Pomiar wewnątrzkomórkowego napływu wapnia sterowanego zapasami w żywych komórkach z wykorzystaniem fluorescencji: od hodowlanych komórek nowotworowych po włókna mięśni szkieletowych

Podsumowanie

Zakres wlotu Ca²⁺ zależnego od zapasów (SOCE) można monitorować przy użyciu fluorescencyjnych wskaźników Ca²⁺. Wygaszanie tych wskaźników przez Mn²⁺ pozwala na badanie SOCE w hodowlach komórkowych i włóknach mięśni szkieletowych. Opisano również technikę umożliwiającą rozdzielczość przestrzenną i czasową SOCE poprzez obrazowanie konfokalne mechanicznie odskórkowanych włókien mięśniowych.

Streszczenie

Wjazd Ca²⁺ zależny od magazynów (SOCE), wcześniej określany jako wjazd Ca²⁺ pojemnościowy, jest ściśle regulowanym mechanizmem napływu zewnątrzkomórkowego Ca²⁺ do komórek w celu uzupełnienia wyczerpanych zapasów Ca²⁺ w retikulum endoplazmatycznym (ER) lub retikulum sarkoplazmatycznym (SR)^1,2. Ponieważ Ca²⁺ jest powszechnym wtórnym przekaźnikiem, nie jest zaskakujące, że SOCE odgrywa istotną rolę w wielu procesach komórkowych, w tym w proliferacji, apoptozie, transkrypcji genów i motoryce. Ze względu na jego szerokie występowanie w niemal wszystkich typach komórek, w tym w komórkach nabłonkowych i mięśniach szkieletowych, ścieżka ta wzbudziła duże zainteresowanie^3,4. Jednakże heterogeniczność charakterystyki SOCE w różnych typach komórek oraz jego funkcja fizjologiczna nie są jeszcze w pełni wyjaśnione^5-7.

Funkcjonalne właściwości kanałów SOCE można ujawnić za pomocą badań metodą patch-clamp, natomiast obszerna wiedza na temat tej ścieżki została zdobyta dzięki pomiarom wewnątrzkomórkowego Ca²⁺ opartym na fluorescencji, ze względu na wygodę i możliwość prowadzenia wysokoprzepustowych przesiewów. Celem niniejszego raportu jest podsumowanie kilku metod opartych na fluorescencji służących do pomiaru aktywacji SOCE w komórkach w monowarstwie, komórkach w zawiesinie oraz w włóknach mięśniowych^5,8-10. Najczęściej stosowaną z tych metod fluorescencyjnych jest bezpośrednie monitorowanie dynamiki wewnątrzkomórkowego Ca²⁺ z wykorzystaniem stosunku F_340nm do F_380nm (długość fali emisji 510 nm) ratiometrycznego wskaźnika Ca²⁺ Fura-2. W celu wyizolowania aktywności jednokierunkowego SOCE od wewnątrzkomórkowego uwalniania Ca²⁺ i usuwania Ca²⁺ na zewnątrz komórki, często stosuje się test wygaszania Mn²⁺. Znane jest, że Mn²⁺ może przenikać do komórek poprzez SOCE, podczas gdy jest on nieprzepuszczalny dla procesów usuwania przez błonę powierzchniową lub pochłaniania przez ER za pomocą pomp Ca²⁺ ze względu na bardzo wysokie powinowactwo do Fura-2. W rezultacie wygaszanie fluorescencji Fura-2 wywołane przedostawaniem się zewnątrzkomórkowego Mn²⁺ do komórek stanowi pomiar aktywności SOCE⁹. Pomiary ratiometryczne oraz testy wygaszania Mn⁺² można przeprowadzać na spektrofluorometrze z kuwetą w trybie populacyjnym lub w systemie opartym na mikroskopie w celu wizualizacji pojedynczych komórek. Zaletą pomiarów pojedynczych komórek jest możliwość wyselekcjonowania za pomocą reporterów GFP lub RFP poszczególnych komórek poddanych manipulacjom genetycznym, co pozwala na badania w komórkach genetycznie zmodyfikowanych lub zmutowanych. Charakterystyka czasowo-przestrzenna SOCE w strukturalnie wyspecjalizowanych mięśniach szkieletowych może zostać uzyskana w preparatach włókien mięśniowych z usuniętą błoną komórkową (skinned muscle fibers) poprzez jednoczesne monitorowanie fluorescencji dwóch wskaźników Ca²⁺ o niskim powinowactwie, ukierunkowanych na konkretne przedziały włókna mięśniowego, takich jak Fluo-5N w SR i Rhod-5N w kanalikach poprzecznych^9,11,12.

