Dwa rodzaje testów do wykrywania chemoatrakcji plemników żaby

Podsumowanie

Komórki jajowe oraz otaczające je powłoki pozakomórkowe często uwalniają peptydy, białka i małe cząsteczki, które komunikują się z plemnikami, by prowadzić je do jaja, wspomagając tym samym zapłodnienie. Wykorzystując plemniki żaby, opisujemy i porównujemy dwie klasy testów służących do wykrywania chemotaksji plemników – testy akumulacji plemników oraz testy śledzenia trajektorii plemników.

Streszczenie

Chemoatrakcja plemników u bezkręgowców może być na tyle silna, że można umieścić pipetę zawierającą atraktujący peptyd w zawiesinie plemników i pod mikroskopem zaobserwować ich gromadzenie się wokół pipety¹. Chemoatrakcja plemników u kręgowców, takich jak żaby, gryzonie i ludzie, jest trudniejsza do wykrycia i wymaga analiz ilościowych. Analizy te dzielą się na dwa główne rodzaje: testy ilościowo określające ruch plemników w stronę źródła chemoatraktanta, tzw. testy akumulacji plemników, oraz testy umożliwiające rzeczywiste śledzenie trajektorii pływania poszczególnych plemników.

Testy akumulacji plemników są stosunkowo szybkie, co pozwala na przeprowadzenie od kilkunastu do kilkuset pomiarów w ciągu jednego dnia, umożliwiając tym samym sprawne wyznaczanie krzywych odpowiedzi na dawkę oraz przebiegów czasowych. Tego rodzaju analizy były szeroko wykorzystywane do charakteryzacji wielu ugruntowanych systemów chemoatrakcji – na przykład chemotaksji neutrofili w kierunku peptydów bakteryjnych oraz chemotaksji plemników w kierunku płynu pęcherzykowego. Testy śledzenia plemników mogą być bardziej pracochłonne, ale dostarczają dodatkowych danych na temat tego, w jaki sposób chemoatraktanty faktycznie zmieniają ścieżki pływania plemników. Ten typ analizy jest niezbędny do wykazania orientacji ruchu plemników względem osi gradientu chemoatraktanta oraz do wizualizacji charakterystycznych zwrotów lub zmian orientacji, które przybliżają plemnik do komórki jajowej.

W niniejszym opracowaniu opisujemy metody stosowane w obu tych rodzajach testów. Wykorzystany test akumulacji plemników nazywany jest testem „dwukomorowym”. Plemniki płazów umieszcza się w wkładce do płytki hodowlanej z poliwęglanowym dnem filtrującym o porach o średnicy 12 μm. Wkładki z plemnikami umieszcza się w dołkach płytki hodowlanej zawierających bufor oraz chemoatraktant, który jest ostrożnie pipetowany na dno dołka w miejscu styku dna ze ścianką (patrz Rys. 1). Po inkubacji górną wkładkę zawierającą rezerwuar plemników ostrożnie usuwa się, a plemniki w dolnej komorze, które przeszły przez membranę, są pobierane, wirowane w celu uzyskania osadu, a następnie zliczane za pomocą hemocytometru lub cytometru przepływowego.

Test śledzenia plemników wykorzystuje komorę Zigmonda, opracowaną pierwotnie do obserwacji chemotaksji neutrofilów i zmodyfikowaną do obserwacji plemników przez Giojalasa i współpracowników^2,3. Komora składa się z grubego szkiełka przedmiotowego, w którym wyfrezowano dwa pionowe rowki. Są one oddzielone platformą obserwacyjną o szerokości 1 mm. Po nałożeniu szkiełka nakrywkowego, do jednego rowka wprowadza się plemniki, a do drugiego czynnik chemoatraktancyjny, a następnie ruch poszczególnych plemników jest wizualizowany za pomocą mikroskopii wideo. Materiał wideo jest następnie analizowany za pomocą oprogramowania w celu zidentyfikowania dwuwymiarowych ruchów komórek w płaszczyźnie x-y jako funkcji czasu (zbiory danych xyt), które tworzą trajektorię każdego plemnika.

Protokół

1. Wykorzystane materiały i bufory

1. Bufor Ringera dla oocytów (1.5 x OR2) zawiera 124 mM NaCl, 3.75 mM KCl, 1.5 mM CaCl₂, 1.5 mM MgCl₂, 1.5 mM Na₂HPO₄, 10 mM Hepes, pH 7.8. Bufor do zapłodnienia (F-1) zawiera 41.25 mM NaCl, 1.25 mM KCl, 0.25 mM CaCl₂, 0.06 mM MgCl₂, 0.5 mM Na₂HPO₄, 2.5 mM Hepes, pH 7.8.
2. Woda z jaj Xenopus laevis jest przygotowywana zgodnie z metodą Sugiyama i wsp.⁴. W skrócie: świeżo złożone jaja żaby w otoczce galaretowatej miesza się w niewielkiej objętości buforu F-1 przez 30 minut, a następnie warunkowane medium usuwa się za pomocą mikropipety. Medium to, nazwane „wodą z jaj”, może być również użyte do przygotowania oczyszczonej alluryny, głównego chemoatraktanta w tym ekstrakcie z galaretki. Plemniki pozyskuje się z hodowlanych osobników Xenopus laevis lub Xenopus tropicalis.
3. Szczegółowy wykaz materiałów potrzebnych do analizy znajduje się w Tabeli Materiałów.

