Artykuł metodologiczny

Monitorowanie aktywności rozszczepionej kaspazy-3 i apoptozy unieśmiertelnionych komórek oligodendroglialnych za pomocą obrazowania żywych komórek i płatalnych substratów barwnika fluorogenicznego po depolaryzacji błony wywołanej potasem

DOI:

10.3791/3422

⸱

13 stycznia 2012

 ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of Guelph

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie żywych komórek apoptozy za pośrednictwem kaspazy-3 w unieśmiertelnionych hodowlach komórek N19-oligodendrocytów przy użyciu substratu kaspazy-3 NucView 488. Technika ta ma zastosowanie do testów zaprogramowanej śmierci komórki w czasie rzeczywistym w różnych typach komórek i tkankach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Centralny układ nerwowy może doświadczać wielu stresów i neurologicznych urazów, które mogą mieć liczne niekorzystne skutki, które ostatecznie prowadzą do zmniejszenia populacji i funkcji neuronów. Uszkodzone aksony mogą uwalniać cząsteczki pobudzające, w tym potas lub glutaminian, do macierzy zewnątrzkomórkowej, co z kolei może powodować dalsze zniewagi i uszkodzenia wspierających komórek glejowych, w tym astrocytów i oligodendrocytów 8, 16. Jeśli zniewaga będzie się utrzymywać, komórki przejdą zaprogramowaną śmierć komórkową (apoptozę), która jest regulowana i aktywowana przez szereg dobrze znanych kaskad transdukcji sygnału 14. Apoptoza i martwica tkanek mogą wystąpić po urazowym uszkodzeniu mózgu, niedokrwieniu mózgu i drgawkach. Klasycznym przykładem regulacji apoptozy jest rodzina zależnych od cysteiny proteaz skierowanych do asparaginianu lub kaspaz. Aktywowane proteazy, w tym kaspazy, są również zaangażowane w śmierć komórek w odpowiedzi na przewlekłe choroby neurodegeneracyjne, w tym chorobę Alzheimera, Huntingtona i stwardnienie rozsiane 4, 14, 3, 11, 7.

W tym protokole opisujemy użycie substratu kaspazy-3 NucView 488 do pomiaru szybkości apoptozy za pośrednictwem kaspazy-3 w unieśmiertelnionych kulturach komórkowych N19-oligodendrocytów (OLG) 15, 5, po ekspozycji na różne stresy zewnątrzkomórkowe, takie jak wysokie stężenia potasu lub glutaminianu. Warunkowo unieśmiertelniona linia komórkowa N19-OLG (reprezentująca przodka O2A) została uzyskana od dr Anthony'ego Campagnoniego (UCLA Semel Institute for Neuroscience) 15, 5 i była wcześniej wykorzystywana do badania molekularnych mechanizmów ekspresji genu mieliny i transdukcji sygnału prowadzącej do różnicowania OLG (np. 6, 10). Stwierdziliśmy, że ta linia komórkowa jest odporna na transfekcję egzogennym białkiem zasadowym mieliny (MBP) konstruktami połączonymi z RFP lub GFP (czerwone lub zielone białko fluorescencyjne) 13, 12. W tym przypadku hodowle komórkowe N19-OLG potraktowano 80 mM chlorku potasu lub 100 mM glutaminianu sodu, aby naśladować przeciek aksonalny do macierzy zewnątrzkomórkowej w celu wywołania apoptozy 9. Użyliśmy dwufunkcyjnego substratu kaspazy-3 zawierającego podjednostkę rozpoznawania kaspazy-3 DEVD (Asp-Glu-Val-Asp) i barwnik wiążący DNA 2. Substrat szybko dostaje się do cytoplazmy, gdzie jest rozszczepiany przez wewnątrzkomórkową kaspazę-3. Barwnik NucView 488 jest uwalniany i dostaje się do jądra komórkowego, gdzie wiąże DNA i fluoryzuje na zielono przy 488 nm, sygnalizując apoptozę. Zastosowanie substratu kaspazy-3 NucView 488 pozwala na obrazowanie żywych komórek w czasie rzeczywistym 1, 10. W tym filmie opisujemy również hodowlę i transfekcję unieśmiertelnionych komórek N19-OLG, a także techniki obrazowania żywych komórek.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Rozmrażanie i hodowla komórek

