Niniejszy artykuł opisuje metodę nanoprecypitacji do syntezy nanocząsteczek polimerowych z wykorzystaniem kopolimerów diblokowych. Omówimy syntezę kopolimerów diblokowych, technikę nanoprecypitacji oraz potencjalne zastosowania.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Formułowanie diblokowych nanocząstek polimerowych za pomocą techniki nanoprecypitacji
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Nanotechnologia jest stosunkowo nową gałęzią nauki, która polega na wykorzystaniu unikalnych właściwości cząstek o rozmiarach nanometrycznych (nanocząstek). Nanocząstki mogą być projektowane w precyzyjny sposób, tak aby ich rozmiar, skład i chemia powierzchni były starannie kontrolowane. Umożliwia to niespotykaną dotąd swobodę w modyfikowaniu niektórych podstawowych właściwości ich ładunku, takich jak rozpuszczalność, dyfuzyjność, biodystrybucja, charakterystyka uwalniania oraz immunogenność. Od momentu ich powstania nanocząstki są wykorzystywane w wielu obszarach nauki i medycyny, w tym w dostarczaniu leków, obrazowaniu i biologii komórki1-4. Jednak ze względu na postrzegane bariery techniczne nie zostały one w pełni wykorzystane poza „laboratoriami nanotechnologicznymi”. W niniejszym artykule opisujemy prostą metodę syntezy platformy nanocząstek opartych na polimerach, która znajduje szerokie spektrum potencjalnych zastosowań.
Pierwszym krokiem jest synteza kopolimeru diblokowego posiadającego zarówno domenę hydrofobową, jak i domenę hydrofilową. Wykorzystując PLGA i PEG jako polimery modelowe, opisaliśmy reakcję sprzęgania z zastosowaniem chemii EDC/NHS5 (Rys. 1). Omówiono również proces oczyszczania polimeru. Zsyntetyzowany kopolimer diblokowy może samoorganizować się w nanocząstki w procesie nanoprecypitacji poprzez oddziaływania hydrofobowo-hydrofilowe.
Opisane nanocząsteczki polimerowe są bardzo wszechstronne. Hydrofobowy rdzeń nanocząsteczki może być wykorzystywany do przenoszenia słabo rozpuszczalnych leków w eksperymentach z dostarczania leków6. Ponadto nanocząsteczki mogą rozwiązać problem toksycznych rozpuszczalników w przypadku słabo rozpuszczalnych odczynników biologii molekularnej, takich jak wortmannina, która wymaga rozpuszczalnika w postaci DMSO. Jednak DMSO może być toksyczny dla komórek i zakłócać przebieg eksperymentu. Te słabo rozpuszczalne leki i odczynniki mogą być skutecznie dostarczane za pomocą nanocząsteczek polimerowych przy minimalnej toksyczności. Nanocząsteczki polimerowe mogą być również ładowane barwnikami fluorescencyjnymi i wykorzystywane do badań nad transportem wewnątrzkomórkowym. Wreszcie nanocząsteczki polimerowe te mogą być koniugowane z ligandami celującymi poprzez powierzchniowy PEG. Takie nanocząsteczki celowane mogą być wykorzystywane do znakowania specyficznych epitopów na powierzchni lub wewnątrz komórek7-10.
Protokół
1. Synteza polimeru PLGA-b-PEG
- Kopolimer poli(D,L-laktydu-ko-glikolidu) (PLGA) z końcowymi grupami karboksylowymi (PLGA-karboksylan) rozpuszcza się w dowolnym rozpuszczalniku do PLGA (wymienionym w sekcji materiałów) do stężenia 5mM. PLGA można rozpuścić przy tym stężeniu poprzez delikatne mieszanie.
- Zarówno NHS (masa cząsteczkowa 115,09), jak i EDC (masa cząsteczkowa 191,7) rozpuszcza się w roztworze PLGA do stężenia 25mM. (Zarówno EDC, jak i NHS są dodawane w nadmiarze stechiometrycznym 5-krotnym w stosunku do PLGA). PLGA-karboksylan przekształca się w PLGA-NHS poprzez dodanie EDC i NHS do roztworu PLGA-karboksylanu i delikatne mieszanie przez około 1 godzinę.
