Mikrofluidyczne platformy kropelkowe są obiecującymi narzędziami do eksperymentów wysokoprzepustowych, ponieważ umożliwiają one niskokosztowe generowanie piko-litrowych, samoczynnie odseparowanych komór z częstotliwością rzędu kHz. Dzięki integracji z szybkimi, czułymi i wysokorozdzielczymi metodami spektroskopii fluorescencyjnej, duże ilości informacji generowanych w tych systemach mogą być efektywnie wydobywane, przetwarzane i wykorzystywane.
Artykuł metodologiczny
Metody detekcji fluorescencyjnej dla mikroprzepływowych platform kroplkowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Rozwój platform mikrofluidycznych do prowadzenia badań z zakresu chemii i biologii był w dużej mierze napędzany szeregiem potencjalnych korzyści związanych z miniaturyzacją systemów. Zalety te obejmują możliwość efektywnego przetwarzania objętości próbek od nano- do femtolitrów, łatwą integrację komponentów funkcjonalnych, naturalną predyspozycję do szeroko zakrojonej multipleksacji, zwiększoną przepustowość analityczną, lepszą kontrolę oraz zmniejszenie rozmiarów aparatury.1
W ostatnich latach dużą uwagę poświęcono rozwojowi mikrofluidycznych systemów opartych na kropelkach (lub przepływie segmentowym) oraz ich potencjałowi jako platform w eksperymentach wysokoprzepustowych.2-4 W takich układach emulsje typu woda w oleju tworzą się samoistnie w kanałach mikrofluidycznych w wyniku niestabilności kapilarnych między dwiema niemieszalnymi fazami. Co istotne, mikrokropelki o precyzyjnie określonych objętościach i składach mogą być generowane z częstotliwością kilku kHz. Ponadto, poprzez enkapsulację interesujących odczynników w odizolowanych przedziałach oddzielonych ciągłą fazą niemieszalną, można wyeliminować zarówno wzajemne przenikanie się próbek (cross-talk), jak i dyspersję (dyfuzyjną oraz dyspersję Taylora), co prowadzi do minimalnego zanieczyszczenia krzyżowego i umożliwia bardzo dokładne kontrolowanie czasu procesów analitycznych. Dodatkowo, ponieważ nie zachodzi kontakt między zawartością kropelek a ściankami kanału (które są zwilżane przez fazę ciągłą), zapobiega się absorpcji i utracie odczynników na ściankach kanału.
Po wygenerowaniu i przetworzeniu kropli tego rodzaju konieczne jest wyodrębnienie wymaganych informacji analitycznych. W tym względzie preferowana metoda detekcji powinna być szybka, zapewniać wysoką czułość i niskie granice wykrywalności, być stosowalna dla różnych gatunków molekularnych, niedestrukcyjna oraz umożliwiać łatwą integrację z urządzeniami mikroprzepływowymi. Aby sprostać tym potrzebom, opracowaliśmy zestaw narzędzi i protokołów eksperymentalnych, które umożliwiają pozyskanie obszernych informacji fotofizycznych z środowisk o małej objętości i znajdują zastosowanie w analizie szerokiego zakresu parametrów fizycznych, chemicznych i biologicznych. W niniejszej pracy przedstawiono dwa przykłady tych metod, zastosowane do detekcji pojedynczych komórek oraz mapowania procesów mieszania wewnątrz kropli o objętości picoliter. Opisujemy cały proces eksperymentalny, w tym wykonanie chipa mikroprzepływowego, układ optyczny oraz proces generowania i detekcji kropli.
Protokół
1. Wytwarzanie mikrochipów
- Wytwarzanie matrycy SU8.