Protokół

1. Pomiar wewnątrzkomórkowego poziomu Ca²⁺ dla pojedynczych komórek

1. Linia komórkowa KYSE-150, pochodząca z raka płaskonabłonkowego przełyku u człowieka (ECSS), jest hodowana w atmosferze 5% CO₂ w temperaturze 37°C w mieszanej pożywce RPMI 1640/Ham's F-12 (1:1) zawierającej 5% płatkowej surowicy bydlęcej.
2. Komórki KYSE-150 są transfekowane plazmidami zawierającymi shRNA specyficzne przeciwko Orai1 lub sekwencję zakodowaną losowo (scrambled). Plazmidy zawierają również gen kodujący czerwone białko fluorescencyjne (RFP) jako reporter, sterowany przez oddzielny promotor.
3. Komórki są hodowane przez 48 godzin w naczyniach z szklanym dnem (szkiełko zakrywe nr 1.5, MatTek, MA).
4. Usunięto pożywkę i przemyto komórki zrównoważonym roztworem soli (BSS) (140 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂, 10 mM HEPES, pH 7.2).
5. Do naczynia dodano 1 ml roztworu BSS zawierającego 2 μM ester acetometylowy Fura-2 (Molecular Probes), a następnie owinięto całe naczynie folią w celu ochrony przed światłem.
6. Inkubowano komórki przez 40 min w temperaturze 37°C, a następnie pozostawiono je na dodatkowe 15 min w temperaturze pokojowej, aby umożliwić całkowitą hydrolizę estru. Komórki przemyto dwukrotnie roztworem BSS.
7. Naczynie umieszczono na stoliku odwróconego mikroskopu Nikon TE200, połączonego ze spektrofluorometrem PTI, z długościami fal wzbudzenia 350 i 390 nm oraz emisją przy 510 nm. Dokładne długości fal wzbudzenia mogą się nieznacznie różnić w zależności od optyki każdego systemu. Dwie długości fal o najlepszej dynamice stosunku wyznacza się poprzez skanowanie widma wzbudzenia soli Fura-2 w roztworach zawierających Ca²⁺ w zakresie od 0 do 39.8 μM (lub wyższe stężenie, przy którym fluorescencja Fura-2 jest nasycona).
8. Przygotowano grawitacyjny system perfuzyjny z czterema różnymi roztworami w BSS: Ca²⁺ (2 mM), EGTA (0.5 mM), EGTA-TG (tapsygargina, 5 μM), Ca²⁺-2-APB (inhibitor SOCE, 75 μM). Można również stosować komputerowo sterowane zautomatyzowane systemy perfuzyjne.
9. W trybie wizualizacji wybrano komórki wykazujące ekspresję RFP.
10. Przy powiększeniu 10x ustawiono końcówkę wlotową systemu perfuzyjnego pod kątem 45 stopni, bezpośrednio nad obszarem zainteresowania.
11. Jednocześnie rejestrowano sygnały fluorescencji F_350nm i F_390nm. Stosunek (F_350nm/F_390nm) wyświetlany jest w trzecim oknie. Zmieniano roztwory perfuzyjne w następującej kolejności: Ca²⁺; EGTA; Ca²⁺; EGTA-TG; Ca²⁺; Ca²⁺-2-APB.

Powyższy protokół można zmodyfikować w celu pomiaru wewnątrzkomórkowego stężenia Ca²⁺ w systemie zawiesiny komórkowej.

