Metody detekcji fluorescencji dla mikroprzepływowych platform kropelkowych

Summary

Platformy mikroprzepływowe oparte na kropelkach są obiecującymi kandydatami do eksperymentów o wysokiej przepustowości, ponieważ są w stanie tanio generować pikolitrowe, samodzielne naczynia z częstotliwością kHz. Dzięki integracji z szybkimi, czułymi metodami spektroskopii fluorescencji o wysokiej rozdzielczości, duże ilości informacji generowanych w tych systemach mogą być efektywnie wydobywane, wykorzystywane i wykorzystywane.

Abstract

Rozwój platform mikroprzepływowych do wykonywania chemii i biologii był w dużej mierze napędzany przez szereg potencjalnych korzyści, które towarzyszą miniaturyzacji systemu. Do zalet zaliczyć możliwość wydajnego przetwarzania próbek o objętości od nano do femotolitrów, łatwą integrację komponentów funkcjonalnych, wrodzoną predyspozycję do multipleksowania na dużą skalę, zwiększoną wydajność analityczną, lepszą kontrolę i zmniejszoną powierzchnię zajmowaną przez instrumenty. ¹

W ostatnich latach duże zainteresowanie skupiało się na rozwoju systemów mikroprzepływowych opartych na kropelkach (lub przepływie segmentowym) i ich potencjale jako platform w eksperymentach o wysokiej przepustowości. ^2-4 W tym przypadku emulsje typu woda w oleju powstają spontanicznie w kanałach mikroprzepływowych w wyniku niestabilności kapilarnej między dwiema niemieszającymi się fazami. Co ważne, mikrokropelki o precyzyjnie określonych objętościach i składach mogą być generowane na częstotliwościach rzędu kilku kHz. Ponadto, poprzez hermetyzację interesujących nas odczynników w izolowanych komorach oddzielonych ciągłą niemieszającą się fazą, można wyeliminować zarówno przesłuchy, jak i dyspersję próbek (oparte na dyfuzji i Taylorze), co prowadzi do minimalnego zanieczyszczenia krzyżowego i możliwości pomiaru czasu procesów analitycznych z dużą dokładnością. Dodatkowo, ponieważ nie ma kontaktu między zawartością kropel a ściankami kanału (które są zwilżane przez fazę ciągłą), zapobiega to wchłanianiu i utracie odczynników na ściankach kanału.

Po wygenerowaniu i przetworzeniu tego rodzaju kropel, konieczne jest wydobycie wymaganych informacji analitycznych. W związku z tym wybrana metoda wykrywania powinna być szybka, zapewniać wysoką czułość i niskie granice wykrywalności, mieć zastosowanie do szeregu gatunków molekularnych, być nieniszcząca i możliwa do łatwej integracji z urządzeniami mikroprzepływowymi. Aby odpowiedzieć na tę potrzebę, opracowaliśmy zestaw narzędzi i protokołów eksperymentalnych, które umożliwiają ekstrakcję dużych ilości informacji fotofizycznych ze środowisk o małej objętości i mają zastosowanie do analizy szerokiego zakresu parametrów fizycznych, chemicznych i biologicznych. W niniejszym artykule przedstawiono dwa przykłady tych metod i zastosowano je do wykrywania pojedynczych komórek i mapowania procesów mieszania wewnątrz kropelek o objętości pikolitrów. Przedstawiamy cały proces eksperymentalny, w tym wytwarzanie chipów mikroprzepływowych, konfigurację optyczną oraz proces generowania i wykrywania kropel.

