Synteza, montaż i charakterystyka jednowarstwowych folii nanocząstek złota chronionych w elektrochemii monowarstw białkowych

Podsumowanie

Koloidy złota stabilizowane alkanethiolate, znane jako monowarstwowe klastry chronione (MPC), są syntetyzowane, charakteryzowane i składane w cienkie warstwy jako interfejs adsorpcji dla elektrochemii monowarstwowej białka białkowego prostego białka redoks, takiego jak azuryna Pseudomonas aeruginosa (AZ) i cytochrom c (cyt c).

Streszczenie

Nanocząstki złota koloidalnego zabezpieczone ligandami alkanethiolate, zwane monolayer protected gold clusters (MPC), są syntetyzowane, a następnie włączane do zespołów foliowych, które służą jako platformy adsorpcyjne dla elektrochemii jednowarstwowej białka (PME). PME jest wykorzystywany jako system modelowy do badania właściwości elektrochemicznych białek redoks poprzez ograniczenie ich do platformy adsorpcyjnej na zmodyfikowanej elektrodzie, która służy również jako partner redoks w reakcjach transferu elektronów (ET). Badania wykazały, że tego rodzaju zespoły folii z nanocząstek złota zapewniają bardziej jednorodne środowisko adsorpcji białek i promują ET bez zależności od odległości w porównaniu z bardziej tradycyjnymi systemami zmodyfikowanymi za pomocą samoorganizujących się monowarstw alkanetiolu (SAM). ^1-3 W tym artykule MPC funkcjonalizowane ligandami heksanotiolanu są syntetyzowane przy użyciu zmodyfikowanej reakcji Brusta⁴ i charakteryzowane za pomocą spektroskopii ultrafioletowej w świetle widzialnym (UV-Vis), transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) i magnetycznego rezonansu jądrowego protonów (¹H) (NMR). Folie MPC są montowane na interfejsach złotych elektrod modyfikowanych SAM przy użyciu metody "cyklu zanurzenia" polegającej na naprzemiennym naprzemiennym stosowaniu warstw MPC i cząsteczek łączących ditiole. Wzrost filmu na złotej elektrodzie jest śledzony elektrochemicznie poprzez pomiar zmian prądu ładowania podwójnej warstwy systemu. Analogiczne folie montowane na szkiełkach modyfikowanych silanem pozwalają na optyczne monitorowanie wzrostu folii, a przekrojowa analiza TEM pozwala na oszacowanie grubości folii. Podczas montażu folii, manipulacja ochroną liganda MPC, a także mechanizmem łączenia międzycząsteczkowego, pozwala na tworzenie folii sieciowych, które są łatwo adaptowalne, do interakcji z białkiem redoks o różnym mechanizmie adsorpcji. Na przykład azuryna Pseudomonas aeruginosa (AZ) może być adsorbowana hydrofobowo do połączonych ditioolem warstw heksanotiolanu MPC, a cytochrom c (cyt c) może być unieruchomiony elektrostatycznie w warstwie międzyfazowej MPC zmodyfikowanej kwasem karboksylowym. W niniejszym raporcie skupimy się wyłącznie na protokole filmowym dla systemu AZ. Badania nad adsorpcją białek na zmodyfikowanych platformach syntetycznych MPC mogą przyczynić się do lepszego zrozumienia interakcji między biomolekułami a materiałami wytworzonymi przez człowieka, a w konsekwencji pomóc w opracowaniu schematów biosensorów, systemów modelowania ET i syntetycznych materiałów biokompatybilnych. ^5-8 Rozdział