  1. Uzyskanie zapasu zamrożonych unieśmiertelnionych komórek N19-oligodendroglialnych z długoterminowych magazynów ciekłego azotu.
  2. Zanurzyć fiolkę zawierającą komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C aż do całkowitego rozmrożenia zawiesiny komórek.
  3. Dodaj 7 ml DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) z wysoką glukozą uzupełnioną 10% FBS (płodowa surowica bydlęca) i 1% penicyliny/streptomycyny do 10 cm płytki hodowlanej.
  4. Dodaj zawiesinę komórek kroplami do płytki, a następnie delikatnie wymieszaj i kołysz płytką Petriego, aby równomiernie rozproszyć komórki.
  5. Hodowla komórek w inkubatorze o temperaturze 34 °C/5% CO2 .
  6. Po 4 godzinach odessać pożywkę z płytek, aby usunąć wszelkie pozostałe DMSO (dimetylosulfotlenek), który był używany jako krioprotektant, i zastąpić świeżą pożywką (7 ml pożywki DMEM o wysokiej zawartości glukozy uzupełnionej 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny).

2. Komórki pasujące

  1. Przy 70-80% konfluencji (4-7 dni wzrostu) odessać pożywkę z komórek.
  2. Dodaj 1 ml 0,25% trypsyny na talerz. Odpipetuj trypsynę, aby oderwać komórki (około 5 minut).
  3. Wykonać odpowiednie rozcieńczenia do warunków doświadczalnych i przepuścić dodatkową płytkę o średnicy 10 cm do przyszłych eksperymentów przy gęstości komórek nie mniejszej niż 0,1 x 106 komórek / ml.

Uwaga: Powinieneś przejść swoje komórki co najmniej dwa razy po rozmrożeniu, zanim użyjesz ich do eksperymentów.

3. Liczenie i powlekanie komórek

  1. Aby ułożyć komórki na płytce do obrazowania żywych komórek, trypsynizuj zgodnie z wcześniejszym opisem.
  2. Usuń około 30 μl komórek i policz za pomocą hemocytometru.
  3. Umieść niepowlekane szklane szkiełko nakrywkowe na płytce 6-dołkowej. Dodać komórki do studzienki o gęstości 0,1 x 106 komórek/ml w 2 ml bezfenolowej pożywki DMEM o wysokiej zawartości glukozy, uzupełnionej 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny, w temperaturze 34 °C/5% CO2 .
  4. Pozostawić komórki do wzrostu przez noc (16-20 godzin) w temperaturze 34 °C/5% CO2 przed transfekcją.

4. Transfekcja

  1. Połącz 100 μl pożywki bez surowicy, 0,5-4 μg oczyszczonego plazmidowego DNA i 4 μl FuGENE HD (Roche). Delikatnie zmieszaj.
  2. Ponownie krótko odwirować i pozwolić DNA na zmieszanie się przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie dodać mieszaninę FuGENE HD DNA bezpośrednio do hodowanych komórek. Delikatnie przechyl talerz, aby wymieszać.
  3. Hodować komórki przez dodatkowe 48 godzin w temperaturze 34 °C/5% CO2 przed poddaniem działaniu substancji lub eksperymentem.

5. Przygotowanie komórek do obrazowania żywych komórek (LCI)

  1. Włącz skrzynkę kontrolną przyrządu LCI Chamlide z żywymi komórkami co najmniej 1 godzinę przed rozpoczęciem eksperymentu. Skrzynka sterownicza reguluje również temperaturę i wilgotność w LCI Chamlide oraz reguluje przepływ wstępnie zmieszanego 5% CO2 .

Uwaga: Zaleca się włączenie skrzynki kontrolnej do 3 godzin przed rozpoczęciem eksperymentów, aby upewnić się, że cały etap osiągnie 34 °C. Ten krok zmniejszy dryft ogniskowej, który jest spowodowany topnieniem i rozszerzalnością cieplną metalowego stolika podczas nagrzewania się podczas obrazowania.

