Artykuł metodologiczny

Monitorowanie aktywności kinaz i fosfatazy w całym cyklu komórkowym za pomocą ratiometrycznego FRET

DOI:

10.3791/3410

⸱

27 stycznia 2012

 ,  ,  , 
1Department of Cell and Molecular Biology, Karolinska Institutet

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reportery oparte na FRET są coraz częściej używane do monitorowania aktywności kinaz i fosfataz w żywych komórkach. W tym miejscu opisujemy metodę, w jaki sposób wykorzystać reportery oparte na FRET do oceny zależnych od cyklu komórkowego zmian w docelowej fosforylacji.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reportery oparte na transferze energii rezonansu (FRET) Förstera1 pozwalają na ocenę endogennej aktywności kinazy i fosfatazy w żywych komórkach. Takie sondy zazwyczaj składają się z wariantów CFP i YFP, w których interweniowana jest sekwencja fosforylująca i domena wiążąca fosfo. Po fosforylacji sonda zmienia konformację, co powoduje zmianę odległości lub orientacji między CFP i YFP, co prowadzi do zmiany wydajności FRET (rys. 1). W ciągu ostatniej dekady opublikowano kilka sond monitorujących równowagę aktywności wielu kinaz i fosfataz, w tym reporterów PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 i Plk19. Biorąc pod uwagę modułową konstrukcję, w niedalekiej przyszłości prawdopodobnie pojawią się dodatkowe sondy10.

Na postęp w cyklu komórkowym wpływają szlaki sygnalizacji stresu 11. Warto zauważyć, że cykl komórkowy jest regulowany inaczej podczas niezakłóconego wzrostu w porównaniu do sytuacji, gdy komórki dochodzą do siebie po stresie12. Obrazowanie poklatkowe komórek w całym cyklu komórkowym wymaga zatem szczególnej ostrożności. Staje się to problemem szczególnie w przypadku obrazowania ratiometrycznego, ponieważ do prawidłowej interpretacji wyników potrzebne są dwa obrazy o wysokim stosunku sygnału do szumu. Ratiometryczne obrazowanie FRET zależnych od cyklu komórkowego zmian w aktywności kinazy i fosfatazy zostało w większości ograniczone do podsekcji cyklu komórkowego8,9,13,14.

Tutaj omawiamy metodę monitorowania sond opartych na FRET za pomocą obrazowania ratiometrycznego w całym cyklu komórkowym człowieka. Metoda opiera się na sprzęcie, który jest dostępny dla wielu badaczy w naukach przyrodniczych i nie wymaga specjalistycznej wiedzy z zakresu mikroskopii czy przetwarzania obrazu.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wprowadzenie sondy do komórek

  1. Komórki kotransfekcyjne za pomocą sondy opartej na fret i plazmidu nadającego oporność. Wybierz metodę transfekcji, która jest skuteczna w Twoim typie komórki. W przypadku komórek U2OS standardowe metody transfekcji fosforanu wapnia dają odpowiednie wyniki15.
  2. Wybierz komórki w odpowiednim antybiotyku przez co najmniej siedem dni. Zwiększa to ilość komórek wykazujących ekspresję sondy i ogranicza liczbę komórek z toksycznymi poziomami ekspresji lub poziomami ekspresji, które poważnie wpływają na cykl komórkowy.
  3. (Opcjonalnie) Wybierz dla stabilnych klonów.
  4. Korzystając ze stałych lub żywych komórek, sprawdź, czy zarówno CFP, jak i YFP są obecne we wszystkich komórkach w przybliżeniu w tym samym stosunku.
  5. W przypadku, gdy niektóre komórki zawierają tylko CFP lub YFP, prawdopodobnie nastąpiła rekombinacja. Rekombinacja może zachodzić zarówno podczas wzrostu bakterii, jak i po transfekcji sondy i może w tym drugim przypadku zależeć od jakości plazmidu. Powtórz przygotowanie plazmidu i zlinearyzuj plazmid przed transfekcją, jeśli problem będzie się powtarzał.

