Komórki odgrywają kluczową i coraz większą rolę w badaniach oraz w odkrywaniu i opracowywaniu nowych terapii. W związku z rosnącym zapotrzebowaniem na większą liczbę komórek niezbędne są bardziej wydajne i skuteczne metody hodowli i pozyskiwania komórek adherentnych. W tym celu można zastosować kolbę wielowarstwową o odpowiednich parametrach.
Artykuł metodologiczny
Skalowanie hodowli komórek ssaków przy użyciu nowej kolby wielowarstwowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Coraz więcej aplikacji opartych na komórkach wymaga ich dużej liczby. Stosowanie jednowarstwowych kolb T, które są odpowiednie podczas ekspansji na małą skalę, może stać się uciążliwe, pracochłonne i czasochłonne w sytuacjach wymagających uzyskania ogromnej liczby komórek. Aby odpowiedzieć na tę potrzebę, omówiono wydajność nowego wielowarstwowego naczynia do hodowli komórkowej, które ułatwia łatwe skalowanie liczby komórek z jednowarstwowych kolb T. Testowane kolby są dostępne w formacie 3- i 5-warstwowym i umożliwiają hodowlę oraz pełny odzysk odpowiednio trzykrotnej i pięciokrotnej liczby komórek w porównaniu z kolbami T-175. Kluczową cechą BD Multi-Flask jest port do mieszania/wyrównywania, który pozwala na szybkie mieszanie wewnątrz naczynia, a także równomierny rozkład komórek i odczynników wewnątrz i pomiędzy warstwami każdego naczynia, co pozwala na spójne otrzymywanie komórek hodowanych w środowisku analogicznym do kolb T-175.
Konstrukcja tych Multi-Flasków umożliwia również wygodny dostęp pipety w celu dodawania odczynników i komórek bezpośrednio do kolb, a także efektywne odzyskiwanie cennych komórek i odczynników, ograniczając ryzyko kontaminacji związane z przelewaniem. W zastosowaniach, w których przelewanie jest preferowane nad pipetowanie, konstrukcja ta minimalizuje retencję pozostałości cieczy, aby zmniejszyć straty cennych komórek i odczynników.
Protokół
1. Protokół wykorzystania flasks wielokomorowych do hodowli komórkowej
- Przygotowanie naczyń i dodawanie zawiesiny komórkowej
- Przygotować pożywkę do wzrostu komórek zgodnie z potrzebami.
- Ustawić Multi-Flask pionowo na boku, zakrętką do góry, na powierzchni roboczej (sterylna komora z laminarnym przepływem powietrza).
- Kolby te są dostępne w formatach 3- i 5-warstwowych i wykorzystują podobny schemat pracy jak kolba T-175.
- Poluzować i zdjąć zakrętki. Dodać wymaganą ilość uprzednio ogrzanej pożywki do kolby, używając pipety 50 lub 100 mL lub poprzez wlewanie.
- Pipety ≤ 10 ml mogą dotrzeć do dna naczynia, gdy Multi-Flaski są ustawione pionowo zakrętką do góry. Pipety ≥ 10 ml mogą wniknąć do naczynia bezpośrednio za logo na Multi-Flasku, zapewniając wygodny dostęp do dodawania większych objętości pożywki do naczynia.
- Aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza w pożywce, pozwolić strumieniowi cieczy spływać wzdłuż wewnętrznej ścianki pokrywy Multi-Flask (od strony logo).
- Dodać zawiesinę komórkową z koncentratu komórek do pożywki wzrostowej przez górną warstwę, używając pipety 10 mL, a następnie zakręcić kolby.
Wskazówki:
- Transportować Multi-Flaski na wózku do inkubatora i wykonać pozostałe kroki.
- Gęstość zasiewu komórek będzie się różnić w zależności od typu komórek, pożywki i wymaganego czasu hodowli. Przyjąć gęstość zasiewu i objętość pożywki stosowaną w standardowych kolbach T-175 i pomnożyć przez 3 lub 5, w zależności od użytego formatu Multi-Flask.