Protokół

1. Synteza jednowarstwowych klastrów złota chronionych jednowarstwowo heksanotiolanem

Jednowarstwowe klastry złota (MPC) funkcjonalizowane heksanotiolanem są syntetyzowane zgodnie ze stosunkiem molowym 1-heksanotiolu (C6) do złota 2:1, aby uzyskać średnią strukturę Au₂₂₅(C6)₇₅. ^4-9 Specyficzne modyfikacje reakcji Brust, takie jak typ liganda, specyficzne proporcje tiolu do złota, temperatura i szybkość dostarczania reakcji lub zabiegi po syntezie, ^9-11 mogą dać różnorodny zakres MPC o różnych rozmiarach rdzeni i funkcjonalnych grupach ochronnych, odpowiednio. ⁴ Przybliżony (średni) skład MPC MPC funkcjonalizowanych różnymi grupami alkanetioolowymi można określić za pomocą analizy magnetycznego rezonansu jądrowego (^NMR) protonów (1 H) próbek rozłożonych jodem.

1. Rozpuścić 1,1 g bromku tetraoktyloamonu (TOABr) w 30 ml toluenu przy odpowiedniej wentylacji dygestoriów.
2. Rozpuścić 0,38 g borowodorku sodu (NaBH₄) w °20 ml ultraoczyszczonej wody o mocy 18 MΩ (UP_{H 2}O) i pozostawić do schłodzenia nad lodem przez co najmniej 30 minut.
3. Rozpuścić 0,31 g wodorotetrachlorouranianu (HAuCl₄) w °20 ml UP_H2O i ilościowo przenieść mieszaninę roztworu do roztworu TOABr-toluenu za pomocą dodatkowego °5 ml UP_H2O w celu przeniesienia fazowego wodnego roztworu złota do roztworu niewodnego. Mieszaj rygorystycznie, lekko zakręcony przez 30 minut, aby spalona pomarańczowa, wodna i klarowna faza niewodna dobrze się wymieszały.
4. Przenieść zarówno klarowną, wodną, jak i spaloną pomarańczową fazę niewodną do rozdzielacza rozdzielającego. Odrzucić warstwę wodną (dolną) i zdekantować warstwę niewodną (górną) do czystej kolby.
5. Dodać C6 w stosunku 2:1 z HAuCl₄ do roztworu niewodnego. Mieszaj przez 30 minut, aby utworzyć polimer Au(I), który wykrywa się po zmianie koloru z czerwonawo-pomarańczowego na bladożółty, prawie bezbarwny roztwór.
6. Przenieść mieszaninę reakcyjną do izolowanej łaźni lodowej i schłodzić do temperatury 0°C przez co najmniej 30 minut, mieszając.
7. Ilościowo i szybko dodać schłodzony roztwór NaBH₄ do mieszaniny reakcyjnej w celu zredukowania Au(I) do metalicznego złota w obecności tioli, natychmiast tworząc gęsty roztwór MPC po dodaniu. Mieszać reakcję przez noc w temperaturze 0°C.
8. Przenieść mieszaninę reakcyjną do rozdzielacza rozdzielającego, wyrzucić warstwę wodną (dolną) do zlewki na odpady i rotacyjnie odparować niewodną (górną) warstwę toluenu do prawie całkowitego wyschnięcia, pozostawiając ciężki szlam w kolbie.
9. Wytrącić MPC, dodając acetonitryl i pozostawiając na noc.
10. Zebrać MPC przez filtrację próżniową przy użyciu fryty szklanej o średniej porowatości z gumowymi łącznikami i boczną kolbą z aspiratorem i przepłukać dużą ilością acetonitrylu.
11. Pozwól MPC wyschnąć na powietrzu, zważyć produkt, scharakteryzować za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) i analizy NMR, a następnie przechowywać w zakrytej pokrywie do wykorzystania w przyszłości. Obrazy TEM należy uzyskać, odlewając kroplowo MPC rozpuszczone w toluenie na folię nośną formwar/węglową na siatce miedzianej (400 oczek) i uruchamiając przyrząd TEM przy napięciu 80-100 kV. Średni rozmiar rdzenia można oszacować za pomocą oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak Image J (freeware).