Aby uzyskać kanały mikrofluidyczne o wysokości 40 μm, nanieś warstwę SU8-50 (MicroChem Corp.) metodą spin coatingu na wafelek krzemowy (Si) przy 3000 rpm przez 30 s. Przeprowadź wstępne wygrzewanie (soft bake) na płycie grzejnej w temperaturze 65°C przez 5 minut i 95°C przez 30 minut w celu odparowania rozpuszczalnika i zagęszczenia filmu. Po ochłodzeniu naświetl rezyst SU8 promieniowaniem o długości fali 360-440 nm z dawką 300 mJ/2 przez odpowiednią maskę. Po naświetleniu wygrzej wafelek w temperaturze 65°C przez 2 minuty i 95°C przez 4 minuty. Po ochłodzeniu wywołaj obszary nienaświetlone (rozpuszczalnik Micrpoposit EC, Chestech) przez 5 minut przy mieszaniu.5 Użyj świeżego rozpuszczalnika EC do wypłukania wafla, a następnie osusz go strumieniem gazu, aby uzyskać czystą powierzchnię. Przemyj wafelek heksanem i metanolem. Zakończ proces wytwarzania matrycy SU8 ostatnim etapem, polegającym na naparowaniu trichloro(1,1,2,2-perfluoocytl)silanu na powierzchnię (w deskryptyce przez 40 minut). - Utwardzanie, dicing i wycinanie otworów w PDMS.
W celu utworzenia ustrukturyzowanych podłoży mikrofluidycznych wymieszaj Sylgard 184 (Dow Corning) w stosunku żywicy do sieciującego 10:1 (w/w), a następnie wlej mieszaninę na matrycę. Odgazuj w deskryptyce, a następnie utwardzaj urządzenie (warstwę górną) przez jedną godzinę w temperaturze 65°C. Wytnij utwardzony PDMS i odklej go od matrycy. Wykonaj otwory dostępowe dla przewodów płynowych za pomocą wycinaka do biopsji. Utwardź kolejną warstwę PDMS (8 g żywicy równomiernie rozprowadzonej w szalce Petriego o wymiarach 10x10 cm) przez 20 minut w temperaturze 65°C. Umieść przygotowaną warstwę górną na warstwie dolnej, a następnie utwardzaj przez noc w temperaturze 65°C. Odklej chipy z szalki Petriego i potnij (dice) do dalszego użytku.
2. Układ eksperymentalny
- Konfiguracja układu mikrofluidycznego
- Napełnić strzykawki (plastikowe lub szklane od Beckton, Dickinson and Company lub od SGE Analytical Science) wymaganymi roztworami, upewniając się, że w żadnych częściach przewodów nie pozostały pęcherzyki powietrza. Do generowania kropel stosuje się dwie fazy. Faza wodna (dyspergowana) zawiera interesujące badacza odczynniki (na przykład zawiesinę komórek w pożywce wzrostowej lub roztwór fluoroforów molekularnych). Faza olejowa, która w tym przypadku pełni rolę fazy ciągłej, jest zazwyczaj tworzona z mieszaniny oleju i surfaktantu, np. 2% surfaktantu Raindance (RainDance Technologies) w oleju fluorowanym (3M Fluorinert Electronic Liquid FC-40) lub 2% Span 80 (Croda) w oleju mineralnym.
- Do końcówek igieł strzykawek dopasować przewody (przewody polietylenowe, Harvard Apparatus) o tej samej średnicy wewnętrznej co igły. Przewody powinny być przycięte do jak najkrótszej długości, aby zminimalizować niestabilności przepływu wynikające z zaburzeń wibracyjnych.
- Drugie końce przewodów podłączyć bezpośrednio do otworów wykonanych w podłożu z PDMS. W celu uzyskania bardziej stabilnego interfejsu między urządzeniem mikrofluidycznym a przewodami można zastosować bardziej złożone rozwiązania, takie jak porty z kapilar krzemionkowych lub złączki (np. Upchurch Nanoports). Port wylotowy chipa podłączyć do przewodu i skierować do kolektora (do zbiórki odpadów lub dalszej obróbki analitu).
