Ekstrakcja lipidów komórkowych do ukierunkowanego rozcieńczania stabilnych izotopów Chromatografia cieczowa - analiza spektrometrii mas

Podsumowanie

Ten protokół pokaże ekstrakcję i analizę wolnych i estryfikowanych bioaktywnych kwasów tłuszczowych z komórek. Kwasy tłuszczowe są dokładnie oznaczane ilościowo za pomocą rozcieńczania stabilnych izotopów, chiralnej chromatografii cieczowej, wychwytywania elektronów, atmosferycznej jonizacji chemicznej, wielokrotnego monitorowania spektrometrii mas (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Streszczenie

Metabolizm kwasów tłuszczowych, takich jak kwas arachidonowy (AA) i kwas linolowy (LA), powoduje powstawanie utlenionych bioaktywnych lipidów, w tym licznych stereoizomerów^1,2. Metabolity te mogą powstawać z wolnych lub estryfikowanych kwasów tłuszczowych. Wiele z tych utlenionych metabolitów ma aktywność biologiczną i jest związanych z różnymi chorobami, w tym chorobami sercowo-naczyniowymi i neurodegeneracyjnymi, astmą i rakiem^3-7. Utlenione bioaktywne lipidy mogą być tworzone enzymatycznie lub przez reaktywne formy tlenu (ROS). Enzymy metabolizujące kwasy tłuszczowe obejmują cyklooksygenazę (COX), lipooksygenazę (LO) i cytochromy P450 (CYPs)^1,8. Metabolizm enzymatyczny powoduje tworzenie enancjoselektywne, podczas gdy utlenianie ROS powoduje racemiczne tworzenie produktów.

Chociaż ten protokół skupia się głównie na analizie bioaktywnych metabolitów pochodzących z AA- i niektórych LA, można go łatwo zastosować do metabolitów innych kwasów tłuszczowych. Bioaktywne lipidy są ekstrahowane z lizatu komórkowego lub pożywki za pomocą ekstrakcji ciecz-ciecz (L-L). Na początku procesu ekstrakcji l-l dodaje się wewnętrzne wzorce stabilnych izotopów w celu uwzględnienia błędów podczas przygotowywania próbki. Rozcieńczenie izotopu stabilnego (SID) uwzględnia również wszelkie różnice, takie jak tłumienie jonów, które mogą wystąpić metabolitów podczas analizy spektrometrii mas (MS)⁹. Po ekstrakcji, w celu zwiększenia czułości wykrywania, stosuje się derywatyzację odczynnikiem do wychwytywania elektronów (EC), bromkiem pentafluorylobenzylu (PFB)^10,11. Monitorowanie reakcji wielokrotnych (MRM) stosuje się w celu zwiększenia selektywności analizy MS. Przed analizą stwardnienia rozsianego lipidy są rozdzielane za pomocą chiralnej wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) w fazie normalnej. Warunki HPLC są zoptymalizowane w celu oddzielenia enancjomerów i różnych stereoizomerów monitorowanych lipidów¹². Ta specyficzna metoda LC-MS monitoruje prostaglandyny (PG), izoprostany (isoP), kwasy hydroksyeikozatetraenowe (HETE), kwasy hydroksyoktadekadienowe (HODE), kwasy oksoeikozatetraenowe (oxoETE) i kwasy oksooktadekadienowe (oxoODE); jednak parametry HPLC i MS można zoptymalizować tak, aby zawierały dowolne metabolity kwasów tłuszczowych¹³.

