Artykuł metodologiczny

Formulacja dwublokowych nanocząstek polimerowych za pomocą techniki nanoprecypitacji

DOI:

10.3791/3398

⸱

20 września 2011

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Nano- and Translational Medicine, Department of Radiation Oncology, Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina School of Medicine, 2Carolina Center for Nanotechnology Excellence, University of North Carolina

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje metodę nanoprecypitacji do syntezy nanocząstek na bazie polimerów za pomocą kopolimerów diblokowych. Omówimy syntezę kopolimerów diblokowych, technikę nanoprecypitacji oraz potencjalne zastosowania.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanotechnologia to stosunkowo nowa gałąź nauki, która polega na wykorzystaniu unikalnych właściwości cząstek o skali nanometrów (nanocząstki). Nanocząstki można projektować w precyzyjny sposób, w którym ich rozmiar, skład i skład chemiczny powierzchni mogą być dokładnie kontrolowane. Daje to bezprecedensową swobodę modyfikowania niektórych podstawowych właściwości ich ładunku, takich jak rozpuszczalność, dyfuzyjność, biodystrybucja, charakterystyka uwalniania i immunogenność. Od momentu powstania nanocząstki były wykorzystywane w wielu dziedzinach nauki i medycyny, w tym w dostarczaniu leków, obrazowaniu i biologii komórki1-4. Nie został on jednak w pełni wykorzystany poza "laboratoriami nanotechnologicznymi" ze względu na postrzeganą barierę techniczną. W tym artykule opisujemy prostą metodę syntezy platformy nanocząstek na bazie polimeru, która ma szeroki zakres potencjalnych zastosowań.

Pierwszym krokiem jest zsyntetyzowanie kopolimeru diblokowego, który ma zarówno domenę hydrofobową, jak i hydrofilową. Używając PLGA i PEG jako polimerów modelowych, opisaliśmy reakcję koniugacji przy użyciu chemii EDC/NHS5 (ryc. 1). Omawiamy również proces oczyszczania polimerów. Zsyntetyzowany kopolimer diblokowy może samoorganizować się w nanocząstki w procesie nanowytrącania poprzez oddziaływania hydrofobowo-hydrofilowe.

Opisana nanocząstka polimeru jest bardzo wszechstronna. Hydrofobowy rdzeń nanocząstki może być wykorzystany do przenoszenia słabo rozpuszczalnych leków do eksperymentów z dostarczaniem leków6. Co więcej, nanocząstki mogą przezwyciężyć problem toksycznych rozpuszczalników dla słabo rozpuszczalnych odczynników biologii molekularnej, takich jak wortmannina, która wymaga rozpuszczalnika takiego jak DMSO. Jednak DMSO może być toksyczne dla komórek i zakłócać eksperyment. Te słabo rozpuszczalne leki i odczynniki mogą być skutecznie dostarczane za pomocą nanocząstek polimerowych o minimalnej toksyczności. Nanocząstki polimerowe mogą być również ładowane barwnikiem fluorescencyjnym i wykorzystywane do badań nad transportem wewnątrzkomórkowym. Wreszcie, te nanocząstki polimerowe mogą być sprzężone z ligandami celującymi za pomocą powierzchniowego PEG. Takie ukierunkowane nanocząstki można wykorzystać do znakowania określonych epitopów na lub w komórkach7-10.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Synteza polimeru PLGA-b-PEG