- Zamontować strzykawki na pompie strzykawkowej (np. programowalne pompy strzykawkowe PHD 4400 Hpsi, Harvard Apparatus) i zdefiniować pożądany przepływ dla każdej fazy (zazwyczaj rzędu mikrolitrów na minutę). Aby uniknąć zwilżania PDMS przez fazę wodną, co prowadziłoby do niestabilnego tworzenia kropel (w zależności od geometrii urządzenia), zaleca się utrzymanie minimalnego stosunku przepływów olej/woda wynoszącego 1. Z tego samego powodu zaleca się, aby przed wprowadzeniem fazy wodnej najpierw przepłukać wszystkie kanały mikrofluidyczne samą fazą olejową. Końcowa konfiguracja użyta w niniejszych eksperymentach jest przedstawiona na Rysunku 2a.
- Konfiguracja układu optycznego
- W celu badania małych objętości (nawet kilku pikolitrów) wewnątrz kanałów mikrofluidycznych z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową należy użyć mikroskopu konfokalnego (z automatyczną funkcją pozycjonowania submikronowego).
- Stosować rozpuszczalne w wodzie cząsteczki fluorescencyjne o jak najwyższej wydajności kwantowej. Cząsteczki wzbudzać laserem pracującym na długości fali odpowiadającej absorpcji danego fluoroforu. Na przykład popularne cząsteczki fluorescencyjne, takie jak izotiocyjanian fluoresceiny (FITC) oraz Alexa-Fluor 488, można efektywnie wzbudzać laserem diodowym 488 nm (np. PicoQuant Gmbh, LDH-P-C-485). Cząsteczki fluorescencyjne, takie jak Texas Red lub Allophycocyanin (APC), można efektywnie wzbudzać przy 633 nm za pomocą lasera He/Ne (np. Newport R-31425).
- Do eksperymentów obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM) należy używać laserów impulsowych pracujących z częstotliwością powtarzania rzędu kilku MHz (z odstępami impulsów wynoszącymi kilka ns) oraz fluoroforów o odpowiednio zróżnicowanych właściwościach czasu życia.
- Do kontrolowania wysokości oraz kierunku wiązki należy używać luster sterujących i układów optycznych.
- Użyć lustra dichroicznego do skierowania wiązki lasera do obiektywu. W przypadku jednoczesnego użycia dwóch laserów można zainstalować dichroiczne lustro dwupasmowe, aby umożliwić odbicie dwóch wiązek laserowych (np. dla wiązek 488 i 633 nm idealne jest lustro z488/633rdc z Chroma Technology Corporation).
- Aby skupić światło laserowe w wąskim punkcie wewnątrz kanału mikrofluidycznego, należy użyć obiektywu mikroskopowego z korekcją w nieskończoność o wysokiej aperturze numerycznej (NA) (np. Olympus 60 x /1.2 NA, imersja wodna). Przy pracy z wysokimi mikrokanałami (>100 μm) należy dobrać odpowiedni obiektyw, aby jego odległość robocza efektywnie obejmowała pełną wysokość mikrokanału.
- Fluorescencję emitowaną przez próbkę (wewnątrz kanału mikrofluidycznego) należy zbierać za pomocą tego samego obiektywu o wysokim NA i transmitować przez to samo lustro dichroiczne.
- Pozostałości światła wzbudzenia należy usunąć za pomocą jednopasmowego lub dwupasmowego filtra emisyjnego (np. filtra z488/633 z Chroma Technology Corporation).
- Emisję fluorescencji należy skupić na otworze (pinhole) o średnicy 75 μm za pomocą soczewki plano-konweksowej (np. +50.2 F; Newport Ltd.). Otwór należy umieścić w płaszczyźnie konfokalnej obiektywu mikroskopu.
- Użyć innego lustra dichroicznego (np. 630dcxr, Chroma Technology Corporation), aby rozdzielić sygnał fluorescencyjny na dwa detektory.
- Fluorescencję odbitą przez lustro dichroiczne należy przefiltrować filtrem emisyjnym (np. filtrem hq540/80 m z Chroma Technology Corporation) i skupić soczewką plano-konweksową (np. f = 30.0, i.d. 25.4 mm, Thorlabs) na pierwszym („zielonym”) detektorze. W eksperymentach z wykorzystaniem drugiego, czerwonego fluoroforu, fluorescencję transmitowaną przez lustro dichroiczne należy przefiltrować innym filtrem emisyjnym (np. filtrem hq640lp z Chroma Technology Corporation), a następnie skupić kolejną soczewką plano-konweksową na drugim („czerwonym”) detektorze.