  1. Pracując w okapie przepływowym, spryskaj magnetyczną komorę hodowlaną Chamlide i pęsetę 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia na 5 minut.
  2. Wyjmij komórki z inkubatora i upewnij się, że są zdrowe. Powinny wydawać się przylegające i dobrze rozprowadzone na szklanym szkiełku nakrywkowym z licznymi procesami membranowymi. Komórki, które są obciążone transfekcją, nie nadają się do eksperymentów i będą miały zmniejszoną liczbę rozszerzeń procesu i często będą miały jądro o nieregularnym kształcie.
  3. Przechyl płytkę 6-dołkową i usuń szkiełko nakrywkowe za pomocą pęsety. Szybko umieść szkiełko nakrywkowe stroną z komórką do góry w dolnej płycie komory hodowlanej. Nie dopuścić do wyschnięcia szkiełka nakrywkowego.
  4. Przymocuj magnetyczny korpus komory hodowlanej i dodaj 500 μl pożywki z oryginalnej płytki 6-dołkowej na wierzch szkiełka nakrywkowego. Ponowne użycie tej pożywki zmniejszy ilość stresu wywieranego na komórki przez zmiany środowiskowe, a także może być przydatne do oceny czynników wydzielanych zewnątrzkomórkowo.
  5. Umieść szklaną pokrywę na komorze hodowlanej.
  6. Użyj KimWipe spryskanego 70% etanolem, aby usunąć wszelkie resztki materiału z dna szkiełka nakrywkowego, które mogłyby zakłócać mikroskopię.
  7. Umieścić komorę hodowlaną w inkubatorze o temperaturze 34 °C/5% CO2 na 30 minut. Ten krok zapewni, że sama komora nagrzeje się do 34 °C, aby zmniejszyć przesuwanie się szkiełka nakrywkowego w miarę nagrzewania się metalu.

6. Ustawienia mikroskopu

Obrazy zostały uzyskane tutaj za pomocą odwróconego mikroskopu Leica DMIRE2 z niestandardową soczewką przekaźnikową i obudową koła filtra emisyjnego do ładowania wkładów z wieloma kołami (Quorum Technologies Inc., Guelph, ON).

  1. Jasne pole - Lampa ustawiona na 2,5 V i czas naświetlania do 240 ms.
  2. Białko czerwonej fluorescencji (RFP) - Wzmocnienie ustawione na 140 przez 200 ms.
  3. Białko zielonej fluorescencji (GFP) - Wzmocnienie ustawione na 140 przez 500 ms.
  4. Nasz mikroskop jest wyposażony w ściemnialną lampę, a nie obracający się dysk, aby kontrolować ilość światła dostępnego dla komórek. Nasze eksperymenty ze światłem prowadzimy przy 90% maksymalnego natężenia lampy.