  1. Poli(D,L-laktyd-ko-glikolid) (PLGA) z końcowymi grupami karboksylowymi (karboksylan PLGA) rozpuszcza się w dowolnym rozpuszczalniku dla PLGA (jak wspomniano w rozdziale dotyczącym materiałów) w stężeniu 5mM. PLGA można rozpuścić w tym stężeniu, delikatnie mieszając.
  2. Zarówno NHS (masa cząsteczkowa 115,09), jak i EDC (masa cząsteczkowa 191,7) rozpuszcza się w roztworze PLGA w stężeniu 25mM. (Zarówno EDC, jak i NHS są dodawane w nadmiarze stechiometrycznym 5 razy w porównaniu z PLGA). Karboksylan PLGA przekształca się w PLGA-NHS przez dodanie EDC i NHS do roztworu karboksylanu PLGA z delikatnym mieszaniem przez około 1 godzinę.
  3. Produkt reakcji PLGA-NHS wytrąca się przez dodanie metanolu roztworu myjącego. Do roztworu dodaje się około 10-krotny nadmiar objętościowy metanolu. Roztwór odwirowuje się przy 2000 x g w celu wytrącenia PLGA-NHS i odrzucenia supernatantu (usuwa ślady EDC i NHS. Ta procedura mycia metanolem jest powtarzana co najmniej trzy razy.
  4. Granulat PLGA-NHS suszy się pod próżnią przez 30 minut, aby usunąć wszelkie ślady roztworu myjącego.
  5. Granulat PLGA-NHS jest teraz ponownie rozpuszczany w tym samym rozpuszczalniku w tym samym stężeniu, które zostało pierwotnie użyte do rozpuszczenia PLGA. Heterobifunkcyjny PEG (karboksylan aminy-PEG) jest następnie dodawany do roztworu PLGA w stężeniu 5mM (stosunek stechiometryczny 1:1). Roztwór mieszaniny inkubuje się przez 24 godziny przy ciągłym mieszaniu.
  6. Po 24 godzinach produkt reakcji kopolimer blokowy PLGA-b-PEG wytrąca się poprzez dodanie nadmiaru roztworu myjącego metanolu. Powtórz proces mycia i wirowania, jak wspomniano powyżej, trzy razy. Spowoduje to usunięcie całego nadmiaru nieprzereagowanego PEG.
  7. Kopolimer blokowy PLGA-b-PEG jest suszony w próżni.

2. Przygotowanie nanocząstek PLGA-b-PEG

Nanocząstki z rdzeniem PLGA pokrytym PEG na powierzchni mogą być przygotowane z tych kopolimerów diblokowych. W takich nanocząstkach można zamknąć wiele różnych leków hydrofobowych. Związki fluorescencyjne mogą być zamknięte w nanocząstkach lub mogą być sprzężone z PLGA, a zatem te nanocząstki mogą być wykorzystywane do obrazowania fluorescencyjnego.

Metoda nanoprecypitacji jest używana do wytwarzania nanocząstek, zwłaszcza gdy pożądany ładunek, który ma być zamknięty, jest wysoce hydrofobowy z natury.

  1. Kopolimer blokowy PLGA-b-PEG i lek/ładunek (do kapsułkowania) rozpuszcza się w dowolnym rozpuszczalniku, który rozpuszcza PLGA. PLGA można rozpuścić w wielu popularnych rozpuszczalnikach, w tym acetonitrylu, DCM, tetrahydrofuranu, acetonu lub octanu etylu. Wybór rozpuszczalnika ma kluczowe znaczenie, ponieważ wpływa na właściwości nanocząstek. Dlatego na tym etapie należy użyć odpowiedniego rozpuszczalnika.
  2. Mieszaninę polimeru i leku dodaje się następnie kroplami do 3-5 objętości mieszającej wody, uzyskując końcowe stężenie polimeru około 3 mg/ml. (rys. 2)
  3. Mieszanie kontynuuje się przez 2 godziny pod zmniejszonym ciśnieniem, aby umożliwić uformowanie się nanocząstek poprzez samoorganizację i usunięcie śladów rozpuszczalnika organicznego.
  4. Zbieranie i oczyszczanie: Nanocząstki są następnie zagęszczane przez wirowanie przy 2 700g przez 10 minut przy użyciu filtra Amicon (MWCO 20KDa), przemywane i odtwarzane w PBS. To usuwa cały nieuwięziony narkotyk/ładunek. Podstawowe charakterystyki biofizyczne, takie jak rozmiar, ładunek powierzchniowy i wydajność ładowania leku, można przeprowadzić, aby lepiej zrozumieć właściwości nanocząstek.

3. Przechowywanie

Liofilizacja jest powszechnie stosowaną metodą przechowywania nanocząstek11. Liofilizacja pozwoli zachować właściwości fizyczne i chemiczne nanocząstek, zapewniając długoterminową stabilność12. Proces liofilizacji może powodować naprężenia na cząstki i destabilizować preparat, dlatego powszechnie stosuje się krio-protektoranty (ochrona przed stresem związanym z zamarzaniem) i lyo-protekcje (ochrona przed stresem związanym z suszeniem). Wybór tych środków ochronnych zależy od pożądanego czasu przechowywania13.

  1. W przypadku liofilizacji dochodzi do całkowitego zestalenia próbki poprzez zamrożenie poniżej jej Tg.
  2. Na etapie suszenia lód jest usuwany przez sublimację. Temperatura i ciśnienie powinny być zoptymalizowane, aby osiągnąć wydajny proces liofilizacji.

