierzę technicznie jest nadal larwą w trzecim stadium rozwojowym, ten etap rozwoju jest łatwy do zidentyfikowania, ponieważ okaz jest nieruchliwy, poczwarka jest miękka i biała, a przetchlinki są zawsze zaniknięte (ryc. 2A). Ten punkt czasowy można uznać za 0 godzin po utworzeniu się puparium (hAPF). Na tym etapie samce można odróżnić od samic po obecności obustronnie położonych gonad w pobliżu środka ciała, które wyglądają jak półprzezroczyste koła (obramowane na ryc. 2A i oznaczone czarną strzałką w 2A").

1. Inscenizacja na podstawie długości metamorfozy:

Przy 0 hAPF, próbki mogą być przenoszone do świeżej fiolki lub szalki Petriego za pomocą zwilżonego pędzla. Aby zapobiec wysychaniu okazów, dodaj kawałek Kimwipe i zwilż wodą. Przenieść fiolkę lub szalkę do inkubatora w temperaturze 25°C do uzyskania pożądanego hAPF.

2. Klasyfikacja według widocznych cech morfologicznych:

Często niewygodne jest analizowanie próbek pod kątem aktywności CRE w określonym punkcie czasowym po zebraniu 0 próbek hAPF. Alternatywnie, można zidentyfikować prawidłowo ustawione próbki w czasie dogodnym do analizy na podstawie obecności i położenia kilku markerów morfologicznych (szczegółowo opisanych poniżej), które są widoczne przez poczwarkę lub po usunięciu poczwarki (ryc. 2).

2a. Kryteria morfologiczne dla przybliżenia stadium metamorficznego:

• 0 hAPF: Białe stadium poczwarki, w którym larwa przestaje się poruszać; przetchlinki przednie zerwane (strzałka na ryc. 2A); widoczna tchawica boczna; miękkie białe poczwarka (ryc. 2A).
• ̃14 hAPF: Puparium garbowane i stwardniałe; worek głowy odcięty; tchawica boczna i gonady mniej wyraźne; nogi i skrzydła w pełni rozciągnięte wzdłuż brzucha; Kanaliki Malpighiego jeszcze niewydatne i zielone (przerywany obszar pudełkowy na ryc. 2B); oczy są niepigmentowane (ryc. 2B').
• ̃25 hAPF: Dwa równoległe kanaliki Malpighiego wydatne i koloru zielonego (przerywany obszar ramkowy na ryc. 2C).
• ̃40 hAPF: Ciemnozielony żółty korpus umieszczony między przednimi końcami kanalików Malpighiego (czerwony grot strzałki na ryc. 2D).
• ̃50 hAPF: Żółte ciało umieszczone w środkowym punkcie kanalików Malpighiego (obszar pudełkowy na ryc. 2E i powiększony w 2E''), a oczy są koloru bursztynowego w przypadku dzikiego genu dla białego genu (potrzebny do czerwonego koloru oczu). Na tym etapie, gdy biały zmutowany fenotyp jest ratowany przez gen mini-biały, który jest częścią zintegrowanego wektora transgenu reporterowego (ryc. 2E').
• ̃70 hAPF: Widoczne grzbietowe piersiowe mikroszczety i makroszczety (ryc. 2F, strzałka); żółte ciało umieszczone w tylnej części kanalików Malpighiego (obszar pudełkowy na ryc. 2F pudełkowy i powiększony w 2F''); kolor oczu jest bladoróżowy, gdy zostanie uratowany przez gen mini-biały (ryc. 2F').
• ̃80 hAPF: Końcówki skrzydeł szare; Kanaliki Malpighiego znajdujące się między przednim a środkowym punktem brzucha (obszar pudełkowy na ryc. 2G i powiększony w 2G"); widoczne są fałdy między segmentami brzusznymi i szczeciny na tergitach brzusznych (ryc. 2G i 2G"); a kolor uratowanych oczu jest jaskrawoczerwony (ryc. 2G').
• ̃90 hAPF: Skrzydła pociemniały do czerni; Kanaliki Malpighiego i żółte ciało przesłonięte garbowaniem tergitów; szczecina piersiowa (strzałka) i brzuszna są dojrzałe i ciemne (ryc. 2H); a zielona smółka pojawia się na grzbietowym tylnym końcu brzucha (ryc. 2H'').