7. Leczenie komórek za pomocą induktorów apoptozy i substratu kaspazy-3 NucView 488

  1. Ważne jest, aby przygotować duże zapasy induktorów apoptozy z wyprzedzeniem i zamrozić je w podwielokrotnościach, tak aby stężenia były spójne między eksperymentami.
  2. Podłoże NucView 488 jest wrażliwe na światło. Przygotować porcje po 15 μl w celu zmniejszenia zamrażania/rozmrażania i przechowywać probówki w temperaturze -20 °C przykryte folią aluminiową. Pracuj przy jak najniższym oświetleniu pomieszczenia, aby zmniejszyć ekspozycję podłoża NucView 488 na światło przed jego użyciem.
  3. Szybko wyjmij komorę hodowlaną z inkubatora, aby komórki nie były narażone na obniżenie temperatury. Umieść komorę hodowlaną w komorze środowiskowej mikroskopu i użyj zacisków, aby komora hodowlana nie się poruszała. W tym momencie należy również przyciemnić światła w pomieszczeniu.
  4. Włącz 5% wstępnie zmieszany zbiornik CO2 z podwójnym regulatorem.
  5. Korzystając z obiektywu 10x, ustaw ostrość, aby znaleźć komórki na monitorze komputera za pomocą mikroskopii jasnego pola. Uwaga: należy użyć największego otworu numerycznego na obiektywie o pożądanym powiększeniu, aby skrócić czas naświetlania.
  6. Dostarczyć induktory apoptozy do komórek (w naszym przypadku 80 mM potasu lub 100 mM glutaminianu), można zastosować jedną z poniższych metod. Jako przykład użyjemy dostarczania 80 mM potasu, używając KCl rozpuszczonego jako 10-krotny koncentrat w naszych typowych pożywkach hodowlanych.
    1. Wymiana mediów przez powolną i lokalną perfuzję:
      - Za pomocą pompy perystaltycznej wymienić pożywkę w komorze hodowlanej na nową pożywkę zawierającą 80 mM potasu.
      - Jeden koniec rurki dostarczy 10 ml zapasu 80 mM potasu rozpuszczonego w DMEM bez fenolu, a drugi koniec rurki usunie media z komory.
      - Potrzebujesz co najmniej 10-krotnej wymiany pożywki, aby upewnić się, że pożywka pozostawiona w komorze ma prawidłowe stężenie potasu.
      - Po wymianie pożywki dodać 3 μl substratu NucView 488 do pożywki w komorze. Odpipetować do mieszania.
    2. Bezpośrednie dodawanie 80 mM K+ i podłoża NucView 488 do pożywki w komorze hodowlanej:
      - Przygotować 10x roztwór podstawowy 80 mM potasu rozpuszczonego w DMEM.
      - Dodać 3 μl substratu NucView 488 do 50 μl 10x 80 mM potasu. Odpipetować do mieszania. Dodać do 500 μl DMEM bez fenolu w komorze hodowlanej.
      Uwaga: ta metoda jest preferowana, jeśli jesteś zainteresowany utrzymaniem lub oceną wzrostu lub innych wydzielanych czynników, które mogą być obecne w oryginalnych pożywkach. Odkryliśmy, że substrat NucView 488 jest stabilny w hodowli komórkowej w eksperymentach trwających nawet 36 godzin.

8. Obrazowanie żywych komórek

  1. Kliknij czerwony kanał, aby wyświetlić transfekowane komórki.
  2. Zaznacz i zapisz około tuzina klatek, w których znajduje się kilka transfekowanych komórek, i zapisz te "punkty etapu X-Y". W zależności od ilości pamięci komputera liczba punktów etapu, które będzie można zdobyć, może być ograniczona.
  3. Niech mikroskop rejestruje obrazy (w jasnym polu, kanale czerwonym i kanale zielonym) w tych zapisanych punktach stage co 6 minut.
  4. Wszelkie zielone zabarwienia, które są widoczne we wczesnych stadiach eksperymentów, prawdopodobnie wskazują na komórki, które już przechodzą apoptozę, zwykle z powodu transfekcji i/lub stresu środowiskowego. Apoptoza spowodowana eksperymentalnymi terapiami zostanie wykryta w późniejszym czasie eksperymentu.

9. Analiza statystyczna



  1. Dla każdego eksperymentu programujemy mikroskop tak, aby pozyskiwał wiele punktów X-Y, aby efektywnie zbierać duży zestaw danych. Każdy eksperyment jest wykonywany w dwóch lub trzech egzemplarzach, a dane są kompilowane z oddzielnych eksperymentów przeprowadzonych w różnych dniach. Z każdego zestawu danych analizujemy do 15 pól widzenia i porównujemy stosunek komórek kaspazo-ujemnych do komórek kaspazo-dodatnich (całkowita liczba komórek w polu widzenia/całkowita liczba komórek kaspazo-dodatnich).

  2. Zarejestrowane pomiary z każdego zestawu danych są grupowane w większy zestaw próbek, a następnie porównywane ze sobą za pomocą tabeli ANOVA (p = 0,05). Pokazujemy błędy standardowe średniej (SEM) każdego eksperymentu, a następnie porównujemy różnicę w średnich, wykonując test porównania średnich Tukeya (p = 0,05), aby określić, które terapie znacznie się od siebie różnią.