12. Hodować komórki KYSE-150 w kolbie T25 w tych samych warunkach hodowli, co powyżej.
13. Po osiągnięciu przez komórki 90% konfluencji, usunąć medium i wypłukać komórki roztworem BSS.
14. Dodać 2,5 ml roztworu BSS zawierającego 2 μM Fura-2 AM i inkubować komórki przez 40 min w 37°C, a następnie przeprowadzić deestryfikację.
15. Usunąć BSS, dodać do kolby 2,5 ml trypsyny i inkubować w 37°C do czasu odklejenia się komórek. Następnie dodać 2,5 ml medium hodowlanego, aby zatrzymać trypsynizację, i zebrać komórki poprzez wirowanie przy 800 rpm przez 5 min.
16. Przemyć komórki medium hodowlanym jeszcze raz poprzez wirowanie i zawiesić osad komórkowy w roztworze BSS (bez dodatku 2 mM CaCl₂, zawierającym Ca²⁺ w zakresie μM), a następnie policzyć komórki za pomocą hematometru.
17. Przenieść ~10⁶ komórek do kuwety kwarcowej (10 mm, Starna Cells) i dopełnić objętość do 2 ml roztworem BSS.
18. Umieścić kuwetę (mieszając za pomocą mieszadła magnetycznego) w spektrofluorometrze.
19. Jednocześnie rejestrować sygnały fluorescencji F_340nm i F_380nm z długością fali emisji 510 nm. Protokół pomiarowy obejmuje: BSS, dodanie 0,5 μl EGTA (stok 0,25 M), dodanie 1 μl tapsygarginy (TG, stok 10 mM), dodanie 4 μl Ca²⁺ (stok 1 M).

2. Test wygaszania Mn w hodowlach komórkowych

1. Przeprowadź skanowanie długości fali wzbudzenia Fura-2 w roztworach o różnych stężeniach Ca²⁺ w zakresie od 0 do 39,8 μM, aby wyznaczyć niezależną od stężenia wapnia długość fali jako punkt izosbestyczny. Zazwyczaj punkt izosbestyczny znajduje się w okolicy 360 nm.
2. Komórki KYSE-150 hoduje się w naczyniach z szklanym dnem i obciąża barwnikiem Fura-2 AM.
3. Przygotuj system perfuzyjny z 5 różnymi roztworami BSS: Ca²⁺ (2 mM), EGTA/TG (odpowiednio 0,5 mM i 5 μM), Mn²⁺ (0,5 mM, bez dodatku EGTA lub Ca²⁺, zawierający wolny Ca²⁺ w zakresie μM), Mn²⁺/2-APB (75 μM), EGTA/Triton X-100 (0,1%).
4. Umieść naczynie na stoliku mikroskopu i wybierz tryb „Excitation Ratio” z długościami fali wzbudzenia 360 nm i 390 nm oraz emisją przy 510 nm.
5. Równocześnie rejestruj sygnały fluorescencji F_360nm i F_390nm, wyświetlając stosunek (F_360nm/F_390nm) w trzecim oknie. Protokół pomiarowy jest następujący: Ca²⁺ przez 1 min w celu stabilizacji fluorescencji, Mn²⁺ przez 30 s, EGTA/TG przez 10 min, Mn²⁺ przez 2 min, EGTA-Triton X-100 (0,1%) przez 1 min w celu uzyskania odczytu tła. Zamiast Mn²⁺ można zastosować roztwór Mn²⁺/2-APB, aby zbadać zniesienie wygaszania fluorescencji, co wskazuje, że wnikanie Mn²⁺ odbywa się poprzez szlak SOCE.

3. Analiza wygaszania przez Mn w komórkach mięśniowych

1. Linia komórkowa mięśni szkieletowych myszy C2C12 jest hodowana na naczyniach z szklanym dnem w atmosferze 5% CO₂ w temperaturze 37°C w pośrodku DMEM zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 10% surowicy konia.
2. Po osiągnięciu przez komórki pełnej konfluencji, pożywkę hodowlaną należy zmienić na pożywkę różnicującą (usunąć płodową surowicę bydlęcą i zmniejszyć stężenie surowicy konia do 2,5%). Mioblasty C2C12 zróżnicują się w miotuby po 4 dniach.
3. Miotuby C2C12 należy załadować Fura-2 AM w końcowym stężeniu 5 μM zgodnie z opisem w punktach 1.4-1.6.
4. Należy dodać N-benzylo-p-toluenosulfonamid (BTS) w końcowym stężeniu 20 μM w celu zahamowania skurczów mięśni oraz związanych z nimi artefaktów ruchowych; przed rozpoczęciem eksperymentu należy odczekać 15 min.
5. Naczynie należy umieścić na stoliku mikroskopu połączonego z urządzeniem PTI i wprowadzić do systemu perfuzji następujące roztwory BSS: 2 Ca²⁺ (2 mM), 0 Ca²⁺, Mn²⁺ (0,5 mM) oraz Mn²⁺/TG (odpowiednio 0,5 mM i 20 μM).
6. System perfuzji należy skonfigurować zgodnie z powyższym opisem.
7. Należy jednocześnie rejestrować sygnały fluorescencji F_360nm i F_390nm, wyświetlając stosunek (F_360nm/F_390nm) w trzecim oknie. Protokół pomiarowy obejmuje: 2 Ca²⁺ przez 1 min, 0 Ca²⁺ przez 1 min w celu wypłukania Ca²⁺, Mn²⁺ przez 0,5 min, Mn²⁺/TG przez 10 min oraz Mn²⁺/EGTA-Triton X-100 (0,1%).