- Produkt reakcji PLGA-NHS wytrąca się poprzez dodanie metanolu jako roztworu piorącego. Do roztworu dodaje się około 10-krotną nadwyżkę objętościową metanolu. Roztwór wiruje się przy 2000 x g, aby wytrącić PLGA-NHS, a następnie odrzuca nadsącz (usuwa to śladowe ilości EDC i NHS). Procedurę płukania metanolem powtarza się co najmniej trzy razy.
- Osad PLGA-NHS suszy się w próżni przez 30 minut, aby usunąć wszelkie ślady roztworu piorącego.
- Osad PLGA-NHS rozpuszcza się ponownie w tym samym rozpuszczalniku i w tym samym stężeniu, które zostało użyte początkowo do rozpuszczenia PLGA. Następnie do roztworu PLGA dodaje się heterobifunkcyjny PEG (amina-PEG-karboksylan) w stężeniu 5mM (stosunek stechiometryczny 1:1). Mieszaninę inkubuje się przez 24 godziny przy ciągłym mieszaniu.
- Po 24 godzinach produkt reakcji, kopolimer blokowy PLGA-b-PEG, wytrąca się poprzez dodanie nadmiaru metanolu jako roztworu piorącego. Proces płukania i wirowania powtarza się trzy razy, zgodnie z opisem powyżej. Usunie to cały nadmiar nieprzereagowanego PEG.
- Kopolimer blokowy PLGA-b-PEG suszy się w próżni.
2. Przygotowanie nanocząsteczek PLGA-b-PEG
Nanocząstki z rdzeniem z PLGA pokrytym PEG na powierzchni mogą zostać przygotowane przy użyciu tych kopolimerów diblokowych. W takich nanocząstkach można enkapsulować różnorodne leki hydrofobowe. Związki fluorescencyjne mogą być enkapsulowane w nanocząstkach lub konjugowane z PLGA, dzięki czemu nanocząstki te mogą być wykorzystywane do obrazowania fluorescencyjnego.
Metoda nanowytrącania jest stosowana do wytwarzania nanocząstek, szczególnie w przypadkach, gdy substancja przeznaczona do enkapsulacji ma charakter silnie hydrofobowy.
- Kopolimer blokowy PLGA-b-PEG oraz lek/ładunek (do enkapsulacji) rozpuszcza się w dowolnym rozpuszczalniku rozpuszczającym PLGA. PLGA można rozpuścić w wielu powszechnie stosowanych rozpuszczalnikach, w tym w acetonitrylu, DCM, tetrahydrofuranie, acetonie lub octanie etylu. Wybór rozpuszczalnika jest krytyczny, ponieważ wpływa on na właściwości nanocząsteczek. W związku z tym na tym etapie należy zastosować odpowiedni rozpuszczalnik.
- Mieszaninę polimeru i leku dodaje się następnie kroplami do 3-5 objętości mieszanej wody, aby uzyskać końcowe stężenie polimeru wynoszące około 3 mg/mL. (Ryc. 2)
- Mieszanie kontynuuje się przez 2 godziny pod zmniejszonym ciśnieniem, aby umożliwić formowanie się nanocząsteczek poprzez samoorganizację i usunąć ślady rozpuszczalnika organicznego.
- Zbiór i oczyszczanie: Nanocząsteczki są następnie zagęszczane poprzez wirowanie przy 2,700xg przez 10 min przy użyciu filtra Amicon (MWCO 20KDa), przemywane i zawieszane ponownie w PBS. Pozwala to na usunięcie całego nieuwięzionego leku/ładunku. W celu lepszego zrozumienia właściwości nanocząsteczek można przeprowadzić podstawowe charakterystyki biofizyczne, takie jak pomiar wielkości, ładunku powierzchniowego i wydajności ładowania leku.
3. Przechowywanie
Liofilizacja jest powszechnie stosowaną metodą przechowywania nanocząsteczek11. Liofilizacja pozwala zachować właściwości fizyczne i chemiczne nanocząsteczek, zapewniając ich długoterminową stabilność12. Proces liofilizacji może wywoływać stres w cząstkach i destabilizować formulację, dlatego powszechnie stosuje się krioprotektanty (ochrona przed stresem mrozowym) oraz lio protegeranty (ochrona przed stresem suszenia). Wybór tych substancji ochronnych jest determinowany przez pożądany czas przechowywania13.
- W procesie liofilizacji następuje całkowite zestalenie próbki poprzez zamrożenie jej poniżej temperatury Tg.