- Mieszanie komórek
- Pozycja mieszania: Trzymać Multi-Flask pionowo logo w stronę użytkownika i obrócić przeciwnie do ruchu wskazówek zegara pod kątem 45°, tak aby otwór mieszający (mix port) był skierowany w stronę użytkownika.
- Trzymając pod tym samym kątem, delikatnie przechylić Multi-Flask od przodu do tyłu (szyjka oddalona od użytkownika), aż ciecz z górnej warstwy całkowicie spłynie w dół przez otwór mieszający. Obracać wokół strony z otworem mieszającym.
- Analogicznie, delikatnie kołysać Multi-Flask od tyłu do przodu (szyjka skierowana w stronę użytkownika), aż pożywka całkowicie spłynie z dolnej warstwy w górę przez otwór mieszający. Powtórzyć kroki 1.2.2 i 1.2.3 jeszcze raz, aby zapewnić właściwe wymieszanie.
- Przywrócić Multi-Flask do pozycji mieszania (krok 1.2.1) i przejść do kroku 1.3.
- Alternatywnie, zawiesinę komórkową można przygotować poza Multi-Flaskiem i dodać ją do naczynia za pomocą pipety lub przez delikatne wlewanie.
- Otwór mieszający umożliwia mieszanie komórek z pożywką wewnątrz naczynia i eliminuje potrzebę przygotowywania dużych objętości zawiesin komórkowych zewnętrznie.
- Umożliwia on również wyrównanie poziomu pożywki pomiędzy warstwami Multi-Flask
- Równoważenie cieczy
- Po wymieszaniu/dodaniu zawiesiny komórkowej ustawić Multi-Flask pionowo na płaskiej powierzchni roboczej, aby wyrównać objętość cieczy w każdej z warstw.
- Rozdzielenie cieczy do każdej warstwy
- Trzymać Multi-Flask logo w stronę użytkownika i obrócić zgodnie z ruchem wskazówek zegara pod kątem 45°, aby rozdzielić ciecz do każdej z warstw.
Wskazówka:
- Dla uzyskania najlepszych rezultatów ważne jest korzystanie z płaskiej powierzchni roboczej w krokach 1.3-1.4
- Trzymać Multi-Flask logo w stronę użytkownika i obrócić zgodnie z ruchem wskazówek zegara pod kątem 45°, aby rozdzielić ciecz do każdej z warstw.
- Transport
- Po rozdzieleniu pożywki zawierającej zawiesinę komórkową, transportować Multi-Flask pod tym samym kątem 45° (zgodnie z ruchem wskazówek zegara), jak w kroku 1.4.1, z pożywką oddaloną od otworu mieszającego, do inkubatora. Pozycja ta jest również odpowiednia podczas wyjmowania kolb z inkubatora w celu obserwacji pod mikroskopem.
- Umieszczanie Multi-Flask na półce inkubatora
- Trzymając Multi-Flask pod kątem 45° (zgodnie z ruchem wskazówek zegara, oddalony od otworu mieszającego), delikatnie obrócić go w dół poziomo na powierzchnię inkubatora (używając narożnika oddalonego od otworu mieszającego jako punktu obrotu). Położyć Multi-Flask logo do góry.
- Konstrukcja Falcon Multi-Flask umożliwia sztaplowanie naczyń i utrzymuje je na miejscu dzięki solidnemu żebru stabilizującemu.
- Trzymając Multi-Flask pod kątem 45° (zgodnie z ruchem wskazówek zegara, oddalony od otworu mieszającego), delikatnie obrócić go w dół poziomo na powierzchnię inkubatora (używając narożnika oddalonego od otworu mieszającego jako punktu obrotu). Położyć Multi-Flask logo do góry.
- Rozprowadzanie komórek i odczynników
- Po położeniu Multi-Flask płasko na powierzchni roboczej, delikatnie kołysać nim w przód i w tył oraz na boki, aby równomiernie rozprowadzić komórki na powierzchniach hodowlanych, dbając o to, by ciecz z żadnej z warstw nie wyciekła. Ułożyć kolby w stos.