2. Monitorowanie ratiometryczne FRET

  1. Komórki nasienne na naczyniach ze szklanym dnem lub szkiełka nakrywkowe do montażu w komorze. Upewnij się, że naczynia/szkiełka nakrywkowe mają grubość nr 1,5 (170 μm).
  2. Zamontuj komórki w pożywce wzrostowej bez czerwieni fenolowej na zmotoryzowanym mikroskopie epifluorescencyjnym z regulacją temperatury ustawioną na 37 °C. Zapewnić regulację pH pożywki, albo za pomocą CO2 , albo za pomocą pożywek niezależnych od CO2, takich jak Liebowitz-15.
  3. Skoncentruj się na komórkach wykorzystujących światło przechodzące. Nie patrz na komórki za pomocą światła fluorescencyjnego.
  4. Zacznij od uzyskania 12- lub 16-bitowego obrazu za pomocą filtrów wzbudzenia YFP (YFPex) i emisji YFP (YFPem) oraz odpowiedniego lustra dichroicznego. Użyj maksymalnego dostępnego kategoryzacji, która nadal pozwala na wymaganą rozdzielczość subkomórkową. Stosowanie wysokiego kategoryzacji w celu skrócenia czasu lub intensywności ekspozycji ma kluczowe znaczenie dla uniknięcia fototoksyczności.
  5. Zmierz lub oszacuj intensywność tła i przybliżony szum, mierząc lub szacując przybliżone średnie, minimalne i maksymalne wartości pikseli w obszarze pozbawionym komórek. Zmień filtry czasu ekspozycji i neutralnej gęstości tak, aby średni sygnał w komórce był w przybliżeniu równy intensywności tła plus od pięciu do dziesięciu razy większa od różnicy między maksymalną i minimalną intensywnością tła.
  6. Sprawdź, czy obrazy nie są bliskie nasycenia. Maksymalna intensywność obrazu powinna być mniejsza niż połowa zakresu dynamiki (e.g. max 2000 w obrazie 12-bitowym), aby umożliwić różnice w intensywności, gdy komórki wchodzą w mitozę.
  7. Powtórzyć kroki od 2.4 do 2.6, używając filtrów wzbudzenia CFP i emisji YFP oraz odpowiedniego lustra dichroicznego.
  8. Wybrać wiele regionów z transfekowanymi komórkami, z wyłączeniem regionów używanych w pkt 2.4–2.7, i upewnić się, że maksymalna intensywność jest mniejsza niż połowa zakresu dynamicznego we wszystkich komórkach.
  9. Rozpocznij eksperyment poklatkowy, rejestrując dwa obrazy co 45 minut przy użyciu zestawów filtrów YFPex - YFPem i CFPex - YFPem.

3. Weryfikacja i optymalizacja warunków

  1. Otwórz uzyskane obrazy i monitoruj czas cyklu komórkowego od mitozy do mitozy dla komórek, które wyrażają transfekowaną sondę.
  2. Porównaj zmierzony czas cyklu ogniwa z danymi opublikowanymi dla użytego typu ogniwa. Alternatywnie, sfilmuj nietransfekowane komórki, uzyskując tylko jeden obraz światła przechodzącego (np. DIC lub kontrast fazowy) co godzinę, aby uzyskać referencyjne czasy cykli komórek.
  3. W przypadku, gdy czas od mitozy do mitozy odpowiada referencyjnym czasom cyklu komórkowego, przejdź do kroku 4. Możesz też ponownie uzyskać obrazy z trudniejszą ekspozycją, większą liczbą punktów czasowych lub wieloma poziomami Z, a następnie powtórzyć krok 3.
  4. W przypadku, gdy czas od mitozy do mitozy nie odpowiada referencyjnym czasom cyklu komórkowego, należy przelać folię na komórki, uzyskując tylko jeden obraz światła przechodzącego (np. DIC lub kontrast fazowy) co godzinę, a następnie jeden obraz na koniec eksperymentu w celu identyfikacji transfekowanych komórek.
  5. Jeśli transfekowane komórki nadal wykazują dłuższe czasy cyklu komórkowego, powtórz krok 1, ale transfekuj mniej sondy lub wybierz stabilne klony, które zawierają bardzo małe ilości sondy.
  6. Jeśli transfekowane komórki wykazują normalne czasy cykli komórkowych przy braku światła fluorescencyjnego, powtórz krok 2, ale zmniejsz ekspozycję, modyfikując bining, filtry o neutralnej gęstości, czas ekspozycji i czas między obrazami.

