Rejestracja transretinalnego ERG z siatkówki myszy: fotoreakcje czopków i pręcików

Podsumowanie

Opisujemy stosunkowo prostą metodę rejestracji transretinalnego elektroretinogramu (ERG) w celu uzyskania odpowiedzi fotoreceptorowych pręcików i czopków z nienaruszonej siatkówki myszy. Podejście to wykorzystuje blokadę przekaźnictwa synaptycznego z fotoreceptorów w celu wyizolowania ich odpowiedzi na światło i zarejestrowania ich za pomocą elektrod polowych umieszczonych w poprzek wyizolowanej, rozłożonej płasko siatkówki.

Streszczenie

W siatkówce kręgowców występują dwie odrębne klasy fotoreceptorów tworzących obraz: pręciki i czopki. Pręciki są zdolne do wykrywania pojedynczych fotonów światła, podczas gdy czopki działają w sposób ciągły w szybko zmieniających się warunkach silnego oświetlenia. Absorpcja światła przez specyficzne dla pręcików i czopków pigmenty wzrokowe w segmentach zewnętrznych fotoreceptorów inicjuje kaskadę fototransdukcji, która ostatecznie prowadzi do zamknięcia kanałów sterowanych cyklicznymi nukleotydami w błonie plazmatycznej i hiperpolaryzacji komórki. Tę indukowaną światłem zmianę prądu i potencjału błonowego można zarejestrować jako fotoreakcję, stosując klasyczną technikę rejestracji elektrodą ssącą^1,2 lub za pomocą transretinalnego elektroretinogramu (ERG) z izolowanych siatkówek z farmakologicznie zablokowanymi komponentami odpowiedzi postsynaptycznej^3-5. Ta druga metoda umożliwia długotrwałe rejestracje z fotoreceptorów mysich z możliwością podawania leków i jest szczególnie użyteczna w celu uzyskania stabilnych fotoreakcji z nielicznych i delikatnych czopków mysich. W przypadku czopków takie eksperymenty można przeprowadzać zarówno w warunkach adaptacji do ciemności, jak i po intensywnym naświetleniu, które powoduje wybielenie niemal wszystkich pigmentów wzrokowych, aby monitorować proces regeneracji światłoczułości czopków podczas adaptacji do ciemności^6,7. W tym filmie pokażemy, jak przeprowadzić transretinalne rejestracje napędzane przez pręciki oraz czopki M/L z adaptowanej do ciemności siatkówki mysiej. Rejestracje z pręcików zostaną wykonane z wykorzystaniem siatkówki myszy typu dzikiego (C57Bl/6). Dla uproszczenia, rejestracje z czopków zostaną uzyskane z genetycznie zmodyfikowanych myszy z nokautem α-podjednostki transducyny pręcików (Tα^-/-), u których brak jest sygnalizacji pręcików⁸.

Protokół

1. Wykonywanie elektrod

1. Przygotować elektrody szklane. Odważyć 120 mg agaru i wymieszać go w 10 mL wody destylowanej (końcowe stężenie agaru 1,2%). Roztopić roztwór agaru w kąpieli wodnej. Wypełnić kapilary szklane (stosujemy kapilary Word Presision Instruments TW100-4 o następujących wymiarach: długość = 100 mm, OD/ID = 1/0,75 mm i objętość wewnętrzna = 44 μL) roztworem agaru za pomocą plastikowej strzykawki. Pozostawić agar do zestalenia w temperaturze pokojowej przez 10 min. W ten sposób można wypełnić do ~200 kapilar (pozostałą mieszankę agaru można przechowywać w temperaturze -4 °C i wykorzystać wielokrotnie).
2. Przeciąć kapilary na pół za pomocą noża diamentowego.
3. Namoczyć otrzymane elektrody szklane w roztworze do elektrod mysich przez co najmniej 24 godziny w temperaturze 4 °C. Przechowywać elektrody w 4 °C i używać ich w okresie od 3 do 4 miesięcy.

