Dwa rodzaje testów do wykrywania chemoatrakcji plemników żaby

Podsumowanie

Komórki jajowe oraz otaczające je powłoki pozakomórkowe często uwalniają peptydy, białka i małe cząsteczki, które komunikują się z plemnikami, by prowadzić je do jaja, wspomagając tym samym zapłodnienie. Wykorzystując plemniki żaby, opisujemy i porównujemy dwie klasy testów służących do wykrywania chemotaksji plemników – testy akumulacji plemników oraz testy śledzenia trajektorii plemników.

Streszczenie

Chemoatrakcja plemników u bezkręgowców może być na tyle silna, że można umieścić pipetę zawierającą atraktujący peptyd w zawiesinie plemników i pod mikroskopem zaobserwować ich gromadzenie się wokół pipety¹. Chemoatrakcja plemników u kręgowców, takich jak żaby, gryzonie i ludzie, jest trudniejsza do wykrycia i wymaga analiz ilościowych. Analizy te dzielą się na dwa główne rodzaje: testy ilościowo określające ruch plemników w stronę źródła chemoatraktanta, tzw. testy akumulacji plemników, oraz testy umożliwiające rzeczywiste śledzenie trajektorii pływania poszczególnych plemników.

Testy akumulacji plemników są stosunkowo szybkie, co pozwala na przeprowadzenie od kilkunastu do kilkuset pomiarów w ciągu jednego dnia, umożliwiając tym samym sprawne wyznaczanie krzywych odpowiedzi na dawkę oraz przebiegów czasowych. Tego rodzaju analizy były szeroko wykorzystywane do charakteryzacji wielu ugruntowanych systemów chemoatrakcji – na przykład chemotaksji neutrofili w kierunku peptydów bakteryjnych oraz chemotaksji plemników w kierunku płynu pęcherzykowego. Testy śledzenia plemników mogą być bardziej pracochłonne, ale dostarczają dodatkowych danych na temat tego, w jaki sposób chemoatraktanty faktycznie zmieniają ścieżki pływania plemników. Ten typ analizy jest niezbędny do wykazania orientacji ruchu plemników względem osi gradientu chemoatraktanta oraz do wizualizacji charakterystycznych zwrotów lub zmian orientacji, które przybliżają plemnik do komórki jajowej.

W niniejszym opracowaniu opisujemy metody stosowane w obu tych rodzajach testów. Wykorzystany test akumulacji plemników nazywany jest testem „dwukomorowym”. Plemniki płazów umieszcza się w wkładce do płytki hodowlanej z poliwęglanowym dnem filtrującym o porach o średnicy 12 μm. Wkładki z plemnikami umieszcza się w dołkach płytki hodowlanej zawierających bufor oraz chemoatraktant, który jest ostrożnie pipetowany na dno dołka w miejscu styku dna ze ścianką (patrz Rys. 1). Po inkubacji górną wkładkę zawierającą rezerwuar plemników ostrożnie usuwa się, a plemniki w dolnej komorze, które przeszły przez membranę, są pobierane, wirowane w celu uzyskania osadu, a następnie zliczane za pomocą hemocytometru lub cytometru przepływowego.

Test śledzenia plemników wykorzystuje komorę Zigmonda, opracowaną pierwotnie do obserwacji chemotaksji neutrofilów i zmodyfikowaną do obserwacji plemników przez Giojalasa i współpracowników^2,3. Komora składa się z grubego szkiełka przedmiotowego, w którym wyfrezowano dwa pionowe rowki. Są one oddzielone platformą obserwacyjną o szerokości 1 mm. Po nałożeniu szkiełka nakrywkowego, do jednego rowka wprowadza się plemniki, a do drugiego czynnik chemoatraktancyjny, a następnie ruch poszczególnych plemników jest wizualizowany za pomocą mikroskopii wideo. Materiał wideo jest następnie analizowany za pomocą oprogramowania w celu zidentyfikowania dwuwymiarowych ruchów komórek w płaszczyźnie x-y jako funkcji czasu (zbiory danych xyt), które tworzą trajektorię każdego plemnika.

Protokół

1. Użyte materiały i bufory

1. Roztwór Ringera dla oocytów′Bufor s (1,5 x OR2) zawiera 124 mM NaCl, 3,75 mM KCl i 1,5 mM CaCl2₂, 1,5 mM MgCl2₂, 1,5 mM Na₂HPO₄, 10 mM Hepes, pH 7,8. Bufor do zapłodnienia (F-1) zawiera 41,25 mM NaCl, 1,25 mM KCl, 0,25 mM CaCl2₂, 0,06 mM MgCl₂₂, 0,5 mM Na₂HPO (histochemia i patologia)₄, 2,5 mM Hepes, pH 7,8.
2. *Xenopus laevis* wodę jajeczną przygotowano zgodnie z metodą Sugiyamy i wsp.⁴Krótko opisując: świeżo złożone jaja żaby w otoczce galaretowatej miesza się w niewielkiej objętości buforu F-1 przez 30 minut, a następnie usuwa się kondycjonowane medium za pomocą mikropipety. Medium to, nazywane „wodą z jaj” (ang. egg water), może być również wykorzystane do przygotowania oczyszczonej alluryny, która jest głównym chemoatraktantem w tym ekstrakcie z galaretki. Plemniki pozyskuje się z hodowli komercyjnych *Xenopus laevis* lub Xenopus tropicalis.
3. Informacje o konkretnych elementach niezbędnych do przeprowadzenia analizy znajdują się w tabeli materiałów.