Większość obecnie dostępnych metod bioanalitycznych nie uwzględnia oddzielnej kwantyfikacji enancjomerów. Jest to niezwykle ważne przy próbie wywnioskowania, czy metabolity zostały utworzone enzymatycznie, czy przez ROS. Dodatkowo, proporcje enancjomerów mogą dostarczyć dowodów na specyficzny enzymatyczny szlak powstawania. Zastosowanie SID pozwala na dokładne określenie ilościowe metabolitów i uwzględnia wszelkie straty próbki podczas przygotowania, a także różnice występujące podczas jonizacji. Użycie odczynnika do wychwytywania elektronów PFB zwiększa czułość detekcji o dwa rzędy wielkości w porównaniu z konwencjonalnymi metodami APCI. Ogólnie rzecz biorąc, ta metoda, jonizacja chemiczna pod ciśnieniem atmosferycznym SID-LC-EC, APCI-MRM/MS, jest jedną z najbardziej czułych, selektywnych i dokładnych metod oznaczania ilościowego bioaktywnych lipidów.

Protokół

1. Mieszanki standardowe i wewnętrzne

1. Przed ekstrakcją lipidów należy przygotować mieszaninę wzorcową (SM) i mieszankę wzorca wewnętrznego (ISM). Dla SM podniec równoważną objętość 1 μg każdego wzorca (łącznie 25) wymienionego w poniższej tabeli odczynników, używając skalibrowanej strzykawki, do kolby miarowej o pojemności 10 ml. Wysuszyć wzorce w atmosferze azotu i rozpuścić w 10 ml acetonitrylu (ACN). Końcowe stężenie wzorcowej mieszanki wyniesie 100 pg/μL. Podzielić na 1 ml porcji i przechowywać w temperaturze -80°C do momentu potrzeby.
2. Z tej wzorcowej mieszaniny można wykonać 6 wzorcowych rozcieńczeń, co daje łącznie 7 wzorców kalibracyjnych (1 pg/ μL, 2 pg/ μL, 5 pg/ μL, 10 pg/ μL, 20 pg/ μL, 50 pg/ μL i 100 pg/ μL). Wzorce te należy przeprowadzać z każdą partią próbek przygotowanych w celu opracowania krzywej kalibracyjnej stosowanej w analizie ilościowej.
3. Dla ISM, za pomocą skalibrowanej strzykawki podamy równoważną objętość 1 μg każdego IS (łącznie 14) wymienionego w poniższej tabeli odczynników do kolby miarowej o pojemności 10 ml i wysuszyć w atmosferze azotu. Rozpuść ISM w 10 ml ACN i podziel na 1 ml podwielokrotności. Końcowe stężenie ISM powinno wynosić 100 pg/μL. Współczynnik ISM jest wystarczający do przetworzenia 1000 próbek.
4. Przechowuj SM i ISM w temperaturze -80°C.

2. Zbiór pożywek i lizat komórkowy

1. Na każdą 10 cm płytkę przylegających komórek (~ 1 X 10⁷) należy zebrać 3 ml pożywki w szklanej probówce wirówkowej o pojemności 10 ml. Następnie przemyj komórki 2 razy solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Dodać 1 ml PBS do płytki, zeskrobać komórki z płytki i pipetować do drugiej szklanej probówki wirówkowej o pojemności 10 ml. W tym momencie komórki i pożywki mogą być przechowywane, jeśli procedura nie będzie w tym czasie kontynuowana. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80°C w przypadku długotrwałego przechowywania lub w temperaturze -20°C przez okres krótszy niż tydzień.

3. Ekstrakcja lipidów z pożywki

1. Wolne bioaktywne lipidy znajdują się w pożywkach komórkowych i można je łatwo wyekstrahować za pomocą jednoetapowej procedury ekstrakcji l-l. Do zebranych pożywek (2.1) dodać 10 μl ISM. W tym czasie 8 dodatkowych szklanych probówek wirówkowych o pojemności 10 ml powinno być oznaczonych #0-7 dla wzorców kalibracyjnych. Dodać 3 ml PBS do każdej z tych probówek, a następnie dodać 10 μl odpowiedniego SM do probówek 1-7 (1-7 z 1.1).
2. Pozostawić ISM do zrównoważenia w każdym wzorcu kalibracyjnym i próbce przez 10 minut, a następnie dodać 5 ml eteru dietylowego. Próbki i wzorce kalibracyjne są następnie umieszczane w wytrząsarce na niskich obrotach przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
3. Po wstrząśnięciu wszystkie wzorce kalibracyjne i próbki są odwirowywane przy 1935 x g przez 10 minut. Następnie, za pomocą pipety Pasteura, przenieś górną fazę (organiczną) do nowej szklanej probówki wirówkowej o pojemności 10 ml i wysusz w azocie.