- Do detekcji fotonów fluorescencji należy użyć fotodiod lawinowych (np. AQR-141, EG&G, Perkin-Elmer). Końcowa konfiguracja przedstawiona jest na Rysunku 2b.
3. Generowanie kropel i akwizycja danych
- Metody generowania kropli
- Do generowania kropli można wykorzystać dwie główne konfiguracje mikrokanałów: format ogniskowania przepływu (flow focusing) lub złącze w kształcie litery T (Rycina 3a i 3b).6,7 Obie metody są równoważne, pod warunkiem że powstałe krople mają szerokość odpowiadającą szerokości samego mikrokanału. W wyniku sił ścinania powstających przy zastosowaniu tych geometrii do łączenia dwóch niemieszalnych płynów oraz następujących po nich niestabilności kapilarnych rozwijających się na granicy faz, samoistnie generowane są monodyspersyjne krople (o objętości nawet kilku femtolitrów).
- Reagenty można enkapsulować na różne sposoby: można je przygotować i zmieszać poza układem do pożądanej mieszaniny/stężenia lub wprowadzić oddzielnie do układu, a następnie połączyć przed formowaniem kropli (Rycina 3c). Ta ostatnia metoda zapewnia większą elastyczność, ponieważ mieszaniny/stężenia można modyfikować poprzez proste dostrojenie względnych szybkości przepływu. Należy zaznaczyć, że w przypadku enkapsulacji komórek zawiesinę komórkową w strzykawce należy mieszać, aby uniknąć sedymentacji komórek w czasie trwania eksperymentu.
- Akwizycja danych fluorescencyjnych.
- Sygnał elektroniczny z detektora w postaci fotodiody lawinowej (opisanej w 2.2.12) należy podłączyć do wielofunkcyjnego urządzenia DAQ do rejestrowania danych (np. PCI 6602, National Instruments) obsługiwanego przez komputer osobisty.
- W przypadku eksperymentów FLIM detektory należy podłączyć do karty TCSPC (Time-Correlated Single Photon Counting, np. TimeHarp 100, PicoQuant GmbH) obsługiwanej przez osobny komputer. Karta ta umożliwia uzyskanie danych o czasie życia fluorescencji przy użyciu metodologii TCSPC: każdy wykryty foton fluorescencyjny jest korelowany z padającym impulsem lasera, a zatem każdemu emitowanemu fotonowi fluorescencyjnemu przypisywany jest czas opóźnienia. Dane te można dopasować do pojedynczej lub wielo-wykładniczej krzywej zaniku, aby uzyskać szacunkowe wartości współczynników szybkości radiacyjnej fluoroforu/ów. Surowe dane należy poddać dekonwolucji z funkcją odpowiedzi przyrządu (IRF) detektora: uzyskuje się ją przy użyciu roztworu Auraminy-O o niskim stężeniu (która wykazuje czas życia fluorescencji rzędu kilku pikosekund).8
4. Rozpoznawanie komórek i mapowanie mieszania wewnątrz kropli
- Rozpoznawanie komórek i mapowanie mieszania wewnątrz kropli
- Do eksperymentu z testem żywotności należy użyć szczepu Escherichia coli Top 10. Komórki należy hodować przez noc w bulionie Luria-Bertani, a przed rozpoczęciem eksperymentów dostosować gęstość optyczną do poziomu 0,5.
- Do wykrywania żywotności komórek należy użyć 0,4 μM SYTO9 i 1 μM jodku propidyny. Oba są barwnikami interkalującymi do DNA, a ich intensywność fluorescencji wzrasta ponad 20-krotnie po związaniu z DNA. SYTO9 jest zielonym barwnikiem fluorescencyjnym, który przenika przez błony komórkowe, natomiast jodek propidyny jest czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym, który nie przenika przez błony. W związku z tym żywe komórki fluorescują na „zielono”, podczas gdy martwe komórki wykazują emisję zarówno „zieloną”, jak i „czerwoną”.