2. Dwukomorowy test chemotaksji plemników żaby

1. Zanurzyć żabę w wodzie zawierającej 0,07% benzokainy w celu znieczulenia, odciąć głowę za pomocą nożyczek z krawędzią karborundową i przeprowadzić podwójne zniszczenie rdzenia kręgowego (pithing), aby zapewnić eutanazję. Odciąć skórę brzucha, aby odsłonić mięśnie. Wykonać nacięcia w linii środkowej i bocznych nacięcia w mięśniach brzusznych, a następnie odsunąć brzegi rany. Delikatnie odsunąć jelita i tkankę tłuszczową, aby odsłonić białe, fasolkowate jądra. Odciąć tkankę łączną za pomocą precyzyjnych nożyczek, uważając, aby nie uszkodzić naczyń krwionośnych. Wyjąć jądro, wypłukać krew za pomocą buforu 1,5 x OR2, a następnie przetoczyć jądro po papierze filtracyjnym, aby usunąć nadmiar buforu i drobne przylegające naczynia krwionośne; następnie umieścić jądro w plastikowej płytce Petriego w 0,2 ml buforu 1,5 x OR2. Napełnić strzykawkę 5 ml 2 ml buforu 1,5 x OR2, delikatnie nakłuć 10-20 otworów w jądrze na większości powierzchni jednego z końców, włożyć igłę z przeciwległej strony i delikatnie wstrzyknąć bufor, aby wypłukać plemniki. Alternatywnie można wstrzykiwać bufor podczas nakłuwania otworów wylotowych, aby wypłukać plemniki. Przenieść zawiesinę plemników za pomocą mikropipety z odciętą końcówką (aby uniknąć ścinania plemników) do probówki do mikrocentryfugi i umieścić na lodzie.
2. Oszacować liczbę uzyskanych plemników żaby poprzez rozcieńczenie plemników 1:100 w buforze 1,5 x OR-2, pobranie 20 μl próbki zmieszanej zawiesiny plemników i przeliczenie liczby komórek za pomocą hemocytometru, korzystając z dużego obszaru o powierzchni 1 mm². Na podstawie odczytu z hemocytometru i współczynnika pobierania próbki obliczyć gęstość plemników oraz całkowitą liczbę zebranych plemników. Wartość ta zazwyczaj wynosi 2 - 6 x 10⁷ plemników w objętości około 2 ml przy użyciu obu jąder. Rozcieńczyć zapasową zawiesinę plemników buforem 1,5 x OR2, aby uzyskać gęstość plemników 2 x 10⁷/ml. Wykorzystać plemniki do analizy w ciągu 2 do 3 godzin od przygotowania. Ocenić ruchliwość plemników, rozcieńczając 5 μl plemników 1:10 buforem F-1 i obserwując ruch za pomocą optyki kontrastowej fazowej. Co najmniej 40% do 50% plemników powinno być ruchliwych. Nawet odpowiednie preparaty będą zawierać dużą liczbę plemników nieruchomych, z których większość jest niedojrzała.
3. Przygotować nową plastikową płytkę kultur tkankowych z 24 dołkami, dozując za pomocą mikropipety 700 μl buforu F1 do każdego dołka. Każdy dołek powinien mieć średnicę około 15 mm na dnie.
4. Rozpocząć serię analiz, rozcieńczając 100 μl zawiesiny plemników w 900 μl buforu F1 w temperaturze pokojowej (około 21 do 23°C) w probówce do mikrocentryfugi, aby aktywować ruchliwość plemników poprzez szok osmotyczny. Za każdym razem, gdy plemniki zostaną aktywowane w ten sposób, należy ich użyć w ciągu 1-2 minut.
5. Umieścić wkładkę o porowatości 12 μm (średnica zewnętrzna 12 mm) w wypełnionym buforem dołku; należy upewnić się, że wkładka jest umieszczona poza centrum, pozostawiając wolną przestrzeń z jednej strony. Natychmiast przenieść 400 μl aktywowanych ruchliwie plemników do dołka za pomocą mikropipety z odciętą końcówką. Nanieść zawiesinę plemników na ściankę wkładki filtrującej i pozwolić jej spłynąć na filtr na dnie wkładki; zawiesiny plemników nie należy pipetować bezpośrednio na filtr.
6. Ostrożnie nanieść mikropipetą 50 μl czynnika chemoatraktacyjnego do dołka w przestrzeni między ścianką dołka a przesuniętą wkładką filtrującą. Należy uważać, aby nanieść kroplę w miejscu styku ścianki bocznej i dna dołka, a następnie wycofać pipetę bez zakłócania systemu. W szczególności tłok mikropipety powinien zostać naciśnięty tylko do pierwszego stopnia, aby całkowicie opróżnić próbkę, ale nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.
7. Powtórzyć kroki 2.5 i 2.6 powyżej, aby rozpocząć taką liczbę analiz, jaka jest wymagana, a następnie inkubować płytkę, aż pierwsza rozpoczęta analiza osiągnie czas inkubacji 50 minut. Zazwyczaj można rozpoczynać analizę co 45 do 60 sekund. Należy zauważyć, że proces ten może zostać usprawniony przez doświadczoną osobę lub dwie osoby pracujące razem. W takim przypadku jeden lub dwa rzędy analiz można zainicjować z większym zapasem ruchliwych plemników i szybszym pipetowaniem, pod warunkiem, że plemniki są zawsze używane w ciągu 1 do 2 minut od aktywacji.
8. Zatrzymać każdą analizę w rozpoczętej sekwencji. Najpierw jedną ręką ostrożnie ustabilizować wkładkę filtrującą, a drugą ostrożnie usunąć większość lub całość zawiesiny plemników z górnej komory za pomocą mikropipety lub odsysania pipetą Pasteura. Natychmiast, używając precyzyjnej pęsety, wyciągnąć wkładkę filtrującą i wyrzucić. Na tym etapie należy zachować ostrożność, aby pozostałe plemniki nie zostały przypadkowo przepchnięte przez filtr, co sztucznie zawyżyłoby wartości przejścia plemników.
9. Z każdego dołka płytki przenieść całą zawiesinę plemników do probówki do mikrocentryfugi. Ważne jest wymieszanie zawiesiny plemników w dołku przed pobraniem, ponieważ plemniki mają tendencję do osiadania na dnie. Dodać 15 μl 25% formaldehydu do końcowego stężenia 0,5 % v/v i schłodzić, jeśli liczenie plemników nie zostanie wykonane tego samego dnia.
10. Uwirować plemniki w każdej probówce, wykonując 10-sekundowe wirowanie przyciskiem w osobistej mikrocentry fudze o prędkości maksymalnej 2000 x g. Usunąć cały supernatant z każdej probówki z wyjątkiem 100 μl, a następnie resuspendować osad w tej objętości. Pobrać 20 μl zawiesiny plemników, rozcieńczyć 1:10 wodą destylowaną i przeliczyć plemniki na hemocytometrze za pomocą obiektywu 40x w mikroskopie pionowym. Wykorzystać wyniki liczenia i czynniki rozcieńczenia, aby obliczyć całkowitą liczbę plemników, które przeszły przez filtr w każdej analizie.

