Pomiar wewnątrzkomórkowego napływu wapnia sterowanego zapasami w żywych komórkach z wykorzystaniem fluorescencji: od hodowlanych komórek nowotworowych po włókna mięśni szkieletowych

Podsumowanie

Zakres wlotu Ca²⁺ zależnego od zapasów (SOCE) można monitorować przy użyciu fluorescencyjnych wskaźników Ca²⁺. Wygaszanie tych wskaźników przez Mn²⁺ pozwala na badanie SOCE w hodowlach komórkowych i włóknach mięśni szkieletowych. Opisano również technikę umożliwiającą rozdzielczość przestrzenną i czasową SOCE poprzez obrazowanie konfokalne mechanicznie odskórkowanych włókien mięśniowych.

Streszczenie

Wjazd Ca²⁺ zależny od magazynów (SOCE), wcześniej określany jako wjazd Ca²⁺ pojemnościowy, jest ściśle regulowanym mechanizmem napływu zewnątrzkomórkowego Ca²⁺ do komórek w celu uzupełnienia wyczerpanych zapasów Ca²⁺ w retikulum endoplazmatycznym (ER) lub retikulum sarkoplazmatycznym (SR)^1,2. Ponieważ Ca²⁺ jest powszechnym wtórnym przekaźnikiem, nie jest zaskakujące, że SOCE odgrywa istotną rolę w wielu procesach komórkowych, w tym w proliferacji, apoptozie, transkrypcji genów i motoryce. Ze względu na jego szerokie występowanie w niemal wszystkich typach komórek, w tym w komórkach nabłonkowych i mięśniach szkieletowych, ścieżka ta wzbudziła duże zainteresowanie^3,4. Jednakże heterogeniczność charakterystyki SOCE w różnych typach komórek oraz jego funkcja fizjologiczna nie są jeszcze w pełni wyjaśnione^5-7.

Funkcjonalne właściwości kanałów SOCE można ujawnić za pomocą badań metodą patch-clamp, natomiast obszerna wiedza na temat tej ścieżki została zdobyta dzięki pomiarom wewnątrzkomórkowego Ca²⁺ opartym na fluorescencji, ze względu na wygodę i możliwość prowadzenia wysokoprzepustowych przesiewów. Celem niniejszego raportu jest podsumowanie kilku metod opartych na fluorescencji służących do pomiaru aktywacji SOCE w komórkach w monowarstwie, komórkach w zawiesinie oraz w włóknach mięśniowych^5,8-10. Najczęściej stosowaną z tych metod fluorescencyjnych jest bezpośrednie monitorowanie dynamiki wewnątrzkomórkowego Ca²⁺ z wykorzystaniem stosunku F_340nm do F_380nm (długość fali emisji 510 nm) ratiometrycznego wskaźnika Ca²⁺ Fura-2. W celu wyizolowania aktywności jednokierunkowego SOCE od wewnątrzkomórkowego uwalniania Ca²⁺ i usuwania Ca²⁺ na zewnątrz komórki, często stosuje się test wygaszania Mn²⁺. Znane jest, że Mn²⁺ może przenikać do komórek poprzez SOCE, podczas gdy jest on nieprzepuszczalny dla procesów usuwania przez błonę powierzchniową lub pochłaniania przez ER za pomocą pomp Ca²⁺ ze względu na bardzo wysokie powinowactwo do Fura-2. W rezultacie wygaszanie fluorescencji Fura-2 wywołane przedostawaniem się zewnątrzkomórkowego Mn²⁺ do komórek stanowi pomiar aktywności SOCE⁹. Pomiary ratiometryczne oraz testy wygaszania Mn⁺² można przeprowadzać na spektrofluorometrze z kuwetą w trybie populacyjnym lub w systemie opartym na mikroskopie w celu wizualizacji pojedynczych komórek. Zaletą pomiarów pojedynczych komórek jest możliwość wyselekcjonowania za pomocą reporterów GFP lub RFP poszczególnych komórek poddanych manipulacjom genetycznym, co pozwala na badania w komórkach genetycznie zmodyfikowanych lub zmutowanych. Charakterystyka czasowo-przestrzenna SOCE w strukturalnie wyspecjalizowanych mięśniach szkieletowych może zostać uzyskana w preparatach włókien mięśniowych z usuniętą błoną komórkową (skinned muscle fibers) poprzez jednoczesne monitorowanie fluorescencji dwóch wskaźników Ca²⁺ o niskim powinowactwie, ukierunkowanych na konkretne przedziały włókna mięśniowego, takich jak Fluo-5N w SR i Rhod-5N w kanalikach poprzecznych^9,11,12.