2. Montaż folii: Zespół folii MPC połączony z ditiolem do elektrochemii białek jednowarstwowych

Złoty substrat jest najpierw elektrochemicznie czyszczony i modyfikowany za pomocą C6 SAM, a następnie zanurzany w naprzemiennych roztworach cząsteczek łączących ditiol i modyfikowanych C6 MPC, aby utworzyć "cykl zanurzenia", który jest powtarzany kilka razy, aby ostatecznie utworzyć zespół folii MPC połączony z ditiolem. Jak opisano we wcześniejszych badaniach,2 oryginalny plazmid białka azuryny Pseudomonas aeruginosa (AZ) został łaskawie podany przez dr Coreya Wilsona z Rice University, a AZ został dostarczony w postaci oczyszczonego i liofilizowanego proszku przez profesora Uniwersytetu w Richmond, dr Jonathana Dattelbauma, który następnie został ponownie uwodniony 4,4 mM buforem fosforanu potasu (KPB, pH = 7,0, μ = 10 mM) w celu wytworzenia roztworu 5-10 μM, co zweryfikowano za pomocą analizy w ultrafiolecie widzialnym (UV-Vis).

1. Zamontuj elektrochemiczne (echem) ogniwo warstwowe w następującej kolejności od dołu do góry: pierwsza płyta ustalająca Lucite, złote podłoże jako elektroda robocza, mosiężny styk elektryczny do złotej elektrody roboczej, pierwsza gumowa uszczelka, o-ring z Vitonu, który określa obszar elektrody (0,32 cm²), szklany korpus ogniwa, druga gumowa uszczelka i druga płyta ustalająca Lucite. Cała komórka jest utrzymywana razem za pomocą prętów gwintowanych i starannie dokręconych nakrętek motylkowych. Ogniwo jest wyposażone w komercyjnie zakupioną elektrodę referencyjną, w której znajduje się szklana lufa z 1 M nasyconym KCl, drutem odniesienia Ag/AgCl i drutem elektrody pomocniczej Pt.
2. Elektrochemicznie oczyścić złoty substrat, wykonując woltamperometrię cykliczną (CV) w oknach potencjału od 0,2 do 0,9 V, 0,2 do 1,2 V i 0,2 do 1,35 V (w porównaniu z Ag/AgCl, KCl) przy 100 mV/s w roztworze 0,1 M H₂SO₄ i 0,01 M KCl.
3. Zmierz prąd ładowania oczyszczonego podłoża z gołego złota, wykonując CV w "warunkach standardowych", w tym w oknie potencjału od 0,1 do 0,4 V (w porównaniu z Ag/AgCl, KCl) skanowanym przy 100 mV/s w KPB. ¹ Wyrzucić KPB i przepłukać kolejno UP_{H 2}O, etanolem (EtOH), UP_{H 2}O i EtOH.
4. Wystawić oczyszczone złote podłoże na działanie °300 μl 5 mM roztworu C6 w EtOH i pozostawić na noc, aby utworzyć uporządkowany C6 SAM. Odrzucić roztwór C6 z celi i przepłukać kolejno EtOH, UP H₂O, EtOH i UP H₂O.
5. Zmierz prąd ładowania SAM w standardowych warunkach. Wyrzucić KPB i spłukać kolejno UP_{H 2}O, EtOH, UP_{H 2}O i EtOH. Prąd ładowania powinien być znacznie zmniejszony w stosunku do pomiaru gołego złota (krok 2.3). ¹
6. Wystawić zmodyfikowany SAM złoty substrat na działanie °300 μl 5 mM roztworu 1,9-nonaneditiolu (NDT) w EtOH i pozostawić na 1 godzinę w celu interdyspersji cząsteczek łączących NDT w C6 SAM. Roztwór NDT należy wylać i spłukać kolejno i dokładnie spłukać EtOH, UP_{H 2}O, EtOH, UP_{H 2}O i chlorkiem metylenu (CH₂Cl₂).
7. Wystawić złoty substrat na działanie roztworu MPC CH₂Cl₂ ( ̃1 mg / ml) z mieszaniem przez powolne bulgotanie z gazem N₂ przez 1 godzinę. W razie potrzeby zastąp odparowany roztwór MPC większą ilością CH₂Cl₂. Jest to kotwiąca warstwa MPC zespołu folii. Wyrzucić roztwór MPC i ponownie przepłukać kolejno CH₂Cl₂, UP_{H 2}O i KPB.
8. Zmierz prąd ładowania warstwy MPC w standardowych warunkach. Wyrzucić KPB i spłukać kolejno UP_{H 2}O i CH₂Cl₂.
9. Wystawić złoty substrat na działanie 300 μl 5 mM roztworu NDT CH₂Cl₂ z mieszaniem przez powolne bulgotanie gazem_N2 przez 20 minut.
10. Wyrzucić NDT i dokładnie spłukać CH₂Cl₂. Powtórz kroki 2.7 i 2.8, aby nałożyć drugą warstwę MPC zespołu folii.
11. Aby zdeponować dodatkowe warstwy MPC, kroki 2.9 i 2.10 są powtarzane. Z każdą dodatkową warstwą MPC obserwuje się odpowiedni wzrost prądu ładowania.
12. Po skompletowaniu połączonej w sieć folii MPC, spłucz podłoże zmodyfikowane folią za pomocą KPB. Białko AZ jest adsorbowane na zespole folii MPC poprzez wstrzyknięcie ̃150 μL ̃5-10 μM roztworu AZ KPB do komórki kanapkowej echem i pozostawienie w zamknięciu i schłodzeniu przez co najmniej 1 godzinę.
13. Wyjmij komórkę echem z lodówki i pozwól jej powrócić do temperatury zbliżonej do pokojowej. Dokładnie spłucz KPB, napełnij komorę echem KPB i bańkuj KPB gazem N₂ przez 10 minut.
14. Badania elektrochemiczne jednowarstwowych białek wykonuje się jako CV w oknie potencjału od -0,25 V do 0,25 V (w porównaniu z Ag/AgCl, KCl) skanowane przy 100 mV/s w KPB.