3. Analiza śledzenia plemników żaby przy użyciu komory Zigmonda

1. Przygotuj stanowisko z mikroskopem odwróconym do rejestracji wideo. Używamy mikroskopu odwróconego Nikon Elipse TE300 wyposażonego w analogową kolorową kamerę wideo Sony DXC-390 z 3 matrycami lub monochromatyczną kamerę cyfrową Hamamatsu ORCA-03G. Komora Zigmonda musi spoczywać na stoliku odwrócona do góry dnem, przy czym w płycie stolika musi znajdować się otwór wystarczająco duży, aby pomieścić szkiełko cover glass o wymiarach 22x40 mm. Taki układ jest konieczny, ponieważ plemniki żaby nie są w stanie płynąć przeciwko grawitacji. Ustaw ostrość obiektywu 4x lub 10x na platformie obserwacyjnej znajdującej się między dwiema rynienkami.
2. Sprawdź, czy kamera jest ustawiona ostro i wycentrowana na platformie obserwacyjnej. W przypadku użycia kamery Sony sygnał jest przesyłany do monitora wideo i do przetwornika A/D (frame grabber) zdolnego do digitalizacji 7 klatek na sekundę z sygnału wideo. Strumień cyfrowy jest przetwarzany przez komputer z procesorem 3 GHz lub szybszym, najlepiej z 4 Gb lub większą ilością pamięci RAM. Choć używamy oprogramowania Scion Image (niestandardowej wersji NIH Image dla systemu Windows) sterującego chwytaczem klatek Scion CG-7, produkty te nie są już dostępne. Aktualnym rozwiązaniem jest użycie oprogramowania Image J z wtyczką VirtualDub do przechwytywania obrazu z analogowej kamery wideo. W przypadku użycia kamery Hamamatsu jej wyjście cyfrowe jest przetwarzane przez oprogramowanie Olympus cellSens i wyświetlane na monitorze komputera. W obu przypadkach dane są zapisywane na wewnętrznym lub zewnętrznym dysku twardym jako 8-bitowy stos plików tiff. Użycie oprogramowania Scion Image wymaga konwersji sekwencji obrazów Tiff na stos przy użyciu programu Image J.
3. Pole mikroskopowe powinno obejmować większość lub całą szerokość platformy obserwacyjnej. Dla uzyskania najlepszych wyników należy stosować optykę kontrastową lub ciemnego pola. Odległość między powierzchnią platformy obserwacyjnej a spodem szkiełka cover glass powinna wynosić od 15 do 20 μm, co określa się poprzez różnicowanie ostrości na każdej z tych powierzchni.
4. Przygotuj chemoatraktant o odpowiednim stężeniu w buforze F1. Przygotuj plemniki Xenopus laevis zgodnie z wcześniejszym opisem i przechowuj w 1.5 x buforze OR2 na lodzie do momentu użycia.
5. Zmontuj komorę Zigmonda. Rozpocznij od czystej i suchej komory. Za pomocą mikropipety nanieś linię oleju silikonowego (4 μl) około 5 mm od zewnętrznej krawędzi każdej rynienki, równolegle do niej. Połóż szkiełko cover glass o wymiarach 22x40 mm na komorze, pozwalając olejowi silikonowemu równomiernie rozprzestrzenić się do zewnętrznej krawędzi każdej rynienki. Jeśli wstępne eksperymenty wykażą problem z przywieraniem plemników, może być konieczne pokrycie szkiełka cover glass nitrocelulozą, zgodnie z sugestią Fabro i wsp.³. Alternatywnie, dodanie białka do stosowanych buforów (np. 1% BSA) może również zredukować przywieranie plemników.
6. Odwróć komorę i umieść ją nad okrągłym wycięciem w stoliku mikroskopu, dbając o to, aby szkiełko cover glass nie stykało się ze stolikiem. Ta odwrócona konfiguracja jest niezbędna, aby doprowadzić plemniki Xenopus z rynienki na platformę. W przeciwieństwie do plemników ssaków, plemniki Xenopus nie są na tyle silne, by płynąć przeciwko grawitacji w celu dotarcia na platformę.
7. Aktywuj 20 μl plemników Xenopus w 1.5 x buforze OR2 poprzez zmieszanie w stosunku 1:10 z buforem F1 w temperaturze pokojowej. Używając mikropipety z przyciętą końcówką, natychmiast przenieś 70 μl plemników z aktywowaną ruchliwością do rynienki. Osiąga się to poprzez trzymanie mikropipety pod niskim kątem i umieszczenie końcówki przy bocznym otworze rynienki. Wyrzucona zawiesina komórek wypełnia rynienkę i mostek poprzez działanie kapilarne. Następnie w ten sam sposób wypełnij przeciwległą rynienkę roztworem chemoatraktantu.