4. Ekstrakcja lipidów z lizatu komórkowego

1. Odwirowywać próbki komórek w szklanych probówkach wirówkowych o wymiarach 1935 x g przez 5 minut. Usunąć szwadron sklarowany nad osadem; dodać 2 ml PBS do każdej probówki i krótko przetrząsnąć. Pobrać 25 μl próbki w celu ilościowego określenia białka. Białko całkowite zostanie wykorzystane do normalizacji lizatu komórkowego.
2. Następnie przenieś połowę mieszaniny lizatu/PBS do oddzielnej szklanej probówki wirówkowej o pojemności 10 ml. Do każdej próbki dodać dodatkowe 2 ml PBS wraz z 10 μl ISM. Postępować zgodnie z procesem ekstrakcji l-l opisanym dla pożywek w ppkt 3.2 i 3.3. Ta podwielokrotność zostanie wykorzystana do pomiaru wolnych lipidów w komórkach i uniknięcia alkalicznej degradacji lipidów, takich jak prostaglandyny. Podwielokrotność ta nie zostanie poddana krokom 4.3 i 4.4 opisanym poniżej.
3. Pierwszy etap procesu ekstrakcji estryfikowanego lipidów l-l wymaga dodania 5 ml CHCl₃/MeOH (2:1) do każdej z próbek. Próbki umieszcza się w wytrząsarce na niskich obrotach na 30 minut. Po wstrząśnięciu próbki odwirowuje się przy 1935 x g przez 10 minut. Następnie, za pomocą pipety Pasteura, przenieś dolną (organiczną) warstwę ekstrakcji l-l do nowej szklanej probówki wirówkowej o pojemności 10 ml i wysusz próbkę pod azotem.
4. Estryfikowane lipidy muszą zostać zmydlone przed oznaczaniem ilościowym. Po wyschnięciu próbek dodaj 0,5 ml 0,4 N KOH w 80% MeOH do każdej probówki. Próbki są następnie inkubowane w temperaturze 60°C przez 1 godzinę. Po inkubacji dodać 2 ml PBS. Dostosuj pH do 6 za pomocą stężonego kwasu HCl (~30 μL). Dodać 10 μl ISM do każdej próbki. Pozostała część procedury jest taka sama, jak ekstrakcja lipidów z pożywki i może być stosowana w ppkt 3.2 i 3.3.
5. Jeżeli ekstrakcje te są przeprowadzane równocześnie z próbkami pożywki, te same wzorce kalibracyjne mogą być użyte do opracowania krzywej kalibracyjnej; jednakże, jeśli próbki te są przeprowadzane w innym czasie, wzorce kalibracyjne muszą być również przetwarzane zgodnie z opisem w ppkt 3.1-3.3.

5. Derywatyzacja pentaferylobenzylbromku (PFB)

1. Do wysuszonych próbek i wzorców kalibracyjnych dodać 100 μl bezwodnego dichlorometanu (CH₂Cl₂), a następnie 100 μl 20% (v/v) N,N-diizopropyloetyloaminy w bezwodnym CH₂Cl₂ i na koniec 100 μl 20% (v/v) PFB w bezwodnym CH₂Cl₂.
2. Po dodaniu odczynników do derywatyzacji, próbki są wirowane, inkubowane w temperaturze 60°C przez 1 godzinę i suszone w azocie. Próbki i wzorce kalibracyjne mogą być przechowywane w temperaturze -80°C, jeśli nie są analizowane natychmiast, lub w temperaturze -20°C przez okres do jednego tygodnia.