4. Przestrzennie i czasowo rozdzielony SOCE w odskórkowanych włóknach mięśniowych

1. Przygotuj następujące roztwory.
   Izotoniczny bufor Tyrode'a: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl₂, 2.5 mM CaCl₂, pH 7.2, 290 mosm
   Pożywka hodowlana: DMEM z 2% surowicy koni i 1% penicyliny oraz streptomycyny
   Roztwór płuczący nr 1: 109.6 mM K-glutaminianu, 2 mM EGTA-KOH, 6.7 mM MgCl₂, 2 mM ATP, 6 mM fosforanu kreatyny (CP), 20 mM N,N-bis(2-hydroksyetyl)-2-aminoetanosulfonowego kwasu (BES)-KOH, pH 7.0
   Roztwór płuczący nr 2: 140 mM K-glutaminianu, 5 mM EGTA-KOH, 6.5 mM MgCl₂, 2 mM ATP, 6 mM CP, 20 mM BES-KOH, pH 7.0
   Roztwór do skinningu: 140 mM K-glutaminianu, 6.5 mM MgCl₂, 2 mM ATP, 6 mM CP, 20 mM BES-KOH, pH 7.0
   Roztwór do ładowania TT: 90.6 mM K-glutaminianu, 18 mM Na-glutaminianu, 0.55 mM CaCl₂, 2 mM EGTA-KOH, 6.7 mM MgCl₂, 5.4 mM ATP, 15 mM CP, 0.0025 mg/ml kinazy kreatynowej (CK), 20 mM BES-KOH, 5 μM cyjanorku karbonylowego p-trifluorometoksyfenylohydrazonu (FCCP), pH 7.0, pCa 7.0
   Roztwór do ładowania SR: 107.8 mM K-glutaminianu, 0.98 mM CaCl₂, 2 mM EGTA-KOH, 6.6 mM MgCl₂, 5.4 mM ATP, 15 mM CP, 0.0025 mg/ml CK, 20 mM BES-KOH, 5 μM FCCP, pH 7.0, pCa 6.6
   Roztwór do opróżniania SR: 100 mM K-glutaminianu, 40 mM Na-glutaminianu, 10 mM EGTA-KOH, 10 mM kwasu 1,2-bis(o-aminofenoksy)etan-N,N,N',N'-tetraoctowego (BAPTA), 0.35 mM MgCl₂, 0.5 mM ATP, 1 mM CP, 20 mM BES-KOH, 5 μM FCCP, pH 7.0. Przed eksperymentami dodaje się 25 mM kofeiny/20 μM tapsygarginy (TG).
2. Aby wypreparować mięsień prostownika palców długiego (EDL), najpierw ułóż myszy i ustaw nogę w pozycji bocznej, następnie usuń skórę z obszaru kostki aż do kolana, przetnij powierzchowne warstwy mięśni tkanki, aby odsłonić EDL, i przetnij oba ścięgna (górne i dolne), aby uwolnić nienaruszony mięsień EDL; ważne jest, aby zachować ścięgna tak długie, jak to możliwe. Mięsień EDL przenosi się do roztworu Tyrode'a zawierającego 0 Ca²⁺ i 0.1 mM EGTA, aby zapobiec jakimkolwiek skurczom.
3. Pod stereomikroskopem, używając dwóch pęset, chwyć dolne ścięgna przyczepu i podziel mięsień EDL na dwa pęki. Powtórz ten proces, aby uzyskać 4, a następnie 8 pęków. Kluczowe jest, aby na koniec procesu każdy z 8 pęków posiadał ścięgna. Jeśli zostaną one utracone w niektórych pękach, należy je odrzucić.
4. Pod stereomikroskopem każdy pasek pęka EDL chwyta się za oba ścięgna i ostrożnie rozciąga, aż pozostaną nienaruszone 3~4 pojedyncze włókna mięśniowe ze ścięgnami po obu stronach.