2. Test dwukomorowy do badania chemotaksji plemników żaby

1. Zanurzyć żabę w wodzie zawierającej 0,07% benzokainy w celu znieczulenia, odciąć głowę nożyczkami z krawędzią karborundową i przeprowadzić podwójną destrukcję mózgu (pithing), aby zapewnić eutanazję. Usunąć skórę z brzucha, aby odsłonić mięśnie. Wykonać cięcia w linii środkowej i bocznych w mięśniach brzucha i odchylić je. Delikatnie odsunąć jelita i tkankę tłuszczową, aby odsłonić białe, fasolkowate jądra. Odciąć tkankę łączną za pomocą precyzyjnych nożyczek, uważając, aby nie uszkodzić naczyń krwionośnych. Wyjąć jedno jądro, wypłukać krew za pomocą buforu 1,5 x OR2, a następnie przetoczyć jądro na papierze filtracyjnym, aby usunąć nadmiar buforu i małe przylegające naczynia krwionośne, po czym umieścić jądro w plastikowej płytce Petriego w 0,2 ml buforu 1,5 x OR2. Napełnić strzykawkę 5 ml 2 ml buforu 1,5 x OR2, delikatnie nakłuć 10-20 otworów w jądrze na większości powierzchni jednego z jego końców, wbić igłę z przeciwnej strony i delikatnie wstrzyknąć bufor, aby wypłukać plemniki. Alternatywnie można wstrzykiwać bufor podczas nakłuwania otworów wyjściowych w celu wypłukania plemników. Przenieść zawiesinę plemników za pomocą mikropipety z obciętą końcówką (aby uniknąć ścinania plemników) do probówki do mikrocentryfugi i umieścić na lodzie.
2. Oszacować liczbę uzyskanych plemników żaby poprzez rozcieńczenie plemników w stosunku 1:100 w buforze 1,5 x OR-2 i pobranie 20 μl próbki zmieszanej zawiesiny plemników, a następnie policzenie liczby komórek za pomocą hemocytometru i dużego obszaru o powierzchni 1 mm². Na podstawie zliczenia z hemocytometru i współczynnika pobierania próbek obliczyć gęstość plemników oraz całkowitą liczbę zebranych plemników. Wartość ta wynosi zazwyczaj 2 - 6 x 10⁷ plemników w objętości około 2 ml przy użyciu obu jąder. Rozcieńczyć zapasową zawiesinę plemników buforem 1,5 x OR2, aby uzyskać gęstość plemników 2 x 10⁷/ml. Wykorzystać plemniki do analizy w ciągu 2 do 3 godzin od przygotowania. Ocenić ruchliwość plemników, rozcieńczając 5 μl plemników w stosunku 1:10 buforem F-1 i obserwując ruch przy użyciu optyki kontrastowej fazowej. Co najmniej 40% do 50% plemników powinno być ruchliwych. Nawet odpowiednie preparaty będą zawierać dużą liczbę plemników nieruchomych, z których większość jest niedojrzała.
3. Przygotować nową 24-dołkową plastikową płytkę do hodowli tkanek, wprowadzając za pomocą mikropipety 700 μl buforu F1 do każdego dołka. Każdy dołek powinien mieć około 15 mm średnicy na dnie.
4. Rozpocząć serię analiz poprzez rozcieńczenie 100 μl zawiesiny plemników w 900 μl buforu F1 w temperaturze pokojowej (około 21 do 23°C) w probówce do mikrocentryfugi, aby aktywować ruchliwość plemników za pomocą szoku osmotycznego. Za każdym razem, gdy plemniki są aktywowane w ten sposób, należy ich użyć w ciągu 1-2 minut.
5. Umieścić w wypełnionym buforem dołku insert o porach 12 μm (średnica zewnętrzna 12 mm); upewnić się, że insert jest umieszczony poza centrum, pozostawiając wolną przestrzeń po jednej stronie. Natychmiast przenieść 400 μl aktywowanych ruchliwie plemników do dołka za pomocą mikropipety z obciętą końcówką. Nanieść zawiesinę plemników na ściankę insertu filtrującego i pozwolić jej spłynąć na filtr na dnie insertu; zawiesiny plemników nie należy pipetować bezpośrednio na filtr.
6. Ostrożnie wprowadzić za pomocą mikropipety 50 μl czynnika chemoatraktującego do dołka, w przestrzeni między ścianką dołka a przesuniętym insertem filtrującym. Należy uważać, aby nanieść kroplę w miejscu styku ścianki bocznej i dna dołka, a następnie wycofać pipetę, nie zakłócając układu. W szczególności tłok mikropipety należy nacisnąć tylko do pierwszego stopnia, aby całkowicie opróżnić próbkę, ale nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.
7. Powtórzyć powyższe kroki 2.5 i 2.6, aby rozpocząć tyle analiz, ile jest potrzebne, a następnie inkubować płytkę, aż pierwsza rozpoczęta analiza osiągnie czas inkubacji 50 minut. Zazwyczaj można rozpoczynać analizę co 45 do 60 sekund. Należy pamiętać, że proces analizy może zostać usprawniony przez doświadczoną osobę lub dwie osoby pracujące razem. W takim przypadku jeden lub dwa rzędy analiz można zainicjować przy użyciu większego zapasu ruchliwych plemników i szybszego pipetowania, pod warunkiem, że plemniki są zawsze używane w ciągu 1 do 2 minut od aktywacji.
8. Zatrzymać każdą analizę w rozpoczętej sekwencji. Najpierw ostrożnie ustabilizować insert filtrujący jedną ręką, a drugą ostrożnie usunąć większość lub całość zawiesiny plemników z górnej komory za pomocą mikropipety lub odessania pipetą Pasteura. Natychmiast, za pomocą precyzyjnej pęsety, wyciągnąć insert filtrujący i go zutylizować. Na tym etapie należy zachować ostrożność, aby pozostałe plemniki nie zostały przepchnięte przez filtr, co sztucznie zawyżyłoby wartości przejścia plemników.
9. Z każdego dołka płytki przenieść całą zawiesinę plemników do probówki do mikrocentryfugi. Ważne jest wymieszanie zawiesiny plemników w dołku przed pobraniem, ponieważ plemniki mają tendencję do osiadania na dnie. Dodać 15 μl 25% formaldehydu do stężenia końcowego 0,5% v/v i schłodzić, jeśli liczenie plemników nie zostanie przeprowadzone tego samego dnia.
10. Zgradientować plemniki w każdej probówce, wykonując 10-sekundowe wirowanie przyciskiem w osobistej mikrocentryfudze o prędkości maksymalnej 2000 x g. Usunąć cały supernatant z każdej probówki z wyjątkiem 100 μl, a następnie resuspender osad w tej objętości. Pobrać 20 μl zawiesiny plemników, rozcieńczyć 1:10 wodą destylowaną i policzyć plemniki na hemocytometrze, używając obiektywu 40x w mikroskopie pionowym. Na podstawie liczby komórek i czynników rozcieńczenia obliczyć całkowitą liczbę plemników, które przeszły przez filtr w każdej analizie.