6. Stabilne rozcieńczanie izotopów Chiralna chromatografia cieczowa Wychwytywanie elektronów Ciśnienie atmosferyczne Jonizacja chemiczna Spektrometria mas (SID-LC-ECAPCI-MS) Analiza

1. Wysuszone próbki i wzorce kalibracyjne rozpuszcza się w 100 μl heksanu/etanolu (97:3). Cała próbka może być następnie przeniesiona do fiolki HPLC z wkładką. Umieść próbki w schłodzonym autosamplerze (4°C) i utwórz listę próbek do analizy.
2. Następnie należy skonfigurować metody HPLC i MS, korzystając z parametrów opisanych w Tabeli 1 i Tabeli 2 poniżej. Tabela 3 zawiera szczegółowe informacje o związkach, w tym energię przejścia i zderzenia MRM (CE) dla każdego lipidu, a także szacowany czas retencji z analizy Waters 2695/Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra. CE określa się poprzez dostrojenie każdego pojedynczego lipidu podczas opracowywania metody.
3. Do normalnej separacji faz używana jest kolumna Chiralpak AD-H (4,6 X 250 mm, 5 μ) podgrzana do 30°C. Wyjściowa faza ruchoma składa się w 98% z heksanu i w 2% z metanolu/izopropanolu (1:1). Po rozdzieleniu HPLC metanol jest dodawany po kolumnie (0,75 ml / min), aby uniknąć osadzania się na igle Corona, co spowodowałoby zmniejszenie czułości. MS jest ustawiony w trybie jonów ujemnych za pomocą źródła APCI. Jeśli źródło musi zostać zmienione z ESI na APCI, pamiętaj o włożeniu igły Corona.
4. Pierwszą próbką, którą należy przeprowadzić, jest zawsze ślepa próba heksanu. Pozwoli to zrównoważyć kolumnę, a także ujawni, czy na kolumnie znajdują się jakiekolwiek zanieczyszczenia, które mogą zakłócać wzorc kalibracji i analizę próbki.
5. Następne serie próbek powinny być próbkami wzorcowymi kalibracyjnymi w kolejności 0-7 (rosnące stężenie SM). Wzorce te zostaną wykorzystane do stworzenia krzywej kalibracyjnej zawierającej stosunek powierzchni wzorcowej/powierzchni IS na osi y do stężenia lub masy wzorca na osi x. Z równania y = mx + b uzyskanego z tego wykresu, stosunek powierzchni próbki do powierzchni IS (y) można wykorzystać do określenia ilości lub stężenia próbki (nieznanej) (x).
6. Ilość bioaktywnych lipidów znajdujących się w pożywce można znormalizować do całkowitej objętości pożywki, a ilość lipidów znajdujących się w lizacie komórkowym można znormalizować do całkowitej liczby komórek / płytki lub ilości całkowitego białka / płytki. W trakcie 4.1 protokołu należy podjąć środki w celu zapewnienia, że komórki są zliczane lub że białko jest oznaczane ilościowo.

7. Reprezentatywne wyniki:

Chromatogramy na rysunku 1 są reprezentatywne dla docelowego profilu lipidomicznego. Pierwszy panel (rysunek 1A) przedstawia 13- i 9-HODE wraz z odpowiadającymi im 13- i 9-oksoODE, pochodzącymi z kwasu linolowego. Ponadto 15-oxoETE, utleniony metabolit 15-HETE jest również pokazany w drugim panelu. Dwa dolne panele pokazują 20-HETE i 20-HETE-IS, [²H₆]-20-HETE. Rysunek 1B przedstawia separację i unikalne przejścia wyznaczone dla stereoizomerów HOTE, które wynikają z enzymatycznego utleniania AA lub ROS. Rysunek 1C przedstawia PGs, isoP i LTB₄. Niektóre normy nie mają deuterowanego azotu inwazyjnego dostępnego na rynku; w związku z tym do kwantyfikacji stosuje się stabilizację obrazu, która jest podobna pod względem czasu przechowywania. Na przykład [²H₈]-12(S)-HETE służy do ilościowego oznaczania gatunków 11-HETE i 8-HETE oprócz 12(R)-HETE i 12(S)-HETE.