Protokół

1. Pomiar wewnątrzkomórkowego Ca²⁺ w poszczególnych komórkach

1. Linia komórkową KYSE-150, pochodzącą z płaskonabłonkowego raka przełyku człowieka (ECSS), hoduje się w atmosferze 5% CO₂ w temperaturze 37°C w mieszanej pożywce RPMI 1640/Ham's F-12 (1:1) zawierającej 5% płodowej surowicy bydlęcej.
2. Komórki KYSE-150 transfekuje się plazmidami zawierającymi shRNA skierowane specyficznie przeciwko Orai1 lub sekwencją kontrolną (scrambled). Plazmidy zawierają również gen kodujący czerwone białko fluorescencyjne (RFP) jako reporter, sterowany przez oddzielny promotor.
3. Komórki hoduje się w szalkach z szklanym dnem (szkiełko cover glass nr 1.5, MatTek, MA) przez 48 godzin.
4. Usuwa się pożywkę i płucze komórki zrównoważonym roztworem soli (BSS) (140 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂, 10 mM HEPES, pH 7.2).
5. Do szalki dodaje się 1 ml roztworu BSS zawierającego 2 μM ester acetometylu Fura-2 (Molecular Probes), a następnie owija całą szalkę folią, aby chronić ją przed światłem.
6. Komórki inkubuje się przez 40 min w temperaturze 37°C, a następnie pozostawia na dodatkowe 15 min w temperaturze pokojowej, aby umożliwić całkowitą hydrolizę estru. Komórki płucze się dwukrotnie roztworem BSS.
7. Szalkę umieszcza się na stoliku odwróconego mikroskopu Nikon TE200, który jest połączony ze spektrofluorometrem PTI z długościami fal wzbudzenia 350 i 390 nm oraz emisją przy 510 nm. Dokładne długości fal wzbudzenia mogą się nieznacznie różnić w zależności od optyki poszczególnych systemów. Dwie długości fal o najlepszej dynamice stosunku określa się poprzez skanowanie widma wzbudzenia soli Fura-2 w roztworach zawierających Ca²⁺ w zakresie od 0 do 39.8 μM (lub wyższe stężenie, przy którym fluorescencja Fura-2 ulega nasyceniu).
8. Przygotowuje się grawitacyjny system perfuzji z czterema różnymi roztworami w BSS: Ca²⁺ (2 mM), EGTA (0.5 mM), EGTA-TG (tapsygargina, 5 μM), Ca²⁺-2-APB (inhibitor SOCE, 75 μM). Można również zastosować komputerowo sterowane automatyczne systemy perfuzji.
9. W trybie wizualizacji wybiera się komórki wykazujące ekspresję RFP.
10. Przy powiększeniu 10x pozycjonuje się końcówkę systemu perfuzji tak, aby znajdowała się bezpośrednio nad obszarem zainteresowania pod kątem 45 stopni.
11. Jednocześnie rejestruje się sygnały fluorescencji F_350nm oraz F_390nm. Stosunek (F_350nm/F_390nm) jest wyświetlany w trzecim oknie. Roztwory perfuzyjne zmienia się w następującej kolejności: Ca²⁺; EGTA; Ca²⁺; EGTA-TG; Ca²⁺; Ca²⁺-2-APB.

Powyższy protokół można zmodyfikować w celu pomiaru wewnątrzkomórkowego Ca²⁺ w systemie zawiesiny komórkowej.