3. Montaż filmu: Zespół folii MPC połączony z ditiolem do śledzenia optycznego

Przed wyhodowaniem folii MPC do oceny optycznej, szklane sekcje szkiełka są wstępnie czyszczone roztworem Piranha (UWAGA! 2:1 skoncentrowane H₂SO₄ i H₂O₂) i traktowane (3-merkaptopropylo)-trimetoksysilanem (3-MPTMS). ^1-2 folie MPC są następnie montowane na tych zmodyfikowanych szkiełkach przy użyciu techniki "cyklu zanurzeniowego", jak opisano powyżej.

1. Przepłukać szkiełko modyfikowane 3-MPTMS CH₂Cl₂ i umieścić je w roztworze MPC CH₂Cl₂ ( ̃1 mg / ml) na 1 godzinę, mieszając na wytrząsarce z małą prędkością. W ten sposób uzupełnia się pierwsza warstwa MPC zespołu folii poprzez zakotwiczenie MPC do merkaptanów grup końcowych silanu. Dokładnie wypłukać szkiełko za pomocą CH₂Cl₂ i osuszyć gazem_N2. Pobrać widmo UV-Vis (od 400 do 1000 nm) szkiełka i ponownie spłukać CH₂Cl₂.
2. Umieść szkiełko w 5 mM roztworze NDT CH₂Cl₂ na 1 godzinę, mieszając na wytrząsarce z małą prędkością. Przepłukać szkiełko za pomocą CH₂Cl₂.
3. Umieść szkiełko w roztworze MPC na 1 godzinę, mieszając na wytrząsarce z małą prędkością. Na tym kończy się druga warstwa MPC zespołu folii. Dokładnie przepłukać szkiełko za pomocą CH₂Cl₂, osuszyć gazem_N2 i pobrać widmo UV-Vis (od 400 do 1000 nm) szkiełka. Absorbancja w całym widmie powinna wzrastać, ponieważ dodatkowe warstwy MPC są adsorbowane do zespołu folii.
4. Aby zdeponować dodatkowe warstwy MPC, powtarzane są kroki 3.2-3.3.