Z reprezentatywnych chromatogramów widać, że istnieje niewielka zmiana w zachowaniu deuterowanego IS w porównaniu do nieoznakowanego wzorca. To przesunięcie do późniejszego czasu retencji jest wynikiem interakcji deuteru z kolumną normalnej fazy. Deuter jest bardziej polarny niż wodór; W związku z tym istnieje silniejsza interakcja z normalną fazą kolumny. Gdyby ta separacja odbywała się przy użyciu kolumny o odwróconej fazie, przesunięcie nastąpiłoby do wcześniejszego czasu retencji, ponieważ bardziej polarna część miałaby słabszą interakcję z odwróconą fazą.

Rysunek 1. Rysunek ten jest reprezentatywnym przykładem ukierunkowanej analizy lipidomicznej. Rysunek 1A przedstawia chromatogramy jonów całkowitych (TIC) dla kilku utlenionych metabolitów LA i AA, w tym 13-oksoODE i 9-oksoODE w pierwszym panelu, 15-oksoETE w drugim panelu, 13-HODE i 9-HODE (panele 3 i 5) oraz 20-HETE (panel 7). HODEs i 20-HETE mają odpowiadający im deuterowany IS w poniższym panelu (4, 6 i 8). TIC na rysunku 2B pokazują separację i unikalne przejścia stereoizomerów HETE pochodzących z AA. Rysunek 2C przedstawia PG, isoP i LT. Energia zderzenia (CE), przejścia MRM i czas retencji (RT, min) zostały zoptymalizowane przy użyciu Waters 2695 LC sprzężonego z Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra i są wymienione w tabeli 3 dla każdego związku.

Czas (min) % A % B 0 Rozdział 98 cyfra arabska 3 Rozdział 98 cyfra arabska 11 96,4 pkt. 3.6 15 Rozdział 92 8 27 Rozdział 27 Rozdział 92 8 Rozdział 30 50 Rozdział 50 Rozdział 38 Rozdział 38 50 Rozdział 50 Rozdział 39 Rozdział 39 Rozdział 98 cyfra arabska Rozdział 45 Rozdział 98 cyfra arabska

Tabela 1. Warunki gradientu HPLC dla chiralnego rozdzielania lipidomiki w fazie normalnej. Rozpuszczalnik A to 100% heksany, a rozpuszczalnik B to metanol/izopropanol (1:1).

Parametr spektrometrii mas ustawienie źródło APCI (Wirus APCI tryb Jon ujemny Długość metody Czas trwania: 40 min Szerokość skanowania MRM 0,002 m/z Czas skanowania MRM 0,15 sekundy Szerokość piku MRM 0,70 FWHM Soczewka tubusu 164 V Źródło: CID 10 eV Gaz kolizyjny Q2 1,5 jednostki Temperatura waporyzatora 450°C Temperatura kapilar 250°C Prąd rozładowania 0 μA Ciśnienie gazu w osłonie 25 jednostek Ciśnienie wymiatania jonów 3 jednostki Pomocnicze ciśnienie gazu 5 jednostek

Tabela 2. Powyżej wymieniono zoptymalizowane parametry spektrometrii mas do pomiaru bioaktywnych lipidów. Parametry te pochodzą z Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra.