3. Analiza śledzenia plemników żaby z użyciem komory Zigmonda

1. Przygotuj stanowisko z mikroskopem odwróconym do nagrywania wideo. Używamy mikroskopu odwróconego Nikon Elipse TE300 wyposażonego w analogową kolorową kamerę wideo Sony DXC-390 z 3 matrycami lub monochromatyczną kamerę cyfrową Hamamatsu ORCA-03G. Komora Zigmonda musi spoczywać na stoliku odwrócona do góry dnem, przy czym w płycie stolika musi znajdować się wystarczający otwór, aby pomieścić szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22x40 mm. Taki układ jest konieczny, ponieważ plemniki żaby nie są w stanie płynąć przeciwko grawitacji. Ustaw ostrość obiektywu 4x lub 10x na platformie obserwacyjnej biegnącej pomiędzy dwiema rynnami.
2. Sprawdź, czy kamera jest odpowiednio ustawiona i wycentrowana na platformie obserwacyjnej. W przypadku użycia kamery Sony sygnał wyjściowy jest przesyłany do monitora wideo oraz do przetwornika A/D (frame grabber), który jest w stanie zdigitalizować 7 klatek na sekundę z sygnału wideo. Strumień cyfrowy jest przetwarzany za pomocą komputera o częstotliwości procesora 3 GHz lub wyższej, najlepiej z 4 Gb lub więcej pamięci RAM. Chociaż używamy oprogramowania Scion Image (niestandardowej wersji NIH Image dla systemu Windows) sterującego modułem przechwytującym Scion CG-7, produkty te nie są już dostępne. Obecnie rozwiązaniem jest zastosowanie oprogramowania Image J z wtyczką VirtualDub do przechwytywania obrazu z analogowej kamery wideo. W przypadku użycia kamery Hamamatsu jej wyjście cyfrowe jest przetwarzane przez oprogramowanie Olympus cellSens i wyświetlane na monitorze komputera. W obu przypadkach dane są zapisywane na wewnętrznym lub zewnętrznym dysku twardym jako 8-bitowy stos plików tiff. Użycie oprogramowania Scion Image wymaga konwersji sekwencji obrazów Tiff do stosu za pomocą programu Image J.
3. Pole widzenia mikroskopu powinno obejmować większość lub całość szerokości platformy obserwacyjnej. Dla uzyskania najlepszych wyników należy zastosować optykę kontrastową lub ciemnopopolową. Odległość między powierzchnią platformy obserwacyjnej a spodem szkiełka nakrywkowego powinna wynosić od 15 do 20 μm, co określa się poprzez różnicowanie ostrości na każdej z powierzchni.
4. Przygotuj chemoatraktant w odpowiednim stężeniu w buforze F1. Przygotuj plemniki Xenopus laevis zgodnie z wcześniejszym opisem i przechowuj w 1,5 x buforze OR2 na lodzie do momentu użycia.
5. Zmontuj komorę Zigmonda. Zacznij od czystej, suchej komory. Za pomocą mikropipety nanieś linię oleju silikonowego (4 μl) około 5 mm od zewnętrznej krawędzi każdej rynny, równolegle do niej. Połóż szkiełko nakrywkowe 22x40 mm na komorze, pozwalając olejowi silikonowemu równomiernie rozprzestrzenić się do zewnętrznej krawędzi każdej rynny. Jeśli wstępne eksperymenty wykażą problem z przywieraniem plemników, może być konieczne pokrycie szkiełka nakrywkowego nitrocelulozą, zgodnie z sugestią Fabro et al.³. Alternatywnie, dodanie białka do stosowanych buforów (np. 1% BSA) może również zmniejszyć przywieranie plemników.
6. Odwróć komorę i umieść ją nad okrągłym wycięciem w stoliku mikroskopu, dbając o to, aby szkiełko nakrywkowe nie stykało się ze stolikiem. Taka odwrócona konfiguracja jest niezbędna, aby przenieść plemniki Xenopus z rynny na platformę. W przeciwieństwie do plemników ssaków, plemniki Xenopus nie są wystarczająco silne, aby płynąć przeciwko grawitacji w kierunku platformy.
7. Aktywuj 20 μl plemników Xenopus w 1,5 x buforze OR2 poprzez zmieszanie w stosunku 1:10 z buforem F1 w temperaturze pokojowej. Używając mikropipety z obciętą końcówką, natychmiast przenieś 70 μl aktywowanych ruchliwie plemników do rynny. Osiąga się to poprzez trzymanie mikropipety pod niskim kątem i umieszczenie końcówki przy bocznym otworze rynny. Wyrzucona zawiesina komórek wypełnia rynnę i mostek dzięki działaniu kapilarnemu. Następnie w ten sam sposób wypełnij przeciwległą rynnę roztworem chemoatraktanta.
