Synteza, montaż i charakterystyka filmów z nanocząsteczek złota chronionych monowarstwą do elektrochemii monowarstw białek

Podsumowanie

Koloidy złota stabilizowane alkanotiolanami, znane jako klastry chronione monowarstwą (MPCs), są syntetyzowane, charakteryzowane i montowane w cienkie filmy służące jako interfejs adsorpcyjny dla elektrochemii monowarstw białkowych w przypadku prostych białek redoks, takich jak azuryna (AZ) z Pseudomonas aeruginosa oraz cytochrom c (cyt c).

Streszczenie

Koloidalne nanocząstki złota chronione ligandami alkanotiolanowymi, nazywane monowarstwowymi chronionymi klastrami złota (MPCs), są syntetyzowane, a następnie włączane do struktur filmowych, które służą jako platformy adsorpcyjne dla elektrochemii monowarstw białkowych (PME). PME jest wykorzystywane jako system modelowy do badania właściwości elektrochemicznych białek redoks poprzez ograniczenie ich do platformy adsorpcyjnej na modyfikowanej elektrodzie, która służy również jako partner redoks w reakcjach przeniesienia elektronów (ET). Badania wykazały, że struktury filmowe z nanocząstek złota tego typu zapewniają bardziej jednorodne środowisko adsorpcji białek i wspomagają ET bez zależności od odległości w porównaniu do bardziej tradycyjnych systemów modyfikowanych samoorganizującymi się monowarstwami (SAM) alkanotioli.^1-3 W niniejszej pracy MPC funkcjonalizowane ligandami heksanotiolanowymi są syntetyzowane przy użyciu zmodyfikowanej reakcji Brusta⁴ i charakteryzowane za pomocą spektroskopii ultrafioletowej i widzialnej (UV-Vis), transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) oraz protonowego (¹H) rezonansu magnetycznego jądrowego (NMR). Filmy MPC są osadzane na powierzchniach elektrod złota modyfikowanych SAM przy użyciu metody „cyklu zanurzeń” polegającej na naprzemiennym nakładaniu warstw MPC i cząsteczek łączących z ditiolu. Wzrost filmu na elektrodzie złotej jest monitorowany elektrochemicznie poprzez pomiar zmian prądu ładowania warstwy podwójnej układu. Analogiczne filmy osadzone na szklanych płytkach modyfikowanych silanami umożliwiają optyczne monitorowanie wzrostu filmu, a analiza TEM w przekroju pozwala na oszacowanie grubości filmu. Podczas formowania filmu manipulacja ochroną ligandów MPC, a także mechanizm wiązania międzycząsteczkowego, pozwalają na uzyskanie sieciowych filmów, które są łatwo adaptowalne do interfejsu z białkami redoks o różnych mechanizmach adsorpcji. Na przykład azuryna (AZ) z Pseudomonas aeruginosa może być adsorbowana hydrofobowo do filmów z MPC heksanotiolanowych łączonych ditiolem, a cytochrom c (cyt c) może być immobilizowany elektrostatycznie na warstwie interfejsowej MPC modyfikowanej kwasem karboksylowym. W niniejszym raporcie skupiamy się wyłącznie na protokole tworzenia filmu dla systemu AZ. Badania dotyczące adsorpcji białek na syntetycznych platformach modyfikowanych MPC mogą pogłębić zrozumienie oddziaływań między biomolekułami a materiałami sztucznymi i w konsekwencji pomóc w opracowaniu schematów biosensorów, systemów modelowania ET oraz syntetycznych materiałów biokompatybilnych.^5-8

