Protokół wykrywania i neutralizacji wolnych rodników w fazie gazowej w głównym nurcie dymu papierosowego

Podsumowanie

Spektroskopia ESR z pułapkowaniem spinowym została wykorzystana do zbadania wpływu roślinnych przeciwutleniaczy, takich jak likopen, pyknogenol i ekstrakt z pestek winogron, na neutralizację wolnych rodników w fazie gazowej w dymie papierosowym.

Streszczenie

Palenie papierosów jest powiązane z nowotworami u ludzi. Wykazano, że większość zgonów z powodu raka płuc jest spowodowana paleniem papierosów ^5,6,7,12. Chociaż smole tytoniowe i pokrewne produkty w fazie cząsteczkowej dymu papierosowego są głównymi przyczynami chorób kancerogennych i mutagennych, dym papierosowy zawiera znaczne ilości wolnych rodników, które są również uważane za istotną grupę kancerogenów^9,10. Wolne rodniki atakują składniki komórkowe, uszkadzając strukturę białek, lipidy oraz sekwencje DNA, co zwiększa ryzyko rozwoju różnych rodzajów nowotworów. Wdychane rodniki tworzą addukty, które przyczyniają się do wielu negatywnych skutków zdrowotnych dymu tytoniowego w płucach³. Prowadzono badania nad redukcją wolnych rodników w dymie papierosowym w celu zmniejszenia ryzyka uszkodzeń indukowanych paleniem. Doniesiono, że hemoglobina i związki zawierające hem mogą częściowo wychwytywać tlenek azotu, utleniacze reaktywne oraz kancerogenne lotne związki nitrozo dymu papierosowego⁴. Do wychwytywania wolnych rodników i usuwania do 90% wolnych rodników z dymu papierosowego wykorzystano „biofiltr” składający się z hemoglobiny i węgla aktywnego¹⁴. Jednak ze względu na nieopłacalność kosztową nie udało się go skomercjalizować. Inne badanie wykazało wysoką wydajność wychwytywania przez shikoninę, składnik chińskiej medycyny ziołowej⁸. W niniejszym badaniu przedstawiamy protokół wprowadzania powszechnych naturalnych ekstraktów przeciwutleniających do filtra papierosowego w celu wychwytywania wolnych rodników w fazie gazowej dymu papierosowego oraz pomiar efektu wychwytywania wolnych rodników w fazie gazowej w głównym nurcie dymu papierosowego (MCS) z wykorzystaniem spektroskopii elektronowego rezonansu spinowego (ESR) z pułapką spinową^1,2,14. Wykazaliśmy wysoką zdolność wychwytywania likopenu oraz ekstraktu z pestek winogron, co może wskazywać na ich przyszłe zastosowanie w filtrach papierosowych. Istotną zaletą tych potencjalnych substancji wychwytujących jest to, że mogą być one pozyskiwane w dużych ilościach odpowiednio z produktów ubocznych przemysłu pomidorowego lub winiarskiego^11,13

Protokół

1. Materiały

Wszystkie rozpuszczalniki użyte w tej pracy były czystością reagentową. Pułapka spinowa, w tym N-tert-butyl-α-phenylnitrone (PBN), oraz standardowa etykieta spinowa 2,2,6,6-tetramethyl-1-piperinyoxyl (TEMPO) zostały zakupione w firmie Sigma i użyte bez dodatkowej obróbki. Roślinne przeciwutleniacze zostały zakupione komercyjnie w firmie Swanson, Inc. USA.

