Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Monitorowanie aktywności kinaz i fosfataz w cyklu komórkowym za pomocą ratiometrycznego FRET

13.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3410

⸱

27 stycznia 2012

 ,  ,  , 
1Department of Cell and Molecular Biology, Karolinska Institutet

W tym artykule

Podsumowanie

Reportery oparte na FRET są coraz częściej wykorzystywane do monitorowania aktywności kinaz i fosfataz w żywych komórkach. W niniejszej pracy opisujemy metodę wykorzystania reporterów opartych na FRET do oceny zmian w fosforylacji celu zależnych od cyklu komórkowego.

Streszczenie

Raportory oparte na transferze energii rezonansowej Förstera (FRET)1 umożliwiają ocenę endogennej aktywności kinaz i fosfataz w żywych komórkach. Takie sondy zazwyczaj składają się z wariantów białek CFP i YFP, przedzielonych sekwencją podatną na fosforylację oraz domeną wiążącą grupy fosforanowe. W wyniku fosforylacji sonda zmienia konformację, co prowadzi do zmiany odległości lub orientacji między CFP a YFP, co z kolei skutkuje zmianą wydajności FRET (Ryc. 1). W ciągu ostatniej dekady opublikowano szereg sond monitorujących równowagę aktywności wielu kinaz i fosfataz, w tym raportory dla PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 oraz Plk19. Biorąc pod uwagę modułową budowę, w najbliższej przyszłości prawdopodobnie pojawią się kolejne sondy10.

Postępowanie przez cykl komórkowy jest wpływane przez szlaki sygnalizacji stresu 11. Warto zauważyć, że cykl komórkowy jest regulowany inaczej podczas niezakłóconego wzrostu w porównaniu do momentu, gdy komórki regenerują się po stresie12. Obrazowanie time-lapse komórek w trakcie cyklu komórkowego wymaga zatem szczególnej ostrożności. Staje się to problemem zwłaszcza przy zastosowaniu obrazowania ratiometrycznego, ponieważ do poprawnej interpretacji wyników wymagane są dwa obrazy o wysokim stosunku sygnału do szumu. Ratiometryczne obrazowanie FRET zmian w aktywnościach kinaz i fosfataz zależnych od cyklu komórkowego było ograniczone głównie do poszczególnych etapów cyklu komórkowego8,9,13,14.

W niniejszym artykule omawiamy metodę monitorowania sond opartych na FRET z wykorzystaniem obrazowania ratiometrycznego w trakcie cyklu komórkowego człowieka. Metoda ta opiera się na sprzęcie dostępnym dla wielu badaczy w naukach o życiu i nie wymaga eksperckiej wiedzy z zakresu mikroskopii ani przetwarzania obrazów.

Protokół

1. Wprowadzanie sondy do komórek

  1. Wykonaj kotransfekcję komórek sondą opartą na FRET oraz plazmidem nadającym oporność. Wybierz metodę transfekcji, która jest wydajna dla badanego typu komórek. W przypadku komórek U2OS standardowe metody transfekcji za pomocą fosforanu wapnia dają odpowiednie wyniki15.
  2. Prowadź selekcję komórek w odpowiednim antybiotyku przez co najmniej siedem dni. Pozwala to zwiększyć liczbę komórek wykazujących ekspresję sondy i ograniczyć liczbę komórek o toksycznym poziomie ekspresji lub takim, który silnie wpływa na cykl komórkowy.
  3. (opcjonalnie) Wyselekcjonuj klony stabilne.
  4. Na komórkach utrwalonych lub żywych zweryfikuj, czy zarówno CFP, jak i YFP są obecne we wszystkich komórkach w przybliżeniu w tym samym stosunku.
  5. W przypadku, gdy niektóre komórki zawierają tylko CFP lub YFP, prawdopodobnie doszło do rekombinacji. Rekombinacja może wystąpić podczas wzrostu bakterii lub po transfekcji sondy, a w tym drugim przypadku może zależeć od jakości plazmidu. Jeśli problem będzie się powtarzał, powtórz przygotowanie plazmidu i zlinearyzuj go przed transfekcją.