12. Hodować komórki KYSE-150 w kolbie T25 w tych samych warunkach hodowli, co powyżej.
13. Gdy komórki osiągną 90% konfluencji, usunąć medium i przepłukać komórki roztworem BSS.
14. Dodać 2,5 ml roztworu BSS zawierającego 2 μM Fura-2 AM i inkubować komórki przez 40 min w 37°C, a następnie przeprowadzić deestryfikację.
15. Usunąć BSS, dodać do kolby 2,5 ml trypsyny i inkubować w 37°C aż do odklejenia się komórek. Następnie dodać 2,5 ml medium hodowlanego, aby zatrzymać trypsynizację, i zebrać komórki poprzez wirowanie przy 800 rpm przez 5 min.
16. Przemyć komórki medium hodowlanym raz jeszcze poprzez wirowanie i resuspender osad komórkowy w roztworze BSS (bez dodatku 2 mM CaCl₂, zawierającym Ca²⁺ w zakresie μM) oraz policzyć komórki za pomocą hematometru.
17. Przenieść ~10⁶ komórek do kuwety kwarcowej (10 mm, Starna Cells) i dopełnić objętość do 2 ml za pomocą BSS.
18. Umieścić kuwetę (mieszając za pomocą mieszadełka magnetycznego) w spektrofluorometrze.
19. Jednocześnie rejestrować sygnały fluorescencji F_340nm i F_380nm z długością fali emisji 510 nm. Protokół pomiarowy obejmuje: BSS, dodanie 0,5 μl EGTA (stok 0,25 M), dodanie 1 μl tapsygarginy (TG, stok 10 mM), dodanie 4 μl Ca²⁺(stok 1 M).

2. Analiza wygaszania Mn w hodowlach komórkowych

1. Przeprowadź skanowanie długości fal wzbudzenia Fura-2 w roztworach o różnych stężeniach Ca²⁺, w zakresie od 0 do 39,8 μM, aby wyznaczyć punkt izosbestyczny jako długość fali niezależną od stężenia wapnia. Zazwyczaj punkt izosbestyczny znajduje się w okolicy 360 nm.
2. Komórki KYSE-150 hoduje się w naczyniach z dna szklanego i obciąża Fura-2 AM.
3. Przygotuj system perfuzyjny z pięcioma różnymi roztworami BSS: Ca²⁺ (2 mM), EGTA/TG (odpowiednio 0,5 mM i 5 μM), Mn²⁺ (0,5 mM, bez dodatku EGTA lub Ca²⁺, zawierający wolny Ca²⁺ w zakresie μM), Mn²⁺/2-APB (75 μM), EGTA/Triton X-100 (0,1%).
4. Zamocuj naczynie na stoliku mikroskopu i wybierz tryb „Excitation Ratio” z długościami fal wzbudzenia 360 nm oraz 390 nm i emisją przy 510 nm.
5. Jednocześnie rejestruj sygnały fluorescencji F_360nm i F_390nm z wyświetleniem stosunku (F_360nm/F_390nm) w trzecim oknie. Protokół pomiarowy przebiega następująco: Ca²⁺ przez 1 min w celu stabilizacji fluorescencji, Mn²⁺ przez 30 s, EGTA/TG przez 10 min, Mn²⁺ przez 2 min, EGTA-Triton X-100 (0,1%) przez 1 min w celu uzyskania odczytu tła. Zamiast Mn²⁺ można zastosować roztwór Mn²⁺/2-APB, aby zbadać zniesienie wygaszania fluorescencji, co wskazuje, że wniknięcie Mn²⁺ odbywa się drogą SOCE.

3. Analiza gaszenia Mn w komórkach mięśniowych

1. C2C12, mysia linia komórek miogennych, jest hodowana na naczyniach z szklanym dnem w atmosferze 5% CO₂ w temperaturze 37°C w pożywce DMEM zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 10% surowicy konskiej.
2. Po osiągnięciu przez komórki konfluencji, pożywkę hodowlaną zmienia się na pożywkę różnicującą (usuwając płodową surowicę bydlęcą i redukując zawartość surowicy konskiej do 2,5%). Mioblasty C2C12 zróżnicują się w miotuby po 4 dniach.
3. Należy obciążyć miotuby C2C12 końcowym stężeniem 5 μM Fura-2 AM zgodnie z opisem w punktach 1.4-1.6.
4. Należy dodać końcowe stężenie 20 μM N-benzylo-p-toluenosulfonamidu (BTS), aby zahamować skurcze mięśni oraz wywołane przez nie artefakty ruchowe, i odczekać 15 min przed rozpoczęciem eksperymentu.
5. Naczynie należy umieścić na stoliku mikroskopu podłączonego do urządzenia PTI i wprowadzić do systemu perfuzyjnego następujące roztwory BSS: 2 Ca²⁺ (2 mM), 0 Ca²⁺, Mn²⁺ (0,5 mM); Mn²⁺/TG (odpowiednio 0,5 mM, 20 μM).
6. System perfuzyjny należy skonfigurować zgodnie z powyższym opisem.
7. Należy jednocześnie rejestrować sygnały fluorescencji F_360nm i F_390nm z wyświetlonym stosunkiem (F_360nm/F_390nm) w trzecim oknie. Protokół pomiarowy obejmuje: 2 Ca²⁺ przez 1 min, 0 Ca²⁺ przez 1 min w celu wypłukania Ca²⁺, Mn²⁺ przez 0,5 min, Mn²⁺/TG przez 10 min oraz Mn²⁺/EGTA-Triton X-100 (0,1%).