2. Przygotowanie dymu papierosowego i analiza wolnych rodników

1. Aby wprowadzić przeciwutleniacze do filtra, przeciwutleniacze pyknogenol i ekstrakt z pestek winogron rozpuszczono najpierw w 95% etanolu, natomiast likopen rozpuszczono w acetonie. Objętości rozpuszczalników różniły się w zależności od rozpuszczalności przeciwutleniacza.
2. Zastosowano ilość przeciwutleniaczy wynoszącą 0,4 mg/filtr. Następnie powleczono je 10 mg węgla aktywnego. W tym celu węgiel aktywny mieszano przez ~12 h z roztworem przeciwutleniacza w warunkach beztlenowych, filtrowano i suszono w próżni.
3. Przeciwutleniacze wprowadzono następnie do konwencjonalnego filtra octanowego (filtr CA). W tym celu filtr przecięto na dwie części. Powleczone roślinne przeciwutleniacze umieszczono pomiędzy dwiema częściami filtra i owinięto kawałkiem taśmy, tworząc strukturę typu kanapka: filtr – przeciwutleniacz – filtr (Rys. 1A). Ten połączony filtr przymocowano następnie do cygar zawierających tytoń. Filtr kontrolny wykonano w ten sam sposób co filtr z przeciwutleniaczem, z wyjątkiem tego, że nie dodano przeciwutleniacza.
4. Przed symulacją palenia badane papierosy rozpakowano i przechowywano w środowisku o stałej wilgotności (20 °C, 60% wilgotności względnej) przy użyciu nasyconego roztworu NaBr przez co najmniej 2 dni.
5. Symulację palenia dla analizy rutynowej przeprowadzono w temperaturze otoczenia przy użyciu jednoportowego urządzenia do palenia, które, jak pokazano na Rys. 1, składa się z aspiratora wodnego lub pompy próżniowej/kompresora powietrza GAST DOA-P104-BN (Benton Harbor, Mich) podłączonej do zestawu do pułapkowania spinowego poprzez trójnik z jednym otwartym końcem. Zaciągnięcia dymu wykonywano poprzez zatykanie otwartego końca, który pozostawał otwarty pomiędzy zaciągnięciami. Przepływ gazu sprawdzano za pomocą przepływomierza i ustawiono na ~2,2 SCFH = 17,5 mL/s poprzez regulację zaworu umieszczonego pomiędzy pompą a otworem odpływowym.
6. Badane papierosy palono przy objętości zaciągnięcia 35 mL przez czas 2 sekund, powtarzając tę czynność co 60 sekund, podobnie jak w¹. Symulację palenia dla ilościowego oszacowania wolnych rodników w fazie gazowej przeprowadzono w połączeniu z systemem pułapkowania spinowego, jak pokazano na Rys. 1.
7. Dla każdego papierosa wykonano dziesięć intensywnych zaciągnięć (35 mL/zaciągnięcie). Wolne rodniki w fazie gazowej zbierano, przepuszczając MCS przez wkład filtra Cambridge, a następnie wprowadzano je do roztworu pułapkującego (0,05 M PBN w benzenie, 2,0 mL).
8. Po ostatnim zaciągnięciu napowietrzony roztwór pułapkujący ponownie doprowadzono do objętości początkowej (2,0 mL) za pomocą tego samego benzenu. Alikwot przeniesiono do szklanej rurki o długości ~250 mm i średnicy wewnętrznej 3 mm, zamkniętej z jednego końca.
9. Roztwór pułapkujący odtleniono za pomocą procedury zamrażania, pompowania i rozmrażania. Zamrożono go w ciekłym azocie i zastosowano próżnię. Następnie rozmrożono go w atmosferze argonu, pozwalając na ujście uwięzionych pęcherzyków gazu, i ponownie zamrożono. Po trzykrotnym powtórzeniu tego cyklu rurkę zamknięto szczelnie przez stopienie szkła w próżni i wykorzystano w dalszych pomiarach ESR. Krok ten jest niezbędny, ponieważ tlen, który jest dobrze rozpuszczalny w benzenie, poszerza linie ESR rodników organicznych. Odtlenianie drastycznie poprawia stosunek sygnału do szumu.
10. Widma ESR pasma X rejestrowano na spektrometrze Bruker EMX przy częstotliwości 9,34 GHz w warunkach standardowych. Ustawienia spektrometru stosowane w większości doświadczeń to: pole centralne 3312,5G, szerokość skanowania 80G, amplituda modulacji 0,5G, stała czasowa 82 mikrosekundy, czas skanowania 40 s.
11. Addukty pułapki spinowej są stosunkowo stabilne w warunkach doświadczalnych, co w niektórych przypadkach wymagało 25 akumulacji, co zazwyczaj trwało ~20 min. Jednak po 12 h intensywność sygnałów ESR w roztworze benzenu spadła około 5-krotnie.
12. Aby ilościowo określić stężenie adduktu pułapkującego, zintegrowano jego początkowe widmo ESR pierwszej pochodnej. Wynikowe widmo absorpcyjne wykazuje szerokie tło singletowe, najprawdopodobniej spowodowane produktami sadzy/smoły zawartymi w dymie.
    