10. Reprezentatywne wyniki

Opisaliśmy eksperyment, aby zilustrować, jak substrat NucView 488 może wskazywać na zwiększoną szybkość apoptozy kultur komórkowych N19-OLG po leczeniu wysokim zewnątrzkomórkowym stężeniem potasu. Komórki N19 transfekowano RFP i traktowano 3 μl substratu NucView 488 (kontrola) lub 3 μl substratu NucView 488 i 80 mM [K+] (leczenie). Komórki monitorowano, a obrazy pozyskiwano w ciągu 12 godzin, co jest wystarczające dla badań obejmujących urazy neurologiczne (ryc. 1A). W warunkach kontrolnych nie zaobserwowaliśmy znaczących ilości apoptozy w porównaniu z kulturami traktowanymi 80 mM [K+] (hashed box), które wykazały około 45% śmierć komórek po 12 godzinach (Figura 1B). Zielony sygnał tła obserwowany w warunkach kontrolnych wskazuje komórki, które ulegają apoptozie bez dodatku pozakomórkowego potasu. Praktycznie żadna z komórek w eksperymencie kontrolnym nie wykazuje apoptozy do 12-godzinnego punktu czasowego, chociaż w innych sytuacjach eksperymenty mogą być wymagane dłużej. Zdjęcia zostały uzyskane przy użyciu obiektywu 10x. Bar = 100 μm.

figure-protocol-1
Rysunek 1. (A) 12-godzinny eksperyment z kulturami N19 OLG 48 godzin po transfekcji z ekspresją RFP-MBP (kanał czerwony) wraz z 3 μl substratu NucView 488 (kanał zielony). Hodowle były albo traktowane końcowym stężeniem 80 mM [K+] (lewe panele), albo nie traktowano ich jako kontrolne (prawe panele). Obrazy uzyskano w odstępach 6-minutowych, a znaczącą aktywację rozszczepionej kaspazy-3 (zielony sygnał) można zaobserwować w hodowlach traktowanych 80 mM [K+] w jądrach komórkowych (hashed box) w porównaniu z eksperymentem kontrolnym. (B) Odsetek rozszczepionych komórek kaspazy-3 (obliczony przez podzielenie całkowitej liczby komórek w polu widzenia przez całkowitą liczbę komórek kaspazo-dodatnich). W porównaniu z warunkami kontrolnymi, zaobserwowaliśmy około 45% śmierci komórek po leczeniu K+ przez 12 godzin.

sVideo 1. 12-godzinny eksperyment z kulturami N19-OLG 48 godzin po transfekcji z ekspresją RFP-MBP (kanał czerwony) z 3 μl substratu NucView 488 (kanał zielony), wraz z obrazami jasnego pola i obrazem scalonym trójstronnie, po leczeniu 80 mM [K+]. Proszę kliknij tutaj, aby zobaczyć/pobrać ten plik wideo.

sVideo 2. 12-godzinny eksperyment z kulturami N19-OLG 48 godzin po transfekcji z ekspresją RFP-MBP (kanał czerwony) z 3 μl substratu NucView 488 (kanał zielony), wraz z obrazami w jasnym polu i obrazem scalonym trójstronnie. Do hodowli nie zastosowano żadnej obróbki i można zaobserwować migrację N19-OLG w polu mikroskopu, w przeciwieństwie do kultur komórkowych poddanych działaniu 80 mM [K+] (porównaj z sVideo 1). Proszę kliknij tutaj, aby zobaczyć/pobrać ten plik wideo.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż nie jest to jedyny dostępny produkt fluorogenny do wykrywania apoptozy, istnieje kilka istotnych zalet stosowania substratu NucView 488 . Jedną z głównych zalet jest możliwość śledzenia apoptozy w żywych komórkach w czasie rzeczywistym, podczas gdy większość alternatywnych produktów wymaga lizy komórek lub ma słabą przepuszczalność komórek. Inne korzyści to wysoka czułość rozpoznawania kaspazy-3, wysoka przepuszczalność komórek, niska cytotoksyczność i brak ingerencji w postęp apoptozy. Podłoże ma również niską fluorescencję tła, dopóki nie zostanie rozszczepione i nie dostanie się do jądra, co eliminuje fluorescencję tła. Sekwencja rozpoznawania kaspazy-3 zawiera 3 ładunki ujemne, a barwnik wiążący DNA ma jeden ładunek dodatni 2. Cząsteczka DEVD-NucView 488 ma zatem ładunek ujemny netto, który zapobiega aktywacji i wiązaniu barwnika z DNA w komórkach, w których kaspaza nie jest aktywna.