Protokół

1. Synteza klastrów złota chronionych monowarstwą heksanotiolanową

Monowarstwy chronionych klastrów złota (MPCs) funkcjonalizowane heksanotiolanami są syntetyzowane przy zachowaniu stosunku molowego 1-heksanotiolu (C6) do złota wynoszącego 2:1, w celu otrzymania średniej struktury Au₂₂₅(C6)₇₅. ^4-9 Specyficzne modyfikacje reakcji Brusta, takie jak rodzaj ligandu, konkretne stosunki tiolu do złota, temperatura i szybkość dozowania reagentów w reakcji lub obróbka po syntezie, ^9-11 mogą pozwolić na uzyskanie różnorodnej gamy MPCs o zróżnicowanych rozmiarach rdzenia i odpowiednio różnych funkcjonalnych grup ochronnych.⁴ Przybliżony (średni) skład MPCs funkcjonalizowanych różnymi grupami alkanotiolowymi można określić za pomocą analizy protonowego (¹H) rezonansu magnetycznego jądrowego (NMR) próbek rozkładanych jodem.

1. Rozpuścić 1,1 g bromku tetraoktyloamoniowego (TOABr) w 30 mL toluenu w odpowiednio wentylowanej komorze z dygestorium.
2. Rozpuścić 0,38 g borowodorku sodu (NaBH₄) w ok. 20 mL ultraczystej wody (UP H₂O) o oporności 18 MΩ i schładzać w łaźni lodowej przez co najmniej 30 min.
3. Rozpuścić 0,31 g kwasu tetrachlorozłotowego (HAuCl₄) w ok. 20 mL UP H₂O i ilościowo przenieść mieszaninę roztworów do roztworu TOABr w toluenie, używając dodatkowych ok. 5 mL UP H₂O, aby przeprowadzić transfer fazowy wodnego roztworu złota do fazy niewodnej. Mieszać intensywnie przy lekko zamkniętym naczyniu przez 30 min, aż do dokładnego wymieszania ciemnopomarańczowej fazy wodnej i bezbarwnej fazy niewodnej.
4. Przenieść obie fazy – bezbarwną wodną i ciemnopomarańczową niewodną – do rozdzielacza. Odrzucić warstwę wodną (dolną) i odlać warstwę niewodną (górną) do czystej kolby.
5. Do roztworu niewodnego dodać C6 w stosunku 2:1 w stosunku do HAuCl₄. Mieszać przez 30 min w celu utworzenia polimeru Au(I), co objawia się zmianą barwy z czerwonopomarańczowej na bladożółtą, niemal bezbarwną.
6. Przenieść mieszaninę reakcyjną do izolowanej łaźni lodowej i schładzać do 0°C przez co najmniej 30 min przy ciągłym mieszaniu.
7. Ilościowo i szybko dodać schłodzony roztwór NaBH₄ do mieszaniny reakcyjnej, aby zredukować Au(I) do złota metalicznego w obecności tioli, co spowoduje natychmiastowe powstanie gęstego, czarnego roztworu MPCs. Mieszać mieszaninę reakcyjną przez noc w temperaturze 0°C.
8. Przenieść mieszaninę reakcyjną do rozdzielacza, odlać warstwę wodną (dolną) do zlewki na odpady, a niewodną warstwę toluenu (górną) odparować w rotavaporze niemal do suchości, aż w kolbie pozostanie gęsty, czarny osad.
9. Wytrącić MPCs poprzez dodanie acetonitrylu i pozostawić na noc.
10. Zebrać MPCs poprzez filtrację próżniową za pomocą szklanego frity o średniej porowatości z gumowymi uszczelkami i kolby z bocznym wylotem podłączonej do aspiratora, a następnie przemyć obficie acetonitrylem.
11. Pozostawić MPCs do wyschnięcia na powietrzu, zważyć produkt, scharakteryzować go za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) oraz analizy NMR, a następnie przechowywać w zamkniętym naczyniu do przyszłego użycia. Obrazy TEM uzyskać poprzez naniesienie kroplą MPCs rozpuszczonych w toluenie na folię wsporczą formvar/węgiel na siatce miedzianej (400 mesh), pracując na urządzeniu TEM przy napięciu 80-100 kV. Średnią wielkość rdzenia można oszacować przy użyciu oprogramowania do analizy obrazów, np. Image J (oprogramowanie bezpłatne).