    Po odjęciu tego tła ponownie zintegrowano oddzielony triplet adduktu pułapkującego (Rys. 2).

3. Reprezentatywne wyniki

Większość wolnych rodników w dymie z palonych papierosów (faza gazowa) jest krótkotrwała i niestabilna. W celu zaobserwowania tych rodników zastosowano technikę pułapkowania spinowego. Polega ona na wychwytywaniu wolnych rodników z fazy gazowej poprzez przekształcanie ich w addukt spinowy, który jest bardziej stabilny i może zostać wykryty za pomocą ESR (Rys. 1). W niniejszym badaniu do zbierania wolnych rodników z gazowej fazy dymu wykorzystano roztwór pułapki spinowej 0,05 M PBN; rodniki te stanowią mieszaninę rodników centrowanych na tlenie i węglu, które są trudne do rozdzielenia¹⁵. W naszym przypadku zaobserwowane stałe rozszczepienia nadsubtelnego a_N = 13,7 G i a_H = 1,95 G są bardzo zbliżone do odpowiadających im wartości dla adduktów pułapkowania wolnych rodników alkoksylowych (RO.)², co sugeruje, że stanowią one główny produkt. Wykazaliśmy, że słabe sygnały ESR i niska powtarzalność zaobserwowane w początkowych pomiarach (Rys. 2) wynikały z obecności wilgoci w strumieniu dymu. Aby rozwiązać ten problem, umieściliśmy pułapkę z ciekłym azotem (LN2) pomiędzy filtrem Cambridge a roztworem pułapki spinowej. Pułapka LN₂ usunęła wodę ze strumienia MCS poprzez szybkie zamrożenie i przechwycenie jej na wewnętrznej ściance szklanej rurki. Znacznie poprawiło to sygnały ESR i pozwoliło na uzyskanie wyników o wysokiej powtarzalności (Rys. 3).

Ilość uwięzionych wolnych rodników określono przy użyciu próbki referencyjnej. Dla próbek kontrolnych bez przeciwutleniaczy typowe stężenie adduktu w benzenie, oszacowane poprzez porównanie jego widma podwójnego całkowania z widmem podwójnego całkowania dla znanego stężenia TEMPO, wynosiło 1,24 μM (Rys. 2). Ponieważ ilość powietrza przepływającego przez każdego papierosa podczas palenia wynosiła ~350 ml, daje to szacunkowe stężenie wolnych rodników w fazie gazowej MCS na poziomie ~7,1X10^-9M oraz całkowitą liczbę rodników uwięzionych z fazy gazowej całego papierosa wynoszącą ~1,5X10¹⁵. Szacunkowa całkowita ilość wolnych rodników w dymie z całego papierosa, obejmująca zarówno fazę gazową, jak i cząsteczkową, wynosiła ~10¹⁶ wolnych rodników⁹.

Zaobserwowano różne poziomy efektu neutralizacji wolnych rodników w fazie gazowej dymu z papierosów w głównym nurcie przez przeciwutleniacze roślinne. Szybkości ich neutralizacji przedstawiono na Rys. 4. Likopen oraz ekstrakt z pestek winogron wykazały najwyższe wartości, podczas gdy najniższą szybkość zaobserwowano w przypadku pyknogenolu (Rys. 4).