- Do detekcji fluorescencji zielonej/czerwonej należy wykorzystać układ przedstawiony w punkcie 2.2).
- Aby zapobiec sedymentacji komórek, należy użyć przenośnego, mini magnetycznego mieszadła (Utah Biodiesel Supply, Utah) do mieszania zawiesin komórkowych w strzykawce BD plastipak o pojemności 3mL, wyposażonej w magnetyczny pasek mieszający o długości 7mm.
- Mapowanie zdarzeń mieszania przy użyciu FLIM
- Należy skupić objętość sondy optycznej na połowie wysokości mikrokanału, w którym przepływają krople.
- Należy utworzyć krople z dwóch roztworów wodnych (jak na Rysunku 3c), z których każdy zawiera (nieoddziałujący) fluorofor o innym charakterystycznym czasie życia fluorescencji.
- Zaczynając od jednej strony kanału, należy przeprowadzić każdy eksperyment wzdłuż całej szerokości kanału w odstępach 1 μm. Krawędzie kanału można łatwo zidentyfikować, ponieważ intensywność fluorescencji drastycznie spada, gdy wiązka lasera zostanie skupiona w ich pobliżu.
- Należy zaimplementować algorytm służący do odróżniania impulsów sygnału (powiązanych z kroplami) od szumu tła fazy olejowej oraz do określania czasu trwania każdego impulsu.
- Należy zaimplementować drugi algorytm do wyodrębniania czasu opóźnienia i wartości intensywności wzdłuż długości każdej kropli w danej szerokości, dla której przeprowadzono eksperyment.9
- Następnie należy użyć algorytmu estymatora maksymalnej wiarygodności (MLE) do oceny czasu życia fluorescencji dla każdej kropli w eksperymencie.8 Wyciągnięcie średniej z wartości czasu życia dla wszystkich kropli w eksperymencie redukuje końcowy błąd obliczeń MLE (im więcej przebadanych kropli, tym mniejszy błąd).
- Po uzyskaniu trajektorii czasu życia dla każdej szerokości, należy połączyć wszystkie trajektorie w mapie 2D. Ponieważ każda wartość czasu życia jest powiązana z konkretną mieszaniną dwóch fluoroforów, można w ten sposób uzyskać mapę stężeń (lub mapę mieszania).
- Opcjonalnie, mapę 3D mieszania kropel można łatwo uzyskać, powtarzając powyższy protokół w różnych pozycjach wzdłuż wysokości kanału mikroprzepływowego.
5. Analiza danych
- Przekształć surowe pliki z danymi eksperymentalnymi na odpowiedni język programowania w celu przeprowadzenia dalszej analizy (np. pliki tekstowe zawierające zmianę liczby fotonów w czasie mogą zostać łatwo zaimportowane do programu Matlab w celu przetworzenia i analizy danych). Może być konieczne napisanie specyficznych kodów, aby uzyskać dostęp do danych zawartych w plikach z bardziej złożonych eksperymentów (takich jak FLIM) lub w celu uruchomienia algorytmów MLE bądź zbudowania map 2D wzorców mieszania na podstawie trajektorii czasu życia.
6. Reprezentatywne wyniki
Rozpoznawanie komórek
Typowe przykłady zmienności liczby fotonów w funkcji czasu dla eksperymentów z wykorzystaniem komórek przedstawiono na rysunku 4a i c, w okresie dwustu milisekund. Istotne jest, że pożywka Luria–Bertani (podłoże LB) stanowi słabo fluorescencyjne tło wyznaczające granice kropli wodnej, podczas gdy na tle tym można wyróżnić wyraźne serie impulsów fotonowych, odpowiadające obecności poszczególnych komórek. Fluorescencyjne tło LB charakteryzuje się w przybliżeniu prostokątnym przekrojem (oznaczonym czerwonymi i zielonymi liniami przerywanymi).