5. Nanieś 1 kroplę buforu Tyrode'a pozbawionego Ca²⁺ na środek szalki z szklanym dnem, ułóż paski EDL prosto na szalce, szybko usuń jak największą ilość roztworu, a następnie przymocuj oba ścięgna za pomocą wodoodpornej taśmy klejącej, upewniając się, że taśma przylega ściśle. Przemyj włókno najpierw roztworem 0 Ca²⁺, a następnie dwukrotnie roztworem 2.5 mM Ca²⁺. Jeśli włókno ulegnie hiperkontrakcji i zauważone zostaną uszkodzenia, należy je odrzucić.
6. W razie potrzeby włókno może być hodowane przez maksymalnie 96 godzin, co pozwala na manipulacje genetyczne. Przemyj włókno 3 razy pełną pożywką hodowlaną i dodaj do szalki 2 ml pożywki, a następnie umieść w inkubatorze w temperaturze 37°C i przy 5% CO₂. Przed każdym eksperymentem zbadaj włókna mięśniowe i odrzuć te bez wyraźnego prążkowania, z oznakami kontaminacji lub z oznakami uszkodzeń, takimi jak kurczenie się błony sarkolemmalnej. Dobre włókna reagują na KCl, stymulację elektryczną i stymulację kofeiną.
7. Pojedyncze włókna mięśniowe przemywa się 3 razy roztworem płuczącym nr 1 i inkubuje w przypominającym wewnątrzkomórkowy roztworze do skinningu z 500 μM Rhod-5N i 0.5 mM Ca²⁺ przez 5 min.
8. Używając igły wolframowej przymocowanej do uchwytu, wykonaj mechaniczny skinning włókna pod stereomikroskopem, umożliwiając automatyczne zamknięcie kanalików poprzecznych (TT) i uwięzienie w TT Rhod-5N sprzężonego z Ca²⁺; przemyj wyskinowane włókna dwukrotnie roztworem płuczącym nr 2. Proces mechanicznego skinningu jest optymalny, gdy podczas procesu usuwane jest mniej niż 25% szerokości komórki.
9. Aby załadować SR, wyskinowane włókna inkubuje się z roztworem do skinningu zawierającym 20 μM Fluo-5N AM przez 1 h w temperaturze pokojowej, a następnie wykonuje się obfite płukanie roztworem płuczącym nr 2 i inkubuje przez dodatkowe 30 min, aby umożliwić całkowitą deestryfikację barwnika.
10. Po 30 min wyskinowane włókna są wizualizowane pod obiektywem 60X mikroskopu konfokalnego. Obrazy fluorescencyjne są pozyskiwane przy długościach fal odpowiadających danym barwnikom (wzbudzenie przy 543 nm i emisja powyżej 570 nm dla Rhod-5N; wzbudzenie przy 488 nm i emisja przy 530-560 nm dla Fluo-5N). Dla obszarów załadowanych każdym z barwników wybierane są interesujące obszary (ROI).
11. Protokół doświadczalny przebiega następująco: roztwór do ładowania TT przez 120 s, roztwór do ładowania SR przez 120 s, roztwór do opróżniania SR przez 400-750 s w celu opróżnienia zapasów Ca²⁺ w SR. Podczas tego procesu rejestrowane są zmiany intensywności Rhod-5N (Ca²⁺ w TT) oraz intensywności Fluo-5N (Ca²⁺ w SR), co pozwala na określenie przebiegu czasowego względnych zmian fluorescencji w TT i SR. Dalej analizowane są średnie wartości intensywności fluorescencji z wielu włókien. Maksymalna intensywność ładowania na koniec etapu ładowania TT/SR jest normalizowana do 100%.