- Ta kolba jest wykonana z materiału optycznie przezroczystego, a komórki w ostatniej warstwie można łatwo obserwować pod mikroskopem.
- Po położeniu Multi-Flask płasko na powierzchni roboczej, delikatnie kołysać nim w przód i w tył oraz na boki, aby równomiernie rozprowadzić komórki na powierzchniach hodowlanych, dbając o to, by ciecz z żadnej z warstw nie wyciekła. Ułożyć kolby w stos.
- Wymiana pożywki
- Odsysać pożywkę, przechylając Multi-Flask w lewo (stroną otworu mieszającego), z logo skierowanym w stronę użytkownika.
- Następnie przechylić Multi-Flask w prawo, kontynuując odsysanie całej pozostałej pożywki.
- Dodać odpowiednią ilość pożywki i postępować zgodnie z krokami 1.3-1.7
2. Pozyskiwanie komórek z kolb wielokomorowych
- Aby przeprowadzić dysocjację komórek, ustaw kolby Multi-Flask pionowo i ustaw każdą z nich w pozycji mieszania (Krok 1.2.1). Delikatnie odwróć kolby szyjką w stronę operatora, aby umożliwić spłynięcie medium do górnej warstwy Multi-Flask.
- Wprowadź końcówkę aspiracyjną o pojemności 5 lub 10 mL przez szyjkę, aż osiągniesz poziom cieczy w pobliżu otworu do mieszania. Odessij zużyte medium.
- Dodaj odczyn dysocjujący/bufor piorący i ustaw w pozycji mieszania, zgodnie z krokiem 1.2.1, a następnie przejdź do kroków 1.3-1.7. Zneutralizuj medium wzrostowym/czynnikiem neutralizującym i przelej zawiesinę komórkową do probówki odbiorczej LUB odwróć kolbę tak, aby komórki spłynęły do górnej warstwy naczynia, a następnie zbierz komórki za pomocą pipety 10 mL.
Wskazówka: Aby zwiększyć odzysk komórek lub odczynników, ustaw Multi-Flask w pozycji mieszania (Krok 1.2.1) i odwróć szyjką w stronę operatora, aby umożliwić całkowite spłynięcie medium ze wszystkich warstw do warstwy górnej. Następnie, pozostawiając Multi-Flask w pozycji odwróconej, przechyl ją zgodnie z ruchem wskazówek zegara pod kątem 45° (oddalając od otworu do mieszania). Użyj pipety (1-10 mL), aby zebrać pozostałe odczynniki.
3. Zalecana objętość robocza w kolbach wielokomorowych Falcon Multi-Flasks
Pożywki hodowlane
3-warstwowa: 75-150 mL na Multi-Flask
5-warstwowa: 125-250 mL na Multi-Flask
Środek dysocjujący
3-warstwowy: ≥15 mL na jedną kolbę typu Multi-Flask
5-warstwowy: ≥25 mL na jedną kolbę typu Multi-Flask
Wskazówka: Należy wyjść od objętości pożywki stosowanej w standardowych kolbach T-175 i pomnożyć ją 3- lub 5-krotnie, w zależności od ocenianego formatu Multi-Flask, tak aby liczba mL na jednostkę powierzchni pozostała taka sama.
4. Reprezentatywne wyniki:
1. Projekt wielokolbowego układu Falcon
Rycina 1.: Wielowarstwowe naczynia do hodowli komórkowej Multi-Flask są dostępne w formacie stosowalnym 3- i 5-warstwowym do zwiększania skali hodowli komórek, zapewniając odpowiednio 525 i 875 cm2 powierzchni wzrostu. Dostęp dla pipety ułatwia dodawanie i usuwanie komórek oraz odczynników z naczynia. Obecność otworu do mieszania (mix-port) pozwala na szybkie mieszanie wewnątrz naczynia i wyrównanie poziomu medium we wszystkich warstwach Multi-Flask.