2. Przygotowanie eksperymentu

1. Mysz poddać adaptacji do ciemności przez noc. Do rejestracji transretinalnej sterowanej pręcikami należy użyć myszy typu dzikiego (np. C57Bl/6), a do rejestracji transretinalnej sterowanej czopkami myszy Tα^-/- pozbawione sygnalizacji pręcikowej⁸.
2. Przygotować 1 L roztworu perfuzyjnego, 100 mL roztworu do elektrod oraz 20 mL roztworu inkubacyjnego (patrz poniżej) i przefiltrować roztwór perfuzyjny przez filtr Millipore 0,45 μm lub 0,22 μm (opcjonalnie).
3. skalibrować źródło światła (stymulator optyczny z diodą LED 505 nm lub żarówką halogenową) za pomocą fotometru umieszczonego na płaszczyźnie siatkówki. W przypadku źródła światła LED należy użyć dyfuzora optycznego, aby uzyskać jednorodność światła.
4. Przygotować komorę perfuzyjną do eksperymentu (konstrukcje komór mogą się różnić). Nasza komora jest wykonana z 3 mm pleksiglasu, z dnem wykonanym z pokrywki małej plastikowej szalki Petriego i posiada aktywną objętość perfuzji ~400 μL (L = 25 mm, W = 8 mm, H ≈ 2 mm). Wypełnić dolną przestrzeń elektrodową komory roztworem do elektrod zawierającym 2 mM L-glutaminianu i 10 mM BaCl₂. Za pomocą plastikowych rurek i szklanej kapilary stworzyć połączenie między roztworem w dolnej przestrzeni elektrodowej (wykonane z złączki rurki plastikowej przymocowanej do dna komory) a uchwytem elektrody. Upewnić się, że w elektrodzie, łączących rurkach lub uchwycie elektrody nie ma pęcherzyków powietrza (w razie potrzeby przepłukać roztwór za pomocą plastikowej strzykawki).
5. Zamontować komorę rejestracyjną na stoliku mikroskopu (opcjonalnie: mikroskop może być zamontowany na stole antywibracyjnym i osłonięty klatką Faradaya w celu zminimalizowania zakłóceń mechanicznych i elektromagnetycznych). Podłączyć dolny uchwyt elektrody do dodatniego bieguna przedwzmacniacza wzmacniacza różnicowego (np. wzmacniacz Warner Instruments DP-311). Wycentrować i wyrównać dolny otwór elektrody komory z plamką światła stymulującego. Podłączyć linię perfuzyjną do komory rejestracyjnej i uruchomić perfuzję.
6. Napowietrzać roztwór perfuzyjny mieszanką 95% O₂/5% CO₂, inkubując go w łaźni wodnej o temperaturze 40 °C. CO₂ dostosowuje pH roztworu do wartości 7,2. Roztwór przepływa z butelki do komory rejestracyjnej grawitacyjnie, przechodząc przez ceramiczny rezystor podgrzewający go do 36-37 °C. Aby zmniejszyć straty ciepła, grzałka powinna znajdować się jak najbliżej komory rejestracyjnej, idealnie na stoliku mikroskopu.
7. Za pomocą regulatora przepływu ustawić szybkość przepływu na około 1 mL/min.
8. Podłączyć górną elektrodę do drugiego (ujemnego) bieguna przedwzmacniacza za pomocą drugiego uchwytu elektrody. Przymocować sondę termopary do górnej elektrody za pomocą pierścienia O-ring. Upewnić się, że końcówki elektrody i termopary znajdują się blisko siebie, aby odczyt temperatury był dokonywany jak najbliżej centrum siatkówki. Zanurzyć końcówkę górnej elektrody w roztworze perfuzyjnym i umieścić ją w centrum komory. Odczekać 10-15 min na stabilizację linii bazowej.
9. Dostosować napięcie DC grzałki tak, aby temperatura roztworu wynosiła 36-37 °C.