8. Rozpocznij nagrywanie wideo w ciągu 3 minut (plemniki Xenopus mają ograniczony czas ruchliwości) i kontynuuj przez 5 minut. Po zakończeniu nagrywania rozmontuj komorę i wypłucz rynienki oraz platformę obserwacyjną pod ciśnieniem strumienia wody, a następnie etanolem z butelki z atomizerem. Usuń olej silikonowy z górnych powierzchni za pomocą papierowych ręczników, uważając, aby nie zanieczyścić platformy obserwacyjnej i rynienek.
9. W razie potrzeby przekonwertuj przechwycone dane wideo na sekwencję obrazów Tiff lub stos przy użyciu oprogramowania Image J. Następnie otwórz plik w programie Image J i w pierwszych 21 klatkach (3 sekundy) wybierz do 50 plemników do śledzenia. Aby uniknąć błędów selekcji, wybieraj plemniki ze wszystkich obszarów pola obserwacyjnego i bez znajomości danych o ich trajektorii. Przechwyć dwuwymiarowe trajektorie komórek w płaszczyźnie x-y jako funkcję czasu (zbiory danych xyt) dla każdego plemnika, klikając myszką przy użyciu modułu wtyczki MtrackJ dla programu Image J. Zwizualizuj trajektorie i oblicz odległości trajektorii, składowe osi oraz prędkości w programie MtrackJ. Alternatywnie, wykonaj te operacje oraz dalszą analizę numeryczną (np. kierunkowość, parametry chemotaksji i histogramy parametrów) poprzez import zbiorów danych xyt do programu Microsoft Excel.
10. Wykreśl trajektorie dla każdego plemnika w programie Excel, aby wykryć ogólne wzorce ruchu, w tym wzorce liniowe, krzywoliniowe i kołowe, a także cechy takie jak zakręty. Wykorzystaj zbiory danych xyt do obliczenia średniej prędkości krzywoliniowej, całkowitego przemieszczenia wzdłuż osi X (gradientu) i Y oraz parametrów orientacji, takich jak średni kąt ruchu względem osi gradientu.

4. Reprezentatywne wyniki:

Ważnymi parametrami technicznymi w teście dwukomorowym są rozmiar i kształt komory, porowatość membrany oraz czas inkubacji. Średnica górnej komory zawierającej plemniki nie powinna być na tyle duża, aby wymagała dużego wolumenu plemników (preferowane jest 0,5 ml lub mniej), a górna komora nie powinna być zbyt głęboka, aby nie tworzyła wysokiej kolumny zawiesiny komórkowej (<1 cm). Objętość buforu w dolnej komorze otaczającej wkładkę górnej komory powinna dokładnie odpowiadać poziomowi zawiesiny komórkowej we wkładce, aby nie wytworzyć transmembranowego ciśnienia hydrostatycznego, które w sposób artefaktyczny wymusiłoby przejście plemników przez membranę. Umieszczenie pustej wkładki w dolnej studzience, a następnie napełnienie jej plemnikami, skutkuje początkowym ciśnieniem hydrostatycznym skierowanym w górę, co zapobiega przechodzeniu plemników przez membranę podczas ładowania. Wybór wielkości porów membrany jest determinowany przez rozmiar plemników oraz dostępność komercyjną porowatych wkładek membranowych. Ustaliliśmy, że w testach z plemnikami żaby można stosować pory o średnicy 8 lub 12 μm, choć pory 12 μm umożliwiają przejście większej liczby plemników, co pozwala na dokładniejsze zliczanie. Pory o rozmiarach większych niż 12 μm nie wydają się być dostępne komercyjnie. Alternatywą dla stosowania wkładek do hodowli tkankowej jest użycie membran Neuroprobe zaprojektowanych do testów chemotaksji w płytkach 96-dołkowych. Oferują one potencjalnie większą przepustowość i szerszy zakres średnic porów. Chociaż większe plemniki ssaków wydawałyby się wymagać większej średnicy porów, z powodzeniem przeprowadziliśmy testy chemotaksji plemników myszy z użyciem wkładek z porami 12 μm (Burnett, nieopublikowane obserwacje). Z kolei mniejsze rozmiary porów mogą być odpowiednie dla mniejszych plemników (np. jeżowca), choć nie testowaliśmy jeszcze tej możliwości.