5. Reprezentatywne wyniki

Zbadaliśmy aktywność SOCE w komórkach KYSE-150, mierząc stężenie wewnątrzkomórkowego Ca²⁺ (Rys. 2.). Wykorzystując RFP jako reporter, mogliśmy wyselekcjonować poszczególne komórki przetransfekowane plazmidem zawierającym specyficzne shRNA przeciwko orai1, genowi kodującemu kanał SOCE. W porównaniu z komórkami przetransfekowanymi plazmidami zawierającymi kontrolne shRNA (scramble) (czarna linia), wyciszenie białka Orai1 skutkuje zmniejszeniem aktywności SOCE (czerwona linia).

SOCE w komórkach KYSE-150 potwierdzono również za pomocą testu wygaszania Mn²⁺ (Rys. 3.). Długość fali wzbudzenia 360 nm odpowiada punktowi izobestycznemu Fura-2, w którym fluorescencja jest niezależna od stężenia Ca²⁺. Po całkowitym wyczerpaniu zapasów Ca²⁺ w ER przez TG, perfuzja Mn²⁺ spowodowała znaczny spadek fluorescencji. Całkowitą aktywność SOCE można zmierzyć na podstawie szybkości spadku intensywności fluorescencji Fura-2, gdzie bardziej strome nachylenie wskazuje na bardziej aktywny SOCE, natomiast mniejsze nachylenie oznacza mniej aktywny SOCE. Nachylenie spadku fluorescencji w komórkach traktowanych 2-APB okazało się znacznie mniejsze, co wskazuje, że aktywność SOCE została zablokowana przez ten związek. Szybkości wygaszania Mn²⁺ określono na podstawie zapisu z pierwszych 10 sekund, w których wygaszanie znajdowało się nadal w zakresie liniowym bez nasycenia.

Podobny test wygaszania fluorescencji przez Mn²⁺ przeprowadzono w mięśniu (Rys. 4). W tym przypadku Mn²⁺ podano wraz z TG. Podczas gdy TG opróżniało zapasy Ca²⁺ w SR, nachylenie krzywej wygaszania fluorescencji stopniowo zmieniało się, aż osiągnęło wartość maksymalną. Krzywa sigmoidalna wskazuje na stopniową aktywację SOCE w tych warunkach eksperymentalnych.

Zdrowe, nienaruszone pojedyncze włókna mięśniowe w hodowli wykazywały wyraźne i jednorodne prążkowanie, brak oznak zanieczyszczeń oraz brak oznak uszkodzeń wywołanych skurczem. Włókna te były zdolne do skurczu w odpowiedzi na stymulację elektryczną lub roztwory depolaryzujące. W obrazowaniu konfokalnym uwięzienie barwnika Rhod-5N w przedziale TT w obrąbbranym włókna wykazało charakterystyczny dla ssaków wzór podwójny (zwizualizowany w kanale czerwonym). Po załadowaniu SR barwnikiem Fluo-5N AM widoczny był typowy dla SR wzór punktowy (w kanale zielonym). Po perfuzji obrąbbranego włókna roztworem do ładowania TT/SR natężenie fluorescencji zarówno Rhod-5N, jak i Fluo-5N wzrosło; po perfuzji roztworem do opróżniania SR poziomy fluorescencji w przedziale SR i przedziale TT zaczęły spadać, co wskazuje na ścisłe powiązanie między opróżnianiem zapasów Ca²⁺ w SR a aktywacją SOCE (Rys. 5.).

Rycina 1. Aktywacja wewnątrzkomórkowego napływu Ca²⁺ zależnego od zapasów (SOCE). Orai1, jednostka tworząca por kanału, znajduje się w błonie plazmatycznej (PM), natomiast STIM1, sensor Ca²⁺, znajduje się w błonach retikulum endoplazmatycznego lub sarkoplazmatycznego (ER/SR). Gdy zapasy Ca²⁺ w ER/SR ulegają zmniejszeniu, albo w wyniku zablokowania pompy Ca²⁺ ER/SR (SERCA), albo w wyniku uwalniania Ca²⁺ przez receptor IP₃ lub receptor ryzodynowy, następuje aktywacja STIM1. Aktywowane cząsteczki STIM1 tworzą skupiska i indukują agregację Orai1, co w dalszej kolejności prowadzi do aktywacji SOCE.