3. Izolowanie siatkówki mysiej

1. Przy słabym czerwonym świetle uśmierć mysz przystosowaną do ciemności za pomocą CO₂ oraz zwichnięcia szyjnego. Opcjonalnie: wykonaj znak referencyjny na gałce ocznej każdej myszy, wypalając najbardziej grzbietowy punkt twardówki za pomocą wypalarki lub rozgrzanej szpilki sekcyjnej. Wszystkie kolejne procedury przeprowadza się w świetle podczerwonym, korzystając z konwerterów obrazu podczerwonego zamontowanych w mikroskopie sekcyjnym.
2. Wypreparuj oczy za pomocą zakrzywionych nożyczek, wywierając delikatny nacisk i rozciągając skórę po bokach każdego oka. Przetnij obie gałki oczne na pół pod oświetleniem podczerwonym, używając mikronużyczek lub żyletki.
3. Usuń rogówkę i soczewkę. Usuń jak największą ilość ciała szklistego.
4. Oddziel pierwszą siatkówkę od warstwy nabłonka pigmentowego i, jeśli to konieczne, dokładnie oczyść ją pęsetą, aby usunąć pozostałe ziarna nabłonka pigmentowego. Zazwyczaj do transretinalnych rejestracji z czuczcików i czopków wykorzystujemy całą siatkówkę. Jeśli jednak chcesz rejestrować sygnały konkretnie z części grzbietowej siatkówki myszy, która posiada więcej czopków M/L⁹, przed oddzieleniem siatkówki usuń część brzuszną oczodołu za pomocą żyletki lub mikronużyczek, wykorzystując znak wypalony jako punkt odniesienia.
5. Umieść drugą przeciętą gałkę oczną w małej szalce Petriego z roztworem inkubacyjnym i inkubuj preparat w ciemnej komorze nasyconej czystym tlenem do momentu użycia. Zazwyczaj w tych warunkach druga gałka oczna myszy może być przechowywana przez kilka godzin w temperaturze pokojowej i wykorzystana do rejestracji.
6. Za pomocą szklanej lub plastikowej pipety przenieś wyizolowaną siatkówkę do kropli roztworu perfuzyjnego (ok. 300 μl) na pokrywce szalki Petriego. Dodaj 5-6 małych kropli roztworu elektrody zawierającego BaCl₂, aby przeprowadzić preinkubację siatkówki z BaCl₂. Umieść kwadratowy fragment (ok. 5x5 mm) papieru filtrującego Millipore (typ HARG 0,45 μm) z fabrycznie wykonanym otworem w centrum (o średnicy 2-2,5 mm), którego rogi od strony tylnej zostały nasmarowane (używamy smaru i uszczelniacza zaworowego Dow Corning 111), w tej samej kropli roztworu. Za pomocą pęsety ułóż siatkówkę na papierze filtrującym (warstwą fotoreceptorów do góry) i dociśnij jej brzegi na obwodzie, aby ją płasko zamocować. Siatkówka powinna być wycentrowana nad otworem w papierze filtrującym.
7. Za pomocą pęsety przenieś papier filtrujący z siatkówką do komory perfuzyjnej i umieść go nad przestrzenią dolnej elektrody, wyrównanej z punktem stymulacji. Delikatnie dociśnij nasmarowane brzegi papieru filtrującego, aby połączyć go z komorą.
8. Umieść górną elektrodę nad centrum siatkówki (lekko dotykając warstwy fotoreceptorów). Wycentrowanie górnej elektrody na siatkówce zwiększa amplitudę sygnału (do ~20-40% w porównaniu z umieszczeniem jej bliżej brzegu siatkówki). Chociaż takie położenie elektrody nieznacznie zniekształca efektywną intensywność bodźca świetlnego docierającego do małego sektora siatkówki (~12-15% jej całkowitej powierzchni), jest to nadal optymalny sposób rozmieszczenia elektrody. Preparat jest teraz gotowy do rejestracji transretinalnej.

4. Rejestracja transretinalna

1. W zależności od linii myszy, zarejestruj odpowiedzi na błysk testowy sterowany przez pręciki lub czopki M/L, w zakresie od niskiego do wysokiego natężenia skalibrowanego światła o długości fali 505 nm, dostarczanego przez źródło światła LED lub stymulator optyczny. W przypadku naszego źródła światła LED natężenie błysku jest kontrolowane przez kombinację komputerowego sterowania napięciem wejściowym diody LED, przełączalnych rezystorów oraz zestawu filtrów neutralnych (stosujemy filtry foliowe ND 0,9 E-Colour nr 211 firmy Rosco Laboratories) umieszczonych pomiędzy diodą LED a siatkówką. Czas trwania błysku testowego LED (20 ms) jest kontrolowany komputerowo. W przypadku użycia stymulatora optycznego z żarówką halogenową, natężenie i długość fali błysku testowego można kontrolować odpowiednio za pomocą zestawu filtrów neutralnych oraz interferencyjnych filtrów wąskopasmowych. Czas trwania błysku testowego może być kontrolowany przez sterowane komputerowo migawki.
2. Opcjonalnie: aby utrzymać efektywne tłumienie komponentu glialnego fotoreakcji za pomocą BaCl₂ przez cały dzień, okresowo wymieniaj roztwór dolnej elektrody (np. przed badaniem każdej siatkówki), przepłukując go za pomocą plastikowej strzykawki wypełnionej świeżym roztworem.