związek przejście CE (eV) Kąt względny (min) 13-oksoodowy 293,03 → 113,10 21 Pytanie 9,9 9-oksoodowy 293,03 → 113,10 21 Pytanie 17,9 15-oksoETE 317,05 → 113,18 Rozdział 18 Rozdział 8.1 13(R)-HODE 295,03 → 195,12 Rozdział 18 Rozdział 12,5 13(S)-HODE 295,03 → 195,12 Rozdział 18 Rozdział 14,8 [²H₄]-13(S)-HODE 299,03 → 198,12 Rozdział 18 Norma 14,9 9(R)-HODE 295,03 → 171,10 Rozdział 18 13,7 9(S)-HODE 295,03 → 171,10 Rozdział 18 Rozdział 21,2 [²H₄]-9(S)-HODE 299,03 → 172,12 Rozdział 18 Rozdział 21,2 20-HEKTAROWY 319,03 → 289,10 Rozdział 18 Rozdział 12.4 [²H₆]-20-HETE 325,03 → 295,10 Rozdział 18 Rozdział 12.4 5(R)-HETE 319,04 → 115,04 16 Rozdział 15,7 5(S)-HETE 319,04 → 115,04 16 Rozdział 16,2 [²H₈]-5(S)-HETE 327,04 → 116,04 16 Rozdział 16,4 12(R)-HETE 319,04 → 179,11 14 Pytanie 11,7 12(S)-HETE 319,04 → 179,11 14 Rozdział 12.3 [²H₈]-12(S)-HETE 327,13 → 184,11 14 Rozdział 12,5 15(R)-HETE 319,04 → 219,12 13 Rozdział 12.4 15(S)-HETE 319,04 → 219,12 13 Rozdział 15,9 [²H₈]-15(S)-HETE 327,03 → 226,12 13 Rozdział 16.1 11(R)-HETE 319,04 → 167,11 16 Rozdział 11.1 11(S)-HETE 319,04 → 167,11 16 Rozdział 12,5 8(R)-HETE 319,04 → 155,09 16 Pytanie 11,7 8(S)-HETE 319,04 → 155,09 16 Rozdział 12,6 Zobacz materiał LTB4 335,03 → 195,10 Rozdział 18 32,0 pkt. [²godz.₄]-LTB₄ 339,03 → 197,10 Rozdział 18 32,0 pkt. PGE₂ 351,03 → 271,15 Rozdział 18 Dnia 31,2 [₂godz.⁴]-PGE₂ 355,03 → 275,15 Rozdział 18 Dnia 31,2 Zobacz materiał PGD₂ 351,03 → 271,15 25 32,5 pkt. [²H₄]-PGD₂ 355,03 → 275,15 25 32,5 pkt. 8-iso-PGE₂ 351,03 → 271,15 Rozdział 18 37,4 pkt. 11β-PGF₂ 353,03 → 193,11 25 27,6 pkt. [²H₄]-11β-PGF₂ 357,03 → 197,11 25 27,6 pkt. PGF_2α 353,03 → 193,11 25 Pytanie 33,1 [²H₄]-PGF_2α 357,03 → 197,11 25 Pytanie 33,1 8-iso-PGF_2α 353,03 → 193,11 25 34,4 pkt. [²H₄]-8-iso-PGF _2α 357,03 → 197,11 25 34,4 pkt.

Tabela 3. W poniższej tabeli wymieniono związki wykryte w chromatogramach jonów całkowitych na rysunku 1A-C. Druga kolumna zawiera przejście używane dla MRM/MS, trzecia kolumna zawiera energię zderzenia (CE, eV), a ostatnia kolumna zawiera czas retencji (RT, min). Parametry zostały zoptymalizowane przy użyciu modułu separacyjnego Waters 2695 sprzężonego z Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra.