Zachowanie spójności między eksperymentami jest konieczne, aby móc dokonywać miarodajnych porównań między powtórzeniami. Jednym z głównych parametrów, które należy zachować na stałym poziomie, jest gęstość komórek, ponieważ wpływa ona na szybkość transfekcji. Uzyskanie wysokich wskaźników transfekcji w unieśmiertelnionych kulturach komórkowych N19-OLG jest trudniejsze niż w przypadku innych popularnych linii komórkowych, takich jak HeLa lub HEK293, i jest wysoce zależne od gęstości, z naszego doświadczenia 12, 13. Nasze najlepsze wyniki transfekcji dla tych komórek zostały uzyskane dzięki Fugene HD (Roche) i zwykle wynoszą około 15%, ale mogą osiągnąć ponad 30%, w zależności od konstrukcji. Staranne liczenie komórek pomoże w uzyskaniu stałych wskaźników transfekcji. Ważne jest również, aby wystawić komórki z różnych metod leczenia na ten sam stopień stresu środowiskowego, szczególnie podczas pomiaru wskaźników apoptozy. W szczególności czas, w którym komórki są wystawione na działanie odczynników transfekcyjnych, lub ilość ekspozycji na światło, są ważnymi zmiennymi środowiskowymi, które należy wziąć pod uwagę i powinny pozostać niezmienne we wszystkich eksperymentach. W przypadku naszych zastosowań stwierdziliśmy, że zebranie dużej liczby pól widzenia zapewnia wystarczająco dużą próbę, aby dokonać statystycznie istotnych porównań [tamże].

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To laboratorium jest wspierane przez Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem, Kanadyjską Radę Nauk Przyrodniczych i Inżynierii oraz Kanadyjskie Towarzystwo Stwardnienia Rozsianego (MSSC). GSTS był laureatem stypendium doktoranckiego MSSC. Jesteśmy wdzięczni dr Joan Boggs (Hospital for Sick Children, Toronto) za wiele pomocnych dyskusji i komentarzy na temat tego manuskryptu. Jesteśmy wdzięczni firmie Biotium za hojny dar w postaci dodatkowej kaspazy-3 NucView 488.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Tabela specyficznych odczynników i sprzętu
NucView 488 Zestaw do oznaczania kaspazy-3 dla żywych komórekBiotium, Inc.30029
Odczynnik do transfekcji FuGENE HDGrupa Roche 04709705001
Dulbecco" s Zmodyfikowany Eagle MediumGIBCO, firmy Life Technologies31053-028
0,25% TrypsynaGIBCO, firmy Life Technologies15050-065
Surowica bydlęcapłodu GIBCO, firmy Life Technologies12483-020
Penicylina/streptomycynaGIBCO, firmy Life Technologies15140122
#1,5-25 mm szklane szkiełko nakrywkowe Warner Instruments64-0715

Chamlide Magnetyczna komora hodowlana CMB do szkiełka nakrywkowego 25 mm

Quorum TechnologiesCM-B-40
Płytki do hodowli tkankowej Cellstart 10 cm VWR international82050-576
BD Falcon 6-dołkowe naczynia do hodowli tkankowychVWR internationalCA62406-161