Pełna szerokość połówki maksimum (FWHM) błysków fluorescencyjnych pochodzących z komórek E. coli jest 30-krotnie krótsza niż w przypadku zdarzeń tła z kropli, co jest zgodne z względną wielkością kropli (40 mikronów, co odpowiada objętości 30 picolitres) i komórek E. coli (1,5–2,0 mikronów).10
Dzięki systemowi detekcji dwukanałowej, na podstawie analizy kanałów zielonego i czerwonego można rozróżnić obecność komórek żywych lub martwych. Rysunki 4 b i d przedstawiają rozkład prawdopodobieństwa opisujący liczbę komórek w jednej kropelce.
Mapowanie zdarzeń mieszania z wykorzystaniem FLIM
Molekularny czas życia fluorescencji jest cechą wewnętrzną pojedynczego fluoroforu, na którą wpływa jedynie jego otoczenie chemiczne. W związku z tym jego pomiary mogą służyć do pozyskiwania informacji o środowisku (takich jak pH roztworu, temperatura, polarność i lepkość) z rozdzielczością i precyzją wyższą niż w przypadku pomiarów fluorescencji całkowitej (zintegrowanej w czasie), które zależą od czynników eksperymentalnych (takich jak stężenie, intensywność wzbudzenia i wydajność zbierania światła).9,11
Jak przedstawiono w innym opracowaniu,8 możliwe jest mapowanie wzorców mieszania wewnątrz kropli przy użyciu dwóch fluoroforów o różnych wartościach czasu życia. W mieszaninie zawierającej dwa (nieoddziałujące ze sobą) gatunki fluorescencyjne zanik będzie miał formę bieksponecjalną, co przedstawiono w równaniu 1:
Poszczególne czasy życia definiuje się jako τ1 i τ2, a amplitudy poszczególnych składowych są określone odpowiednio przez α1 i α2. Średni czas życia można wówczas zdefiniować w następujący sposób:
gdzie β1 i β2 to ułamki każdego z komponentów, zdefiniowane w następujący sposób:
Ponieważ objętość sondy jest stała, a kropelki przepływają przez tę pozycję, można w ten sposób uzyskać trajektorię wartości czasu życia wzdłuż długości kropelek dla danej szerokości. Charakterystyczną trajektorię dla konkretnej szerokości, uśrednioną dla 6000 kropelek, można zaobserwować na Rysunku 5a.
Połączenie trajektorii na całej szerokości kanału prowadzi do utworzenia dwuwymiarowej mapy stężeń (lub mieszania). Typowy wynik przedstawiono na Rysunku 5b.
Dzięki uśrednieniu wyników z dużej liczby kropelek można znacznie zredukować błąd standardowy uzyskanych rezultatów (błąd standardowy na poziomie 1% przy 95% przedziale ufności dla Rysunku 5a). Metoda wyznaczania trajektorii czasu życia zakłada, że wszystkie kropelki są praktycznie identyczne. Wykazano, że założenie to jest w dużej mierze prawidłowe z dwóch głównych powodów: gdyby kropelki znacząco się od siebie różniły, uzyskane uśrednione trajektorie czasu życia miałyby bardziej płaskie, mniej rozbieżne profile (podczas gdy wzdłuż długości uśrednionych kropelek konsekwentnie wykrywane są wyraźne różnice w czasie życia). Co więcej, wyniki są powtarzalne niezależnie od analizowanych poszczególnych kropelek czy liczby kropelek wykorzystanych w obliczeniach.8
Rycina 1. Schemat procesu wytwarzania chipa mikroprzepływowego.
Rycina 2. a) Schemat przedstawiający pompy strzykawkowe i strzykawki połączone z chipem mikrofluidycznym do tworzenia kropel; b) Schematyczny rysunek typowego układu optycznego do wzbudzenia i detekcji dwóch laserów i dwóch fluoroforów (zielonego i czerwonego). DC = Lustro dichroiczne, EM = Filtr emisyjny, L = Soczewka, PH = Otwór przypomiarowy (pinhole), APD = Detektor fotodiodowy lawinowy.
Rycina 3. Strategie formowania kropli na chipie: a) konfiguracja ogniskowania przepływu; b) konfiguracja złącza T. c) Enkapsulacja na chipie w kroplach dwóch pierwotnie oddzielnych odczynników wodnych.