2. Formowanie filmu: Formowanie filmu MPC sieciowanego ditiolami do elektrochemii monowarstw białkowych

Podłoże złote jest najpierw oczyszczane elektrochemicznie i modyfikowane za pomocą SAM C6 przed zanurzeniem w naprzemiennych roztworach cząsteczek łączących ditiolowych i zmodyfikowanych C6 MPC w celu przeprowadzenia „cyklu zanurzania”, który jest powtarzany kilkukrotnie, aby ostatecznie utworzyć zespół filmu MPC połączonego ditiolem. Jak opisano w poprzednich badaniach,² oryginalny plazmid dla białka azuryny (AZ) Pseudomonas aeruginosa został uprzejmie przekazany przez dr. Coreya Wilsona z Rice University, natomiast AZ został dostarczony w formie oczyszczonego i liofilizowanego proszku przez profesora University of Richmond, dr. Jonathana Dattelbauma; następnie go rehydratowano w 4,4 mM buforze fosforanowym potasu (KPB, pH = 7.0, μ = 10 mM), aby przygotować roztwór o stężeniu 5-10 μM, co zweryfikowano za pomocą analizy spektroskopowej w zakresie ultrafioletu i światła widzialnego (UV-Vis).

1. Zmontuj elektrochemiczną (echem) celę kanapkową w następującej kolejności, od dołu do góry: pierwsza płyta mocująca z Lucitu, podłoże złote jako elektroda robocza, mosiężny styk elektryczny do złotej elektrody roboczej, pierwsza uszczelka gumowa, o-ring z Vitonu definiujący obszar elektrody (0,32 cm²), szklany korpus celi, druga uszczelka gumowa oraz druga płyta mocująca z Lucitu. Cała cela jest utrzymywana w całości przez pręty gwintowane i starannie dokręcone nakrętki motylkowe. Cela jest wyposażona w zakupioną komercyjnie elektrodę odniesienia, która zawiera szklany cylinder z 1 M nasyconym KCl, drut odniesienia Ag/AgCl oraz drut elektrody pomocniczej z Pt.
2. Oczyść elektrochemicznie złote podłoże, wykonując woltampetrię cykliczną (CV) w oknach potencjału od 0,2 do 0,9 V, 0,2 do 1,2 V oraz 0,2 do 1,35 V (względem Ag/AgCl, KCl) przy prędkości 100 mV/s w roztworze 0,1 M H₂SO₄ i 0,01 M KCl.
3. Zmierz prąd ładowania oczyszczonego, gołego złotego podłoża, wykonując CV w „standardowych warunkach”, obejmujących okno potencjału od 0,1 do 0,4 V (względem Ag/AgCl, KCl) przy skanowaniu 100 mV/s w KPB.¹ Odlej KPB i płucz sukcesywnie UP H₂O, etanolem (EtOH), UP H₂O i EtOH.
4. Poddaj oczyszczone złote podłoże działaniu ˜300 μl 5 mM roztworu C6 w EtOH i pozostaw go na noc w celu utworzenia uporządkowanej SAM C6. Odlej roztwór C6 z celi i płucz sukcesywnie EtOH, UP H₂O, EtOH i UP H₂O.
5. Zmierz prąd ładowania SAM w standardowych warunkach. Odlej KPB i płucz sukcesywnie UP H₂O, EtOH, UP H₂O i EtOH. Prąd ładowania powinien być wyraźnie niższy niż w przypadku pomiaru dla gołego złota (krok 2.3).¹
6. Poddaj złote podłoże zmodyfikowane SAM działaniu ˜300 μl 5 mM roztworu 1,9-nonanditiolu (NDT) w EtOH i pozostaw na 1 h, aby cząsteczki łączące NDT wbudowały się w SAM C6. Odlej roztwór NDT i płucz sukcesywnie i dokładnie EtOH, UP H₂O, EtOH, UP H₂O oraz chlorkiem metylenu (CH₂Cl₂).
7. Poddaj złote podłoże działaniu roztworu MPC w CH₂Cl₂ (˜1 mg/mL) przy mieszaniu poprzez powolne przesycanie gazem N₂ przez 1 h. W razie potrzeby uzupełnij odparowany roztwór MPC dodatkowym CH₂Cl₂. Jest to kotwicząca warstwa MPC zespołu filmu. Odlej roztwór MPC i ponownie płucz sukcesywnie CH₂Cl₂, UP H₂O oraz KPB.
8. Zmierz prąd ładowania warstwy MPC w standardowych warunkach. Odlej KPB i płucz sukcesywnie UP H₂O oraz CH₂Cl₂.
9. Poddaj złote podłoże działaniu ˜300 μl 5 mM roztworu NDT w CH₂Cl₂ przy mieszaniu poprzez powolne przesycanie gazem N₂ przez 20 min.
10. Odlej NDT i płucz dokładnie CH₂Cl₂. Powtórz kroki 2.7 i 2.8, aby nanieść drugą warstwę MPC zespołu filmu.
11. Aby nanieść dodatkowe warstwy MPC, powtórz kroki 2.9 i 2.10. Przy każdej dodatkowej warstwie MPC obserwuje się odpowiadający jej wzrost prądu ładowania.
12. Po utworzeniu sieciowego filmu MPC wypłucz zmodyfikowane podłoże za pomocą KPB. Białko AZ adsorbuj na zespole filmu MPC, wstrzykując ˜150 μL ˜5-10 μM roztworu AZ w KPB do elektrochemicznej celi kanapkowej i pozostawiając ją zamkniętą w lodówce przez co najmniej 1 h.
13. Wyjmij celę elektrochemiczną z lodówki i pozwól jej powrócić do temperatury bliskiej pokojowej. Wypłucz dokładnie KPB, napełnij ponownie celę KPB i przesycaj KPB gazem N₂ przez 10 min.
14. Elektrochemiczne badania monowarstwy białkowej wykonuje się jako CV w oknie potencjału od -0,25 V do 0,25 V (względem Ag/AgCl, KCl) przy skanowaniu 100 mV/sec w KPB.