2. Wydajność komórek przy użyciu wielu kolb:
Naczynia te są dostępne w formatach 3-warstwowych i 5-warstwowych, które odpowiadają odpowiednio 3- i 5-krotnej powierzchni flask T-175. W związku z tym, w Multi-Flaskach hodowano i odzyskano odpowiednio ≥ 3 i 5 razy więcej komórek BHK-21 (nerki noworodka chomika) niż we flaskach T-175 (130± 6,8 x 106 oraz 218 ± 23,6 x 106 komórek odpowiednio, w porównaniu do 43,2 ± 3,5 x 106 komórek; Ryc. 2A). Wydajność komórkowa na jednostkę powierzchni była równoważna w 3- i 5-warstwowych Multi-Flaskach oraz flaskach T-175 dla linii BHK-21, LnCAP (ludzka linia komórkowa gruczolakoraka prostaty), Hep-G2 (ludzka linia komórkowa raka wątroby) oraz EcoPack 2-293 (ludzka linia komórkowa nerki) hodowanych przez okres 48-96h (Ryc. 2B) w pożywkach wzrostowych (35 ml na warstwę) zgodnie z zaleceniami dostawcy komórek (ATCC, Sigma i/lub Clontech). Komórki policzono za pomocą automatycznego licznika Vi-CELL (1).
Rysunek 2A : Trzykrotna i pięciokrotna liczba komórek BHK-21 została wyhodowana i odzyskana z Multi-Flasków 3- i 5-warstwowych w porównaniu z kolbami T-175. Oczekiwana wydajność została wyznaczona na podstawie średniej wydajności komórkowej z kontrolnych kolb T-175 pomnożonej przez trzy i pięć dla odpowiednio 3- i 5-warstwowych Multi-Flasków (n=4 kolby/format).
Rycina 2B : Wydajność komórkowa na cm2 była zbliżona w 3- i 5-warstwowych kolbach Multi-Flask oraz kolbach T-175 dla komórek BHK-21, LnCAP, HepG2 i EcoPack2-293. Każdy słupek reprezentuje średnią z 4 do 6 kolb. Komórki BHK-21 (11 000 cells/cm2) hodowano przez 72 godziny, komórki LnCAP (20 000 cells/cm2) oraz komórki EcoPack2-293 (˜35 000 cells/cm2) hodowano przez 96 godzin, a komórki HepG2 (25 000 cells/cm2) hodowano przez 48 godzin przed zbiorem.
3. Rozdzielanie pożywki pomiędzy warstwy Multi-Flask
Do 5-warstwowych flasks Multi-Flask (250 mL/naczynie 5-warstwowe) dodano pożywkę do hodowli komórkowej (DMEM; Invitrogen) i podzielono ją na warstwy zgodnie z opisanym powyżej protokołem. Rozkład pożywki mierzono poprzez wiercenie otworów w każdej warstwie i wypompowywanie pożywki z poszczególnych warstw. Masa cieczy odzyskanej z każdej warstwy okazała się być stosunkowo jednolita pomiędzy warstwami, jak pokazano na Rys. 3. Wyniki prezentują się następująco: 51,8 ± 0,73, 50,3 ± 0,58, 50,21 ± 0,13, 49,88 ± 0,35, 49,45 ± 0,37 (gm).
Rysunek 3. Jednorodny rozkład pożywki w każdej z pięciu warstw 5-warstwowej kolby Multi-Flask. Do kolb Multi-Flask dodano pożywkę do hodowli komórkowej (250 ml/naczynie 5-warstwowe), po czym zrównoważono ją i podzielono na poszczególne warstwy. Pożywkę wypompowano przez otwory wywiercone w poszczególnych warstwach, a następnie odnotowano masę cieczy z każdej warstwy (n=6 kolb).