Protocol

1. Produkcja mikroprocesorów

1. Mistrz produkcji SU8.
   Aby uzyskać kanały mikroprzepływowe o wysokości 40 μm, należy przędzić SU8-50 (MicroChem Corp.) na płytce Si z prędkością 3000 obr./min przez 30 s. Piecz na miękko na płycie grzejnej w temperaturze 65°C przez 5 minut i 95°C przez 30 minut, aby odparować rozpuszczalnik i zagęścić film. Po schłodzeniu należy naświetlić rezystor SU8 promieniowaniem 360-440 nm o temperaturze 300 mJ/² pod odpowiednią maską. Po ekspozycji piecz wafel w temperaturze 65°C przez 2 minuty i w temperaturze 95°C przez 4 minuty. Po schłodzeniu rozwijaj nienaświetlone obszary (rozpuszczalnik Micrpoposit EC, Chestech) przez 5 minut, mieszając. ⁵ Użyj świeżego rozpuszczalnika EC do wypłukania płytki, a następnie wysusz ją pod gazem, aby uzyskać czystą powierzchnię. Potraktuj wafel myjkami z heksanem i metanolem. Zakończyć główny proces wytwarzania SU8 ostatnim etapem odparowania trichloro(1,1,2,2-perfluoocytl)silanu na powierzchnię (w eksykatorze przez 40 minut).
2. PDMS utwardzanie, krojenie w kostkę i dziurkowanie.
   Aby uformować strukturalne podłoża mikroprzepływowe, mieszamy Sylgard 184 (Dow Corning) w stosunku 10:1 (w/w) żywicy do środka sieciującego, a następnie zalewamy wzorzec. Odgazuj w eksykatorze, a następnie utwardź urządzenie (wierzchnią warstwę) przez godzinę w temperaturze 65°C. Utwardzony PDMS odetnij i oderwij go od wzorca. Wykonaj otwory dostępowe do przewodów płynowych za pomocą stempla do biopsji. Utwardź kolejną warstwę PDMS (8 g żywicy równomiernie rozprowadzoną na szalce Petriego o wymiarach 10x10 cm) przez 20 minut w temperaturze 65°C. Ułóż przygotowaną wierzchnią warstwę na dolnej warstwie, a następnie utwardź przez noc w temperaturze 65°C. Obierz chipsy z szalki Petriego i pokrój je w kostkę do użycia.