Uwagi:

1. W późnych stadiach metamorfozy płeć osobników można określić na podstawie morfologii narządów płciowych (groty strzał na ryc. 2I i 2J) lub obecności przyciemnionych grzebieni płciowych na pierwszym zestawie męskich nóg.
2. Większą precyzję oceny stopnia zaawansowania można osiągnąć poprzez uwzględnienie dodatkowych markerów morfologicznych, jak opisano wcześniej¹⁷.

D. Kroki, aby usunąć okaz z poczwarki:

1. Za pomocą taśmy laboratoryjnej przyklej kawałek taśmy pakowej do deski rozwarstwiającej lepką powierzchnią skierowaną do góry.
2. Zwilż pędzel i nałóż wilgoć na przepoczwarzone okazy. Za pomocą pędzla przenieś próbki do Kimwipe.
3. Za pomocą kleszczy lub pędzla przenieś próbki na taśmę pakową i przyklej powierzchnią grzbietową skierowaną do góry (zakrzywiona strona poczwarki).
4. Pozostawić próbki do wyschnięcia na ̃15 minut. Suche poczwarki są znacznie łatwiejsze do otwarcia niż te, które są wilgotne. W tym momencie okazy mogą być grubo oznaczone za pomocą markerów morfologicznych widocznych przez poczwarkę.
5. Za pomocą kleszczy stopniowo otwieraj poczwarkę, zaczynając od przedniego wieczka i podążaj w kierunku tylnego końca. Jeśli do wyizolowania określonej tkanki potrzebna jest dokładniejsza sekcja, można to zrobić w szkiełku zegarkowym z roztworem PBS. W przeciwnym razie przenieś poczwarki do kropli lepkiego oleju halowęglowego HC700 (Sigma-Aldrich) na szkiełku mikroskopowym.
6. Umieścić próbki na szkiełku, używając mikroskopu stereoskopowego i stosując wyżej opisane kryteria (sekcja 2a), można określić stopień zaawansowania próbki.

3. Konfokalna mikroskopowa ocena ekspresji genu reporterowego w całej próbce wierzchowca

1. W przypadku całych prób z mocowaniem należy używać obiektywów 4X lub 10X. Używając fluorescencji stymulowanej ekspozycją na lampę rtęciową lub alternatywnie oglądając w jasnym polu, wyreguluj stolik mikroskopu, aby ustawić próbkę w polu optycznym, a następnie ustaw ostrość próbki.
2. Korzystając z oprogramowania mikroskopu konfokalnego, dostosuj długość fali wzbudzenia dla EGFP (lub odpowiednią długość fali w przypadku stosowania innego białka fluorescencyjnego).
3. Aby zapobiec fotowybielaniu próbki, zacznij od intensywności lasera 5-10%. Jeśli sygnał jest rozczarowujący, zwiększ intensywność w razie potrzeby.
4. Aby poprawić stosunek sygnału do szumu dla obrazów konfokalnych, włącz ustawienia oprogramowania, które uśredniają pomiary pikseli z powtórzonych skanów, takie jak uśrednianie Kalmana lub uśrednianie liniowe i stosowe. Z naszego doświadczenia wynika, że uśrednianie Kalmana dla trzech skanów poprawia stosunek sygnału do szumu, nie wydłużając przy tym czasu na zebranie obrazu.
5. Do ilościowych porównań aktywności CRE istotne jest, aby intensywność fluorescencji próbki nie nasyciła wielu pikseli. Używając przekroju z, w którym fluorescencja wydaje się najbardziej intensywna, dostosuj ustawienia tak, aby niewiele pikseli było nasyconych. Można to zrobić, przełączając się na tabelę przeglądową ostrzegającą o nasyceniu i dostosowując napięcie, wzmocnienie i przesunięcie kanału do ustawień, w których niewiele pikseli jest nasyconych. Wreszcie, aby zebrać wystarczający sygnał z próbki, często konieczne jest wyregulowanie apertury konfokalnej.
6. Po określeniu optymalnych ustawień uruchom z-scan.
7. Po zakończeniu skanowania przekonwertuj stos obrazów na projekcję i zapisz ten obraz w formacie Tagged Image File Format lub "TIFF".

Uwaga:

1. Niezbędne jest użycie tych samych ustawień konfokalnych dla wszystkich próbek replik i reporterowych linii transgenowych, które zostaną uwzględnione w ilościowym porównaniu aktywności CRE.