3. Montaż filmu: Montaż filmu MPC powiązanego ditiolem do śledzenia optycznego

Przed hodowlą filmów MPC do oceny optycznej, fragmenty szkiełek przedmiotowych są wstępnie oczyszczane roztworem Piranha (UWAGA! stężony H₂SO₄ i H₂O₂ w stosunku 2:1) i traktowane (3-merkaptopropyl)-trimetoksysilanem (3-MPTMS).^1-2 Następnie filmy MPC są osadzane na tych zmodyfikowanych szkiełkach szklanych przy użyciu techniki „cyklu zanurzeniowego” (dip cycle), zgodnie z wcześniejszym opisem.

1. Opłucz szkiełko modyfikowane 3-MPTMS przy użyciu CH₂Cl₂ i umieść je w roztworze MPC w CH₂Cl₂ (˜1 mg/mL) na 1 hr, wytrząsając na wytrząsarce z niską prędkością. Dopełnia to formowanie pierwszej warstwy MPC w strukturze filmu poprzez zakotwiczenie MPC do grup końcowych merkaptanów silanu. Dokładnie opłucz szkiełko CH₂Cl₂ i wysusz strumieniem gazu N₂. Wykonaj widmo UV-Vis (od 400 do 1000 nm) szkiełka, a następnie ponownie opłucz je CH₂Cl₂.
2. Umieść szkiełko w 5 mM roztworze NDT w CH₂Cl₂ na 1 hr, wytrząsając na wytrząsarce z niską prędkością. Opłucz szkiełko CH₂Cl₂.
3. Umieść szkiełko w roztworze MPC na 1 hr, wytrząsając na wytrząsarce z niską prędkością. Dopełnia to formowanie drugiej warstwy MPC w strukturze filmu. Dokładnie opłucz szkiełko CH₂Cl₂, wysusz strumieniem gazu N₂ i wykonaj widmo UV-Vis (od 400 do 1000 nm) szkiełka. Absorbancja w całym widmie powinna wzrastać wraz z adsorpcją kolejnych warstw MPC do struktury filmu.
4. Aby osadzić dodatkowe warstwy MPC, powtarza się kroki 3.2-3.3.

