Opisujemy uwrażliwioną metodę identyfikacji postembrionalnych regulatorów ekspresji i lokalizacji białek w C. elegans, wykorzystującą genomowy screening oparty na RNAi oraz zintegrowany transgen kodujący funkcjonalne białko znakowane fluorescencyjnie.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przesiewanie RNAi w celu identyfikacji fenotypów postembrionalnych u C. elegans
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
C. elegans okazał się wartościowym systemem modelowym w odkrywaniu i charakteryzacji funkcjonalnej wielu genów i szlaków genetycznych1. Bardziej zaawansowane narzędzia i zasoby do badań w tym systemie ułatwiają dalsze odkrywanie genów o bardziej subtelnych fenotypach lub rolach.
W niniejszej pracy przedstawiamy uogólniony protokół, który zaadaptowaliśmy do identyfikacji genów C. elegans wykazujących interesujące fenotypy pozazarodkowe przy użyciu RNAi2. Procedurę tę można łatwo zmodyfikować w celu analizy wybranego fenotypu, niezależnie od tego, czy wykorzystuje się optykę świetlną, czy fluorescencyjną w mikroskopie stereoskopowym lub złożonym. Niniejszy protokół przesiewowy wykorzystuje cechy fizyczne organizmu oraz narzędzia molekularne opracowane przez społeczność badawczą C. elegans. Jako przykład demonstrujemy zastosowanie zintegrowanego transgenu wykazującego produkt fluorescencyjny w badaniu przesiewowym RNAi w celu zidentyfikowania genów niezbędnych do prawidłowej lokalizacji tego produktu w późnych stadiach larwalnych oraz u osobników dorosłych. Po pierwsze, wykorzystaliśmy dostępną komercyjnie bibliotekę RNAi genomowego z pełnowymiarowymi insertami cDNA. Biblioteka ta ułatwia szybką identyfikację wielu kandydatów poprzez redukcję produktu kandydującego genu za pomocą RNAi. Po drugie, stworzyliśmy zintegrowany transgen wykazujący nasze białko z markerem fluorescencyjnym w tle wrażliwym na RNAi. Po trzecie, dzięki narażeniu wyklutych zwierząt na RNAi, badanie to pozwala na identyfikację produktów genów o kluczowej roli zarodkowej, która w przeciwnym razie maskowałaby rolę pozazarodkową w regulacji badanego białka. Na koniec, w badaniu przesiewowym wykorzystano mikroskop złożony z rozdzielczością pojedynczej komórki.
Protokół
1. Konstrukcja szczepu przesiewowego
Staranny dobór szczepu do przesiewania ma kluczowe znaczenie dla powodzenia procesu i został opisany w innym opracowaniu3. Dla niektórych badaczy w eksperymencie konieczne jest użycie szczepu wykazującego widoczny produkt z transgenu. Wiele szczepów zintegrowanych z transgenami jest dostępnych w CGC lub od poszczególnych badaczy. Jeśli do przesiewania wymagany jest szczep transgeniczny, który nie jest dostępny, można go wygenerować przy użyciu opublikowanych metod, takich jak bombardowanie4, UV/TMP5 lub insercja transposonu Mos6. Aby zwizualizować białko, które n....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiona tutaj metoda przesiewowa RNAi umożliwia czułą i szybką analizę produktów genów wymaganych do prawidłowego (lub transgenicznego) fenotypu postembrionalnego. Przedstawionym przykładem jest przesiewanie genów zaangażowanych w lokalizację subkomórkową białka znakowanego fluorescencyjnie. Protokół ten można jednak zmodyfikować w celu zidentyfikowania genów wpływających na inne interesujące badacza fenotypy postembrionalne.
Metoda ta wykorzystuje podejście oparte na genach kandydatach .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie mamy nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy pragną podziękować dr. Rickowi Padgetowi (Waksman Institute, Rutgers University, NJ) za przekazanie cDNA dbl-1 oraz dr. Christopherowi Rongo (Waksman Institute, Rutgers University, NJ) za marker do iniekcji. Laboratorium dr. Bartha Granta przeprowadziło bombardowanie za pomocą armatki genowej w celu integracji konstrukcji dbl-1 z tagiem gfp w niskiej liczbie kopii. Laboratorium René Garcii udzieliło pomocy technicznej podczas tworzenia texIs100. Laboratoria René Garcii, Robyn Lints oraz Hongmina Qina zapewniły merytoryczne wsparcie. Praca ta była finansowana z funduszy startowych Departamentu Medycyny Molekularnej i Komórkow....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Agar NGM | Pożywka do wzrostu nicieni | IPM Scientific, Inc | Można przygotować zgodnie z protokołem dla agaru NGM25 |
| Pożywka M9 | 22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 86mM NaCl, 1 mM MgSO4 | ||
| Agar-agar | EMD Millipore | 1.01614.1000 | 2% w wodzie dla płytek NGM. 4% w wodzie dla podkładek na szkiełka przedmiotowe (najpierw autoklawować, następnie rozpuścić w mikrofalówce). |
| Pepton Bacto | BD Biosciences | 211677 | 0,25% |
| IPTG | Research Products International Corp. | I56000-5.0 | stężenie końcowe 1 mM |
| karbenycylina | Research Products International Corp. | C46000-5.0 | roztwór roboczy 50 μg/ml |
| Bulion LB Lennox | BD Biosciences | 240230 | 20 g/litr |
| tetracyklina | Sigma-Aldrich | 268054 | roztwór roboczy 12,5 μg/ml |
| podchloryn sodu | Dowolny dostawca | 5% wybielacz domowy | Używać świeżego wybielacza. |
| wodorotlenek sodu | Dowolny dostawca | CAS 1310-73-2 | stok 5 N |
| pożywka M9 | Wormlab Recipe Book | http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm#Commonlab | 26 |
| lewamizol | Sigma-Aldrich | 31742 | roztwór roboczy 100 μM - 1 mM |
| azydku sodu | Fisher Scientific | S227 | roztwór roboczy 10 mM w M9 |
| płytka 24-dołkowa | Greiner Bio-One | 662160 | dystrybutor VWR |
| szkiełka przedmiotowe | Dowolny dostawca | 75 x 25 x 1 mm | |
| szkiełka zakrywkowe | Dowolny dostawca | 22 x 22 mm nr 1,5 | Stosować grubość zalecaną przez producenta mikroskopu. |
| mikroskop złożony | Carl Zeiss, Inc. | A1m | Stosować obiektywy i filtry dostosowane do potrzeb eksperymentu. |
| pompa do mediów | Pompa perystaltyczna Manostat | Kate model #72-620-000 | Stosować dreny i ustawienia odpowiednie dla urządzenia |
Bibliografia
- Giacomotto, J., Segalat, L. High-throughput screening and small animal models, where are we. Br. J. Pharmacol. 160, 204-216 (2010).
- Lamitina, T. Functional genomic approaches in C. elegans. Methods in Molecular Biology. 351, 127-138 (2006).
- Boutros, ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