2. Konfiguracja eksperymentalna

1. Konfiguracja mikroprzepływowa
   1. Napełnij strzykawki (plastikowe lub szklane firmy Beckton, Dickinson and Company lub SGE Analytical Science) wymaganymi roztworami, upewniając się, że w żadnej części rurki nie pozostały pęcherzyki powietrza. Do wytwarzania kropelek stosuje się dwie fazy. Faza wodna (zdyspergowana) zawiera odczynniki będące przedmiotem zainteresowania (na przykład zawiesinę komórek w pożywce wzrostowej lub roztwór fluoroforów molekularnych). Faza olejowa, która w tym przypadku pełni rolę fazy ciągłej, jest na ogół tworzona z mieszaniny oleju i środka powierzchniowo czynnego, np. 2% środka powierzchniowo czynnego Raindance (RainDance Technologies) w oleju fluorowanym (3M Fluorinert Electronic Liquid FC-40); lub 2% Span 80 (Croda) w oleju mineralnym.
   2. Dopasuj rurkę (rurkę polietylenową, aparat Harvarda) o tej samej średnicy wewnętrznej co końcówki igły strzykawki na jednym końcu do igieł. Rurka powinna być przycięta do jak najkrótszej długości, aby zminimalizować niestabilność przepływu spowodowaną zakłóceniami wibracyjnymi.
   3. Podłącz drugie końce rurki bezpośrednio do otworów wybitych w podłożu PDMS. Bardziej złożone rozwiązania, takie jak zastosowanie portów kapilarnych lub złączy krzemionkowych (np. Upchurch Nanoports), mogą być również wdrożone w celu uzyskania bardziej niezawodnego interfejsu między urządzeniem mikroprzepływowym a rurką. Podłącz port wylotowy chipa do rurki i skieruj do kolektora (w celu zbierania odpadów lub dalszego przetwarzania analitu).
   4. Zamontuj strzykawki na pompie strzykawkowej (np. programowalne pompy strzykawkowe PHD 4400 Hpsi, Harvard Apparatus) i określ pożądane natężenie przepływu dla każdej fazy (zwykle rzędu mikrolitrów na minutę). Zaleca się minimalny stosunek natężenia przepływu oleju do wody wynoszący 1, aby uniknąć zwilżenia PDMS przez fazę wodną, co prowadziłoby do niestabilnego tworzenia się kropel (w zależności od geometrii urządzenia). Z tego samego powodu zaleca się również, aby przed wprowadzeniem fazy wodnej najpierw przepłukać samą fazę olejową przez dowolne kanały mikroprzepływowe. Ostateczny układ wykorzystany w eksperymentach przedstawiono na rysunku 2a.
2. Konfiguracja systemu optycznego
   1. Do badania małych objętości (do kilku pikolitrów) w kanałach mikroprzepływowych z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową należy użyć mikroskopu konfokalnego (z automatyczną zdolnością pozycjonowania submikronowego).
   2. Używaj rozpuszczalnych w wodzie cząsteczek fluorescencyjnych o idealnie wysokiej wydajności kwantowej. Wzbudz cząsteczki za pomocą lasera działającego na długości fali, która odpowiada absorpcji zaangażowanego fluoroforu. Na przykład popularne cząsteczki fluorescencyjne, takie jak 5-izotiocyjanian fluoresceiny (FITC) i Alexa-Fluor 488, mogą być skutecznie wzbudzane za pomocą lasera diodowego 488 nm (np. PicoQuant Gmbh, LDH-P-C-485). Cząsteczki fluorescencyjne, takie jak Texas Red lub allofikocyjanina (APC), mogą być skutecznie usuwane przy długości fali 633 nm za pomocą lasera He/Ne (np. Newport R-31425).
   3. Używaj laserów impulsowych pracujących z częstotliwością powtarzania kilku MHz (z kilkoma separacjami impulsów ns) i fluoroforów o wystarczająco zróżnicowanych właściwościach życiowych do eksperymentów z obrazowaniem czasu życia fluorescencji (FLIM).
   4. Użyj lusterek sterujących wiązką i optyki, aby kontrolować wysokość wiązki, a także kierunek wiązki.
   5. Użyj lustra dichroicznego, aby odbić wiązkę lasera do soczewki obiektywu. Jeśli dwa lasery są używane jednocześnie, można zainstalować dwupasmowe zwierciadło dichroiczne, aby umożliwić odbicie dwóch wiązek laserowych (np. dla wiązek 488 i 633 nm idealne jest lustro z488/633rdc firmy Chroma Technology Corporation).
   6. Użyj obiektywu mikroskopowego z korekcją nieskończoności i wysokim otworem numerycznym (NA) (np. Olympus 60 x /1.2 NA, zanurzenie w wodzie), aby ustawić światło lasera na ciasnym ognisku w kanale mikroprzepływowym. Podczas pracy z wysokimi mikrokanalikami (>100 μm) stosowany obiektyw musi być odpowiednio dobrany, aby zapewnić, że jego odległość robocza efektywnie pokrywa całą wysokość mikrokanału.
   7. Zebrać fluorescencję emitowaną przez próbkę (w kanale mikroprzepływowym) za pomocą tego samego obiektywu o wysokim NA i przesyłaną przez to samo zwierciadło dichroiczne.
   8. Usuń wszelkie szczątkowe światło wzbudzenia za pomocą jedno- lub dwupasmowego filtra emisyjnego (np. filtra z488/633 firmy Chroma Technology Corporation).
   9. Skoncentruj emisję fluorescencji na otworku o średnicy 75 μm za pomocą soczewki płasko-wypukłej (np. +50,2 F; Newport Sp. z o.o.). Umieść otwór w płaszczyźnie konfokalnej obiektywu mikroskopu.
   10. Użyj innego zwierciadła dichroicznego (np. 630dcxr, Chroma Technology Corporation), aby rozdzielić sygnał fluorescencyjny na dwa detektory.
   11. Przefiltruj fluorescencję odbitą przez zwierciadło dichroiczne za pomocą filtra emisyjnego (np. filtra hq540/80 m firmy Chroma Technology Corporation) i ustaw go za pomocą soczewki płasko-wypukłej (np. f = 30,0, średnica wewnętrzna 25,4 mm, Thorlabs) na pierwszym ("zielonym") detektorze. W przypadku eksperymentów z udziałem wtórnego czerwonego filtra fluoroforowego: fluorescencja przekazywana przez zwierciadło dichroiczne z innym filtrem emisyjnym (np. filtrem hq640lp firmy Chroma Technology Corporation), a następnie ogniskowanie jej za pomocą innej soczewki płasko-wypukłej na drugim ("czerwonym") detektorze.
   12. Do detekcji fotonów fluorescencyjnych należy stosować fotodiody lawinowe (np. AQR-141, EG&G, Perkin-Elmer). Ostateczna konfiguracja jest zilustrowana na rysunku 2b.