Rycina 4. Odczyt optyczny śladów o czasie trwania 0,2 s zarejestrowanych dla (a) komórek martwych oraz (c) komórek żywych (przepływy dla zawiesiny komórkowej: 1 μl min-1, oleju: 2 μl min-1). Każdy sygnał w kształcie łuku odpowiada słabo fluorescencyjnemu pożywce LB tworzącej kroplę wodną, przy czym granice kropli zaznaczono liniami przerywanymi. Sygnały zielone reprezentują odczyt przy długości fali 633nm, a sygnały czerwone przy długościach fal powyżej 633 nm. Komórki są rozpoznawane po pionowym piku wynikającym z działania barwników interkalujących DNA. Rozkład prawdopodobieństwa obecności komórek w pojedynczych kroplach dla (b) komórek martwych i (d) komórek żywych.
Rysunek 5. a) Typowa uśredniona trajektoria czasu życia wzdłuż długości kropli przy określonej szerokości; b) Typowa reprezentacja kombinacji wszystkich uśrednionych trajektorii badanych wzdłuż pełnej szerokości kropli w formie dwuwymiarowej mapy czasu życia (lub stężenia, wyrażonego jako % FITC / % Str-AF488).
Dyskusja
Opisaliśmy proces wykonania urządzenia mikroprzepływowego, konfigurację eksperymentalną oraz powiązane protokoły formowania mikrokropli, enkapsulacji odczynników i detekcji optycznej przetworzonych kropli. Wybrane dwa przykłady (detekcja pojedynczych komórek w kroplach oraz mapowanie procesów mieszania wewnątrz płynących kropli) reprezentują powszechne zastosowania, które są obecnie badane przy użyciu mikroprzepływów kropelkowych.
Jak pokazują przedstawione eksperymenty, wykorzystanie mikrofluidycznych platform kropelkowych oferuje pewne atrakcyjne cechy, takie jak wysoka przepustowość, niemal idealne zamknięcie oraz wysoka powtarzalność... Jednak ogromna ilość generowanych danych i wysoka prędkość ich powstawania wymagają zastosowania szybkich metod detekcji o wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej, aby w pełni wykorzystać zalety tych zminiaturyzowanych platform. W niniejszym przypadku wykazujemy, że jest to możliwe dzięki zastosowaniu precyzyjnych technik spektroskopii fluorescencyjnej. W szczególności technika detekcji FLIM (wykorzystująca laser impulsowy z okresami powtarzania rzędu zaledwie kilku ns) pozwala na błyskawiczne pozyskiwanie informacji z szybko przepływających kropli (około 200 na sekundę). W tym przypadku rozdzielczość czasowa wykrywanych zdarzeń wynosiła nawet 1 μs. Jeśli chodzi o ograniczenia dotyczące wielkości kropli i stężeń, zastosowanie soczewek o większej aperturze numerycznej oraz laserów o większej mocy pozwoliłoby z łatwością na detekcję stężeń rzędu nM w kroplach o wielkości nawet 5 μm (przy czym ograniczenia w wielkości kropli wynikają z rozdzielczości procesu wytwarzania fotolitograficznego oraz stopnia pozycjonowania submikronowego).