- W etapie suszenia lód jest usuwany poprzez sublimację. Temperaturę i ciśnienie należy zoptymalizować, aby zapewnić efektywny przebieg procesu liofilizacji.
4. Reprezentatywne wyniki:
Charakterystyka diblokowego kopolimeru PLGA-b-PEG
Do potwierdzenia pomyślnej koniugacji polimerów można wykorzystać różne techniki. Skład PLGA-b-PEG można scharakteryzować za pomocą 400 MHz 1H magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR). Masę cząsteczkową otrzymanego produktu (PLGA-b-PEG) można zweryfikować za pomocą chromatografii żelowej (GPC). Krzywa rozkładu masy cząsteczkowej oraz czas elucji dla PLGA-b-PEG powinny różnić się od wartości dla samego PLGA i PEG. Wspólnie techniki te powinny pozwolić na charakterystykę otrzymanego produktu i określenie, czy reakcja koniugacji przebiegła pomyślnie.
Charakterystyka nanocząsteczek PLGA-b-PEG
Wielkość cząstek oraz rozkład wielkości można zmierzyć za pomocą dynamicznego rozpraszania światła. Różne parametry procesu nanoprecypitacji wpływają na wielkość cząstek. Masa cząsteczkowa polimerów użytych na początku (zarówno PLGA, jak i PEG) również wpływa na rozkład wielkości cząstek. Do potwierdzenia rozkładu wielkości i struktury nanocząstek, jak pokazano na rysunku 3, można zastosować transmisyjną mikroskopię elektronową (TEM). Zakres wielkości cząstek mieści się zazwyczaj w skali nm. Duża wielkość cząstek przy nierównomiernym rozkładzie może wskazywać albo na błąd w reakcji koniugacji, albo na konieczność optymalizacji metody nanoprecypitacji. Dodatkowo, potencjał zeta powierzchni można zmierzyć urządzeniem ZetaPALS.
Wydajność załadunku leku/ładunku można określić za pomocą standardowej metody HPLC.
Cząstki rozpuszcza się w rozpuszczalniku organicznym, a następnie można przeprowadzić analizę HPLC w celu pomiaru absorbancji leku/ładunku (Ryc. 4). Można przeprowadzić badanie kinetyki uwalniania leku, w którym znane, stałe ilości nanocząstek poddaje się dializie w jednostkach dializacyjnych 30 Slide-A-Lyzer MINI. W ustalonych odstępach czasu pobiera się zawartość jednostki dializacyjnej i dodaje równą objętość rozpuszczalnika organicznego, aby rozpuścić nanocząstki. Próbki te poddaje się analizie HPLC w celu określenia ilości zawartości leku/ładunku.
Rycina 1. Chemia EDC/NHS
Rysunek 2. Metoda nanoprecypitacji do otrzymywania polimerowych nanocząsteczek. Organiczny roztwór rozpuszczalnika (acetonitrylu lub DCM) zawierający diblok PEG-PLGA oraz lek lub ładunek do wprowadzenia do cząsteczki jest dodawany kroplowo do 3-5 mL mieszanej H2O.
Rycina 3. Transmisyjna mikroskopia elektronowa nanocząstek. Obraz TEM nanocząstek PEG-PLGA zawierających wortaminę. Jako czynnik kontrastowy zastosowano kwas fosfotungstowy.
Rysunek 4. Kontrolowane uwalnianie leku z nanocząsteczki. Uwalnianie Paclitaxel z nanocząsteczek po dializie w PBS. W określonych punktach czasowych cząsteczki usuwano z kaset dializacyjnych i rozpuszczano w acetonitrylu. Roztwór analizowano metodą HPLC. Porównano dwie oddzielne serie nanocząsteczek.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Metoda nanoprecypitacji z użyciem kopolimerów diblokowych stanowi prosty i szybki sposób inżynierii polimerowych nanocząsteczek. Powstałe nanocząsteczki składają się z hydrofobowego rdzenia, który może być wykorzystany do dostarczania związków słabo rozpuszczalnych. Powierzchniowa warstwa hydrofilowa zapewnia doskonałą rozpuszczalność w wodzie, stanowiąc jednocześnie miejsce do potencjalnej dalszej koniugacji z ligandem celującym.