4. Reprezentatywne wyniki:

Charakterystyka kopolimeru dwublokowego PLGA-b-PEG

Różne techniki mogą być użyte do potwierdzenia udanej koniugacji polimerów. Skład PLGA-b-PEG można scharakteryzować za pomocą magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) 1H 400 MHz. Masę cząsteczkową utworzonego produktu (PLGA-b-PEG) można zweryfikować za pomocą chromatografii żelowej (GPC). Krzywa rozkładu masy cząsteczkowej PLGA-b-PEG i czas elucji powinny różnić się od samych PLGA i PEG. W połączeniu techniki te powinny scharakteryzować utworzony produkt i określić, czy reakcja koniugacji zakończyła się sukcesem.

Charakterystyka nanocząstek PLGA-b-PEG

Wielkość i rozkład wielkości cząstek mogą być mierzone za pomocą dynamicznego rozpraszania światła. Różne parametry w procesie nanoprecypitacji wpływają na wielkość cząstek. Masy cząsteczkowe początkowo użytych polimerów (zarówno PLGA, jak i PEG) również wpływają na rozkład wielkości cząstek. Przejściowa mikroskopia elektronowa (TEM) może być również wykorzystana do potwierdzenia rozkładu wielkości i struktury nanocząstek, jak pokazano na rysunku 3. Zakres wielkości cząstek mieści się na ogół w zakresie nm. Duże rozmiary cząstek o nierównomiernym rozkładzie wielkości mogą wskazywać albo na błąd w reakcji koniugacji, albo na metodę nanoprecypitacji, która wymaga optymalizacji. Ponadto, powierzchniowy potencjał zeta może być mierzony za pomocą ZetaPALS.
Wydajność załadunku leku/ładunku można określić ilościowo za pomocą standardowej HPLC.

Cząsteczki są rozpuszczone w rozpuszczalniku organicznym i można przeprowadzić HPLC w celu zmierzenia absorbancji leku/ładunku (Rys. 4). Badanie kinetyczne uwalniania leku można przeprowadzić, gdy znane stałe ilości nanocząstek są dializowane w 30 jednostkach dializy Slide-A-Lyzer MINI. W ustalonych odstępach czasu zbiera się zawartość w jednostce dializy i dodaje się równą objętość rozpuszczalnika organicznego w celu rozpuszczenia nanocząstek. HPLC przeprowadza się na tych próbkach w celu ilościowego określenia zawartości leku/ładunku.

figure-protocol-1
Rysunek 1. Chemia EDC/NHS

figure-protocol-2
Rysunek 2. Metoda nanoprecypitacji do otrzymywania nanocząstek polimerowych. Organiczny roztwór rozpuszczalnika (acetonitrylu lub DCM) zawierający diblok PEG-PLGA i lek lub ładunek, który ma być załadowany do cząstki, dodaje się kroplami do 3-5 ml mieszającegoH2O.

figure-protocol-3
Rysunek 3. Transmisyjna mikroskopia elektronowa nanocząstek. Obraz TEM nanocząstek PEG-PLGA zawierających wortaminę. Jako środek kontrastowy stosowano kwas fosfowolframowy.

figure-protocol-4
Rysunek 4. Kontrolowane uwalnianie leku z nanocząsteczki. Uwalnianie paklitakselu z nanocząstek po dializie w PBS. W tym czasie cząstki zostały usunięte z kaset dializacyjnych i rozpuszczone w acetonitrylu. Roztwór zmierzono za pomocą HPLC. Porównano dwie odrębne partie nanocząstek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda nanoprecypitacji z wykorzystaniem kopolimerów diblokowych stanowi prostą i szybką metodę inżynierii nanocząstek polimerowych. Powstałe nanocząstki składają się z hydrofobowego rdzenia, który można wykorzystać do dostarczania słabo rozpuszczalnych związków. Powierzchniowa warstwa hydrofilowa zapewnia doskonałą rozpuszczalność w wodzie, zapewniając jednocześnie ugrupowanie dla potencjalnej dalszej koniugacji z docelowym ligandem.