4. Analiza FRET

  1. Analiza może być wykonywana przez większość programów dedykowanych do mikroskopii. Tutaj opisujemy, jak przeprowadzić analizę za pomocą darmowego oprogramowania ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij) z wykorzystaniem wtyczki Ratio Plus (http://imagej.nih.gov/ij/plugins/ratio-plus.html).
  2. Otwórz obrazy w ImageJ. W przypadku, gdy Twoje obrazy są w formacie wielokolorowego stosu (np. Deltavision), oddziel poszczególne kanały, najpierw konwertując je na hyperstack: Image-hyperstack-stack na hyperstack, a następnie podziel je na stosy jednokanałowe za pomocą: Image-hyperstack-reduce dimensionality
  3. Pomnóż stos YFPex - YFPem przez 3 za pomocą: Process-Math-Multiply Ten krok jest opcjonalny, ponieważ ma na celu jedynie zwiększenie wizualnej przejrzystości obrazów poprzez zapewnienie, że proporcje nie mieszczą się w zakresie od 0 do 1.
  4. W stosie YFPex - YFPem narysuj obszar zainteresowania (ROI) w obszarze, który jest pozbawiony komórek, ale znajduje się blisko komórki, która ma być mierzona. Różne komórki na tym samym obrazie mogą wymagać różnych regionów, ponieważ zarówno tło, jak i intensywność sygnału są zwykle najsilniejsze w środku obrazu.
  5. Dodaj ROI do menedżera ROI: Analyze-tools-ROI manager.
  6. Zmierz średnią intensywność zwrotu z inwestycji zarówno w stosie YFPex - YFPem, jak i CFPex - YFPem: Analizuj-Mierz.
  7. Powtórz tę czynność w wielu punktach czasowych i sprawdź, czy intensywność tła w pobliżu komórki zainteresowania jest podobna w całym filmie.
  8. Ustaw pomiary tak, aby uwzględniały minimalną intensywność: Analizuj-Ustaw pomiary-Min i Maksymalna wartość szarości.
  9. Narysuj obszar zainteresowania obejmujący większą część komórki i zmierz minimalną intensywność zarówno w stosie YFPex - YFPem, jak i CFPex - YFPem. Weź różnicę między zmierzoną minimalną intensywnością a intensywnością tła od 4,6 i podziel ją przez dwa. Zapewnia to początkowe oszacowanie wartości przycinania.
  10. Współczynnik otwarcia plus. Wybierz stos YFPex - YFPem i CFPex - YFPem. W polu Współczynnik FRET wybierz CFPex - YFPem jako stos 1, w przypadku odwróconego współczynnika FRET wizualizującego sondy, w których wydajność FRET spada po fosforylacji, wybierz YFPex - YFPem jako stos 1.
  11. Wstaw zmierzone intensywności tła i wartości przycinania.
  12. Ustaw skalowanie wynikowego stosu proporcji i zastosuj odpowiednią tabelę przeglądową (LUT), aby zobrazować zmiany proporcji.