Jedną z wad opisanego testu dwukomorowego jest to, że plemniki są umieszczane w górnej komorze, co nieuchronnie prowadzi do przedostawania się części z nich pod wpływem grawitacji, obniżając tym samym stosunek sygnału do tła. Wynika to z faktu, że plemniki Xenopus nie wykazują wystarczającej aktywności ruchowej, aby płynąć wbrew grawitacji, tak jak robią to plemniki ssaków. Inną trudnością w badaniu plemników Xenopus jest krótki czas ich ruchliwości – od 5 do 15 minut po aktywacji. Ograniczenie to sprawia, że podczas przeprowadzania wielu testów konieczna jest aktywacja nowej partii plemników co 2 do 3 minut. W rezultacie badania przebiegu czasowego wykazały, że większość plemników przedostaje się w ciągu pierwszych 20 minut testu⁵. Chociaż stosujemy 50-minutowy okres inkubacji, okres ten można prawdopodobnie skrócić do 20 lub 30 minut. W przeciwieństwie do nich, w przypadku plemników mysich, które pozostają ruchliwe przez wiele godzin, stosowaliśmy testy trwające do 2 godzin, uzyskując dobre wyniki (Burnett, niepublikowane obserwacje).

W teście dwukomorowym z wykorzystaniem plemników żaby całkowita liczba plemników przechodzących przez membranę porowatą wynosi zazwyczaj od 10 do 20 tysięcy, co stanowi około 1 do 2% plemników umieszczonych w wkładce górnej komory. Obecność gradientu chemoatraktanta w dolnej komorze może zwiększyć przejście plemników nawet od 4 do 10 razy. Rycina 2 przedstawia typową krzywą zależności odpowiedzi od dawki uzyskaną w tym teście. Wyciąg z galaretki jajowej Xenopus („woda z jaj”) zawierający znane białko chemoatraktanty – allurynę (czerwone kółka), umieszczono w dolnej komorze w serii rozcieńczeń. Całkowita ilość białka z wody z jaj zawarta w każdym teście jest podana w mikrogramach/test – jest to ilość dostarczona w pierwotnej objętości 50 μl. Ponieważ dostarczone białko utworzy gradient dyfuzyjny, rzeczywisty zakres stężeń białka, na które reagują plemniki, nie jest znany, ale można go oszacować jako 5 do 10 razy niższy od stężenia białka w dostarczonej kropli. Z tego powodu podajemy ilość wprowadzonego białka, a nie jego stężenie. Zazwyczaj wykonujemy testy w dubletach lub triplikatach dla każdej dawki i wyciągamy średnią z wyników; następnie cały eksperyment powtarzamy 3 lub 4 razy, używając w każdym eksperymencie plemników od różnych samców. Dla każdej dawki oblicza się średnią oraz błąd standardowy średniej, przy czym błąd standardowy średniej zazwyczaj wynosi od 5 do 10% średniej. Należy zauważyć, że białka bez znanej aktywności chemoatraktantnej, takie jak albuminy surowicy bydlęcej (otwarte kółka, Ryc. 2), mogą powodować niski, niespecyficzny wzrost przejścia plemników przez membranę. Ciekawą obserwacją jest fakt, że krzywa zależności odpowiedzi od dawki dla wody z jaj jest wielofazowa – występuje faza wzrostowa i faza spadkowa. Tego typu wielofazowa zależność jest powszechna w przypadku chemoatraktantów plemników; odpowiedź plemników ludzkich na płyn pęcherzykowy wykazuje podobną zależność dwufazową⁶, co prawdopodobnie jest przydatne, gdyż wysokie stężenia chemoatraktanta w pobliżu komórki jajowej mogą służyć do ograniczania dalszych reakcji poszukiwawczych plemników.

Czasami zdarza się, że wartości kontrolne dla tego testu są wyższe od normy, co zmniejsza krotność wzrostu wywołaną przez chemoatraktant. Zazwyczaj wynika to z mechanicznego uszkodzenia wkładu z filtrem podczas przeprowadzania analizy. Dlatego ważne jest, aby nie zakłócać wkładów podczas nakładania plemników lub chemoatraktantu, w trakcie inkubacji testu oraz podczas wyjmowania wkładu. Szczególnie istotne jest, aby rezerwuar z plemnikami we wkładzie został opróżniony za pomocą mikropipety lub ssania przed wyjęciem wkładu z dołka. Zapewnia to, że plemniki nie zostaną przeniesione przez porowatą membranę do dolnej komory podczas wyjmowania wkładu.