4. Przestrzennie i czasowo rozdzielony SOCE w odsłoniętych włóknach mięśniowych

1. Przygotować następujące roztwory.
   Izotoniczny bufor Tyrode'a: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl₂, 2,5 mM CaCl₂, pH 7,2, 290 mosm
   Pożywka hodowlana: DMEM z 2% surowicą końską oraz 1% penicyliną i streptomycyną
   Roztwór płuczący nr 1: 109,6 mM glutaminianu potasu, 2 mM EGTA-KOH, 6,7 mM MgCl₂, 2 mM ATP, 6 mM fosforanu kreatyny (CP), 20 mM kwasu N,N-bis(2-hydroksyetylo)-2-aminoetanosulfonowego (BES)-KOH, pH 7,0
   Roztwór płuczący nr 2: 140 mM glutaminianu potasu, 5 mM EGTA-KOH, 6,5 mM MgCl₂, 2 mM ATP, 6 mM CP, 20 mM BES-KOH, pH 7,0
   Roztwór do skinningu: 140 mM glutaminianu potasu, 6,5 mM MgCl₂, 2 mM ATP, 6 mM CP, 20 mM BES-KOH, pH 7,0
   Roztwór do ładowania TT: 90,6 mM glutaminianu potasu, 18 mM glutaminianu sodu, 0,55 mM CaCl₂, 2 mM EGTA-KOH, 6,7 mM MgCl₂, 5,4 mM ATP, 15 mM CP, 0,0025 mg/ml kinazy kreatynowej (CK), 20 mM BES-KOH, 5 μM cyjanorku karbonylu p-trifluorometoksyfenylohydrazonu (FCCP), pH 7,0, pCa 7,0
   Roztwór do ładowania SR: 107,8 mM glutaminianu potasu, 0,98 mM CaCl₂, 2 mM EGTA-KOH, 6,6 mM MgCl₂, 5,4 mM ATP, 15 mM CP, 0,0025 mg/ml CK, 20 mM BES-KOH, 5 μM FCCP, pH 7,0, pCa 6,6
   Roztwór do opróżniania SR: 100 mM glutaminianu potasu, 40 mM glutaminianu sodu, 10 mM EGTA-KOH, 10 mM kwasu 1,2-bis(o-aminofenoksy)etan-N,N,N',N'-tetraoctowego (BAPTA), 0,35 mM MgCl₂, 0,5 mM ATP, 1 mM CP, 20 mM BES-KOH, 5 μM FCCP, pH 7,0. Przed eksperymentami dodać 25 mM kofeiny/20 μM tapsygarginy (TG).
2. Aby wypreparować mięsień prostownika długiego palców (EDL), ułożyć myszy i ustawić nogę w pozycji bocznej, następnie usunąć skórę z obszaru kostki aż do kolana, naciąć powierzchowne warstwy tkanki mięśniowej, aby odsłonić EDL, i przeciąć ścięgna górne oraz dolne, aby uwolnić nienaruszony mięsień EDL; ważne jest, aby zachować ścięgna w jak najdłuższej formie. EDL przenieść do roztworu Tyrode'a zawierającego 0 Ca²⁺ i 0,1 mM EGTA, aby zapobiec skurczom.
3. Pod mikroskopem stereoskopowym, używając dwóch pęset, uchwycić dolne ścięgna przyczepu i podzielić mięsień EDL na dwa pęczki. Powtórzyć ten proces, aby uzyskać 4, a następnie 8 pęczków. Kluczowe jest, aby na koniec procesu każdy z 8 pęczków posiadał ścięgna. Pęczki, które utraciły ścięgna, należy odrzucić.
4. Pod mikroskopem stereoskopowym każdy pasek pęczka EDL chwycić za oba ścięgna i ostrożnie rozciągać, aż pozostaną nienaruszone 3~4 pojedyncze włókna mięśniowe ze ścięgnami po obu stronach.