4. Rozdzielenie komórek pomiędzy warstwy w Multi-Flask
Komórki można dodawać i mieszać wewnątrz Multi-Flask. Symulowano rozprzestrzenianie się komórek między warstwami Multi-Flask, używając kulek (10μm; PolySciences Inc.) o rozmiarze zbliżonym do komórek. Zawiesinę kulek wprowadzono do naczynia Multi-Flask za pomocą pipety 10 mL przez górną warstwę i wymieszano z medium w naczyniu, zgodnie z opisanym powyżej protokołem. Rozkład kulek zmierzono, wiercąc otwory w każdej warstwie i wypompowując ciecz zawierającą zawiesinę kulek z poszczególnych warstw. Stężenie kulek odzyskanych z każdej warstwy odczytano za pomocą licznika Coulter Counter i zapisano. Poniżej przedstawiono równomierny rozkład kulek między warstwami w 3-warstwowych Multi-Flaskach (Rys. 4A). Port mieszający umożliwia jednorodne rozmieszczenie komórek i odczynników pomiędzy warstwami Multi-Flask.
Rycina 4A : Rozkład kulek w każdej z trzech warstw 3-warstwowego Multi-Flask. Suspensję kulek (3,6 x106/ml) dodano do pożywki naniesionej do Multi-Flasków (stosunek objętości suspensji kulek do pożywki wynosił 1:10, vol:vol), a następnie wymieszano, po czym przeprowadzono etapy równowagowania i rozdziału zgodnie z opisanym protokołem. Stężenie kulek odzyskanych z każdej warstwy (pożywka przepompowana przez otwory wykonane w każdej warstwie) zmierzono za pomocą licznika Coulter Counter i zapisano. Poniżej przedstawiono równoważne rozkłady kulek między warstwami w 3-warstwowych Multi-Flaskach (n=5 flaszków)
Poniżej przedstawiono reprezentatywne obrazy wzorców barwienia Ecopack 2-293 komórek hodowanych do >80% konfluencji w 3-warstwowych Multi-Flaskach w uzupełnionych mediach wzrostowych. Monowarstwy komórkowe utrwalono i zabarwiono fioletem krystalicznym, następnie warstwy Multi-Flask wycięto, a obrazy zeskanowano (2). Należy zauważyć, że rozmieszczenie komórek było jednorodne na wszystkich warstwach Multi-Flask (Rys. 4B). Podobne wyniki uzyskano dla wielu ocenianych typów komórek (dane niepokazane).
Figura 4B : Ta rycina ilustruje homogeniczny wzrost komórek pomiędzy warstwami w Multi-Flaskach. Komórki Ecopack-2-293 hodowlane do >80% konfluencji w 3-warstwowych Multi-Flaskach oraz w kolbach T-175 zostały utrwalone i zabarwione fioletem krystalicznym. Naczynia Multi-Flask zostały przecięte, a każda zabarwiona warstwa została zeskanowana.
5. Dopływ powietrza w Multi-Flask:
Analiza zużytych pożywek za pomocą analizatora BioProfile FLEX (3,4) (Nova Biomedical) z komórek EcoPack2-293 hodowanych przez 96 godzin nie wykazała różnic w nasyceniu powietrzem komórek hodowanych w 5-warstwowych Multi-Flaskach w porównaniu do kolb T-175 (81,03 ± 1,9 vs. 83,4 ± 5,8 % O2 z otoczenia).
Rysunek 5 : Nasycenie powietrzem (% tlenu w otoczeniu O2) w zużytych pożywkach było podobne w przypadku pożywek wymieszanych wcześniej w 5-warstwowych Multi-Flasks w porównaniu z kolbami T-175. Komórki EcoPack2-293 wysiano z gęstością 35 000 komórek/cm2 i hodowano przez 96 godzin przed analizą pożywki (n=3 kolby).
Dyskusja
Niniejsze badanie wykazuje wzrost wydajności, jaki konstrukcja Multi-Flask oferuje badaczom. Choć dla uzyskania optymalnych wyników podczas korzystania z Multi-Flasków istotne jest przestrzeganie opisanych powyżej kroków, w niniejszym protokole istnieją krytyczne etapy uznane za najważniejsze. Należą do nich: (i) mieszanie komórek i odczynników za pomocą portu mieszającego wewnątrz naczynia, (ii) transportowanie Multi-Flask pod kątem 45° zgodnie z ruchem wskazówek zegara po rozdzieleniu cieczy do każdej z warstw, (iii) położenie Multi-Flask płasko w inkubatorze po rozdzieleniu cieczy.