Ważne parametry techniczne w teście w komorze Zigmonda obejmują odległość między szkiełkiem podstawowym a platformą obserwacyjną, powiększenie obserwacji wideo, rodzaj zastosowanej optyki oraz częstotliwość odświeżania klatek. Odległość między platformą obserwacyjną wynosi zazwyczaj od 10 do 15 μm, choć wartość ta może być zmieniana poprzez ilość oleju silikonowego zastosowanego jako warstwa interfejsu między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem komory – im więcej oleju, tym większa odległość. Cienka warstwa cieczy wydłuża czas potrzebny na utworzenie gradientu, a także zwiększa trwałość gradientu po jego utworzeniu. Grubsza warstwa cieczy pozwala na szybsze uformowanie gradientu, jednak jest on mniej stabilny i ma krótszy czas trwania. Dynamikę tworzenia się gradientu można zwizualizować, stosując barwnik fluorescencyjny lub fluorescencyjny dekstran w studzience z chemoatraktantem i wykorzystując mikroskopię fluorescencyjną do obserwacji tych procesów. Odczynnik testowy powinien być dopasowany pod względem masy cząsteczkowej do stosowanego chemoatraktanta, a określona dynamika powinna posłużyć do ustalenia, ile minut należy przeznaczyć na uformowanie gradientu i rejestrację ruchów plemników.

Ogólne powiększenie powinno być niskie (obiektyw 4x lub 10x), jeśli ma zostać zvisualizowana cała platforma obserwacyjna, zgodnie z opisanymi warunkami analizy. Z kolei wyższe powiększenie (obiektyw 40x lub 63x) może być użyteczne w przypadku chęci monitorowania stosunkowo krótkich odcinków trajektorii lub analizy ruchów flagellarnych. Śledzenie może być przeprowadzane za pomocą metod półautomatycznych opisanych w niniejszej pracy lub poprzez automatyczne śledzenie realizowane w bardziej zaawansowanych pakietach oprogramowania, takich jak MetaMorph lub Imaris Track. W obu przypadkach łatwość śledzenia w dużym stopniu zależy od kontrastu obrazu, niezależnie od tego, czy rozpoznawanie obiektów odbywa się przez operatora, czy przy wsparciu oprogramowania. Choć w niektórych przypadkach można zastosować optykę pola jasnego, zazwyczaj wymagane jest użycie optyki kontrastowej z przesunięciem fazowym lub optyki pola ciemnego. Wreszcie, częstotliwość klatek zależy od pożądanej rozdzielczości czasowej śledzenia. Przy zastosowaniu metod półautomatycznych, jak w naszej procedurze, prawdopodobnie ogranicza się do stosunkowo niskiej częstotliwości klatek – od 4 do 8 klatek na sekundę – ze względu na pracochłonny charakter rejestracji danych. Z drugiej strony, do obserwacji gwałtownych odpowiedzi, takich jak formy fal flagellarnych, może być wymagana częstotliwość wideo. Często cele eksperymentalne najlepiej realizować, przeprowadzając oddzielnie doświadczenia z wolniejszą i szybszą częstotliwością klatek, ponieważ pozwala to jednocześnie na zmianę innych parametrów, takich jak powiększenie, optyka lub cyfrowe przetwarzanie obrazu.

Typowe wyniki testu śledzenia w komorze Zigmonda obejmują zestaw trajektorii, takich jak te widoczne dla pięćdziesięciu plemników żaby w klipie wideo Movie 1. Na tle obrazu platformy obserwacyjnej trajektorie poszczególnych plemników są zaznaczone na czerwono dla eksperymentu kontrolnego (brak gradientu chemoatraktanta). Dwuwymiarowe trajektorie komórek w płaszczyźnie x-y jako funkcja czasu dla każdego plemnika mogą być wykreślone i zapisane za pomocą programu MtrackJ, a następnie zaimportowane do programu Microsoft Excel. Do analizy trajektorii oś gradientu chemoatraktanta wyznaczamy jako oś X, a oś prostopadłą jako oś Y, zgodnie z konwencją opracowaną pierwotnie przez Fabro et al.³. Jak pokazano na schemacie na Rysunku 3, rzeczywista trajektoria składa się z kroków, których suma długości odpowiada odległości łukowej przebytej w trajektorii (niebieskie/złote strzałki). Wypadkowa odległość i kierunek ruchu każdego plemnika stanowią wektor łączący pierwszy i ostatni punkt trajektorii (czerwona strzałka ukośna). Wypadkowy ruch można rozłożyć na składową osi X oraz składową osi Y (czerwone przerywane strzałki; określane odpowiednio jako wypadkowa delta X i wypadkowa delta Y).