4. Kwantyfikacja aktywności pierwiastków cis-regulatorowych

Chociaż niektóre programy do akwizycji konfokalnej pozwalają na dalsze przetwarzanie obrazów projekcyjnych, wolimy korzystać z darmowego programu Image J do oceny obrazów konfokalnych¹⁸. Korzystając z obrazu J ¹⁸, zarejestrowane wzorce ekspresji GFP można określić ilościowo jako statystyki wartości pikseli w określonym obszarze. Chociaż obrazy nie muszą być w skali szarości, wolimy to robić.

1. Po uruchomieniu programu Image J otwórz obraz TIFF, który ma zostać oceniony.
2. Kliknij przycisk wyboru odręcznego i obrysuj obszar próbki, w którym pożądane jest określenie ilościowe; na przykład obszar na rysunku 3 w przerywanej żółtej obwódce. (Patrz uwaga a poniżej dotycząca wyboru obszaru do oceny ilościowej).
3. Aby uzyskać statystykę wartości pikseli, kliknij kartę Analizuj, a następnie wybierz miarę. Pojawi się pole wyników pokazujące obszar oraz średnią, minimalną i maksymalną wartość pikseli. Zapisz średni wynik wartości piksela i powtórz tę czynność, aby wygenerować statystyki wartości pikseli dla powtórzonych próbek (zob. uwaga b dotycząca liczby powtórzeń).
4. Zalecamy zebranie drugiej średniej wartości piksela z obszaru kontrolnego, w którym CRE nie jest aktywny; na przykład regionu na rysunku 3 w przerywanej czerwonej obwódce. Tę ostatnią wartość można odjąć od poprzedniej wartości, aby usunąć efekty tła z pomiaru w celu uzyskania skorygowanej średniej wartości piksela. Z naszego doświadczenia wynika, że to jeszcze bardziej zmniejsza zmienność między powtórzonymi próbkami (patrz uwaga c dotycząca wyboru wielkości dla regionu kontrolnego).
5. Użyj skorygowanych średnich wartości pikseli z powtórzonych próbek, aby obliczyć średnią aktywność regulacyjną dla CRE i błąd standardowy średniej. Tę wartość czynności regulacyjnej i pomiar błędu można porównać z innymi transgenami reporterowymi, w których sekwencja CRE różni się (na przykład rysunek 3).

Uwagi:

1. Obraz J pozwala użytkownikowi wybrać zdefiniowany kształt i obszar, na podstawie którego zostanie określony średni wynik wartości piksela. Ponieważ jednak rozmiar próbki często się zmienia, wolimy używać narzędzia do zaznaczania odręcznego, aby określić obszar, który ma być oceniany dla każdej próbki.
2. Większa liczba powtórzeń (N) skutkuje lepszym oszacowaniem średniej działalności regulacyjnej dla danego CRE. Okazuje się, że N między 4 a 8 jest na ogół wystarczające.
3. Z naszego doświadczenia wynika, że rozmiar wybranego obszaru kontrolnego ma niewielki wpływ na zmierzoną średnią wartość piksela dla obszaru kontrolnego. Ogólnie rzecz biorąc, wybieramy obszar o wielkości proporcjonalnej do obszaru zainteresowania.

5. Reprezentatywne wyniki:

Dzika wersja CRE D. melanogaster, zwana Elementem Dymorficznym¹³, napędza wysoki poziom ekspresji reportera EGFP w segmencie brzusznym A6 poczwarek żeńskich (Ryc. 3A). Stwierdzono, że sekwencja 13 par zasad w tym elemencie jest miejscem wiązania czynnika transkrypcyjnego DSX, a znaczenie tej sekwencji in vivo można wykazać, określając ilościowo aktywność regulacyjną dla tego CRE, gdy to miejsce wiązania jest zmutowane. Biorąc pod uwagę, że aktywność regulacyjna pierwiastka dymorficznego typu dzikiego wynosi 100±5%, mutacja tego miejsca DSX zmniejszyła aktywność regulacyjną do 28±3%. Podobne porównania można przeprowadzić w odniesieniu do działań regulacyjnych dla wewnątrzgatunkowych alleli CRE lub między ortologicznymi CRE z różnych gatunków. Na przykład, biorąc pod uwagę poziomy EGFP w segmencie żeńskim A6 napędzane przez szczep D. melanogaster Canton S jako aktywność regulacyjną 100±4%, stwierdzono, że ortologiczne CRE dla gatunku D. simulans i D. willistoni wykazują odpowiednio aktywność regulacyjną równą 75±4% i 0±0% (ryc. 3B).