2. Monitorowanie ratiometrycznego FRET

  1. Wysiać komórki na szalkach z szklanym dnem lub na szkiełkach podstawkowych do montażu w komorze. Należy upewnić się, że szalki/szkiełka podstawkowe są z grubością nr 1.5 (170 μm).
  2. Zamontować komórki w pożywce wzrostowej bez czerwieni fenolowej w zmotoryzowanym mikroskopie epifluorescencyjnym z kontrolą temperatury ustawioną na 37 °C. Zapewnić regulację pH pożywki, albo za pomocą CO2, albo stosując pożywki niezależne od CO2, takie jak Liebowitz-15.
  3. Ustawić ostrość na komórkach, korzystając ze światła przechodzącego. Nie obserwować komórek przy użyciu światła fluorescencyjnego.
  4. Rozpocząć od pozyskania obrazu 12 lub 16-bitowego, używając filtrów wzbudzenia YFP (YFPex) i emisji YFP (YFPem) oraz odpowiedniego lustra dichroicznego. Zastosować maksymalny dostępny binning, który wciąż pozwala na uzyskanie wymaganej rozdzielczości subkomórkowej. Użycie wysokiego binningu w celu skrócenia czasu ekspozycji lub zmniejszenia intensywności jest kluczowe dla uniknięcia fototoksyczności.
  5. Zmierzyć lub oszacować intensywność tła oraz przybliżony poziom szumu, mierząc lub szacując przybliżone średnie, minimalne i maksymalne wartości pikseli w obszarze pozbawionym komórek. Zmienić czas ekspozycji i filtry neutralnej gęstości tak, aby średni sygnał w komórce wynosił w przybliżeniu intensywność tła plus pięciokrotność do dziesięciokrotności różnicy między maksymalną a minimalną intensywnością tła.
  6. Zweryfikować, czy obrazy nie są bliskie nasycenia. Maksymalna intensywność na obrazie powinna być mniejsza niż połowa zakresu dynamicznego (np. maks. 2000 w obrazie 12-bitowym), aby uwzględnić różnice w intensywności w momencie wejścia komórek w fazę mitozy.
  7. Powtórzyć kroki 2.4 do 2.6, używając filtrów wzbudzenia CFP i emisji YFP oraz odpowiedniego lustra dichroicznego.
  8. Wybrać wiele obszarów z transfekowanymi komórkami, z wyłączeniem obszarów wykorzystanych w punktach 2.4 do 2.7, i upewnić się, że maksymalna intensywność we wszystkich komórkach jest mniejsza niż połowa zakresu dynamicznego.
  9. Rozpocząć eksperyment time-lapse, pozyskując dwa obrazy co 45 min przy użyciu zestawów filtrów YFPex - YFPem oraz CFPex - YFPem.

3. Weryfikacja i optymalizacja warunków

  1. Otwórz pozyskane obrazy i monitoruj czas cyklu komórkowego od mitozy do mitozy dla komórek wykazujących ekspresję transfektowanej sondy.
  2. Porównaj zmierzony czas cyklu komórkowego z opublikowanymi danymi dla użytego typu komórek. Alternatywnie, zarejestruj obraz nietransfektowanych komórek, wykonując co godzinę jeden obraz w świetle przechodzącym (np. DIC lub kontrast fazowy), aby uzyskać referencyjne czasy cyklu komórkowego.
  3. Jeśli czas od mitozy do mitozy odpowiada referencyjnym czasom cyklu komórkowego, przejdź do kroku 4. W przeciwnym razie ponownie pozyskaj obrazy, stosując silniejszą ekspozycję, większą liczbę punktów czasowych lub wiele poziomów z i powtórz krok 3.
  4. W przypadku gdy czas od mitozy do mitozy nie odpowiada referencyjnym czasom cyklu komórkowego, zarejestruj obraz transfektowanych komórek, wykonując co godzinę jeden obraz w świetle przechodzącym (np. DIC lub kontrast fazowy), a następnie jeden obraz na koniec eksperymentu w celu zidentyfikowania komórek transfektowanych.
  5. Jeśli komórki transfektowane nadal wykazują wydłużony czas cyklu komórkowego, powtórz krok 1, transfektując mniejszą ilość sondy lub wybierając klony stabilne zawierające bardzo niskie ilości sondy.
  6. Jeśli komórki transfektowane wykazują prawidłowy czas cyklu komórkowego w nieobecności światła fluorescencyjnego, powtórz krok 2, zmniejszając ekspozycję poprzez modyfikację binningu, filtrów gęstości neutralnej, czasu ekspozycji oraz odstępów czasowych między obrazami.