Ponieważ chemotaksja w plemnikach kręgowców może wiązać się ze stosunkowo subtelnymi zmianami kierunku ruchu, dla każdego stanu analizuje się zazwyczaj dużą liczbę plemników (od 100 do 300), wybranych losowo, co często wymaga połączenia danych z 4 do 6 niezależnych eksperymentów. W celach ilustracyjnych użyjemy jednak danych pochodzących tylko z pięćdziesięciu plemników żaby. Tabela 1 przedstawia powszechnie stosowane parametry służące do wykrywania zmian w ruchu plemników. Średni całkowity dystans przebyty wzdłuż osi X zwiększy się znacząco, jeśli w obecności chemoatraktanta populacja plemników jako całość będzie podążać trajektoriami bardziej zbieżnymi z gradientem. W naszym przykładzie średni całkowity dystans wzdłuż osi X wzrósł ponad trzykrotnie w obecności wody z jajeczkiem. Można również wykreślić histogram całkowitego dystansu wzdłuż osi X dla populacji plemników, co daje tę zaletę, że można wykryć mniejsze subpopulacje plemników reagujących. Pomocne w wykrywaniu takich populacji mogą być również dwa parametry opracowane przez Fabro i współpracowników³. Zarówno procent plemników wykazujących dodatni całkowity ruch wzdłuż osi X (% ΔX>0), jak i procent plemników wykazujących całkowity ruch liniowy nie większy niż 45 stopni względem osi gradientu (%ΔX/|ΔY|> 1), mogą gwałtownie wzrosnąć, jeśli cała populacja plemników jest wrażliwa na chemoatraktant, lub wzrosnąć w mniejszym, ale wciąż istotnym stopniu, jeśli wrażliwe są jedynie subpopulacje plemników. Nasz przykład w Tabeli 1 pokazuje wzrost obu parametrów dla pięćdziesięciu plemników żaby poddanych działaniu gradientu wody z jajeczkiem. Należy zauważyć, że przypadkowy ruch nieukierunkowany da wartości niezerowe dla obu tych parametrów, wynoszące odpowiednio 50% i 25%; wartości kontrolne wyższe od tych (takie jak w Tabeli 1) reprezentują tło wynikające albo z małej liczby próbek, albo z błędu w orientacji plemników specyficznego dla projektu eksperymentalnego.

Kierunkowość przemieszczania się plemników w odpowiedzi na czynniki chemoatraktacyjne może być bezpośrednio oceniana poprzez kąt theta, czyli kąt między wektorem całkowitego przemieszczenia każdego plemnika a osią gradientu (X). Nasz przykład w Tabeli 1 pokazuje, że średnia wartość theta zmalała dla plemników płynących w gradiencie wody z jajeczkiem, co wskazuje, że trajektorie plemników w całej populacji były lepiej dopasowane do gradientu. Podobnie jak w przypadku całkowitego przemieszczenia wzdłuż osi X (patrz. powyżej), wartości theta dla populacji plemników mogą być przedstawione jako rozkład – jest to podejście uwzględniające również subpopulacje plemników reagujących, które zostało niedawno zbadane przez Gakamsky'ego i współpracowników⁷.

W końcu z danych opisujących dwuwymiarowe trajektorie komórek w płaszczyźnie x-y jako funkcję czasu można wyekstrahować prędkości krzywoliniowe i chwilowe poszczególnych plemników. Można zauważyć wzrost prędkości, jak również zmianę orientacji ruchu, co sugeruje wystąpienie odpowiedzi chemokinetycznej oraz odpowiedzi chemotaktycznej.

Dane te stanowią punkt wyjścia do analizy trajektorii plemników. Dalsza analiza mogłaby obejmować pomiary liniowości i krzywizny trajektorii w każdym momencie, zgodnie z metodami stosowanymi przez Bohmera i wsp.⁸ oraz Shibę i wsp.⁹, automatyczną detekcję zwrotów, jak w pracy Burnetta i wsp.¹⁰, a także nieliniowość ocenianą za pomocą analizy fraktalnej^11,12. Przy założeniu, że ruch plemników po tych trajektoriach jest monitorowany przy większym powiększeniu, możliwe byłoby również obrazowanie ruchów wici oraz sygnałów wapniowych w czasie rzeczywistym, co realizowało kilka laboratoriów ^{8,9,13,14,15,16}. Takie badania wykazały, że plemniki zarówno bezkręgowców, jak i ssaków reagują na chemoatraktanty gwałtownymi zwrotami w górę gradientu w kierunku źródła chemoatraktanta. Zwroty te są towarzyszone zgięciom wici, które zmieniają orientację plemnika podobnie jak ster; zgięcia te wydają się być inicjowane przez określone, falowe sygnały wapniowe rozprzestrzeniające się wzdłuż wici. Zatem ostatecznym celem śledzenia plemników jest skorelowanie dynamiki układu sygnalizacyjnego ze zmianami w napędzie wiciowym, które stanowią podstawę orientacji plemnika w gradiencie chemotaktycznym. Cele te nie zostały jeszcze osiągnięte w przypadku plemników Xenopus, które poruszają się ruchem helikalnym¹⁷, wykazują niską krzywiznę trajektorii¹⁰, a których sygnały wapniowe nie zostały jeszcze zmonitorowane.