5. Nanieść 1 kroplę buforu Tyrode'a wolnego od Ca²⁺ na środek szalki z szklanym dnem, ułożyć paski EDL prosto na szalce, szybko usunąć jak najwięcej roztworu, a następnie przymocować oba ścięgna za pomocą wodoodpornej taśmy klejącej, upewniając się, że taśma przylega ściśle. Włókno najpierw przemyć roztworem 0 Ca²⁺, a następnie dwukrotnie roztworem 2,5 mM Ca²⁺. Jeśli włókno ulegnie hiperkontrakcji i zauważone zostaną uszkodzenia, należy je odrzucić.
6. W razie potrzeby włókno można hodować do 96 godzin, co umożliwia manipulacje genetyczne. Włókno przemyć 3 razy pełną pożywką hodowlaną, dodać do szalki 2 ml pożywki i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37°C i 5% CO₂. Przed każdym eksperymentem zbadać włókna mięśniowe i odrzucić te bez wyraźnego prążkowania, z oznakami kontaminacji lub oznakami uszkodzeń, takimi jak kurczenie się błony sarkolemmalnej. Dobre włókna reagują na KCl, stymulację elektryczną oraz stymulację kofeiną.
7. Pojedyncze włókna mięśniowe przemyć 3 razy roztworem płuczącym nr 1 i inkubować w roztworze do skinningu przypominającym środowisko wewnątrzkomórkowe z dodatkiem 500 μM Rhod-5N i 0,5 mM Ca²⁺ przez 5 min.
8. Używając igły wolframowej przymocowanej do uchwytu, mechanicznie przeprowadzić skinning włókna pod mikroskopem stereoskopowym, pozwalając na automatyczne zamknięcie kanalików poprzecznych (TT) i uwięzienie w nich Rhod-5N w kompleksie z Ca²⁺; włókna po skinningu przemyć dwukrotnie roztworem płuczącym nr 2. Proces mechanicznego skinningu jest optymalny, gdy podczas zabiegu usunięto mniej niż 25% szerokości komórki.
9. Aby załadować SR, włókna po skinningu inkubować z roztworem do skinningu zawierającym 20 μM Fluo-5N AM przez 1 h w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć obficie roztworem płuczącym nr 2 i inkubować przez kolejne 30 min, aby umożliwić pełną deestryfikację barwnika.
10. Po 30 min włókna po skinningu wizualizować pod obiektywem 60X mikroskopu konfokalnego. Obrazy fluorescencyjne pozyskiwać przy długościach fal odpowiadających danym barwnikom (wzbudzenie przy 543 nm i emisja powyżej 570 nm dla Rhod-5N; wzbudzenie przy 488 nm i emisja w zakresie 530-560 nm dla Fluo-5N). Wyznaczyć obszary zainteresowania (ROI) dla obszarów załadowanych każdym z barwników.
11. Protokół eksperymentalny przebiega następująco: roztwór do ładowania TT przez 120 s, roztwór do ładowania SR przez 120 s, roztwór do opróżniania SR przez 400-750 s w celu wyczerpania zapasów Ca²⁺ w SR. Podczas tego procesu rejestrować zmiany intensywności Rhod-5N (Ca²⁺ w TT) oraz intensywności Fluo-5N (Ca²⁺ w SR), tworząc przebieg czasowy względnych zmian fluorescencji w TT i SR. Dalszej analizy poddać średnim wartościom intensywności fluorescencji z wielu włókien. Maksymalną intensywność ładowania na koniec etapu ładowania TT/SR znormalizować do 100%.