5. Reprezentatywne wyniki

Aktywność Plk1 jest po raz pierwszy widoczna w jądrze w fazie G2 i osiąga szczyt podczas mitozy. Rysunek 3 przedstawia eksperyment z zastosowaniem minimalnych ustawień fototoksyczności, jak opisano w sekcji 2. Należy pamiętać, że jest to reprezentatywny wynik początkowy i że warunki ekspozycji lub czas między obrazami mogą być modyfikowane w celu zwiększenia stosunku sygnału do szumu lub rozdzielczości czasowej. Rysunek 3D pokazuje, że większość komórek wykazujących ekspresję sondy proliferuje w czasie cyklu komórkowego od 20 do 25 godzin, co wskazuje, że warunki obrazowania i poziomy ekspresji sondy nie wpływają na czas cyklu komórkowego. Chociaż występuje znaczny szum, wyraźnie widoczny jest trend wzrostu aktywności Plk1 w G2 i osiągania szczytu w mitozie14 (ryc. 3A). Przetwarzanie surowych danych, w tym przypadku za pomocą średniego filtrowania przedstawionego jako kimograf (rys. 3B) lub kwantyfikacja średniego odwróconego współczynnika (rys. 3C) może zwiększyć przejrzystość.

figure-protocol-1
Rysunek 1. Zasada działania sondy opartej na FRET do monitorowania aktywności kinazy i fosfatazy. Dwa fluorofory, zwykle CFP (niebieski) i YFP (zielony), są połączone domeną wiążącą fosfo (pomarańczowy) i sekwencją fosforylującą (żółtą). Fosforylacja (kolor czerwony) pośredniczy w wiązaniu z domeną wiążącą fosę, indukując w ten sposób zmianę konformacyjną w sondzie. Zmiana konformacyjna powoduje różnicę w odległości lub orientacji między dwoma fluoroforami, co wpływa na wydajność FRET między CFP i YFP. FRET można wizualizować poprzez wzbudzanie CFP i monitorowanie emisji YFP (linie przerywane).

figure-protocol-2
Rysunek 2. Schematyczny zarys procedury doświadczalnej.

figure-protocol-3
Rysunek 3. Aktywność Plk1 jest po raz pierwszy widoczna w jądrze w fazie G2 i osiąga szczyt podczas mitozy. Komórki U2OS wykazujące ekspresję sondy opartej na FRET, monitorującej aktywność Plk19,14, były filmowane przez 60 godzin przy użyciu systemu obrazowania Deltavision Spectris wyposażonego w obiektyw powietrzny 20x NA 0,7 i lampę rtęciową. Warunki obrazowania zostały wybrane tak, aby powodowały minimalną fototoksyczność, jak opisano w sekcji 2, przy użyciu 4-krotnego binningu i filtrów o neutralnej gęstości, które blokują 99% wpadającego światła. A, fałszywa reprezentacja kolorów odwróconego współczynnika FRET, podążająca za jedną komórką przez 4 podziały. B, kymograf komórki pokazanej w A po zastosowaniu filtra średniej. C, kwantyfikacja odwróconego stosunku FRET komórki pokazanej w AD, skumulowane wejście mitotyczne 50 komórek eksprymujących sondę FRET, w tym podziały komórek potomnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monitorowanie FRET przez cały cykl komórkowy wymaga uwzględnienia, które jest mniej istotne przy ocenie krótkoterminowych reakcji na bodźce zewnętrzne. Po pierwsze, postęp cyklu komórkowego jest łatwo zaburzony przez sygnalizację stresu, co wymaga ograniczenia fototoksyczności do minimum. Po drugie, wszystkie reportery mogą potencjalnie wpływać na procesy komórkowe poprzez miareczkowanie kinaz, fosfataz lub domen interakcji. Prawdopodobnie najprostszym sposobem oceny, czy warunki eksperymentalne są odpowiednie, jest zmie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy są wspierani przez Szwedzką Radę ds. Badań, Szwedzką Fundację Badań Strategicznych, Szwedzkie Towarzystwo Onkologiczne, Szwedzkie Towarzystwo Walki z Rakiem Dziecięcym, Fundację Ake Wibergs i Fundację Jeanssons.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Leibovitz L-15, bez czerwieni fenolowejGIBCO, firmy Life Technologies21083-027
DMEM+Glutamax-IGIBCO, firmy Life Technologies31966
Hyklon płodowej surowicy bydlęcej (FBS) SV30160,03
0,05% Hyklon trypsyny EDTA SH30236,01
Hyklon penicyliny-streptomycynySV30010
DPBS GIBCO, firmy Life Technologies14287
Puromycin Sigma-AldrichP8833