3. Generowanie kropel i akwizycja danych

1. Metody generowania kropel
   1. Do generowania kropel można użyć dwóch głównych konfiguracji mikrokanałów: formatu skupiającego przepływ lub formatu trójnika (rysunek 3a i 3b). ^6,7 Obie metody są równoważne, o ile powstałe kropelki są tak szerokie, jak sam mikrokanał. W wyniku sił ścinających, które powstają w wyniku wykorzystania tych geometrii do zbliżenia dwóch niemieszających się płynów i wynikających z tego niestabilności kapilarnych, które powstają na granicy faz, spontanicznie generowane są kropelki monodyspersyjne (tak małe jak kilka femtolitrów).
   2. Odczynniki można kapsułkować na różne sposoby: odczynniki można przygotować i wymieszać z wióra do pożądanej mieszaniny/stężenia lub można je wprowadzić oddzielnie do chipa, a następnie połączyć ze sobą przed utworzeniem kropel (rysunek 3c). Ta ostatnia metoda zapewnia większą elastyczność, ponieważ mieszaniny/stężenia można modyfikować, po prostu dostrajając względne natężenia przepływu. Należy zauważyć, że w przypadku kapsułkowania komórek, zawiesinę komórek w strzykawce należy wymieszać, aby uniknąć kondensacji komórek w czasie trwania eksperymentu.
2. Akwizycja danych fluorescencyjnych.
   1. Sprzężyć sygnał elektroniczny z detektora fotodiody lawinowej (opisanego w ppkt 2.2.12) z wielofunkcyjnym urządzeniem DAQ do rejestrowania danych (np. PCI 6602, National Instruments), działającym na komputerze osobistym.
   2. W przypadku eksperymentów FLIM należy podłączyć detektory do karty TCSPC (Time-Correlated Single Photon Counting – TCSPC) (np. TimeHarp 100, PicoQuant GmbH) działającej na oddzielnym komputerze. Karta ta pozwala na uzyskanie danych o czasie życia fluorescencji przy użyciu metodologii TCSPC: każdy wykryty foton fluorescencyjny jest skorelowany z padającym impulsem laserowym, a zatem każdemu wyemitowanemu fotonowi fluorescencyjnemu przypisuje się czas opóźnienia. Dane te można dopasować do jedno- lub wielowykładniczej krzywej rozpadu, aby uzyskać oszacowanie współczynnika szybkości promieniowania fluoroforu/s. Dekonwolucja surowych danych za pomocą funkcji odpowiedzi instrumentu (IRF) detektora: uzyskuje się ją przy użyciu roztworu Auramine-O o niskim stężeniu (który wykazuje czas trwania fluorescencji wynoszący kilka pikosekund). ⁸