5. Reprezentatywne wyniki

Zbadaliśmy aktywność SOCE w komórkach KYSE-150, mierząc wewnątrzkomórkowe stężenie Ca²⁺ (Ryc. 2.). Wykorzystując RFP jako reporter, mogliśmy wyselekcjonować poszczególne komórki przetransfekowane plazmidem zawierającym specyficzne shRNA przeciwko orai1, genowi kodującemu kanał SOCE. W porównaniu z komórkami przetransfekowanymi plazmidami zawierającymi kontrolne shRNA (scramble) (czarna linia), wyciszenie białka Orai1 prowadzi do zmniejszenia aktywności SOCE (czerwona linia).

SOCE w komórkach KYSE-150 została również potwierdzona za pomocą testu wygaszania Mn²⁺ (Ryc. 3.). Długość fali wzbudzenia 360 nm odpowiada punktowi izobestycznemu Fura-2, w którym fluorescencja jest niezależna od stężenia Ca²⁺. Po całkowitym opróżnieniu zapasów Ca²⁺ w ER przez TG, perfuzja Mn²⁺ spowodowała znaczny spadek fluorescencji. Całkowitą aktywność SOCE można zmierzyć na podstawie szybkości spadku intensywności fluorescencji Fura-2, gdzie bardziej stromy nachylenie wskazuje na bardziej aktywny proces SOCE, a mniejsze nachylenie na mniej aktywny SOCE. Nachylenie spadku fluorescencji w komórkach traktowanych 2-APB okazało się znacznie mniejsze, co wskazuje, że aktywność SOCE została zablokowana przez ten związek. Szybkości wygaszania Mn²⁺ określono na podstawie zapisu z pierwszych 10 sekund, gdy wygaszanie znajdowało się jeszcze w zakresie liniowym, bez nasycenia.

Podobny test wygaszania Mn²⁺ przeprowadzono w mięśniu (Rys. 4.). W tym przypadku Mn²⁺ podano wraz z TG. Podczas gdy TG opróżniało zapasy Ca²⁺ w SR, nachylenie krzywej wygaszania fluorescencji stopniowo zmieniało się, aż osiągnęło maksymalną wartość. Krzywa sigmoidalna wskazuje na stopniową aktywację SOCE w tych warunkach eksperymentalnych.

Zdrowe, nienaruszone pojedyncze włókna mięśniowe w hodowli wykazywały wyraźne i jednolite prążkowanie, brak oznak zanieczyszczeń oraz brak oznak uszkodzeń wywołanych skurczem. Włókna te były zdolne do skurczu w odpowiedzi na stymulację elektryczną lub roztwory depolaryzujące. W obrazowaniu konfokalnym zatrzymanie barwnika Rhod-5N w przedziale TT w obranych włókien wykazało charakterystyczny dla ssaków wzór podwójny (wizualizowany w kanale czerwonym). Po załadowaniu SR barwnikiem Fluo-5N AM widoczny był typowy punktowy wzór SR (w kanale zielonym). Po perfuzji obranego włókna roztworem ładującym TT/SR intensywność fluorescencji zarówno Rhod-5N, jak i Fluo-5N wzrosła; po perfuzji roztworem wyczerpującym SR poziomy fluorescencji w przedziale SR i przedziale TT zaczęły spadać, co wskazuje odpowiednio na ścisłe sprzężenie między wyczerpaniem zapasów Ca²⁺ w SR a aktywacją SOCE (Rys. 5.).

Rycina 1. Aktywacja zależnego od zapasów napływu Ca²⁺ (SOCE). Orai1, jednostka tworząca por kanału, znajduje się w błonie komórkowej (PM), natomiast STIM1, sensor Ca²⁺, znajduje się w błonach retikulum endoplazmatycznego lub sarkoplazmatycznego (ER/SR). Gdy zapasy Ca²⁺ w ER/SR ulegają zmniejszeniu, albo w wyniku blokowania pompy Ca²⁺ ER/SR (SERCA), albo na skutek uwalniania Ca²⁺ przez receptor IP₃ lub receptor rjanodynowy, następuje aktywacja STIM1. Aktywowane cząsteczki STIM1 tworzą skupiska i indukują agregację Orai1, co prowadzi do aktywacji SOCE.