8. Rozpocznij nagrywanie wideo w ciągu 3 minut (plemniki Xenopus mają ograniczony czas ruchliwości) i kontynuuj przez 5 minut. Po zakończeniu nagrywania rozmontuj komorę i przemyj rynny oraz platformę obserwacyjną pod ciśnieniem strumienia wody, a następnie etanolem z butelki z rozpylaczem. Usuń olej silikonowy z górnych powierzchni za pomocą ręczników papierowych, uważając, aby nie zanieczyścić platformy obserwacyjnej i rynien.
9. W razie potrzeby przekonwertuj przechwycone dane wideo na sekwencję obrazów Tiff lub stos przy użyciu oprogramowania Image J. Następnie otwórz plik w programie Image J i na pierwszych 21 klatkach (3 sekundy) wybierz do 50 plemników do śledzenia. Aby uniknąć stronniczości, wybieraj plemniki ze wszystkich obszarów pola obserwacyjnego, nie znając danych o ich trajektorii. Przechwyć dwuwymiarowe trajektorie komórek w płaszczyźnie x-y jako funkcję czasu (zestawy danych xyt) dla każdego plemnika, klikając myszką przy użyciu modułu wtyczki MtrackJ dla Image J. Wizualizuj trajektorie i oblicz odległości trajektorii, składowe osi i prędkości w programie MtrackJ. Alternatywnie, wykonaj te operacje oraz dalszą analizę numeryczną (np. kierunkowość, parametry chemotaksji i histogramy parametrów) poprzez import zestawów danych xyt do programu Microsoft Excel.
10. Wykreśl trajektorie dla każdego plemnika w programie Excel, aby wykryć ogólne wzorce ruchu, w tym wzorce liniowe, krzywoliniowe i koliste, a także cechy takie jak zwroty. Wykorzystaj zestawy danych xyt do obliczenia średniej prędkości krzywoliniowej, przemieszczenia wypadkowego wzdłuż osi X (gradientu) i Y oraz parametrów orientacji, takich jak średni kąt poruszania się wzglętnie do osi gradientu.

4. Reprezentatywne wyniki:

Ważnymi parametrami technicznymi w teście dwukomorowym są rozmiar i kształt komory, porowatość membrany oraz czas inkubacji. Średnica górnej komory zawierającej plemniki nie powinna być zbyt duża, aby nie wymagać znacznej objętości plemników (preferowane 0,5 ml lub mniej), a sama komora nie powinna być zbyt głęboka, aby nie tworzyła wysokiej kolumny zawiesiny komórek (<1 cm). Objętość buforu w dolnej komorze otaczającej wkład górnej komory powinna dokładnie odpowiadać poziomowi zawiesiny komórek we wkładzie, aby uniknąć powstania transmembranowego ciśnienia hydrostatycznego, które mogłoby sztucznie wymusić przejście plemników przez membranę. Umieszczenie pustego wkładu w dolnej studni przed załadowaniem plemników skutkuje początkowym ciśnieniem hydrostatycznym skierowanym w górę, co zapobiega przedostawaniu się plemników przez membranę podczas ładowania. Wybór wielkości porów membrany jest determinowany przez rozmiar plemników oraz komercyjną dostępność porowatych wkładów membranowych. Stwierdzono, że w testach z plemnikami żaby można stosować pory o średnicy 8 lub 12 μm, przy czym pory 12 μm umożliwiają przejście większej liczby plemników, co pozwala na dokładniejsze zliczenie. Pory o rozmiarach większych niż 12 μm nie wydają się być dostępne w sprzedaży. Alternatywą dla wkładów do hodowli tkankowych jest zastosowanie membran Neuroprobe przeznaczonych do testów chemotaksji w płytkach 96-dołkowych. Oferują one potencjalnie większą przepustowość i szerszy zakres średnic porów. Chociaż większe plemniki ssaków wydawałyby się wymagać większej średnicy porów, pomyślnie przeprowadzono testy chemotaksji plemników myszy z użyciem wkładów z porami 12 μm (Burnett, niepublikowane obserwacje). Z kolei mniejsze rozmiary porów mogą być odpowiednie dla mniejszych plemników (np. jeżowców), choć możliwość ta nie została jeszcze przetestowana.