5. Reprezentatywne wyniki

Roztwory

1. Roztwór do perfuzji siatkówki myszy: 112.5 mM NaCl, 3.6 mM KCl, 2.4 mM MgCl₂, 1.2 mM CaCl₂, 10 mM HEPES (pH 7.2), 20 mM NaHCO₃, 3 mM bursztyczanu sodu, 0.5 mM glutaminianu sodu, 0.02 mM EDTA oraz 10 mM glukozy. Dodatkowo roztwór uzupełnia się o 2 mM L-glutaminianu i 10 μM DL-AP-4 w celu zablokowania wyższych rzędów komponentów odpowiedzi świetlnej^10,11, a także o 0.1% roztworów witamin MEM i aminokwasów MEM (Sigma), aby poprawić żywotność siatkówki.
2. Roztwór elektrodowy dla myszy: 140 mM NaCl, 3.6 mM KCl, 2.4 mM MgCl₂, 1.2 mM CaCl₂, 3 mM HEPES (pH 7.4, NaOH). Roztwór w dolnej przestrzeni elektrodowej zawiera również 2 mM L-glutaminianu w celu zablokowania transmisji synaptycznej¹⁰ oraz dodatkowo 10 mM BaCl₂ w celu stłumienia komponentu glejowego odpowiedzi świetlnej^3,12.
3. Roztwór do inkubacji siatkówki: rozpuścić 272 mg medium L-15 (Sigma) i 20 mg BSA w 20 mL wody dejonizowanej. Końcowe stężenia L-15 i BSA wynoszą odpowiednio 13.6 mg/mL i 1 mg/mL. pH należy dostosować do 7.4 za pomocą 1 M HCl.

Rysunek 1. Schemat przedstawiający izolację siatkówki myszy do pomiarów transretinalnego ERG.

Rycina 2. Fotografia komory perfuzyjnej i elektrod rejestrujących wraz z ich uchwytami. Czerwone strzałki wskazują kierunek przepływu perfuzyjnego.

Rycina 3. Schematyczny rysunek układu eksperymentalnego do rejestracji transretinalnego ERG. Czerwone strzałki wskazują kierunek przepływu perfuzji.

Rycina 4. Reprezentatywne wyniki: zarejestrowana rodzina odpowiedzi transretinalnych indukowanych przez pręciki mysie. Fotoreakcje zostały przefiltrowane filtrem dolnoprzepustowym 30 Hz (8-biegunowy filtr Bessela), zdigitalizowane z częstotliwością 1 kHz i zapisane na komputerze do dalszej analizy. Przedstawione ślady reprezentują średnie z 5-6 odpowiedzi przy niskich natężeniach światła oraz 2-3 odpowiedzi przy nasycających natężeniach światła.

Rycina 5. Reprezentatywne wyniki: zarejestrowana rodzina odpowiedzi transretinalnych indukowanych przez czopki u myszy. Odpowiedzi na światło zostały przefiltrowane filtrem dolnoprzepustowym 30 Hz (8-biegunowy filtr Bessela), zdigitalizowane z częstotliwością 1 kHz i zapisane w komputerze do dalszej analizy. Przedstawione przebiegi są średnimi z 5-10 odpowiedzi przy niskim natężeniu światła i 3-5 odpowiedzi przy nasycającym natężeniu światła.

Dyskusja

Opisana powyżej metoda rejestracji transretinalnego ERG sterowanego przez pręciki i czopki staje się potężnym narzędziem do badania funkcji fotoreceptorów myszy zarówno u zwierząt typu dzikiego, jak i modyfikowanych genetycznie. Oprócz łatwej charakterystyki podstawowych właściwości fotoreakcji, ta prosta technika zapewnia dużą stabilność odpowiedzi podczas długotrwałych eksperymentów przeprowadzanych na preparatach siatkówki niemal nienaruszonej. Zarówno maksymalna amplituda odpowiedzi pręcików w adaptacji do ciemności,...