Prawidłowe zastosowanie Multi-Flask prowadzi do uzyskania homogennej populacji komórek w każdym naczyniu, hodowanych w środowisku analogicznym do kolb T-175 (5). Naczynia te pozwalają na uzyskanie 3- i 5-krotnie większej liczby komórek przy podobnej powierzchni zajmowanej przez kolbę T-175. Naczynia 3- i 5-warstwowe zapewniają odpowiednio 525 i 875 cm2 powierzchni wzrostu, oferując użytkownikom oszczędność miejsca oraz pracy. Obróbka powierzchni do hodowli tkankowej jest porównywalna do standardowych kolb, co umożliwia skalowanie procesu bez konieczności ponownej optymalizacji istniejących warunków hodowli oraz bez obniżania jakości, homogeniczności lub wydajności komórek (6, 7). Zapewnia to również porównywalność z wcześniej zebranymi danymi. Naczynia te mogą być również powlekane odczynnikami takimi jak kolagen, fibronektyna czy poli-D-lizyna, aby zapewnić specjalistyczne podłoże do przywierania, wzrostu i różnicowania określonych typów komórek, takich jak hepatocyty8, keratynocyty9 czy komórki macierzyste hodowane w bezserumowych formulacjach pożywek. Roztwory powlekające można usuwać przy minimalnej retencji cieczy resztkowej, co redukuje marnotrawstwo cennych odczynników oraz umożliwia skuteczne usunięcie roztworu powlekającego przed hodowlą komórek. Rekomendowana optymalna objętość pożywki do hodowli komórek w Multi-flaskach mieści się w zakresie 0,142-0,287 ml/cm2, co przekłada się na 25-50 ml na warstwę. W przeciwieństwie do innych kolb wielowarstwowych, produkt ten posiada port do mieszania w naczyniu, który umożliwia szybkie mieszanie wewnątrz naczynia oraz jednorodne rozmieszczenie komórek i odczynników wewnątrz i pomiędzy warstwami każdego naczynia. Różne linie komórkowe, kultury pierwotne i komórki macierzyste były efektywnie skalowane przy użyciu Multi-Flasks. Naczynia te są szczególnie korzystne w zastosowaniach wymagających dużej liczby komórek, takich jak wysokoprzepustowe badania przesiewowe, produkcja szczepionek, transfekcje wektorów wirusowych i terapia komórkowa.
Oszczędność czasu, miejsca i pracy oraz ograniczenie ilości generowanych odpadów to kluczowe korzyści wynikające z zastosowania Multi-Flask w porównaniu do konwencjonalnych hodowli w naczyniach jednowarstwowych. W tej samej przestrzeni, wykorzystując 3 Multi-Flasky 5-warstwowe, możemy hodować około trzykrotnie większą liczbę komórek niż przy użyciu 5 kolb T-175. Ta zaleta w zakresie oszczędności miejsca nie ogranicza się tylko do kolb T-175, lecz może zostać rozciągnięta na inne naczynia: standardowa aparatura do butelek obrotowych, mieszcząca się w typowych inkubatorach laboratoryjnych, pomieści ˜4 butelki obrotowe (2200 ml), z których każda zapewnia 850cm2 powierzchni. Na tej samej powierzchni można umieścić ˜20 Multi-Flasków 5-warstwowych, zapewniając tym samym pięciokrotnie większą powierzchnię wzrostu do hodowli komórek. Ponadto, wraz ze wzrostem świadomości ekologicznej („Go-Green”), wysoce pożądane są rozwiązania ograniczające generowanie odpadów. W tym względzie zastosowanie Multi-Flasków w porównaniu do kolb T-175 prowadzi do 38-procentowego zmniejszenia ilości odpadów (5 kolb T-175 waży ˜640g, podczas gdy jeden Multi-Flask 5-warstwowy waży ˜ 400g), a zalety te przekładają się na obniżenie kosztów przechowywania i utylizacji odpadów, co skutkuje oszczędnościami ekonomicznymi dla użytkownika.