4. Charakterystyka jednowarstwowych chronionych złotych warstw foliowych za pomocą przekrojowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej

TEM przekroje są przygotowywane przez ponowne osadzenie folii osadzonych en face. ^{2, 12} Odbywa się to poprzez uprzednie przymocowanie folii MPC zmontowanej na szkiełku modyfikowanym 3-MPTMS na czystych, standardowych szkiełkach mikroskopowych przy użyciu żywicy epoksydowej Embed 812, aby umożliwić lepszą obsługę podczas poniższej procedury. Zachowaj ostrożność przy zastosowanym cieple, ponieważ wyższe temperatury spowodują rozkład MPC w folii.

1. Wymieszaj żywicę epoksydową Embed 812 i pozostaw do zgęstnienia na co najmniej 12 godzin.
2. Napełnij kapsułkę BEEM "00" żywicą epoksydową i odwróć na wierzchu próbki folii MPC (przygotowanej w sekcji 3). Wywieraj nacisk na kapsułkę tak, aby pęcherzyk uniósł się do górnej części kapsułki, tworząc uszczelnienie między żywicą epoksydową a próbką folii MPC. Pozostawić do polimeryzacji przez co najmniej 18 godzin w temperaturze 60°C, a następnie schłodzić zamontowane szkiełka do temperatury pokojowej.
3. Podgrzewane przesuwa się przez 20 sekund na odlewanej aluminiowej płycie grzejnej w temperaturze 200°C w celu ułatwienia wyjmowania bloku z dołączoną folią MPC en face.
4. Odetnij próbkę zawierającą film z bloku kapsułki BEEM za pomocą piły jubilerskiej.
5. Ponownie osadź usuniętą część w płaskiej formie silikonowej folią MPC skierowaną do wnętrza studzienki silikonowej. Wypełnić dobrze krzem żywicą epoksydową w temperaturze pokojowej i pozostawić do polimeryzacji na co najmniej 18 godzin w temperaturze 60°C. Schłodzić próbkę do temperatury pokojowej.
6. Uzyskaj cienkie sekcje próbki o długości fali 60-80 nm na ultramikrotomie Leica UCT, używając noża diamentowego do cięcia sekcji prostopadłych do krawędzi noża.
7. Umieść pokrojone odcinki na folii nośnej formvar/carbon na siatce miedzianej (400 oczek) i wykonaj zdjęcia TEM przygotowanych przekrojów poprzecznych zespołów folii MPC.

5. Reprezentatywne wyniki:

Wykres 1 Dwuwarstwowe monitorowanie prądu ładowania wzrostu warstwy MPC przez łącznie 5 cykli zanurzania (naprzemienna ekspozycja na roztwory MPC i NDT). Prąd ładowania wzrastał systematycznie z każdym cyklem zanurzania, dodając do filmu "warstwy" MPC (rys. 2). Cykliczne woltammogramy pobrano przy użyciu okna potencjału od 0,1 do 0,4 V (w porównaniu z Ag/AgCl, KCl) skanowanym z prędkością 100 mV/s w 4,4 mM buforze fosforanu potasu (pH = 7,0, μ = 10 mM). Przedruk za zgodą M.L. Vargo, C.P. Gulki, J.K. Geriga, C.M. Manieri, J.D. Dattelbauma, C.B. Marksa, N.T. Lawrence'a, M.L. Trawicka i M.C. Leopolda, Langmuir 26(1), 560-569. Prawa autorskie 2010 Amerykańskie Towarzystwo Chemiczne.

Rysunek 2 (a) Schematyczne przedstawienie białka AZ zaadsorbowanego w zespole folii MPC połączonej z ditiolem. (b) Typowy cykliczny woltammogogram dla AZ zaadsorbowany do zespołu folii MPC zebrany przy użyciu okna potencjału od -0,25 do +0,25 V (w porównaniu z Ag/AgCl, KCl) skanowany przy 100 mV/s w 4,4 mM buforze fosforanu potasu (pH = 7,0, μ = 10 mM).