Jedną z wad opisanego testu dwukomorowego jest to, że plemniki są umieszczane w górnej komorze, co nieuchronnie prowadzi do przedostania się części z nich pod wpływem grawitacji, zmniejszając tym samym stosunek sygnału do tła. Jest to konieczne ze względu na fakt, że plemniki Xenopus nie wykazują wystarczającej ruchliwości, aby płynąć pod prąd grawitacji, tak jak robią to plemniki ssaków. Inną trudnością w badaniu plemników Xenopus jest krótki czas utrzymywania się ich ruchliwości – od 5 do 15 minut po aktywacji. Ograniczenie to sprawia, że podczas przeprowadzania wielu testów konieczna jest aktywacja nowej partii plemników co 2 do 3 minut. W rezultacie badania przebiegu czasowego wykazały, że większość plemników przedostaje się w ciągu pierwszych 20 minut testu⁵. Chociaż stosujemy 50-minutowy okres inkubacji, okres ten można prawdopodobnie skrócić do 20 lub 30 minut. W przeciwieństwie do nich, w przypadku plemników myszy, które pozostają ruchliwe przez wiele godzin, stosowaliśmy okres testowania trwający do 2 godzin z dobrymi wynikami (Burnett, niepublikowane obserwacje).

W teście dwukomorowym z wykorzystaniem plemników żaby całkowita liczba plemników przechodzących przez porowatą membranę wynosi zazwyczaj od 10 do 20 tysięcy, czyli około 1-2% plemników umieszczonych w insertcie górnej komory. Obecność gradientu chemoatraktanta w dolnej komorze może zwiększyć liczbę przechodzących plemników od 4 do 10 razy. Rysunek 2 przedstawia typową krzywą odpowiedzi na dawkę uzyskaną w tym teście. Ekstrakt z galaretki jajowej Xenopus („woda jajowa”) zawierający znane białko chemoatraktantowe allurynę (czerwone kółka) został umieszczony w dolnej komorze w serii rozcieńczeń. Całkowita ilość białka wody jajowej zawarta w każdym teście jest podana w mikrogramach/test – jest to ilość dostarczona w pierwotnej objętości 50 μl. Ponieważ dostarczone białko utworzy gradient dyfuzyjny, rzeczywisty zakres stężeń białka, na które reagują plemniki, nie jest znany, ale można szacować, że jest od 5 do 10 razy niższy niż stężenie białka w dostarczonej kropli. Z tego powodu określamy ilość wprowadzonego białka, a nie jego stężenie. Zazwyczaj przeprowadzamy testy w dubletach lub trypletach dla każdej dawki i wyciągamy średnią z wyników; następnie powtarzamy cały eksperyment 3 lub 4 razy, używając w każdym z nich plemników od różnych samców. Dla każdej dawki oblicza się średnią oraz błąd standardowy średniej, przy czym błąd standardowy średniej wynosi zazwyczaj od 5 do 10% wartości średniej. Należy zauważyć, że białka bez znanej aktywności chemoatraktantowej, takie jak albuminy surowicy bydlęcej (puste kółka, Rys. 2), mogą powodować niski poziom niespecyficznego wzrostu liczby plemników przechodzących przez membranę. Ciekawą obserwacją jest to, że krzywa odpowiedzi na dawkę dla wody jajowej ma charakter wielofazowy – obejmuje fazę wzrostową i fazę spadkową. Tego typu wielofazowa zależność jest powszechna dla chemoatraktantów plemników; odpowiedź plemników ludzkich na płyn pęcherzykowy wykazuje podobną zależność dwufazową⁶, co prawdopodobnie jest użyteczne, ponieważ wysokie stężenia chemoatraktanta występujące w sąsiedztwie komórki jajowej mogą służyć do ograniczenia dalszych reakcji poszukiwawczych po stronie plemników.

Czasami zdarza się, że wartości kontrolne dla tego testu są wyższe od normy, co zmniejsza krotność wzrostu wywołaną przez chemoatraktant. Zazwyczaj przyczyną jest uszkodzenie mechaniczne wkładu z filtrem podczas przeprowadzania analizy. Dlatego ważne jest, aby nie poruszać wkładami podczas wprowadzania plemników lub chemoatraktanta, w trakcie inkubacji testu lub podczas wyjmowania wkładu. Szczególnie istotne jest, aby zbiornik z plemnikami we wkładzie został opróżniony za pomocą mikropipety lub ssania przed podniesieniem wkładu z dołka. Zapewnia to, że plemniki nie zostaną zniesione przez porowatą membranę do dolnej komory podczas wyjmowania wkładu.