Rysunek 1. Schemat ulepszonego projektu symulacji palenia w celu gromadzenia wolnych rodników w fazie gazowej w głównym nurcie dymu papierosowego (MCS) przy użyciu pułapki spinowej. MCS był zasysany przez aspirator wodny przez filtr CA, następnie przez filtr Cambridge (filtr żółty) i przepuszczany przez pułapkę z ciekłym azotem w celu usunięcia H₂O. Produkty w fazie gazowej trafiały ostatecznie do pułapki spinowej i były przepuszczane w formie bąbelków przez roztwór pułapki spinowej. Przeciwutleniacz roślinny umieszczono pomiędzy dwoma konwencjonalnymi filtrami octanowymi (powiększenie w okręgu A) przymocowanymi do papierosa, aby wychwytywać wolne rodniki w MCS.

Rycina 2. Ilościowe oszacowanie stężenia adktu pułapkowania spinowego w benzenie wymaga odjęcia szerokiego sygnału tła od widma pierwszej całki. Parametry rozszczepienia nadsubtelnego dla adktu pułapkowania spinowego wynoszą a_H = 1.95 G, a_N = 13.7G.

Rysunek 3. Przeprowadzenie przez pułapkę z LN2 znacznie poprawia jakość sygnałów ESR otrzymanych w wyniku spin-trappingu MCS.

Rycina 4. Wpływ naturalnych przeciwutleniaczy na stężenie wolnych rodników w MCS. Względne intensywności sygnałów wynoszą: kontrola – 100%, pycnogenol – 55%, ekstrakt z pestek winogron – 12%, likopen – 10%.

Dyskusja

Niezawodna ocena wpływu różnych wymiatywaczy wolnych rodników w dymie tytoniowym wymaga powtarzalnej techniki ilościowego wykrywania wolnych rodników. Wcześniej¹ wykazano, że niewielkie objętości roztworów pułapek spinowych o wyższym stężeniu w rozpuszczalnikach niepolarnych są najskuteczniejsze w wychwytywaniu wolnych rodników z dymu tytoniowego. Dym papierosowy zawsze zawiera parę wodną powstałą w wyniku spalania związków organicznych oraz pozostałą wilgoć w tytoniu, która może przedostać się do rozpuszczalnika pułapkującego. Ta domieszka wody w roztworze pułapki spinowej PBN znacznie skraca czas życia adduktów pułapkowania spinowego oraz zmniejsza intensywność ich sygnałów ESR. Usunięcie tej wilgoci poprzez proste przepuszczenie MCS przez rurkę w kształcie litery U chłodzoną ciekłym azotem drastycznie poprawiło jakość widm ESR w naszych eksperymentach, mimo że pewna część rodników w fazie gazowej mogła zostać również uwięziona na zamrożonej powierzchni.

Stosując tę technikę, porównaliśmy względną wydajność różnych naturalnych związków wykazujących działanie wymiatującego rodniki, wprowadzonych do filtrów papierosowych. Stwierdziliśmy, że likopen i ekstrakt z pestek winogron bezpośrednio po włączeniu do filtrów papierosowych są w stanie wymieść do 90% wolnych rodników z gazowej fazy MSC. Tak wysoka zdolność wymiatania plasuje te tanie i łatwo dostępne naturalne związki wśród najskuteczniejszych opisanych protectorów wolnych rodników, takich jak hemoglobina i szikonina^8,14. Jednak w naszych eksperymentach filtry papierosowe obciążone badanymi naturalnymi przeciwutleniaczami utraciły znaczną część swojej zdolności wymiatania po tygodniu przechowywania w temperaturze pokojowej. Rozwiązanie tego problemu może stymulować przyszłe zastosowanie likopenu i ekstraktu z pestek winogron w komercyjnych filtrach papierosowych.