Rysunek 2. Pomiar wewnątrzkomórkowego Ca²⁺ w komórkach KYSE-150. Zamiana roztworu zewnątrzkomórkowego z 0 Ca²⁺ (0,5 mM EGTA) na 2 mM Ca²⁺ nie wywołała żadnej zmiany poziomu wewnątrzkomórkowego Ca²⁺. 5 μM TG w roztworze kąpieli z 0 Ca²⁺ wywołało pasywny uwalnianie Ca²⁺ z ER. Po wyczerpaniu zapasów Ca²⁺ w ER (>10 min), dodanie zewnątrzkomórkowego Ca²⁺ (2 mM) aktywowało trwały wzrost poziomu wewnątrzkomórkowego Ca²⁺ poprzez SOCE, który może zostać zablokowany przez inhibitory SOCE, np. skf-96365 i 2-APB (dane nie pokazano). Komórki transfektowane plazmidami zawierającymi shRNA specyficzne przeciwko orai1 (kolor czerwony) wykazały znacznie mniejszą aktywność SOCE niż komórki transfektowane sekwencją scramble (kolor czarny).

Rycina 3. Test wygaszania Mn²⁺ dla SOCE w komórkach KYSE-150. Wygaszanie fluorescencji Fura-2 przez Mn²⁺ (0.5 mM) mierzono przy niezależnej od Ca²⁺ długości fali wzbudzenia Fura-2 (360 nm). Komórki poddano działaniu 5 μM TG przez 10 min w celu całkowitego opróżnienia zapasów Ca²⁺ w ER. Nachylenie krzywej spadku fluorescencji Fura-2 po dodaniu Mn²⁺ (linie przerywane, w ciągu pierwszych 10 s) reprezentowało aktywację SOCE, wyrażoną jako procentowy spadek fluorescencji na jednostkę czasu (wartość początkowa jako 100%). Maksymalnie wygaszony sygnał fluorescencji ustalono na koniec eksperymentu poprzez lizę komórek z użyciem 0,1% Triton X-100 (jako 0%). Komórki traktowane 2-APB (75 μM) wykazały znacznie mniejszy kąt nachylenia krzywej, co sugeruje, że SOCE jest blokowane przez ten związek w komórkach KYSE-150.

Rysunek 4. Stopniowa aktywacja SOCE w komórkach mięśniowych ujawniona w teście wygaszania Mn²⁺. Aktywację SOCE można było zarejestrować podczas wyczerpywania zapasów Ca²⁺ w SR przez TG. Jednoczesne zastosowanie Mn²⁺ (0.5mM) i TG (20 μM) wywołało stopniowy i sigmoidalny spadek fluorescencji wewnątrzkomórkowej Fura-2 (cyjanowa przerywana linia wskazuje najszybszy punkt wygaszania), który różnił się od początkowej szybkości wygaszania Mn²⁺ (niebieska przerywana linia). Nachylenie krzywej wygaszania Mn²⁺ pozostało niemal na poziomie podstawowym w komórkach traktowanych 2-APB (75 μM), co sugeruje zahamowanie SOCE.

Rysunek 5. Rozdzielcza przestrzennie i czasowo odpowiedź SOCE w odsłoniętym włóknie mięśniowym. (A) Sól Rhod-5N została wprowadzona do TT, a Fluo-5N AM do SR. (B) Po zastosowaniu roztworu do deplecji Ca²⁺, fluorescencja w przedziałach TT i SR uległa zmniejszeniu. Spadek fluorescencji Fluo-5N wskazywał na szybkie uwalnianie zawartości Ca²⁺ z SR, a spadek fluorescencji Rhod-5N sugerował aktywację SOCE.

Dyskusja

Chociaż długości fal wzbudzenia dla Fura-2 związanego z Ca²⁺ i wolnego od Ca²⁺ wynoszą odpowiednio 340 nm i 380 nm, najlepszy zakres dynamiczny stosunku Fura-2 do pomiaru stężenia Ca²⁺ może występować przy innych długościach fal w konkretnym systemie mikroskopowym. Takie przesunięcia długości fal wynikają zazwyczaj ze zmian w drodze optycznej po dodaniu różnych komponentów optycznych. W niniejszym badaniu długości fal wzbudzenia dla Fura-2 określono jako 350 nm i 390 nm, wykonując analizę widmową fluorescencji Fura-2.