4. Analiza FRET

  1. Analizę można przeprowadzić za pomocą większości oprogramowania przeznaczonego do mikroskopii. Tutaj opisujemy, jak wykonać analizę przy użyciu bezpłatnego programu ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij) z wykorzystaniem wtyczki Ratio Plus (http://imagej.nih.gov/ij/plugins/ratio-plus.html).
  2. Otwórz obrazy w programie ImageJ. W przypadku, gdy obrazy są w formacie wielokolorowego stosu (np. Deltavision), oddziel poszczególne kanały, najpierw konwertując je na hyperstack: Image-hyperstack-stack to hyperstack, a następnie rozdziel je na stosy pojedynczych kanałów za pomocą: Image-hyperstack-reduce dimensionality
  3. Pomnóż stos YFPex - YFPem przez 3 za pomocą funkcji: Process-Math-Multiply. Ten krok jest opcjonalny, ponieważ ma on na celu jedynie zwiększenie przejrzystości wizualnej obrazów poprzez zapewnienie, że wartości stosunku nie znajdują się w zakresie od 0 do 1.
  4. W stosie YFPex - YFPem wyznacz obszar zainteresowania (ROI) w miejscu pozbawionym komórek, ale znajdującym się blisko komórki przeznaczonej do pomiaru. Różne komórki na tym samym obrazie mogą wymagać różnych obszarów, ponieważ zarówno tło, jak i intensywność sygnału są zazwyczaj najsilniejsze w centrum obrazu.
  5. Dodaj ROI do menedżera ROI: Analyze-tools-ROI manager.
  6. Zmierz średnią intensywność ROI zarówno w stosie YFPex - YFPem, jak i w stosie CFPex - YFPem: Analyze-Measure.
  7. Powtórz czynność w wielu punktach czasowych i zweryfikuj, czy intensywności tła w pobliżu badanej komórki są podobne w całym filmie.
  8. Ustaw pomiary tak, aby obejmowały minimalną intensywność: Analyze-Set measurements-Min and Max grey value.
  9. Wyznacz obszar zainteresowania obejmujący większość komórki i zmierz minimalną intensywność w stosie YFPex - YFPem oraz CFPex - YFPem. Oblicz różnicę między zmierzoną minimalną intensywnością a intensywnością tła z punktu 4.6 i podziel ją przez dwa. Daje to wstępną szacunkową wartość przycięcia (clipping value).
  10. Otwórz Ratio Plus. Wybierz stosy YFPex - YFPem oraz CFPex - YFPem. Dla stosunku FRET wybierz CFPex - YFPem jako stos 1; dla odwróconego stosunku FRET, służącego do wizualizacji sond, w których wydajność FRET spada podczas fosforylacji, wybierz YFPex - YFPem jako stos 1.
  11. Wprowadź zmierzone intensywności tła oraz wartości przycięcia.
  12. Ustaw skalowanie wynikowego stosu stosunków i zastosuj odpowiednią tablicę wyszukiwania (LUT), aby zwizualizować zmiany stosunków.