Dyskusja

Standardy i wzorce wewnętrzne stosowane w tym protokole stanowią reprezentację ukierunkowanej metody lipidomicznej. Do analizy LC-MS użyto modułu separacyjnego Waters 2695 i Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra, a optymalne ustawienia parametrów można znaleźć w tabelach 1 i 2. Ponadto ten protokół ekstrakcji został zaprojektowany dla komórek przylegających, ale może być modyfikowany dla innych typów komórek, a także innych matryc biologicznych, w tym moczu, krwi i tkanek. Wiele wzorców lipido...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
5-okso-6E,8Z,11Z,14Z-eikozatetraenoic-6,8,9,11,12,14,15-d7 kwas	Cayman Chemical	334250	[2H7]-5-ox–TE
5S-hydroksy-6E,8Z,11Z,14Z-eikozatetraenowy-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 Kwas	Cayman Chemical	334230	[2H8]-5(S)-HETE Wewnętrzny standard
12S-hydroksy-5Z,8Z,10E,14Z-eikozatetraenowy-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 acid	Cayman Chemical	334570	[2H8]-12(S)-HETE
15S-hydroxy-5Z,8Z,11Z,13E-eicosatetraenoic-5,6,8,9,11,12,14,15-d8	acid Cayman Chemical	334720	[2H8]-15(S)-HETE Wzorzec wewnętrzny
20-hydroksy-5Z,8Z,11Z,14Z-eikozatetraenowy-16,16,17,17,18,18-d6	Kwas Cayman Chemical	390030	[2H6]-20-HETE Wzorzec wewnętrzny
9S-hydroksy-10E,12Z-oktadecadienoik-9,10,12,13-d4	Cayman Chemical	338410	[2H4]-9(S)-HODE Wewnętrzny standard
Kwas 13S-hydroksy-9Z,11E-oktadecadienoi-9,10,12,13-d4	Cayman Chemical	338610	[2H4]-13(S)-HODE 9
alpha;,11α,15S-trihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4 acid	Cayman Chemical	316010	[2H4]-PGF2α Wzorzec wewnętrzny
9&alfa;,11&alfa;,15S-trihydroksy-(8β)-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 acid	Cayman Chemical	316350	[2H4]-8-iso-PGF2a Wzorzec wewnętrzny
α,11β.,15S-trihydroksy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 Kwas	Cayman Chemical	10008989	[2H4]-11β-PGF2 Wzorzec wewnętrzny
9&alfa;,15S-dihydroksy-11-okso-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4 acid	Cayman Chemical	312010	[2H4]-PGD2 Wzorzec wewnętrzny
9-oxo-11α,15S-dihydroksy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4 acid	Cayman Chemical	314010	[2H4]-PGE< sub>2 Wzorzec wewnętrzny
5S,12R-dihydroksy-6Z,8E,10E,14Z-eikozatetraen-6,7,14,15-d4 Kwas	Cayman Chemical	320110	[2H4]-LTB4 Wzorzec wewnętrzny
9&alfa;,11,15S-trihydroksy-tromba-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 Kwas	Cayman Chemical	319030	[2H4]-TxB2 Wzorzec wewnętrzny
Kwas 5-okso-6E,8Z,11Z,14Z-eikozatetraenowy	Kajman Chemiczny	34250	5-ox–TE Standardowy
12-okso-5Z,8Z,10E,14Z-eikozatetraenowy Kwas	Cayman Chemical	34580	12-ox–TE Standard
15-oxo-5Z, Kwas 8Z,11Z,13E-eikozatetraenowy	Cayman Chemical	34730	15-ox–TE Standard
5R-hydroksy-6E,8Z,11Z,14Z-eikozatetraenowy Kwas	Cayman Chemical	34225	5(R)-HETE Standard
5S-hydroksy-6E,8Z,11Z,14Z-eikozatetraenowy Kwas	Cayman Chemical	34230	5(S)-HETE Standard