4. Charakterystyka struktur filmu z klastrów złota chronionych monowarstwą za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej w przekroju poprzecznym

Przekroje poprzeczne do TEM przygotowuje się poprzez ponowne zatopienie w żywicy filmów zatopionych en face.^{2, 12} W tym celu najpierw przymocowuje się film MPC osadzony na szkiełku przedmiotowym zmodyfikowanym 3-MPTMS do czystego, standardowego szkiełka przedmiotowego, używając żywicy epoksydowej Embed 812, aby ułatwić manipulację podczas poniższej procedury. Należy zachować ostrożność przy stosowaniu ciepła, ponieważ wyższe temperatury spowodują rozkład MPC w filmie.

1. Wymieszać żywicę epoksydową Embed 812 i pozostawić do zagęszczenia na co najmniej 12 hr.
2. Wypełnić kapsułkę BEEM typu „00” żywicą epoksydową i odwrócić ją na próbce filmu MPC (przygotowanej w sekcji 3). Przyłożyć nacisk do kapsułki tak, aby pęcherzyk powietrza uniósł się do góry, tworząc uszczelnienie między żywicą epoksydową a próbką filmu MPC. Pozostawić do polimeryzacji na co najmniej 18 hr w temperaturze 60°C, a następnie schłodzić zamontowane szkiełka do temperatury pokojowej.
3. Podgrzewać zamontowane szkiełka przez 20 sec na aluminiowej płycie grzejnej w temperaturze 200°C, aby ułatwić usunięcie bloku z przymocowanym filmem MPC en face.
4. Odciąć próbkę zawierającą film od bloku kapsułki BEEM za pomocą piłki jubilerskiej.
5. Ponownie zatopić usuniętą część w płaskiej formie silikonowej, stroną z filmem MPC skierowaną do góry, w stronę wnętrza wgłębienia silikonowego. Wypełnić wgłębienie silikonowe żywicą epoksydową w temperaturze pokojowej i pozostawić do polimeryzacji na co najmniej 18 hr w temperaturze 60°C. Schłodzić próbkę do temperatury pokojowej.
6. Przygotować cienkie sekcje próbki o grubości 60-80 nm na ultramikrotomie Leica UCT, używając noża diamentowego do cięcia sekcji prostopadle do krawędzi noża.
7. Nanieść wycięte sekcje na nośną folię formvar/węgiel na siatce miedzianej (400 mesh) i wykonać obrazy TEM przygotowanych przekrojów poprzecznych struktur filmu MPC.

5. Reprezentatywne wyniki:

Rycina 1 Monitorowanie prądu ładowania warstwy podwójnej podczas wzrostu filmu MPC przez łącznie 5 cykli zanurzania (naprzemienna ekspozycja na roztwory MPC i NDT). Prąd ładowania systematycznie wzrastał z każdym cyklem zanurzania, dodając „warstwy” MPC do filmu (Ryc. 2). Woltamperogramy cykliczne zarejestrowano w oknie potencjałów od 0,1 do 0,4 V (względem Ag/AgCl, KCl) przy prędkości skanowania 100 mV/s w 4,4 mM buforze fosforanowym potasu (pH = 7,0, μ = 10 mM). Przedrukowano za zgodą M.L. Vargo, C.P. Gulka, J.K. Gerig, C.M. Manieri, J.D. Dattelbaum, C.B. Marks, N.T. Lawrence, M.L. Trawick i M.C. Leopold, Langmuir 26(1), 560-569. Copyright 2010 American Chemical Society.