Rycina 2. Pomiar wewnątrzkomórkowego Ca²⁺ w komórkach KYSE-150. Wymiana roztworu zewnątrzkomórkowego z 0 Ca²⁺ (0,5 mM EGTA) na 2 mM Ca²⁺ nie wywołała żadnej zmiany poziomu wewnątrzkomórkowego Ca²⁺. 5 μM TG w roztworze kąpieli z 0 Ca²⁺ wywołało pasywne uwalnianie Ca²⁺ z ER. Po wyczerpaniu zapasów Ca²⁺ w ER (>10 min), dodanie zewnątrzkomórkowego Ca²⁺ (2 mM) aktywowało trwały wzrost wewnątrzkomórkowego Ca²⁺ poprzez SOCE, który może być blokowany przez inhibitory SOCE, np. skf-96365 i 2-APB (dane niepokazane). Komórki transfekowane plazmidami zawierającymi shRNA specyficzne przeciwko orai1 (kolor czerwony) wykazały znacznie zredukowane SOCE w porównaniu do komórek transfekowanych sekwencją kontrolną (scramble, kolor czarny).

Rysunek 3. Test wygaszania Mn²⁺ dla SOCE w komórkach KYSE-150. Wygaszanie fluorescencji Fura-2 przez Mn²⁺ (0,5 mM) mierzono przy niezależnej od Ca²⁺ długości fali wzbudzenia Fura-2 (360 nm). Komórki traktowano 5 μM TG przez 10 min w celu całkowitego wyczerpania zapasów Ca²⁺ w ER. Nachylenie krzywej spadku fluorescencji Fura-2 po dodaniu Mn²⁺ (linie przerywane, w ciągu pierwszych 10 s) reprezentowało aktywację SOCE, wyrażoną jako procentowy spadek fluorescencji na jednostkę czasu (wartość początkowa jako 100%). Maksymalnie wygaszony sygnał fluorescencji ustalono na koniec eksperymentu poprzez lizę komórek przy użyciu 0,1% Triton X-100 (jako 0%). Komórki traktowane 2-APB (75 μM) wykazały znacznie mniejsze nachylenie, co sugeruje, że SOCE jest blokowany przez ten związek w komórkach KYSE-150.

Rycina 4. Stopniowana aktywacja SOCE w komórkach mięśniowych ujawniona za pomocą testu gaszenia Mn²⁺. Aktywację SOCE można było zarejestrować podczas opróżniania zapasów Ca²⁺ z SR przez TG. Jednoczesne zastosowanie Mn²⁺ (0.5mM) i TG (20 μM) wywołało stopniowy i sigmoidalny spadek wewnątrzkomórkowej fluorescencji Fura-2 (cyjanowa linia przerywana wskazuje najszybszy punkt gaszenia), który różnił się od początkowego tempa gaszenia przez Mn²⁺ (niebieska linia przerywana). Nachylenie krzywej gaszenia Mn²⁺ pozostało niemal na poziomie podstawowym w komórkach traktowanych 2-APB (75 μM), co sugeruje zahamowanie SOCE.

Rysunek 5. Rozdzielone przestrzennie i czasowo SOCE w pozbawionej błony komórkowej włóknie mięśniowym. (A) Do kanalików poprzecznych (TT) wprowadzono sól Rhod-5N, a do siateczki śródplazmatycznej (SR) wprowadzono Fluo-5N AM. (B) Po zastosowaniu roztworu do deplecji Ca²⁺ fluorescencja w obu przedziałach (TT i SR) uległa zmniejszeniu. Spadek fluorescencji Fluo-5N wskazywał na szybkie uwalnianie zawartości Ca²⁺ z SR, a spadek fluorescencji Rhod-5N sugerował aktywację SOCE.

Dyskusja

Chociaż długości fal wzbudzenia dla Fura-2 związanego z Ca²⁺ i wolnego od Ca²⁺ wynoszą odpowiednio 340 nm i 380 nm, najlepszy zakres dynamiczny stosunku Fura-2 do pomiaru stężenia Ca²⁺ może występować przy innych długościach fal w konkretnym systemie mikroskopowym. Takie przesunięcia długości fal wynikają zazwyczaj ze zmian w drodze optycznej po dodaniu różnych komponentów optycznych. W niniejszym badaniu długości fal wzbudzenia dla Fura-2 określono jako 350 nm i 390 nm, wykonując analizę widmową fluorescencji Fura-2.