4. Rozpoznawanie komórek i mapowanie mieszania się w kropelkach

1. Rozpoznawanie komórek i mapowanie mieszania się w kropelkach
   1. Użyj szczepu Escherichia coli Top 10 do eksperymentu z testem żywotności. Hoduj komórki w bulionie Luria-Bertani przez noc i dopasuj gęstość optyczną do 0,5 przed eksperymentami.
   2. Użyj 0,4 μM SYTO9 i 1 μM jodku propydyny do wykrycia żywotności komórek. Oba są barwnikami interkalującymi DNA, a ich intensywność fluorescencji wzrasta ponad 20-krotnie po związaniu się z DNA. SYTO9 to zielony barwnik fluorescencyjny, który jest przepuszczalny dla membrany, a jodek propidyny jest czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym, który jest nieprzepuszczalny dla membrany. Tak więc żywe komórki fluoryzują "na zielono", podczas gdy martwe komórki wykazują zarówno "zielone", jak i "czerwone" emisje.
   3. Użyj konfiguracji przedstawionej w 2.2) do wykrywania fluorescencji zielonej/czerwonej.
   4. Użyj przenośnego, mini-mieszadła magnetycznego (Utah Biodiesel Supply, Utah), aby wymieszać zawiesiny komórek w strzykawce BD plastipak o pojemności 3 ml wyposażonej w mieszadło magnetyczne o średnicy 7 mm, aby zapobiec sedymentacji komórek.
2. Mapowanie zdarzeń mieszania za pomocą FLIM
   1. Skoncentruj objętość sondy optycznej na połowie wysokości mikrokanału, wzdłuż którego przepływają kropelki.
   2. Tworzą kropelki z dwóch roztworów wodnych (jak na rysunku 3c), z których każdy zawiera (nieoddziałujący) fluorofor o różnych charakterystycznych czasach życia fluorescencji.
   3. Zaczynając od jednej strony kanału, przeprowadzać każde doświadczenie na całej szerokości kanału w odstępach 1 μm. Krawędzie kanałów można łatwo zidentyfikować, ponieważ intensywność fluorescencji drastycznie spada, gdy wiązka lasera zostanie skupiona w ich pobliżu.
   4. Zaimplementuj algorytm do odróżniania impulsów sygnału (związanych z kropelkami) od tła szumu fazy olejowej i do ustalenia czasu trwania każdego impulsu.
   5. Zaimplementuj drugi algorytm, aby wyodrębnić wartości czasu opóźnienia i intensywności wzdłuż długości każdej kropli na określonej szerokości, na której przeprowadzono eksperyment. ⁹
   6. Następnie użyj algorytmu estymatora maksymalnego prawdopodobieństwa (MLE), aby ocenić czas życia fluorescencji dla każdej kropli w eksperymencie. ⁸ Uśrednienie wartości czasu życia dla wszystkich kropel w eksperymencie zmniejsza ostateczny błąd obliczeń MLE (im więcej zbadanych kropel, tym mniejszy błąd).
   7. Po uzyskaniu trajektorii okresu użytkowania dla każdej szerokości połącz wszystkie trajektorie na mapie 2D. Ponieważ każda wartość czasu życia jest powiązana z określoną mieszaniną dwóch fluoroforów, można w ten sposób uzyskać mapę stężeń (lub mieszania).
   8. Opcjonalnie można łatwo uzyskać mapę 3D mieszania kropel, powtarzając ten protokół w różnych pozycjach wzdłuż wysokości kanału mikroprzepływowego.

5. Analiza danych

1. Zreinterpretuj surowe pliki danych eksperymentalnych na odpowiedni język obliczeniowy, aby można je było dalej analizować (np. pliki tekstowe, które zawierają zmiany liczby fotonów w czasie, można łatwo wyodrębnić do Matlaba w celu przetwarzania i analizy danych). Być może będziesz musiał napisać określone kody, aby uzyskać dostęp do danych zawartych w plikach bardziej złożonych eksperymentów (takich jak te dla FLIM) lub w celu uruchomienia algorytmów MLE lub zbudowania map 2D wzorców mieszania z trajektorii życia.

6. Reprezentatywne wyniki

Rozpoznawanie komórek

Typowe przykłady zmienności liczby fotonów w funkcji czasu w eksperymentach komórkowych są pokazane na rysunkach 4a i c, w okresie dwustu milisekund. Co ważne, bulion Luria-Bertani (pożywka LB) działa jak słabo fluorescencyjne tło wyznaczające granice kropel wody, podczas gdy na tym tle można wyróżnić wyraźne rozbłyski fotonów, odpowiadające obecności pojedynczych komórek. Tło fluorescencyjne LB charakteryzuje się w przybliżeniu prostokątnym przekrojem poprzecznym (oznaczonym czerwonymi i zielonymi liniami przerywanymi).

Pełna połowa szerokości (FWHM) wybuchów fluorescencyjnych powstających z komórek E. coli jest 30-krotnie krótsza niż zdarzenia kropelkowe tła, co jest zgodne ze względną długością kropelek (40 mikronów, co odpowiada objętości 30 pikolitrów) i komórek E. coli (1,5–2,0 mikronów). ¹⁰

Dzięki dwukanałowemu systemowi detekcji, istnienie żywych komórek lub martwych komórek można odróżnić od analizy kanałów zielonego i czerwonego. Rysunki 4 b i d pokazują rozkład prawdopodobieństwa opisujący liczbę komórek w kropli.