Wykres 3 Reprezentatywne monitorowanie spektralne UV-VIS wzrostu warstwy MPC związanej z ditiolem na szkiełku modyfikowanym 3-MPTMS. Cykl zanurzania polega na wystawieniu szkiełka na działanie roztworu łącznikowego NDT, a następnie na wystawieniu na działanie roztworu MPC. Każde kolejne zanurzenie powoduje wzrost grubości warstwy i jednoczesny wzrost absorbancji. Wraz ze wzrostem liczby cykli zanurzenia, powierzchniowe pasmo plazmonu jest stopniowo definiowane przy ̃520 nm. Przedruk za zgodą M.L. Vargo, C.P. Gulki, J.K. Geriga, C.M. Manieri, J.D. Dattelbauma, C.B. Marksa, N.T. Lawrence'a, M.L. Trawicka i M.C. Leopolda, Langmuir 26(1), 560-569. Prawa autorskie 2010 Amerykańskie Towarzystwo Chemiczne.

Wykres 4 Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) analiza obrazu przekroju poprzecznego zespołu folii MPC połączonego z ditiolem. Wstawka: Typowy obraz TEM MPC funkcjonalizowanych heksanotiolanem stosowanych w montażu folii. Analiza TEM określiła średnią średnicę złotego rdzenia MPC na ̃2 nm za pomocą analizy obrazu J. Przedruk za zgodą M.L. Vargo, C.P. Gulki, J.K. Geriga, C.M. Manieri, J.D. Dattelbauma, C.B. Marksa, N.T. Lawrence'a, M.L. Trawicka i M.C. Leopolda, Langmuir 26(1), 560-569. Prawa autorskie 2010 Amerykańskie Towarzystwo Chemiczne.

Dyskusja

Elektrochemia jednowarstwowa białek jest skuteczną techniką stosowaną do badania interakcji między białkami redoks a syntetycznymi platformami adsorpcyjnymi. Skuteczność tej strategii zależy jednak od zdolności do zaprojektowania interfejsu adsorpcji z wysokim stopniem kontroli poziomu molekularnego. Platformy oparte na MPC stworzone przez ten protokół reprezentują specjalnie zaprojektowane platformy, które są w stanie zapewnić bardziej jednorodne środowisko adsorpcji białek³ i ułatwić ET na większą odległoś...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bromek tetraoktyloamoniowy	Sigma-Aldrich	294136
Borowodorek sodu	Sigma-Aldrich	213462
Tetrachloroaurat wodoru	Sigma-Aldrich	254169-5G
1-heksanotiol	Sigma-Aldrich	234192
Transmisyjny mikroskop elektronowy	JEOL	1010
Spektrometr magnetycznego rezonansu jądrowego	Bruker Corporation	300 MHz
Folia nośna formvar / węglowa na siatce miedzianej (400 oczek)	Mikroskopia elektronowa Nauki	FCF400-Cu
Podłoże złoto	Evaporated Metal Films Corp.	Niestandardowe
elektrody referencyjne Ag/AgCl	Microelectrod, Inc.	MI-401F
Potencjostaty	CH Instruments, Inc.	CHI650A, CHI610B
1,9-nonanedithiol	Sigma-Aldrich	N29805
(3-merkaptopropylo)-trimetoksysilan	Sigma-Aldrich	175617
Spektrofotometr ultrafioletowy w świetle widzialnym	Agilent Technologies	8453
Embed 812 żywica epoksydowa	Mikroskopia elektronowa Sciences	14120
"00" Kapsuła BEEM	Mikroskopia elektronowa Sciences	70000-B
Płaska forma silikonowa	Mikroskopia elektronowa Sciences	70900
Nóż diamentowy	Diatome	21-ULE, S12801