Choć w niniejszej pracy skupiliśmy się na szczegółowym opisaniu metod analizy stosowanych dla plemników Xenopus laevis, zarówno test akumulacji plemników w dwóch komorach, jak i test śledzenia w komorze Zigmonda mogą być wykorzystane dla plemników ssaków, pod warunkiem wprowadzenia pewnych modyfikacji. Oba testy mogą być przeprowadzane w temperaturze 37 °C, jeśli jest to pożądane, przy użyciu podgrzewacza do preparatów oraz, w przypadku testu w komorze Zigmonda, podgrzewacza stolika mikroskopu. Zazwyczaj plemniki ssaków są izolowane, poddawane kapacytacji i inkubowane z użyciem odpowiednich buforów i chemoatraktantów dla ssaków, jednak analiza danych będzie podobna do opisanej tutaj dla gatunków płazów. Kolejną różnicą jest to, że komora Zigmonda jest zazwyczaj umieszczana pionowo na stoliku mikroskopu pionowego, ponieważ plemniki ssaków, w przeciwieństwie do plemników Xenopus, mogą pływać w górę, na platformę obserwacyjną. Te dwa testy, choć nie zostały jeszcze sprawdzone w pełnym zakresie, mogą znaleźć zastosowanie w przyszłych badaniach nad plemnikami wielu gatunków.

Rycina 1. Schematyczny rysunek testu dwukomorowego. Plemniki umieszcza się w wkładce, której dno stanowi filtr poliwęglanowy z porami o średnicy 12 μm. Roztwór chemoatraktanta jest ostrożnie pipetowany do dołka w celu zainicjowania powstania gradientu stężeń.

Rysunek 2. Reprezentatywne dane dla plemników żaby z zastosowaniem dwukomorowego testu chemotaksji plemników. Woda z jaj przygotowana z jaj X. laevis wykazuje wielofazową krzywą zależność dawka-aktywność, która jest charakterystyczna dla chemoatraktantów plemników. Albumina surowicy bydlęcej zwiększa przejście plemników tylko nieznacznie – jest to niespecyficzny efekt białka. Rysunek zmodyfikowany na podstawie pracy Al-Anzi & Chandler⁵.

Film 1. Klip wideo przedstawiający trajektorie plemników żaby naniesione kolorem czerwonym na platformę obserwacyjną komory Zigmonda. Szerokość platformy wynosi 1 mm. Kliknij tutaj, aby obejrzeć klip wideo.

Rysunek 3. Konwencje osi, krzywoliniowa trajektoria plemnika oraz wektor całkowitego przemieszczenia liniowego naniesione na platformę obserwacyjną komory Zigmonda. Uzyskane dane dzielą się na trzy typy. Po pierwsze, same trajektorie plemników (strzałki niebieskie/złote) mogą ujawniać specyficzne wzorce, takie jak okręgi i zwroty (gwiazdki). Dla ścieżki trajektorii można zmierzyć dystans krzywoliniowy oraz prędkości krzywoliniowe. Po drugie, dla każdej trajektorii można obliczyć całkowity dystans liniowy przebyty wzdłuż całej trajektorii, wypadkową składową przemieszczenia w osi X (gradientu), wypadkową składową przemieszczenia w osi Y oraz kąt theta między osią X a wektorem całkowitego przemieszczenia, a następnie porównać te wartości jako rozkład dla wszystkich śledzonych plemników. Po trzecie, chwilowe zmiany prędkości i kierunku ruchu dla poszczególnych odcinków w obrębie pojedynczych trajektorii mogą być badane indywidualnie lub jako populacja. Powyżej przedstawiono schemat komory widzianej z boku.

Tabela 1. Parametry często stosowane podczas analizy danych z komory Zigmonda.

Dyskusja

Chemotaksja komórek przemieszczających się za pomocą ruchu ameboidalnego lub pływania napędzanego wiciami występuje w wielu kontekstach biologicznych, a badanie tego zjawiska wymaga dostępności praktycznych i niezawodnych testów. Niektóre przykłady tego zjawiska, takie jak przyciąganie plemników do komórki jajowej jeżowca lub gromadzenie się komórek śluzowców w celu utworzenia ciała owocnikowego, mają bezpośredni efekt wizualny. Ilościowe określanie tego zjawiska było podejmowane na różne sposoby, jak opisano w pracy Eis...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Płytki 24-dołkowe	BD Biosciences	35/1147
Wkładki o średnicy zewnętrznej 12 mm z membraną o porach 12 μm	EMD Millipore	PIXP01250	Wcześniej używano płytek transwell Costar-Corning nr 3403 – obecnie wycofane z produkcji
Komora Zigmonda	Neuroprobe	Z02
Olej silikonowy	GE Healthcare	SF1154	Odpowiednik Dow Corning 550 Fluid
Oprogramowanie Image J	Wayne Rasband, Research Services Branch, National Institute of Mental Health	Bezpłatne pobieranie ze strony http://rsbweb.nih.gov/ij	Program w języku Java działający w systemach Windows, Linux i Mac
Oprogramowanie MtrackJ	Biomedical Imaging Group	Bezpłatne pobieranie ze strony http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/	Program w języku Java działający w systemach Windows, Linux i Mac
Oprogramowanie Virtual Dub	GNU General Public Licensed	Bezpłatne pobieranie z adresu http://www.virtualdub.org/index.html	Instrukcje instalacji na stronie Image J w sekcji wtyczek (plugins); tylko dla systemu Windows
Oprogramowanie cellSens	Olympus Corporation	Patrz strona internetowa: http://www.olympusamerica.com/seg_section/product.asp?product=1070	Służy do sterowania i pozyskiwania obrazów z różnych kamer. Posiada również funkcje przetwarzania obrazu