Mapowanie zdarzeń mieszania za pomocą FLIM

Czas życia fluorescencji molekularnej jest nieodłączną właściwością pojedynczego fluoroforu, na którą wpływa tylko jego środowisko chemiczne. W związku z tym jego pomiary mogą być wykorzystywane do uzyskiwania informacji środowiskowych (takich jak pH, temperatura, polarność i lepkość roztworu) z lepszą rozdzielczością i precyzją niż zintegrowane w czasie pomiary fluorescencji, które są zależne od czynników eksperymentalnych (takich jak stężenie, intensywność wzbudzenia i wydajność zbierania optycznego). ^9,11

Jak przedstawiono w innym ^miejscu,8 możliwe jest odwzorowanie wzorców mieszania wewnątrz kropel za pomocą dwóch fluoroforów o różnych wartościach życia. W mieszaninie zawierającej dwa (nieoddziałujące) związki fluorescencyjne rozpad przyjmie postać dwuwykładniczą, jak pokazano w równaniu 1:

Indywidualne czasy życia są zdefiniowane jako τ1 i τ2; a amplituda każdego składnika jest określona odpowiednio przez α1 i α2. Średni czas życia można następnie zdefiniować w następujący sposób:

Gdzie β1 i β2 są ułamkami każdego składnika i są zdefiniowane w następujący sposób:

Ponieważ objętość sondy jest stała i kropelki przepływają przez tę pozycję, można w ten sposób uzyskać trajektorię wartości czasu życia wzdłuż długości kropel o tej konkretnej szerokości. Charakterystyczną trajektorię dla danej szerokości, uśrednioną dla 6000 kropel, można zaobserwować na rysunku 5a.

Łączenie trajektorii na całej szerokości kanału prowadzi do utworzenia mapy stężeń (lub mieszania) 2D. Typowy wynik przedstawiono na rysunku 5b.

Poprzez uśrednienie wyników wśród dużej liczby kropel, błąd standardowy otrzymanych wyników może być znacznie zredukowany (1% błędu standardowego z 95% przedziałem ufności dla rysunku 5a). Metoda wyznaczania trajektorii czasu życia zakłada, że wszystkie krople są praktycznie identyczne. Udowodniono, że jest to w dużej mierze poprawne z dwóch głównych powodów: gdyby kropelki znacząco się różniły, uzyskane uśrednione trajektorie życia miałyby bardziej płaskie, mniej rozbieżne profile (i konsekwentnie wykrywane są ostre różnice w czasie życia wzdłuż długości uśrednionych kropel). Co więcej, wyniki są powtarzalne niezależnie od poszczególnych analizowanych kropel lub ilości kropel użytych w obliczeniach. ⁸

Rysunek 1. przebieg procesu przy produkcji chipów mikroprzepływowych.

Rysunek 2. a) Schemat przedstawiający pompy strzykawkowe i strzykawki, połączone z chipem mikroprzepływowym w celu tworzenia kropel; b) Schematyczne przedstawienie typowego układu optycznego dla dwóch laserów – wzbudzenie i detekcja dwóch fluoroforów (zielonego i czerwonego). DC = zwierciadło dichroiczne, EM = filtr emisyjny, L = soczewka, PH = otwór na szpilkę, APD = detektor fotodiody lawinowej.

Rysunek 3. Strategie tworzenia kropel na chipie: a) konfiguracja skupiająca przepływ; b) Konfiguracja skrzyżowania T. c) Na chipie kapsułkowanie w kropelkach dwóch oryginalnie oddzielnych odczynników wodnych.

Rysunek 4. Odczyt optyczny ścieżek 0,2 s zarejestrowanych dla (a) martwych i (c) żywych komórek (natężenia przepływu dla zawiesiny komórek: 1 μl ^min-1, olej: 2 μl ^min-1). Każdy sygnał w kształcie łuku odpowiada słabo fluorescencyjnemu ośrodkowi LB, który tworzy wodną kroplę, z granicami kropli zaznaczonymi liniami przerywanymi. Sygnały zielone reprezentują odczyt poniżej 633 nm, a sygnały czerwone powyżej długości fal 633 nm. Komórki wyróżniają się pionowym kolcem powstającym w wyniku interkalacji barwników DNA. Rozkład prawdopodobieństwa zajętości komórek w pojedynczych kropelkach dla (b) martwych komórek i (d) żywych komórek.

Rysunek 5. a) typowa uśredniona trajektoria życia wzdłuż długości kropli o określonej szerokości; b) Typowe przedstawienie kombinacji wszystkich uśrednionych trajektorii badanych wzdłuż całej szerokości kropel na mapie czasu życia 2D (lub stężenia, wyrażonego jako % FITC / % Str-AF488).