Istnieje wiele platform nanocząstek, w tym liposomy, nanocz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez Golfers Against Cancer, grant pilotażowy Carolina Center for Nanotechnology Excellence, University Cancer Research Fund oraz National Health Institute K-12 Career Development Award.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
EDCThermo Fisher Scientific, Inc.22980Odczynnik do koniugacji
NHSThermo Fisher Scientific, Inc.24500Odczynnik do koniugacji
amino-PEG-karboksylanLaysan Bio Inc.Polimer Nh2-PEG-CM-5000(Można użyć dowolnego PEG MW, 5000 jest wymieniony tutaj)
PLGA-karbsylan figure-materials-1 LactelB6013-2Polimer
Dichlorometan (DCM)Sigma-Aldrich34856Rozpuszczalnik
Acetonitryl > 99% czystościSigma-Aldrich34851Rozpuszczalnik
Metanol > 99% czystościSigma-Aldrich34860Wash

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Drotleffa, S., Lungwitz, U., Breuniga, M., Dennis, A., Blunk, T., Tessmarc, J., Goëpferich, A. Biomimetic polymers in pharmaceutical and biomedical sciences. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 58, 385-407 (2004).
  2. Bulte, J. W. M. Nanoparticles in Biomedical Imaging. 3, (2008).
  3. Omid, C., Farokhzad, R. L. Impact of Nanotechnology on Drug Delivery. ACS NANO. 3, 16-20 (2009).
  4. Li, Y. -P., Pei, Y. -Y., Xian-Ying, Z., Zhou-Hui, G., Zhao-Hui, Z., Wei-Fang, Y., Jian-Jun, Z., Jian-Hua, Z., Xiu-Jian, G. PEGylated PLGA nanoparticles as protein carriers: synthesis, preparation and biodistribution in rats. Journal of Controlled Release. 71, 203-211 (2011).
  5. Hermanson, G. T. Bioconjugate techniques. , 2nd Edition, (2008).
  6. Jeong, B., Bae, Y. H., Lee, D. S., Kim, S. W. Biodegradable block copolymers as injectable drug-delivery systems. Nature. 388, 860-862 (1997).
  7. Yoo, H. S., Park, T. G. Folate receptor targeted biodegradable polymeric doxorubicin micelles. Journal of Controlled Release. 96, 273-283 (2004).
  8. Cheng, J., Teply, B. A., Sherifi, I., Sung, J., Luther, G., Gu, F. X., Levy-Nissenbaum, E., Radovic-Moreno, A. F., Langer, R., Farokhzad, O. C. Formulation of Functionalized PLGA-PEG Nanoparticles for In Vivo Targeted Drug Delivery. Biomaterials. 28, 869-876 (2007).
  9. Gu, F., Zhang, L. F., Teply, B. A., Mann, N., Wang, A., Radovic-Moreno, A. F., Langer, R., Farokhzad, O. C. Precise engineering of targeted nanoparticles by using self-assembled biointegrated block copolymers. Proceedings of the National Academy of Science. 105, 2586-2591 (2008).
  10. Sanna, V., Pintus, G., Roggio, A. M., Punzoni, A., Posadino, A. M., Arca, A., Marceddu, S., Bandiera, P., Uzzau, S., Sechi, M. Targeted Biocompatible Nanoparticles for the Delivery of (-)-Epigallocatechin 3-Gallate to Prostate Cancer Cells. J. Med. Chem. 54, 1321-1332 (2011).
  11. Abdelwahed, W., Degobert, G., Stainmesse, S., Fessi, H. Freeze-drying of nanoparticles: Formulation, process and storage considerations. Advanced Drug Delivery Reviews. 58, 1688-1713 (2006).
  12. Holzer, M., Vogel, V., Mäntele, W., Schwartz, D., Haase, W., Langer, K. Physico-chemical characterisation of PLGA nanoparticles after freeze-drying and storage. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 72, 428-437 (2009).
  13. Lee, M. K., Kim, M. Y., Kim, S., Lee, J. Cryoprotectants for Freeze Drying of Drug Nano-Suspensions: Effect of Freezing Rate. Journal of Pharmaceutical Sciences. 98, 4808-4817 (2009).
  14. Wang, A. Z. Biofunctionalized targeted nanoparticles for therapeutic applications. Expert opinion on biological therapy. 8, 1063-1070 (2008).
  15. Jeong, B., Bae, Y. H., Kim, S. W. Drug release from biodegradable injectable thermosensitive hydrogel of PEG-PLGA-PEG triblock copolymers. J. Control Release. 63, 155-163 (2000).
  16. Gref, R. Biodegradable long-circulating polymeric nanospheres. Science. 263, 1600-1603 (1994).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Diblock Polymeric NanoparticlesNanoprecipitation TechniquePLGA PEG CopolymerEDC NHS ChemistryPolymer PurificationDrug Loading EfficiencyDynamic Light ScatteringTransmission Electron MicroscopyHPLC AnalysisCellular Trafficking Studies

Powiązane artykuły