Ważne parametry techniczne w teście w komorze Zigmonda obejmują odległość między szkiełkiem podstawowym a platformą obserwacyjną, powiększenie obserwacji wideo, rodzaj zastosowanej optyki oraz częstotliwość klatek. Odległość od platformy obserwacyjnej wynosi zazwyczaj od 10 do 15 μm, choć wartość ta może być zmieniana poprzez ilość oleju silikonowego stosowanego jako warstwa pośrednia między szkiełkiem a preparatem komorowym – im więcej oleju, tym większa odległość. Cienka warstwa cieczy zwiększa czas potrzebny na utworzenie się gradientu, a także wydłuża trwałość gradientu po jego powstaniu. Grubsza warstwa cieczy umożliwia szybsze formowanie się gradientu, ale ma on krótszy czas trwania i mniejszą stabilność. Dynamikę tworzenia się gradientu można zwizualizować, stosując barwnik fluorescencyjny lub fluorescencyjny dekstran w studzience z chemoatraktantem i wykorzystując mikroskopię fluorescencyjną do obserwacji tych procesów. Masa cząsteczkowa odczynnika testowego powinna być dopasowana do masy cząsteczkowej stosowanego chemoatraktanta, a określona dynamika powinna służyć do oceny, ile minut należy przeznaczyć na utworzenie gradientu i rejestrację ruchów plemników.

Należy stosować ogólnie niskie powiększenie (obiektyw 4x lub 10x), jeśli celem jest wizualizacja całej platformy obserwacyjnej, zgodnie z opisanymi przez nas warunkami badania. Z kolei wyższe powiększenie (obiektyw 40x lub 63x) może być przydatne w przypadku chęci monitorowania stosunkowo krótkich fragmentów trajektorii lub analizy ruchów wici. Śledzenie może być realizowane za pomocą metod półautomatycznych, opisanych w niniejszej pracy, lub poprzez automatyczne śledzenie z wykorzystaniem bardziej zaawansowanych pakietów oprogramowania, takich jak MetaMorph lub Imaris Track. W obu przypadkach łatwość śledzenia w dużym stopniu zależy od kontrastu obrazu, niezależnie od tego, czy proces ten wykonuje operator, czy wspomaga go oprogramowanie do rozpoznawania obiektów. Chociaż w niektórych przypadkach można zastosować optykę pola jasnego, zazwyczaj wymagane jest użycie optyki kontrastowej (fazowej) lub optyki pola ciemnego. Wreszcie, częstotliwość klatek zależy od pożądanej rozdzielczości czasowej śledzenia. Przy zastosowaniu metod półautomatycznych, zgodnie z naszą procedurą, prawdopodobnie ogranicza się do stosunkowo niskiej częstotliwości klatek – od 4 do 8 klatek na sekundę – ze względu na pracochłonność rejestracji danych. Z drugiej strony, w przypadku szybkich odpowiedzi, takich jak formy fal wici, mogą być wymagane obserwacje w pełnej częstotliwości wideo. Często cele eksperymentalne najlepiej realizować, przeprowadzając osobno doświadczenia z niską i wysoką częstotliwością klatek, ponieważ pozwala to również na zmianę innych parametrów, takich jak powiększenie, optyka lub cyfrowe przetwarzanie obrazu.

Typowe wyniki testu śledzenia w komorze Zigmonda obejmują zestaw trajektorii, takich jak te widoczne dla pięćdziesięciu plemników żaby w klipie wideo Movie 1. Na obrazie platformy obserwacyjnej trajektorie poszczególnych plemników zaznaczono na czerwono dla eksperymentu kontrolnego (brak gradientu chemoatraktanta). Dwuwymiarowe trajektorie komórek w płaszczyźnie x-y jako funkcja czasu dla każdego plemnika mogą być wykreślane i rejestrowane przez program MtrackJ, a następnie importowane do programu Microsoft Excel. Do analizy trajektorii oś gradientu chemoatraktanta wyznaczamy jako oś X, a oś prostopadłą jako oś Y, zgodnie z konwencją opracowaną pierwotnie przez Fabro i wsp. ³. Jak pokazano na schemacie na Rysunku 3, faktyczna trajektoria składa się z kroków, których suma długości odpowiada dystansowi krzywoliniowemu przebytemu wzdłuż trajektorii (strzałki niebieskie/złote). Całkowity dystans i kierunek ruchu każdego plemnika stanowią wektor łączący pierwszy i ostatni punkt trajektorii (czerwona strzałka ukośna). Całkowity przemieszczenie można rozdzielić na składową osi X oraz składową osi Y (czerwone przerywane strzałki; określane odpowiednio jako net delta X i net delta Y).