Discussion

Opisaliśmy wytwarzanie urządzenia mikroprzepływowego, układ eksperymentalny i związane z nim protokoły tworzenia mikrokropelek i enkapsulacji odczynników oraz optycznego wykrywania przetworzonych kropel. Dwa wybrane przykłady (wykrywanie pojedynczych komórek w kropelkach i mapowanie procesów mieszania wewnątrz przepływających kropelek) reprezentują typowe zastosowania, które są obecnie badane za pomocą mikrofluidyki kropelkowej.

Jak pokazują przedstawione eksperymenty, zastosowanie kropelkowych platform mikroprzepływowych ma pewne atrakcyjne cechy, takie jak wysoka przepustowość, quasi-doskonałe uwięzienie, wysoka odtwarzalność... Duża ilość wytwarzanych informacji i duża szybkość, z jaką informacje te są generowane, wymagają jednak zastosowania szybkich metod detekcji o wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej, jeśli mają być w pełni wykorzystane te zminiaturyzowane platformy. W tym przypadku pokazujemy, że jest to możliwe przy użyciu wysoce precyzyjnych technik spektroskopowych fluorescencyjnych. W szczególności technika detekcji FLIM (wykorzystująca laser impulsowy z okresami powtarzania wynoszącymi zaledwie kilka ns) ujawnia zdolność do uzyskiwania bardzo szybkich informacji z szybko przepływających kropel (około 200 na sekundę). W tym przypadku rozdzielczość czasowa wykrytych zdarzeń wynosiła zaledwie 1 μs. Jeśli chodzi o ograniczenia wielkości i stężenia kropel, zastosowanie soczewek o większej aperturze numerycznej i laserów o większej mocy z łatwością pozwoliłoby na wykrycie stężeń nM w kropelkach o wielkości zaledwie 5 μm (ograniczenia w wielkości kropel są narzucone przez rozdzielczości procesu wytwarzania fotolitograficznego i etapu pozycjonowania submikronowego).

Kropelki mikroprzepływowe są idealnymi kandydatami do przeprowadzania eksperymentów na dużą skalę z udziałem małych ilości odczynników, aż do pojedynczego celu/zdarzenia. Obecne ograniczenia tej technologii polegają na trudnościach w generowaniu kropel z wielu różnych źródeł (dziesiątki lub setki) różnych źródeł w sposób wysokoprzepustowy. Ponadto trudność w namierzaniu i manipulowaniu każdą wygenerowaną pojedynczą kroplą nakłada poważne ograniczenia na praktyczne zastosowanie tych technik. W związku z tym zagadnienia te znajdują się w centrum ważnych prac badawczych mających na celu opracowanie niezbędnych rozwiązań technologicznych, które umożliwią mikroprzepływowym platformom kropelkowym stanie się standardową metodą referencyjną badań i analiz w zastosowaniach wysokoprzepustowych.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Odczynnik 5-izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC)		Sigma-Aldrich	F3651
Streptavidin-Alexa Fluor 488		Odczynnik Sondy molekularne, Life Technologies	S11223
Odczynnik perfluorodekaliny		Sigma-Aldrich	P9900
1H,1H,2H,2H-perfluorooktanol	Odczynnik	Sigma-Aldrich	370533
Zestaw elastomerów silikonowych Sylgard 184	Odczynnik	Premier Farnell UK LTD	1673921
odczynnik auramine-O		Sigma-Aldrich	861030
485 nm pulsacyjny laser diodowy	Sprzęt	PicoQuant	LDH-P-C-485
TCSPC Karta	Sprzęt	Lustro	TimeHarp 100
	Wyposażenie	Chroma Technology Corp.	z488rdc,
Sprzęt do obiektywów mikroskopowych		Olympus Corporation	UPLSAPO 60XW
Sprzęt do fotodiody lawinowej		PerkinElmer, Inc.	AQR-141
Odczynnik	DMEM	Invitrogen	ABCD1234
SYTO9	Odczynnik	Invitrogen	S34854
Odczynnik jodku propidium		Invitrogen	P3566
Escherichia coli top 10 szczep	Komórki	Invitrogen	C4040-10