Wewnątrzkomórkowy poziom Ca²⁺ w cytozolu wynika z równowagi między kilkoma źródłami, w tym uwalnianiem Ca²⁺ z wnętrza komórki, napływem Ca²⁺ z zewnątrz oraz mechanizmami usuwania Ca²⁺ przez retikulum endoplazmatyczne (ER) i błonę komórkową. Aby wyizolować jednokierunkowy napływ Ca²⁺ zależny od SOC od uwalniania Ca²⁺ z wewnątrzkomórkowych magazynów i usuwania Ca²⁺ z komórki, można zastosować test wygaszania fluorescencji przez Mn²⁺. Znane jest, że Mn²⁺ może przenikać do komórek poprzez SOCE, lecz nie jest usuwany przez błonę komórkową ani pobierany do ER przez pompy Ca²⁺. Zatem wygaszanie fluorescencji stanowi pomiar jednokierunkowego strumienia Mn²⁺ do wnętrza komórek, co pozwala oszacować stopień aktywacji SOCE. Test wygaszania przez Mn²⁺ przeprowadza się w punkcie izobestycznym, czyli przy takiej długości fali, przy której intensywność fluorescencji Fura-2 jest niezależna od stężenia Ca²⁺. Punkt izobestyczny dla każdego układu należy wyznaczyć poprzez skanowanie widma. Alternatywnie wygaszanie przez Mn²⁺ można rejestrować poprzez korektę fluorescencji przy dowolnych dwóch długościach fali w taki sposób, aby wartość końcowa była niezależna od stężenia Ca²⁺¹³.

Aby uzyskać informacje przestrzenne i czasowe na temat aktywności SOCE w mięśniach szkieletowych, zastosowano metodę z użyciem dwóch barwników, która umożliwia jednoczesny pomiar aktywności SOCE oraz zawartości Ca²⁺ w SR w odsłonionych włóknach mięśnia EDL dorosłych ssaków. Korelację między zmianami zawartości Ca²⁺ w SR a aktywnością SOCE można przedstawić na wykresie, aby wskazać próg i czułość aktywacji SOCE w odpowiedzi na wyczerpanie zapasów Ca²⁺ w SR. Roztwór do ładowania TT został zoptymalizowany pod kątem dodatkowego nasycenia kanalików T jonami Ca²⁺ oraz ich przygotowania (primingu), natomiast roztwór do ładowania SR został zaprojektowany tak, aby promować maksymalne ładowanie SR jonami Ca²⁺ i dodatkowo nasycić kanalik T stężeniem ~500 μM Ca²⁺. Do roztworu do ładowania TT/SR oraz roztworu do wyczerpywania SR dodano FCCP, aby wyeliminować wpływ mitochondriów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
RPMI 1640	Mediatech	10-040-CV
Ham's F-12	Mediatech	10-080-CV
DMEM	Mediatech	10-013-CV
Szalki z dnem szklanym	MatTek	P35G-1.5-14-C
Fura-2 AM	Invitrogen (Molecular Probes)	F1221	-20 °C, szczelnie zamknięte, chronione przed światłem, rozpuszczone w DMSO
Fluo-5N AM	Invitrogen (Molecular Probes)	F14204	-20 °C, szczelnie zamknięte, chronione przed światłem
Rhod-5N	Invitrogen (Molecular Probes)	R14207	-20 °C, szczelnie zamknięte, chronione przed światłem
Kuweta kwarcowa	Starna Cells	3-Q-10
tapsigargin	Tocris	1138
2-amin–toksy-diphenylboran (2-APB)	Tocris	1224
N-benzylo-p-toluenosulfonamid (BTS)	Sigma-Aldrich	435600
Kollagenaza typu I	Sigma	C0130
Sprzęt:
Spektrofluorometr (Photon Technology International, NJ): lampa ksenonowa, sterowany komputerowo szybki monochromator z dostępem swobodnym, monochromator emisji oparty na kuwecie, odwrócony mikroskop fluorescencyjny Nikon TE-200, obiektyw olejowy S Fluor 40x/1.30, detektory PMT. Konfokalny mikroskop skaningowy (BioRad Radiance2100): laser argonowy 453/477/488/514, laser HeNe 543nm, odwrócony mikroskop Nikon TE2000, obiektyw 60X (N.A. 1.4, olejowy). Stereomikroskop o powiększeniu > 100 (Zeiss Stemi SV11 Apo).