Wewnątrzkomórkowy poziom Ca²⁺ w cytozolu wynika z równowagi między kilkoma źródłami, w tym uwalnianiem Ca²⁺ z wnętrza komórki, napływem Ca²⁺ z zewnątrz oraz mechanizmami usuwania Ca²⁺ przez retikulum endoplazmatyczne (ER) i błonę komórkową. Aby wyizolować jednokierunkowy napływ Ca²⁺ zależny od SOC od uwalniania Ca²⁺ z wewnątrzkomórkowych magazynów i usuwania Ca²⁺ z komórki, można zastosować test wygaszania fluorescencji przez Mn²⁺. Znane jest, że Mn²⁺ może przenikać do komórek poprzez SOCE, lecz nie jest usuwany przez błonę komórkową ani pobierany do ER przez pompy Ca²⁺. Zatem wygaszanie fluorescencji stanowi pomiar jednokierunkowego strumienia Mn²⁺ do wnętrza komórek, co pozwala oszacować stopień aktywacji SOCE. Test wygaszania przez Mn²⁺ przeprowadza się w punkcie izobestycznym, czyli przy takiej długości fali, przy której intensywność fluorescencji Fura-2 jest niezależna od stężenia Ca²⁺. Punkt izobestyczny dla każdego układu należy wyznaczyć poprzez skanowanie widma. Alternatywnie wygaszanie przez Mn²⁺ można rejestrować poprzez korektę fluorescencji przy dowolnych dwóch długościach fali w taki sposób, aby wartość końcowa była niezależna od stężenia Ca²⁺¹³.

Aby uzyskać informacje przestrzenne i czasowe na temat aktywności SOCE w mięśniach szkieletowych, zastosowano metodę z użyciem dwóch barwników, która umożliwia jednoczesny pomiar aktywności SOCE oraz zawartości Ca²⁺ w SR w odsłonionych włóknach mięśnia EDL dorosłych ssaków. Korelację między zmianami zawartości Ca²⁺ w SR a aktywnością SOCE można przedstawić na wykresie, aby wskazać próg i czułość aktywacji SOCE w odpowiedzi na wyczerpanie zapasów Ca²⁺ w SR. Roztwór do ładowania TT został zoptymalizowany pod kątem dodatkowego nasycenia kanalików T jonami Ca²⁺ oraz ich przygotowania (primingu), natomiast roztwór do ładowania SR został zaprojektowany tak, aby promować maksymalne ładowanie SR jonami Ca²⁺ i dodatkowo nasycić kanalik T stężeniem ~500 μM Ca²⁺. Do roztworu do ładowania TT/SR oraz roztworu do wyczerpywania SR dodano FCCP, aby wyeliminować wpływ mitochondriów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
RPMI 1640	Mediatech	10-040-CV
Ham's F-12	Mediatech	10-080-CV
DMEM	Mediatech	10-013-CV
Szalki z dnem szklanym	MatTek	P35G-1.5-14-C
Fura-2 AM	Invitrogen (Molecular Probes)	F1221	-20 °C, szczelnie zamknięte, chronione przed światłem, rozpuszczone w DMSO
Fluo-5N AM	Invitrogen (Molecular Probes)	F14204	-20 °C, szczelnie zamknięte, chronione przed światłem
Rhod-5N	Invitrogen (Molecular Probes)	R14207	-20 °C, szczelnie zamknięte, chronione przed światłem
Kuweta kwarcowa	Starna Cells	3-Q-10
tapsigargin	Tocris	1138
2-amin–toksy-diphenylboran (2-APB)	Tocris	1224
N-benzylo-p-toluenosulfonamid (BTS)	Sigma-Aldrich	435600
Kollagenaza typu I	Sigma	C0130
Sprzęt:
Spektrofluorometr (Photon Technology International, NJ): lampa ksenonowa, sterowany komputerowo szybki monochromator z dostępem swobodnym, monochromator emisji oparty na kuwecie, odwrócony mikroskop fluorescencyjny Nikon TE-200, obiektyw olejowy S Fluor 40x/1.30, detektory PMT. Konfokalny mikroskop skaningowy (BioRad Radiance2100): laser argonowy 453/477/488/514, laser HeNe 543nm, odwrócony mikroskop Nikon TE2000, obiektyw 60X (N.A. 1.4, olejowy). Stereomikroskop o powiększeniu > 100 (Zeiss Stemi SV11 Apo).