Dwa rodzaje testów do wykrywania chemoatrakcji plemników żaby

Podsumowanie

Komórki jajowe oraz otaczające je powłoki pozakomórkowe często uwalniają peptydy, białka i małe cząsteczki, które komunikują się z plemnikami, by prowadzić je do jaja, wspomagając tym samym zapłodnienie. Wykorzystując plemniki żaby, opisujemy i porównujemy dwie klasy testów służących do wykrywania chemotaksji plemników – testy akumulacji plemników oraz testy śledzenia trajektorii plemników.

Streszczenie

Chemoatrakcja plemników u bezkręgowców może być na tyle silna, że można umieścić pipetę zawierającą atraktujący peptyd w zawiesinie plemników i pod mikroskopem zaobserwować ich gromadzenie się wokół pipety¹. Chemoatrakcja plemników u kręgowców, takich jak żaby, gryzonie i ludzie, jest trudniejsza do wykrycia i wymaga analiz ilościowych. Analizy te dzielą się na dwa główne rodzaje: testy ilościowo określające ruch plemników w stronę źródła chemoatraktanta, tzw. testy akumulacji plemników, oraz testy umożliwiające rzeczywiste śledzenie trajektorii pływania poszczególnych plemników.

Testy akumulacji plemników są stosunkowo szybkie, co pozwala na przeprowadzenie od kilkunastu do kilkuset pomiarów w ciągu jednego dnia, umożliwiając tym samym sprawne wyznaczanie krzywych odpowiedzi na dawkę oraz przebiegów czasowych. Tego rodzaju analizy były szeroko wykorzystywane do charakteryzacji wielu ugruntowanych systemów chemoatrakcji – na przykład chemotaksji neutrofili w kierunku peptydów bakteryjnych oraz chemotaksji plemników w kierunku płynu pęcherzykowego. Testy śledzenia plemników mogą być bardziej pracochłonne, ale dostarczają dodatkowych danych na temat tego, w jaki sposób chemoatraktanty faktycznie zmieniają ścieżki pływania plemników. Ten typ analizy jest niezbędny do wykazania orientacji ruchu plemników względem osi gradientu chemoatraktanta oraz do wizualizacji charakterystycznych zwrotów lub zmian orientacji, które przybliżają plemnik do komórki jajowej.

W niniejszym opracowaniu opisujemy metody stosowane w obu tych rodzajach testów. Wykorzystany test akumulacji plemników nazywany jest testem „dwukomorowym”. Plemniki płazów umieszcza się w wkładce do płytki hodowlanej z poliwęglanowym dnem filtrującym o porach o średnicy 12 μm. Wkładki z plemnikami umieszcza się w dołkach płytki hodowlanej zawierających bufor oraz chemoatraktant, który jest ostrożnie pipetowany na dno dołka w miejscu styku dna ze ścianką (patrz Rys. 1). Po inkubacji górną wkładkę zawierającą rezerwuar plemników ostrożnie usuwa się, a plemniki w dolnej komorze, które przeszły przez membranę, są pobierane, wirowane w celu uzyskania osadu, a następnie zliczane za pomocą hemocytometru lub cytometru przepływowego.

Test śledzenia plemników wykorzystuje komorę Zigmonda, opracowaną pierwotnie do obserwacji chemotaksji neutrofilów i zmodyfikowaną do obserwacji plemników przez Giojalasa i współpracowników^2,3. Komora składa się z grubego szkiełka przedmiotowego, w którym wyfrezowano dwa pionowe rowki. Są one oddzielone platformą obserwacyjną o szerokości 1 mm. Po nałożeniu szkiełka nakrywkowego, do jednego rowka wprowadza się plemniki, a do drugiego czynnik chemoatraktancyjny, a następnie ruch poszczególnych plemników jest wizualizowany za pomocą mikroskopii wideo. Materiał wideo jest następnie analizowany za pomocą oprogramowania w celu zidentyfikowania dwuwymiarowych ruchów komórek w płaszczyźnie x-y jako funkcji czasu (zbiory danych xyt), które tworzą trajektorię każdego plemnika.

Protokół

1. Wykorzystane materiały i bufory

1. Bufor Ringera dla oocytów (1.5 x OR2) zawiera 124 mM NaCl, 3.75 mM KCl, 1.5 mM CaCl₂, 1.5 mM MgCl₂, 1.5 mM Na₂HPO₄, 10 mM Hepes, pH 7.8. Bufor do zapłodnienia (F-1) zawiera 41.25 mM NaCl, 1.25 mM KCl, 0.25 mM CaCl₂, 0.06 mM MgCl₂, 0.5 mM Na₂HPO₄, 2.5 mM Hepes, pH 7.8.
2. Woda z jaj Xenopus laevis jest przygotowywana zgodnie z metodą Sugiyama i wsp.⁴. W skrócie: świeżo złożone jaja żaby w otoczce galaretowatej miesza się w niewielkiej objętości buforu F-1 przez 30 minut, a następnie warunkowan....

Dyskusja

Chemotaksja komórek przemieszczających się za pomocą ruchu ameboidalnego lub pływania napędzanego wiciami występuje w wielu kontekstach biologicznych, a badanie tego zjawiska wymaga dostępności praktycznych i niezawodnych testów. Niektóre przykłady tego zjawiska, takie jak przyciąganie plemników do komórki jajowej jeżowca lub gromadzenie się komórek śluzowców w celu utworzenia ciała owocnikowego, mają bezpośredni efekt wizualny. Ilościowe określanie tego zjawiska było podejmowane na różne sposoby, jak opisano w pracy Eis.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Płytki 24-dołkowe	BD Biosciences	35/1147
Wkładki o średnicy zewnętrznej 12 mm z membraną o porach 12 μm	EMD Millipore	PIXP01250	Wcześniej stosowano płytki transwell Costar-Corning nr 3403 – obecnie wycofane z produkcji
Komora Zigmonda	Neuroprobe	Z02
Olej silikonowy	GE Healthcare	SF1154	Odpowiednik Dow Corning 550 Fluid
Oprogramowanie Image J	Wayne Rasband, Research Services Branch, National Institute of Mental Health	Bezpłatne pobieranie ze strony http://rsbweb.nih.gov/ij	Program Java działający w systemach Windows, Linux i Mac
Oprogramowanie MtrackJ	Biomedical Imaging Group	Bezpłatne pobieranie ze strony http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/	Program Java działający w systemach Windows, Linux i Mac
Oprogramowanie Virtual Dub	GNU General Public Licensed	Bezpłatne pobieranie przez http://www.virtualdub.org/index.html	Instrukcje konfiguracji na stronie Image J w sekcji wtyczek; tylko dla systemu Windows
Oprogramowanie cellSens	Olympus Corporation	Patrz strona: http://www.olympusamerica.com/seg_section/product.asp?product=1070	Służy do sterowania i akwizycji obrazów z różnych kamer. Posiada również funkcje przetwarzania obrazu