Ponieważ chemotaksja plemników kręgowców może wiązać się ze stosunkowo subtelnymi zmianami kierunku ruchu, dla każdego warunku zazwyczaj analizuje się duże liczby plemników (od 100 do 300), wybranych losowo, co często wymaga połączenia danych z 4 do 6 niezależnych eksperymentów. Jednak w celach ilustracyjnych wykorzystamy dane pochodzące tylko z pięćdziesięciu plemników żaby. Tabela 1 przedstawia powszechne parametry używane do wykrywania zmian w przemieszczaniu się plemników. Średni przemieszczenie wypadkowe wzdłuż osi X wzrośnie znacząco, jeśli w obecności chemoatraktanta populacja plemników jako całość podąża po trajektoriach, które ściślej pokrywają się z gradientem. W naszym przykładzie średnie przemieszczenie wypadkowe wzdłuż osi X wzrosło ponad trzykrotnie w obecności wody z jajeczkami. Można również wykreślić histogram przemieszczenia wypadkowego wzdłuż osi X dla populacji plemników, co ma tę zaletę, że pozwala na wykrycie mniejszych subpopulacji plemników reagujących. Dwa parametry opracowane przez Fabro i wsp.³ mogą również pomóc w wykryciu takich populacji. Zarówno odsetek plemników wykazujących dodatnie przemieszczenie wypadkowe wzdłuż osi X (% ΔX>0), jak i odsetek plemników wykazujących wypadkowe przemieszczenie liniowe nie większe niż 45 stopni od osi gradientu (%ΔX/|ΔY|> 1), mogą wzrosnąć gwałtownie, jeśli cała populacja plemników jest wrażliwa na chemoatraktant, lub o mniejsze, ale wciąż istotne wartości, jeśli wrażliwe są tylko subpopulacje plemników. Nasz przykład w Tabeli 1 pokazuje wzrost obu parametrów dla pięćdziesięciu plemników żaby narażonych na gradient wody z jajeczkami. Należy zauważyć, że losowy ruch nieukierunkowany da niezerowe wartości dla obu tych parametrów, wynoszące odpowiednio 50% i 25%; wartości kontrolne wyższe od tych (takie jak w Tabeli 1) reprezentują tło wynikające albo z małej liczby próbek, albo z błędu w orientacji plemników specyficznego dla projektu eksperymentalnego.

Kierunkowość ruchu plemników w odpowiedzi na czynniki chemoatraktacyjne może być bezpośrednio oceniana za pomocą parametru theta, czyli kąta pomiędzy wektorem całkowitego przemieszczenia każdego plemnika a osią gradientu (X). Nasz przykład w Tabeli 1 pokazuje, że średnia wartość theta zmalała dla plemników płynących w gradiencie wody z jajeczka, co wskazuje, że trajektorie plemników jako populacji były lepiej dopasowane do gradientu. Podobnie jak w przypadku całkowitego przemieszczenia wzdłuż osi X (patrz. powyżej), wartości theta dla populacji plemników mogą być przedstawione jako rozkład; podejście to jest również czułe na subpopulacje plemników reagujących i zostało niedawno zbadane przez Gakamsky i wsp.⁷.

Wreszcie, prędkości krzywoliniowe i chwilowe dla poszczególnych plemników mogą zostać wyznaczone z danych opisujących dwuwymiarowe trajektorie komórek w płaszczyźnie x-y w funkcji czasu. Można zaobserwować wzrost prędkości oraz zmianę kierunku ruchu, co sugeruje wystąpienie odpowiedzi chemokinetycznej, jak również odpowiedzi chemotaktycznej.

Dane te stanowią punkt wyjścia do analizy trajektorii plemników. Dalsza analiza mogłaby obejmować pomiary liniowości i krzywizny trajektorii w czasie rzeczywistym, zgodnie z metodami opisanymi przez Bohmer i wsp.⁸ oraz Shiba i wsp.⁹, zautomatyzowaną detekcję skrętów, przeprowadzoną przez Burnett i wsp.¹⁰, a także nieliniowość ocenianą za pomocą analizy fraktalnej^11,12. Przy założeniu, że ruch plemników po tych trajektoriach jest monitorowany przy większym powiększeniu, możliwe byłoby również obrazowanie ruchów flagellum oraz sygnałów wapniowych w czasie rzeczywistym, co realizowano w kilku laboratoriach ^{8,9,13,14,15,16}. Badania te wykazały, że plemniki bezkręgowców i ssaków reagują na chemoatraktanty gwałtownymi skrętami w kierunku gradientu prowadzącego do źródła chemoatraktanta. Skrętom tym towarzyszą zgięcia flagellum, które zmieniają orientację plemnika w sposób podobny do działania steru; zgięcia te wydają się być inicjowane przez określone, falowe sygnały wapniowe rozchodzące się wzdłuż flagellum. Zatem ostatecznym celem śledzenia plemników jest skorelowanie dynamiki systemu sygnalizacyjnego ze zmianami w napędzie flagellarnego, które stanowią podstawę orientacji plemnika w gradiencie chemotaktycznym. Cele te nie zostały jeszcze osiągnięte w przypadku plemników Xenopus, które poruszają się ruchem helikalnym¹⁷, wykazują niską krzywiznę trajektorii¹⁰, a których sygnały wapniowe nie zostały jeszcze zmonitorowane.