5. Reprezentatywne wyniki

Aktywność Plk1 jest najpierw widoczna w jądrze komórkowym w fazie G2 i osiąga szczyt podczas mitozy. Rysunek 3 przedstawia eksperyment z zastosowaniem minimalnych ustawień fototoksyczności, zgodnie z opisem w sekcji 2. Należy pamiętać, że jest to reprezentatywny wynik wstępny, a warunki ekspozycji lub czas między obrazami mogą zostać zmodyfikowane w celu zwiększenia stosunku sygnału do szumu lub rozdzielczości czasowej. Rysunek 3D pokazuje, że większość komórek wykazujących ekspresję sondy proliferuje z czasem cyklu komórkowego wynoszącym od 20 do 25 godzin, co wskazuje, że warunki obrazowania i poziomy ekspresji sondy nie wpływają na czas trwania cyklu komórkowego. Mimo znacznego szumu, trend wzrostu aktywności Plk1 w fazie G2 i jej szczytu w mitozie14 jest wyraźnie widoczny (rys. 3A). Przetwarzanie surowych danych, tutaj poprzez filtrowanie średnią przedstawione jako kymograf (rys. 3B), lub kwantyfikacja średniego odwróconego stosunku (rys. 3C) mogą poprawić przejrzystość.

Schemat cyklu kinaza-fosfataza, regulacja białek, działanie enzymów, proces fosforylacji.
Rycina 1. Zasada działania sondy opartej na FRET do monitorowania aktywności kinaz i fosfataz. Dwa fluorofory, zazwyczaj CFP (niebieski) i YFP (zielony), są połączone domeną wiążącą fosforan (pomarańczowy) i sekwencją fosforylowalną (żółty). Fosforylacja (czerwony) pośredniczy w wiązaniu z domeną wiążącą fosforan, indukując tym samym zmianę konformacyjną sondy. Zmiana konformacyjna skutkuje różnicą w odległości lub orientacji między dwoma fluoroforami, co wpływa na wydajność FRET pomiędzy CFP a YFP. FRET można zwizualizować poprzez pobudzenie CFP i monitorowanie emisji YFP (linie przerywane).

Schemat procesu transfekcji plazmidowej, mikroskopia epifluorescencyjna, etapy analizy stosunku FRET.
Rysunek 2. Schematyczny zarys procedury eksperymentalnej.

Obrazowanie time-lapse oraz wykresy ekspresji białek i wejścia w mitozę, analiza danych fluorescencyjnych.
Rycina 3. Aktywność Plk1 jest po raz pierwszy widoczna w jądrze w fazie G2 i osiąga szczyt podczas mitozy. Komórki U2OS wykazujące ekspresję sondy opartej na FRET do monitorowania aktywności Plk19,14 były filmowane przez 60 hr przy użyciu systemu obrazowania Deltavision Spectris wyposażonego w obiektyw powietrzny 20x NA 0.7 i lampę rtęciową. Warunki obrazowania dobrano tak, aby zminimalizować fototoksyczność, zgodnie z opisem w sekcji 2, stosując binning 4x oraz filtry gęstości neutralnej blokujące 99% światła wpadającego. A, reprezentacja w fałszywych kolorach odwróconego stosunku FRET, śledząca jedną komórkę przez 4 podziały. B, kymograf komórki pokazanej w A po zastosowaniu filtra średniej. C, ilościowe oznaczenie odwróconego stosunku FRET komórki pokazanej w A. D, skumulowane wejście w mitozę 50 komórek wykazujących ekspresję sondy FRET, wliczając podziały komórek potomnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Monitorowanie FRET w trakcie całego cyklu komórkowego wymaga uwzględnienia kwestii, które są mniej istotne podczas oceny krótkotrwałych reakcji na bodźce zewnętrzne. Po pierwsze, progresja cyklu komórkowego jest łatwo zaburzana przez sygnalizację stresu, co wymaga zminimalizowania fototoksyczności. Po drugie, wszystkie reportery mogą potencjalnie wpływać na procesy komórkowe poprzez miareczkowanie kinaz, fosfataz lub domen interakcji. Prawdopodobnie najprostszym sposobem na ocenę, czy warunki eksperymentalne są odpowiedn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy otrzymali wsparcie od Szwedzkiej Rady Badawczej (Swedish Research Council), Szwedzkiej Fundacji Badań Strategicznych (Swedish Foundation for Strategic Research), Szwedzkiego Towarzystwa Walki z Rakiem (Swedish Cancer Society), Szwedzkiego Towarzystwa Walki z Rakiem Dziecka (Swedish Child Cancer Society), Fundacji Åke Wiberga oraz Fundacji Jeanssona.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Leibovitz L-15, bez czerwieni fenolowejGIBCO, by Life Technologies21083-027
DMEM+Glutamax-IGIBCO, by Life Technologies31966
Płotkowa surowica bydlęca (FBS)HycloneSV30160.03
0.05% Trypsyna EDTAHycloneSH30236.01
Penicylina-StreptomycynaHycloneSV30010
DPBSGIBCO, by Life Technologies14287
PuromycynaSigma-AldrichP8833