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sun, Y., Wallrabe, H., Seo, S. A., Periasamy, A. FRET microscopy in 2010: the legacy of Theodor Forster on the 100th anniversary of his birth. Chemphyschem. 12, 462-474 (2011).
  2. Allen, M. D., Zhang, J. Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters. Biochem. Biophys. Res. Commun. 348, 716-721 (2006).
  3. Kunkel, M. T., Ni, Q., Tsien, R. Y., Zhang, J., Newton, A. C. Spatio-temporal dynamics of protein kinase B/Akt signaling revealed by a genetically encoded fluorescent reporter. J. Biol. Chem. 280, (2005).
  4. Violin, J. D., Zhang, J., Tsien, R. Y., Newton, A. C. A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase. C. J. Cell. Biol. 161, 899-909 (2003).
  5. Kunkel, M. T., Toker, A., Tsien, R. Y., Newton, A. C. Calcium-dependent regulation of protein kinase D revealed by a genetically encoded kinase activity reporter. Journal of Biological Chemistry. 282, 6733-6742 (2007).
  6. Harvey, C. D. A genetically encoded fluorescent sensor of ERK activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19264-19269 (2008).
  7. Fosbrink, M., Aye-Han, N. N., Cheong, R., Levchenko, A., Zhang, J. Visualization of JNK activity dynamics with a genetically encoded fluorescent biosensor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5459-5464 (2010).
  8. Gavet, O., Pines, J. Progressive activation of CyclinB1-Cdk1 coordinates entry to mitosis. Dev. Cell. 18, 533-543 (2010).
  9. Fuller, B. G. Midzone activation of aurora B in anaphase produces an intracellular phosphorylation gradient. Nature. 453, 1132-1136 (2008).
  10. Ni, Q., Titov, D. V., Zhang, J. Analyzing protein kinase dynamics in living cells with FRET reporters. Methods. 40, 279-286 Forthcoming.
  11. Morgan, D. O. The cell cycle : principles of control. , New Science Press, in association with Oxford University Press. (2007).
  12. Lindqvist, A., Rodriguez-Bravo, V., Medema, R. H. The decision to enter mitosis: feedback and redundancy in the mitotic entry network. J. Cell. Biol. 185, 193-202 (2009).
  13. Gavet, O., Pines, J. Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis. J. Cell. Biol. 189, 247-259 (2010).
  14. Macurek, L. Polo-like kinase-1 is activated by aurora A to promote checkpoint recovery. Nature. 455, 119-123 (2008).
  15. van der Eb, A. J., Graham, F. L. Assay of transforming activity of tumor virus DNA. Methods. Enzymol. 65, 826-839 (1980).
  16. Lamprecht, M. R., Sabatini, D. M., Carpenter, A. E. CellProfiler: free, versatile software for automated biological image analysis. Biotechniques. 42, 71-75 (2007).
  17. Roszik, J., Lisboa, D., Szollosi, J., Vereb, G. Evaluation of intensity-based ratiometric FRET in image cytometry--approaches and a software solution. Cytometry A. 75, 761-767 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Aktywno kinazy i fosfatazyratiometryczne obrazowanie FRETmonitorowanie cyklu kom rkowegosonda aktywno ci PLK1FRET CFP YFPobrazowanie poklatkowekom rki U2 OSImageJ Ratio Plusanaliza wej cia w mitozwarunki kom rkowe bez stresu

Powiązane artykuły