8R-hydroksy-5Z,9E,11Z, Kwas 14Z-eikozatetraenowy	Cayman Chemical	34350	8(R)-HETE Standard
8S-hydroksy-5Z,9E,11Z,14Z-kwas eikozatetraenowy	Cayman Chemical	34360	8(S)-HETE Standard
11R-hydroksy-5Z,8Z,12E,14Z-eikozatetraenowy Kwas	Cayman Chemical	34505	11(R)-HETE Standard
11S-hydroksy-5Z,8Z,12E, Kwas 14Z-eikozatetraenowy	Cayman Chemical	34510	11(S)-HETE Standard
12R-hydroksy-5Z,8Z,10E,14Z-eikozatetraenowy Kwas	Cayman Chemical	34560	12(R)-HETE Standard
12S-hydroksy-5Z,8Z,10E,14Z-eikozatetraenowy Kwas	Cayman Chemical	34570	12(S)-HETE Standard
15R-hydroksy-5Z,8Z,11Z, Kwas 13E-eikozatetraenowy	Cayman Chemical	34710	15(R)-HETE Standard
15S-hydroksy-5Z,8Z,11Z,13E-eikozatetraenowy	Cayman Chemical	34720	15(S)-HETE Standard
20-hydroksy-5Z,8Z,11Z,14Z-eikozatetraenowy Kwas	Cayman Chemical	90030	20-HETE Standard
9R-hydroksy-10E,12Z-oktadekadienowy kwas	Cayman Chemical	38405	9(R)-HODE Standard
9S-hydroksy-10E,12Z-oktadekadienowy kwas	Cayman Chemical	38410	9(S)-HODE Standard
13R-hydroksy-9Z,11E-oktadekadienowy kwas	Cayman Chemical	38605	13(R)-HODE Standard
13S-hydroksy-9Z,11E-oktadekadienowy kwas	Cayman Chemical	38610	13(S)-HODE Standard
9&alfa;,11&alfa;,15S-trihydroksy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic Kwas	Cayman Chemical	16010	PGF2&alfa; < / sub> Standardowy
9&alfa;,11&alfa;,15S-trihydroksy-(8β)-prosta-5Z,13E-dien-1-oic Kwas	Kajman Chemiczny	16350	8-iso-PGF2&alfa; Standardowy
9&alfa;,11β,15S-trihydroksy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic	acid Cayman Chemical	16520	11β-PGF2 Standard
9&alfa;,15S-dihydroksy-11-oxo-prosta-5Z,13E-dien-1-oic acid	Cayman Chemical	12010	PGD2 Standard
9-oxo-11α,15S-dihydroksy-(8β)-prosta-5Z,13E-dien-1-oic acid	Cayman Chemical	14350	8-iso-PGE2 Standard
9-okso-11&alfa;,15S-dihydroksy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic	Cayman Chemical	14010	PGE2 Norma
5S,12R-dihydroksy-6Z,8E,10E,14Z-eikozatetraenowy Kwas	Cayman Chemical	20110	LTB4 Norma
Kwas 9&alfa;,11,15S-trihydroksytromba-5Z,13E-dien-1-oic	Cayman Chemical	19030	TxB2 Standardowa
sól fizjologiczna buforowana fosforanami	GIBCO, firmy Life Technologies	14190
Eter dietylowy	Sigma-Aldrich	346136
Dichlorometan	Acros Organics	61030-1000	bezwodny
N,N-diizopropyloetyloamina	Sigma-Aldrich	387649
Bromek pentafonylobenzylu	Kwas solny Sigma-Aldrich	101052
	Sigma-Aldrich	320331
Wodorotlenek potasu	Fluka	00650
Acetonitryl	Fisher Scientific	A996-4
Metanol	Fisher Scientific	A454-4
Chloroform	Fisher Scientific	366927
Hexane	Fisher Scientific	H303-4
Izopropanol	Fisher Scientific	A464-4
Etanol	Decon Laboratories	2716
Woda	Fisher Scientific	W7-4
Pipety Pasteura	Fisher Scientific	13-678-200
10 ml Szklane probówki wirówkowe	Kimble Chase	73785-10	Zakrętki
fenolowe	Kimble Chase	73802-13415
Kolumna Chiralcel ADH	Chiral Technologies	19325
Fiolki HPLC	Wody	60000751CV
Wkładki HPLC	Wody	WAT094171