Bibliografia

  1. Sun, Y., Wallrabe, H., Seo, S. A., Periasamy, A. FRET microscopy in 2010: the legacy of Theodor Forster on the 100th anniversary of his birth. Chemphyschem. 12, 462-474 (2011).
  2. Allen, M. D., Zhang, J. Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters. Biochem. Biophys. Res. Commun. 348, 716-721 (2006).
  3. Kunkel, M. T., Ni, Q., Tsien, R. Y., Zhang, J., Newton, A. C. Spatio-temporal dynamics of protein kinase B/Akt signaling revealed by a genetically encoded fluorescent reporter. J. Biol. Chem. 280, (2005).
  4. Violin, J. D., Zhang, J., Tsien, R. Y., Newton, A. C. A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase. C. J. Cell. Biol. 161, 899-909 (2003).
  5. Kunkel, M. T., Toker, A., Tsien, R. Y., Newton, A. C. Calcium-dependent regulation of protein kinase D revealed by a genetically encoded kinase activity reporter. Journal of Biological Chemistry. 282, 6733-6742 (2007).
  6. Harvey, C. D. A genetically encoded fluorescent sensor of ERK activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19264-19269 (2008).
  7. Fosbrink, M., Aye-Han, N. N., Cheong, R., Levchenko, A., Zhang, J. Visualization of JNK activity dynamics with a genetically encoded fluorescent biosensor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5459-5464 (2010).
  8. Gavet, O., Pines, J. Progressive activation of CyclinB1-Cdk1 coordinates entry to mitosis. Dev. Cell. 18, 533-543 (2010).
  9. Fuller, B. G. Midzone activation of aurora B in anaphase produces an intracellular phosphorylation gradient. Nature. 453, 1132-1136 (2008).
  10. Ni, Q., Titov, D. V., Zhang, J. Analyzing protein kinase dynamics in living cells with FRET reporters. Methods. 40, 279-286 Forthcoming.
  11. Morgan, D. O. The cell cycle : principles of control. , New Science Press, in association with Oxford University Press. (2007).
  12. Lindqvist, A., Rodriguez-Bravo, V., Medema, R. H. The decision to enter mitosis: feedback and redundancy in the mitotic entry network. J. Cell. Biol. 185, 193-202 (2009).
  13. Gavet, O., Pines, J. Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis. J. Cell. Biol. 189, 247-259 (2010).
  14. Macurek, L. Polo-like kinase-1 is activated by aurora A to promote checkpoint recovery. Nature. 455, 119-123 (2008).
  15. van der Eb, A. J., Graham, F. L. Assay of transforming activity of tumor virus DNA. Methods. Enzymol. 65, 826-839 (1980).
  16. Lamprecht, M. R., Sabatini, D. M., Carpenter, A. E. CellProfiler: free, versatile software for automated biological image analysis. Biotechniques. 42, 71-75 (2007).
  17. Roszik, J., Lisboa, D., Szollosi, J., Vereb, G. Evaluation of intensity-based ratiometric FRET in image cytometry--approaches and a software solution. Cytometry A. 75, 761-767 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Aktywność kinazy i fosfatazyratiometryczne obrazowanie FRETmonitorowanie cyklu komórkowegosonda aktywności PLK1FRET CFP YFPobrazowanie poklatkowekomórki U2 OSImageJ Ratio Plusanaliza wejścia w mitozęwarunki komórkowe bez stresu
Monitorowanie aktywności kinaz i fosfataz w cyklu komórkowym za pomocą ratiometrycznego FRET
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.