Rysunek 2 (a) Schematyczne przedstawienie białka AZ zaadsorbowanego na zestawieniu filmu MPC połączonego ditiolem. (b) Typowy woltamperogram cykliczny dla białka AZ zaadsorbowanego na zestawieniu filmu MPC, zarejestrowany w oknie potencjałów od -0.25 do +0.25 V (względem Ag/AgCl, KCl) przy szybkości skanowania 100 mV/s w 4.4 mM buforze fosforanowym potasu (pH = 7.0, μ = 10 mM).

Rysunek 3 Reprezentatywny monitoring widm UV-Vis wzrostu filmu MPC połączonego ditiolem na szkiełku modyfikowanym 3-MPTMS. Cykl zanurzania składa się z ekspozycji szkiełka na roztwór łącznika NDT, a następnie na roztwór MPC. Każde kolejne zanurzenie prowadzi do wzrostu grubości filmu i jednoczesnego wzrostu absorbancji. Wraz ze wzrostem liczby cykli zanurzania, prążek plazmonu powierzchniowego stopniowo kształtuje się przy ˜520 nm. Przedrukowano za zgodą M.L. Vargo, C.P. Gulka, J.K. Gerig, C.M. Manieri, J.D. Dattelbaum, C.B. Marks, N.T. Lawrence, M.L. Trawick i M.C. Leopold, Langmuir 26(1), 560-569. Copyright 2010 American Chemical Society.

Rycina 4 Analiza obrazu przekroju w transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) struktury filmu MPC połączonego ditiolami. Wstawka: Typowy obraz TEM MPC funkcjonalizowanych heksanotiolanem użytych w strukturze filmu. Analiza TEM przy użyciu programu Image J pozwoliła określić średnicę rdzenia złota MPC na poziomie ˜2 nm. Przedrukowano za zgodą M.L. Vargo, C.P. Gulka, J.K. Gerig, C.M. Manieri, J.D. Dattelbaum, C.B. Marks, N.T. Lawrence, M.L. Trawick oraz M.C. Leopold, Langmuir 26(1), 560-569. Copyright 2010 American Chemical Society.

Dyskusja

Elektrochemia monowarstw białkowych jest skuteczną techniką stosowaną do badania oddziaływań między białkami redoks a syntetycznymi platformami adsorpcyjnymi. Skuteczność tej strategii zależy jednak od możliwości zaprojektowania interfejsu adsorpcyjnego z wysokim stopniem kontroli na poziomie molekularnym. Platformy oparte na MPC stworzone zgodnie z tym protokołem stanowią specjalnie zaprojektowane układy, które są w stanie zapewnić bardziej jednorodne środowisko adsorpcji białek³ oraz ułatwić ET na większym d...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bromek tetraoktyloamoniu	Sigma-Aldrich	294136
Borowodorek sodu	Sigma-Aldrich	213462
Tetrachloroauran(III) wodoru	Sigma-Aldrich	254169-5G
1-Heksanotiol	Sigma-Aldrich	234192
Transmisyjny mikroskop elektronowy	JEOL	1010
Spektrometr magnetycznego rezonansu jądrowego	Bruker Corporation	300 MHz
Siatka miedziana (400 mesh) z warstwą Formvar/węgiel	Electron Microscopy Sciences	FCF400-Cu
Podłoże złote	Evaporated Metal Films Corp.	Custom
Elektroda odniesienia Ag/AgCl	Microelectrodes, Inc.	MI-401F
Potencjostaty	CH Instruments, Inc.	CHI650A, CHI610B
1,9-Nonanoditiol	Sigma-Aldrich	N29805
(3-merkaptopropyl)-trimetoksysilan	Sigma-Aldrich	175617
Spektrofotometr UV-Vis	Agilent Technologies	8453
Żywica epoksydowa Embed 812	Electron Microscopy Sciences	14120
"00" kapsułka BEEM	Electron Microscopy Sciences	70000-B
Krzemowa forma płaska	Electron Microscopy Sciences	70900
Nóż diamentowy	Diatome	21-ULE, S12801