Krople mikroprzepływowe są idealnymi nośnikami do przeprowadzania szeroko zakrojonych eksperymentów z użyciem niewielkich ilości odczynników, aż do poziomu pojedynczego celu lub zdarzenia. Obecne ograniczenia tej technologii wiążą się z trudnością w wysokoprzepustowym generowaniu kropel z bardzo wielu (dziesiątek lub setek) różnych źródeł. Ponadto trudności w celowaniu i manipulowaniu każdą pojedynczą wygenerowaną kroplą nakładają poważne ograniczenia na praktyczną aplikowalność tych technik. W związku z tym kwestie te znajdują się w centrum istotnych wysiłków badawczych, których celem jest opracowanie niezbędnych rozwiązań technologicznych, które pozwolą platformom mikroprzepływowym opartym na kroplach stać się standardową metodą referencyjną badań i analiz w zastosowaniach wysokoprzepustowych.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować za wsparcie następującym radom badawczym i grantom: EPSRC, HFSP, National Research Foundation of Korea (numer grantu R11-2009-044-1002-0K20904000004-09A050000410).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Izotiocyjanian fluoresceiny (FITC) | Odczynnik | Sigma-Aldrich | F3651 | |
| Streptawidyna-Alexa Fluor 488 | Odczynnik | Molecular Probes, Life Technologies | S11223 | |
| Perfluorodekalina | Odczynnik | Sigma-Aldrich | P9900 | |
| 1H,1H,2H,2H-perfluorooktanol | Odczynnik | Sigma-Aldrich | 370533 | |
| Zestaw do elastomeru silikonowego Sylgard 184 | Odczynnik | Premier Farnell UK LTD | 1673921 | |
| auramina-O | Odczynnik | Sigma-Aldrich | 861030 | |
| Impulsowy laser diodowy 485 nm | Sprzęt | PicoQuant | LDH-P-C-485 | |
| Karta TCSPC | Sprzęt | PicoQuant | TimeHarp 100 | |
| Lustro dichroiczne | Sprzęt | Chroma Technology Corp. | z488rdc, | |
| Obiektyw mikroskopowy | Sprzęt | Olympus Corporation | UPLSAPO 60XW | |
| Fotodioda lawinowa | Sprzęt | PerkinElmer, Inc. | AQR-141 | |
| DMEM | Odczynnik | Invitrogen | ABCD1234 | |
| SYTO9 | Odczynnik | Invitrogen | S34854 | |
| Jodek propidyny | Odczynnik | Invitrogen | P3566 | |
| Escherichia coli szczep top 10 | Komórki | Invitrogen | C4040-10 |
Bibliografia
- Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442, 368-368 (2006).
- Zheng, B., Angew, I. smagilov, F, R. A Microfluidic Approach for Screening Submicroliter Volumes against Multiple Reagents by Using Preformed Arrays of Nanoliter Plugs in a Three-Phase Liquid/Liquid/Gas Flow. Chem. Int. Ed. 44, 2520-2520 (2005).
- Huebner, A., Sharma, S., Srisa-Art, M., Hollfelder, F., Edel, J. B., Demello, A. J. Microdroplets: A sea of applications. Lab on a Chip. 8, 1244-1244 (2008).
- deMello, A. J. Control and detection of chemical reactions in microfluidic systems. Nature. 442, 394-394 (2006).
- Thorsen, T., Roberts, R. W., Arnold, F. H., Quake, S. R. Dynamic pattern formation in a vesicle-generating microfluidic device. Phys. Rev. Lett. 86, 4163-4163 (2001).
- Anna, S. L., Bontoux, N., Stone, H. A. Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels. Appl. Phys. Lett. 82, 364-364 (2003).
- Casadevall i Solvas, X., Srisa-Art, M., deMello, A. J., Edel, B. J. Mapping of Fluidic Mixing in Microdroplets with 1 μs Time Resolution Using Fluorescence Lifetime Imaging. Anal. Chem. 82, 3950-3950 (2010).
- Robinson, T. A., Schaerli, Y., Wootton, R., Hollfelder, F., Dunsby, C., Baldwin, G., Neil, M., French, P., deMello, A. J. Removal of background signals from fluorescence thermometry measurements in PDMS microchannels using fluorescence lifetime imaging. Lab. Chip. 9, 3437-3441 (2009).
- Huebner, A., Srisa-Art, M., Holt, D., Abell, C., Hollfelder, F., deMello, A. J., Edel, J. B. Quantitative detection of protein expression in single cells using droplet microfluidics. Chem. Commun. 1218, (2007).
- Edel, J. B., Eid, J. S., Meller, A. Accurate single molecule FRET efficiency determination for surface immobilized DNA using maximum likelihood calculated lifetimes. J. Phys. Chem. B. 73, 2986-2990 (2007).
Przedruki i uprawnienia