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Antczak, C., Takagi, T., Ramirez, C. N., Radu, C., Djaballah, H. Live-cell imaging of caspase activation for high-content screening. J. Biomol. Screen. 14, 956-969 (2009).
  2. Cen, H., Mao, F., Aronchik, I., Fuentes, R. J., Firestone, G. L. DEVD-NucView488: a novel class of enzyme substrates for real-time detection of caspase-3 activity in live cells. FASEB. J. 22, 2243-2252 (2008).
  3. de Calignon, A., Fox, L. M., Pitstick, R., Carlson, G. A., Bacskai, B. J., Spires-Jones, T. L., Hyman, B. T. Caspase activation precedes and leads to tangles. Nature. 464, 1201-1204 (2010).
  4. Eldadah, B. A., Faden, A. I. Caspase pathways, neuronal apoptosis, and CNS injury. J. Neurotrauma. 17, 811-829 (2000).
  5. Foster, L. M., Phan, T., Verity, A. N., Bredesen, D., Campagnoni, A. T. Generation and analysis of normal and shiverer temperature-sensitive immortalized cell lines exhibiting phenotypic characteristics of oligodendrocytes at several stages of differentiation. Dev. Neurosci. 15, 100-109 (1993).
  6. Fulton, D., Paez, P. M., Fisher, R., Handley, V., Colwell, C. S., Campagnoni, A. T. Regulation of L-type Ca(++) currents and process morphology in white matter oligodendrocyte precursor cells by golli-myelin proteins. Glia. 58, 1292-1303 (2010).
  7. Hisahara, S., Okano, H., Miura, M. Caspase-mediated oligodendrocyte cell death in the pathogenesis of autoimmune demyelination. Neurosci. Res. 46, 387-397 (2003).
  8. Lau, A., Tymianski, M. Glutamate receptors, neurotoxicity and neurodegeneration. Pflugers. Arch. 460, 525-542 (2010).
  9. Lawrence, M. S., Ho, D. Y., Sun, G. H., Steinberg, G. K., Sapolsky, R. M. Overexpression of Bcl-2 with herpes simplex virus vectors protects CNS neurons against neurological insults in vitro and in vivo. J. Neurosci. 16, 486-496 (1996).
  10. Paez, P. M., Spreuer, V., Handley, V., Feng, J. M., Campagnoni, C., Campagnoni, A. T. Increased expression of golli myelin basic proteins enhances calcium influx into oligodendroglial cells. J. Neurosci. 27, 12690-12699 (2007).
  11. Sanchez Mejia, R. O., Friedlander, R. M. Caspases in Huntington's disease. Neuroscientist. 7, 480-489 (2001).
  12. Smith, G. S. T., De Avila, M., Paez, P., Spreuer, V., Wills, M. K. B., Jones, N., Boggs, J. M., Harauz, G. Proline substitutions and threonine pseudo-phosphorylation of the SH3-ligand of 18.5 kDa myelin basic protein decrease affinity for the Fyn-SH3-domain and alter process development and protein localization in oligodendrocytes. J. Neurosci. Res. , Forthcoming (2011).
  13. Smith, G. S. T., Paez, P. M., Spreuer, V., Campagnoni, C. W., Boggs, J. M., Campagnoni, A. T., Harauz, G. Classical 18.5-and 21.5-kDa isoforms of myelin basic protein inhibit calcium influx into oligodendroglial cells, in contrast to golli isoforms. J. Neurosci. Res. 89, 467-480 (2011).
  14. Springer, J. E., Azbill, R. D., Knapp, P. E. Activation of the caspase-3 apoptotic cascade in traumatic spinal cord injury. Nat. Med. 5, 943-946 (1999).
  15. Verity, A. N., Bredesen, D., Vonderscher, C., Handley, V. W., Campagnoni, A. T. Expression of myelin protein genes and other myelin components in an oligodendrocytic cell line conditionally immortalized with a temperature-sensitive retrovirus. J. Neurochem. 60, 577-587 (1993).
  16. Yu, S. P. Regulation and critical role of potassium homeostasis in apoptosis. Prog. Neurobiol. 70, 363-386 (2003).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Monitorowanie apoptozysubstrat NucView 488depolaryzacja indukowana potasemmikroskopia fluorescencyjnatest mierci kom rkowejobrazowanie w czasie rzeczywistymsubstrat kaspazy

Powiązane artykuły