Istnieje wiele platform nanocząsteczkowych, w tym liposomy, nan...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta została sfinansowana przez Golfers Against Cancer, grant pilotażowy Carolina Center for Nanotechnology Excellence, University Cancer Research Fund oraz National Health Institute K-12 Career Development Award.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| EDC | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22980 | Odczynnik do sprzęgania |
| NHS | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 24500 | Odczynnik do sprzęgania |
| amine-PEG-carboxylate | Laysan Bio Inc. | Nh2-PEG-CM-5000 | Polimer (Można użyć dowolnej masy cząsteczkowej PEG, tutaj wymieniono 5000) |
| PLGA-carbxylate |  Lactel | B6013-2 | Polimer |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 34856 | Rozpuszczalnik |
| Acetonitrile >99% purity | Sigma-Aldrich | 34851 | Rozpuszczalnik |
| Methanol >99% purity | Sigma-Aldrich | 34860 | Roztwór do płukania |
Bibliografia
- Drotleffa, S., Lungwitz, U., Breuniga, M., Dennis, A., Blunk, T., Tessmarc, J., Goëpferich, A. Biomimetic polymers in pharmaceutical and biomedical sciences. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 58, 385-407 (2004).
- Bulte, J. W. M. Nanoparticles in Biomedical Imaging. 3, (2008).
- Omid, C., Farokhzad, R. L. Impact of Nanotechnology on Drug Delivery. ACS NANO. 3, 16-20 (2009).
- Li, Y. -P., Pei, Y. -Y., Xian-Ying, Z., Zhou-Hui, G., Zhao-Hui, Z., Wei-Fang, Y., Jian-Jun, Z., Jian-Hua, Z., Xiu-Jian, G. PEGylated PLGA nanoparticles as protein carriers: synthesis, preparation and biodistribution in rats. Journal of Controlled Release. 71, 203-211 (2011).
- Hermanson, G. T. Bioconjugate techniques. , 2nd Edition, (2008).
- Jeong, B., Bae, Y. H., Lee, D. S., Kim, S. W. Biodegradable block copolymers as injectable drug-delivery systems. Nature. 388, 860-862 (1997).
- Yoo, H. S., Park, T. G. Folate receptor targeted biodegradable polymeric doxorubicin micelles. Journal of Controlled Release. 96, 273-283 (2004).
- Cheng, J., Teply, B. A., Sherifi, I., Sung, J., Luther, G., Gu, F. X., Levy-Nissenbaum, E., Radovic-Moreno, A. F., Langer, R., Farokhzad, O. C. Formulation of Functionalized PLGA-PEG Nanoparticles for In Vivo Targeted Drug Delivery. Biomaterials. 28, 869-876 (2007).
- Gu, F., Zhang, L. F., Teply, B. A., Mann, N., Wang, A., Radovic-Moreno, A. F., Langer, R., Farokhzad, O. C. Precise engineering of targeted nanoparticles by using self-assembled biointegrated block copolymers. Proceedings of the National Academy of Science. 105, 2586-2591 (2008).
- Sanna, V., Pintus, G., Roggio, A. M., Punzoni, A., Posadino, A. M., Arca, A., Marceddu, S., Bandiera, P., Uzzau, S., Sechi, M. Targeted Biocompatible Nanoparticles for the Delivery of (-)-Epigallocatechin 3-Gallate to Prostate Cancer Cells. J. Med. Chem. 54, 1321-1332 (2011).
- Abdelwahed, W., Degobert, G., Stainmesse, S., Fessi, H. Freeze-drying of nanoparticles: Formulation, process and storage considerations. Advanced Drug Delivery Reviews. 58, 1688-1713 (2006).
- Holzer, M., Vogel, V., Mäntele, W., Schwartz, D., Haase, W., Langer, K. Physico-chemical characterisation of PLGA nanoparticles after freeze-drying and storage. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 72, 428-437 (2009).
- Lee, M. K., Kim, M. Y., Kim, S., Lee, J. Cryoprotectants for Freeze Drying of Drug Nano-Suspensions: Effect of Freezing Rate. Journal of Pharmaceutical Sciences. 98, 4808-4817 (2009).
- Wang, A. Z. Biofunctionalized targeted nanoparticles for therapeutic applications. Expert opinion on biological therapy. 8, 1063-1070 (2008).
- Jeong, B., Bae, Y. H., Kim, S. W. Drug release from biodegradable injectable thermosensitive hydrogel of PEG-PLGA-PEG triblock copolymers. J. Control Release. 63, 155-163 (2000).
- Gref, R. Biodegradable long-circulating polymeric nanospheres. Science. 263, 1600-1603 (1994).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