Oświadczenia
Wszyscy autorzy są pracownikami firmy Becton Dickinson, segment Biosciences, jednostka Discovery Labware.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 3-warstwowa hodowla tkankowa modyfikowana powierzchniowo 525cm2 | BD Biosciences | 353143 | |
| 5-warstwowa hodowla tkankowa modyfikowana powierzchniowo 875cm2 | BD Biosciences | 353144 | |
| pipeta 100ml | BD Biosciences | 357600 | |
| pipeta 10 ml | BD Biosciences | 357551 | |
| pipeta aspiracyjna 5 ml | BD Biosciences | 357501 | |
| stożkowa probówka z polipropylenu 50 ml | BD Biosciences | 352070 | |
| kolba T-175 do hodowli tkankowych modyfikowana powierzchniowo | BD Biosciences | 353028 | |
| fiolet krystaliczny do barwienia metodą Grama | BD Biosciences | 212525 | |
| DMEM | Invitrogen | 11885 | |
| GMEM | Sigma-Aldrich | G5154 | |
| RPMI-1640 | ATCC | 30-2001 | |
| MEM | ATCC | 30-2003 | |
| Trypsyna-EDTA | Lonza Inc. | CC-5012 | |
| płodowa surowica bydlęca | Invitrogen | 16000-044 | |
| bulion tryptonowo-fosforanowy | Sigma-Aldrich | T8159 | |
| komórki BHK-21 | Sigma-Aldrich | 85011433 | |
| Hep-G2, LnCAP | ATCC | ||
| Ecopack 2-293 | Clontech Laboratories | ||
| Paraformaldehyd | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Kuleczki polistyrenowe | Polysciences, Inc. | 24628-20 | |
| Analizator Bio-Profile Flex | Nova BioMedical |
Bibliografia
- Szabo, S. E., Monroe, S. L., Fiorino, S., Bitzan, J., Loper, K. Evaluation of an automated instrument for viability and concentration mesurements of cryopreserved hematopoietic cells. Lab. Hematol. 10, 109-109 (2004).
- Bonnekoh, B., Wevers, A., Jugert, F., Merk, H., Mahrle, G. Colorimetric growth assay for epidermal cell cultures by their crystal violet binding capacity. Arch. Dermatol. Res. 281, 487-487 (1989).
- Sengupta, N., Rose, S. T., Morgan, J. A. Metabolic Flux analysis of CHO cell metabolism in the late non-growth phase. Biotechnol. Bioeng. 108, 83-83 (2010).
- Zhu, M. M., Goyal, A., Rank, D. L., Gupta, S. K. Effects of elevated pCO2 and osmolality on growth of cells and production of antibody–fusion protein B1: a case study. Biotechnol. Prog. 21, (2005).
- Ryan, J. M., Sharf, B. B., Cristofalo, J. The influence of culture medium volume on cell density and life-span of human diploid fibroblasts. Exp Cell Res. 91, 389-389 (2004).
- Flaherty, P. Tips and Techniques for enhancing your cell culture. , http://www.bdbiosciences.com/hotlines/webinars/ondemand/index.jsp (2009).
- Sanyal, S., Abraham, E. J., Slater, K., Cai, A., Lacey, B., Hartshorn, C., Flaherty, P., McHugh, B., Qian, S. Scaling up cells in BD Falcon Cell Culture Multi-Flasks. , http://www.bdbiosciences.com/documents/multiflasks-SBSposter.pdf (2011).
- DiPersio, C. M., Jackson, D. A., Zaret, K. S. The extracellular matrix coordinately modulates liver transcription factors and hepatocyte morphology. Mol. Cell. Biol. 11, 4405-4405 (1991).
- Grose, R., Hutter, C., Bloch, W., Thorey, I., Watt, F. M., Fassler, R., Brakebusch, W. S. A crucial role of β1 integrins for keratinocyte migration in vitro and during cutaneous wound repair. Dev. 129, 2303-2303 (2002).
Przedruki i uprawnienia