Choć w tym miejscu skupiliśmy się na szczegółowym opisie metod analizy stosowanych dla plemników Xenopus laevis, zarówno test akumulacji plemników w dwóch komorach, jak i test śledzenia w komorze Zigmonda mogą być stosowane w przypadku plemników ssaków po wprowadzeniu odpowiednich modyfikacji. Oba testy można przeprowadzić w temperaturze 37 °C, korzystając z podgrzewacza do szkiełek, a w przypadku testu w komorze Zigmonda – z podgrzewaczem stolika mikroskopowego. Zazwyczaj plemniki ssaków są izolowane, poddawane kapacytacji i inkubowane z użyciem odpowiednich buforów i chemoatraktantów dla ssaków, jednak analiza danych jest podobna do tej opisanej tutaj dla gatunków płazów. Kolejną różnicą jest to, że komora Zigmonda jest zazwyczaj umieszczana pionowo na stoliku mikroskopu biologicznego, ponieważ plemniki ssaków, w przeciwieństwie do plemników Xenopus, potrafią wpłynąć na platformę obserwacyjną. Te dwa testy, choć jeszcze niezweryfikowane, mogą znaleźć zastosowanie w badaniach plemników wielu gatunków w przyszłości.

Rysunek 1. Schemat testu dwukomorowego. Plemniki umieszcza się w wkładce, której dno stanowi filtr poliwęglanowy z porami o średnicy 12 μm. Roztwór chemoatraktanta jest ostrożnie nanoszony pipetą do dołka w celu zainicjowania tworzenia się gradientu stężeń.

Rycina 2. Reprezentatywne dane dla plemników żaby z zastosowaniem dwukomorowego testu chemotaksji plemników. Woda z jaj przygotowana z jaj X. laevis wykazuje wielofazową krzywą dawka-aktywność, która jest charakterystyczna dla chemoatraktantów plemników. Albumina surowicy bydlęcej zwiększa przenikanie plemników tylko nieznacznie – jest to nieswoisty efekt białka. Rycina zmodyfikowana na podstawie pracy Al-Anzi & Chandler⁵.

Film 1. Klip wideo przedstawiający trajektorie plemników żaby zaznaczone na czerwono na platformie obserwacyjnej komory Zigmonda. Szerokość platformy wynosi 1 mm. Kliknij tutaj, aby obejrzeć klip wideo.

Rycina 3. Konwencje osi, krzywoliniowa trajektoria plemnika oraz wektor wypadkowej drogi liniowej naniesione na platformę obserwacyjną komory Zigmonda. Uzyskane dane dzielą się na trzy typy. Po pierwsze, same trajektorie plemników (niebieskie/złote strzałki) mogą ujawniać specyficzne wzorce, takie jak okręgi i zwroty (gwiazdki). Dla ścieżki trajektorii można zmierzyć odległość krzywoliniową i prędkości krzywoliniowe. Po drugie, dla każdej trajektorii można obliczyć wypadkową odległość liniową przebytą w całej trajektorii, wypadkową składową przemieszczenia w osi X (gradientu), wypadkową składową przemieszczenia w osi Y oraz kąt theta między osią X a wektorem wypadkowego przemieszczenia, a następnie porównać je jako rozkład dla wszystkich śledzonych plemników. Po trzecie, można badać chwilowe zmiany prędkości i kierunku ruchu dla segmentów w obrębie poszczególnych trajektorii, zarówno indywidualnie, jak i dla całej populacji. Powyżej przedstawiono widok boczny komory na schemacie.

Tabela 1. Parametry często stosowane w analizie danych z komory Zigmonda.

Dyskusja

Chemotaksja komórek przemieszczających się za pomocą ruchu ameboidalnego lub pływania napędzanego wiciami występuje w wielu kontekstach biologicznych, a badanie tego zjawiska wymaga dostępności praktycznych i niezawodnych testów. Niektóre przykłady tego zjawiska, takie jak przyciąganie plemników do komórki jajowej jeżowca lub gromadzenie się komórek śluzowców w celu utworzenia ciała owocnikowego, mają bezpośredni efekt wizualny. Ilościowe określanie tego zjawiska było podejmowane na różne sposoby, jak opisano w pracy Eis...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Płytki 24-dołkowe	BD Biosciences	35/1147
Wkładki o średnicy zewnętrznej 12 mm z membraną o porach 12 μm	EMD Millipore	PIXP01250	Wcześniej stosowano płytki transwell Costar-Corning nr 3403 – obecnie wycofane z produkcji
Komora Zigmonda	Neuroprobe	Z02
Olej silikonowy	GE Healthcare	SF1154	Odpowiednik Dow Corning 550 Fluid
Oprogramowanie Image J	Wayne Rasband, Research Services Branch, National Institute of Mental Health	Bezpłatne pobieranie ze strony http://rsbweb.nih.gov/ij	Program Java działający w systemach Windows, Linux i Mac
Oprogramowanie MtrackJ	Biomedical Imaging Group	Bezpłatne pobieranie ze strony http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/	Program Java działający w systemach Windows, Linux i Mac
Oprogramowanie Virtual Dub	GNU General Public Licensed	Bezpłatne pobieranie przez http://www.virtualdub.org/index.html	Instrukcje konfiguracji na stronie Image J w sekcji wtyczek; tylko dla systemu Windows
Oprogramowanie cellSens	Olympus Corporation	Patrz strona: http://www.olympusamerica.com/seg_section/product.asp?product=1070	Służy do sterowania i akwizycji obrazów z różnych kamer. Posiada również funkcje przetwarzania obrazu