Rysunek 1. Wykorzystanie intensywności fenotypu oka białego ratownika do uczynienia linii transgenicznych homozygotycznymi. Aby ilościowo ocenić transgeny reporterowe, ważne jest, aby każda próbka miała ten sam genotyp transgenu reporterowego. (A) Białe zmutowane tło genetyczne genu z sekwencją miejsca lądowania attP jest wykorzystywane do specyficznej dla miejsca integracji transgenu. Osobniki transgeniczne (B) hemizygotyczne i (C) homozygotyczne dla zintegrowanego wektora można zazwyczaj odróżnić na podstawie intensywności uratowanego fenotypu koloru oczu na podstawie liczby kopii zintegrowanego genu mini białego. Linie homozygotyczne można ustalić poprzez skrzyżowanie (C) samców i samic much o fenotypie najciemniejszego koloru oczu.

Rysunek 2. Wykorzystanie markerów morfologicznych do określenia stadium metamorficznego Drosophila. Podczas metamorfozy z larwy w dorosłą muszkę owocową okaz przechodzi przez szereg stereotypowych morfologii, które można wykorzystać do określenia płci i przybliżenia etapu rozwoju. Okazy w B-H zostały usunięte z ich poczwarki. Pola w panelach A, E, F, G i H wskazują powiększone obszary odpowiednio dla paneli A", E", F", G" i H".

Rysunek 3. Ilościowe porównanie działań w zakresie elementów cis-regulacyjnych. Dla wszystkich próbek ekspresję genu EGFP-reporter, w której pośredniczy określony element dymorficzny, oceniano u samic po 80 godzinach od powstania poczwarki. Liczba u góry każdego obrazu to poziom wyrażenia EGFP dla próbki, który jest obliczany jako średnia wartość piksela dla segmentu brzusznego A6 (wskazana dla lewego górnego ekranu jako obszar w przerywanej żółtej obwódce) pomniejszona o średnią wartość piksela dla segmentu A4 (korekcja tła; wskazana dla skrajnego górnego rogu obrazu jako obszar w przerywanej czerwonej obwódce). Dla każdego transgenu reporterowego oceniono cztery kontrpróby w celu obliczenia średniej wartości piksela segmentu A6. Aktywność regulacyjną podaje się jako % średniej wartości piksela żeńskiego szczepu (A) typu dzikiego lub (B) żeńskiego szczepu Canton S ±SEM. (A) ekspresji GFP dla samic posiadających allel elementu dymorficznego typu dzikiego i wersję zmutowaną, w której doszło do ablacji pojedynczego miejsca wiązania czynnika transkrypcyjnego DSX. To zmutowane miejsce wiązania zmniejszyło aktywność pierwiastka dymorficznego do 28±3% sekwencji typu dzikiego. (B) Porównanie działań regulacyjnych dla sekwencji ortologicznych do elementu dymorficznego D. melanogaster (szczep Canton S). Biorąc pod uwagę, że ekspresja GFP, w której pośredniczy allel elementu dymorficznego D. melanogaster, wynosi 100%, sekwencje ortologiczne spokrewnionych gatunków D. simulans i D. willistoni mają aktywność odpowiednio 75±4% i 0±0%.

6. Materiały

Nazwa materiału typ firma Numer katalogowy komentarz Specyficzna dla danego miejsca integracja transgenu usługa Najlepszy gen Plan H Wybierz miejsce lądowania, odbierz linie transformacyjne Olej halowęglowy Odczynnik Sigma-Aldrich H8898 powiedział: Służy do mocowania preparatów do obrazowania konfokalnego Dumont #5 Kleszcze narzędzie Narzędzia naukowe Numer katalogowy: 11252-40 Drobnie spiczaste i trwałe do preparowania Mikroskop stereoskopowy SZ61 Zoom narzędzie Olympus Konfigurowalny Doskonała optyka do pracy z muszkami owocowymi Mikroskop konfokalny FluoView narzędzie Olympus Konfigurowalny Zapewnia obrazy konfokalne o wysokiej rozdzielczości

Dyskusja

Elementy cis-regulatorowe kodują program genomowy, który określa wzorce ekspresji genów, a tym samym proces rozwoju¹ i są ważnymi miejscami zarówno dla mutacji leżących u podstaw ewolucji morfologicznej^2-4 , jak i zmienności fenotypowej dla cech ludzkich^5,6,19. Pomimo tego znaczenia, logika regulacyjna dla nieruchomości komercyjnych pozostaje słabo poznana. Główną przyczyną tego deficytu wiedzy jest brak odpowiednich metod ilościowego porównywania sekwencji funkcjonalnych CRE. Tu...