Przesiewanie RNAi w celu identyfikacji fenotypów postembrionalnych u C. elegans

Podsumowanie

Opisujemy uwrażliwioną metodę identyfikacji postembrionalnych regulatorów ekspresji i lokalizacji białek w C. elegans, wykorzystującą genomowy screening oparty na RNAi oraz zintegrowany transgen kodujący funkcjonalne białko znakowane fluorescencyjnie.

Streszczenie

C. elegans okazał się wartościowym systemem modelowym w odkrywaniu i charakteryzacji funkcjonalnej wielu genów i szlaków genetycznych¹. Bardziej zaawansowane narzędzia i zasoby do badań w tym systemie ułatwiają dalsze odkrywanie genów o bardziej subtelnych fenotypach lub rolach.

W niniejszej pracy przedstawiamy uogólniony protokół, który zaadaptowaliśmy do identyfikacji genów C. elegans wykazujących interesujące fenotypy pozazarodkowe przy użyciu RNAi². Procedurę tę można łatwo zmodyfikować w celu analizy wybranego fenotypu, niezależnie od tego, czy wykorzystuje się optykę świetlną, czy fluorescencyjną w mikroskopie stereoskopowym lub złożonym. Niniejszy protokół przesiewowy wykorzystuje cechy fizyczne organizmu oraz narzędzia molekularne opracowane przez społeczność badawczą C. elegans. Jako przykład demonstrujemy zastosowanie zintegrowanego transgenu wykazującego produkt fluorescencyjny w badaniu przesiewowym RNAi w celu zidentyfikowania genów niezbędnych do prawidłowej lokalizacji tego produktu w późnych stadiach larwalnych oraz u osobników dorosłych. Po pierwsze, wykorzystaliśmy dostępną komercyjnie bibliotekę RNAi genomowego z pełnowymiarowymi insertami cDNA. Biblioteka ta ułatwia szybką identyfikację wielu kandydatów poprzez redukcję produktu kandydującego genu za pomocą RNAi. Po drugie, stworzyliśmy zintegrowany transgen wykazujący nasze białko z markerem fluorescencyjnym w tle wrażliwym na RNAi. Po trzecie, dzięki narażeniu wyklutych zwierząt na RNAi, badanie to pozwala na identyfikację produktów genów o kluczowej roli zarodkowej, która w przeciwnym razie maskowałaby rolę pozazarodkową w regulacji badanego białka. Na koniec, w badaniu przesiewowym wykorzystano mikroskop złożony z rozdzielczością pojedynczej komórki.

Protokół

1. Konstrukcja szczepu do screeningu

Staranny dobór szczepu do przesiewania jest kluczowy dla sukcesu analizy i został opisany w innym opracowaniu³. Dla niektórych badaczy w eksperymencie konieczne jest użycie szczepu wykazującego widoczny produkt z transgenu. Wiele szczepów z zintegrowanymi transgenami jest dostępnych w CGC lub od poszczególnych badaczy. Jeśli do przesiewania wymagany jest szczep transgeniczny, który nie jest dostępny, można go wygenerować za pomocą opublikowanych metod, takich jak bombardowanie⁴, UV/TMP⁵ lub insercja transpozonu Mos⁶. Aby zwizualizować białko, które nas interesowało, wstawiliśmy sekwencję kodującą gfp w ramce odczytu z dojrzałą sekwencją cDNA (użyliśmy sekwencji dbl-1). Ponieważ to białko fuzyjne GFP nie jest widoczne pod stereomikroskopem, zastosowaliśmy marker współwstrzykiwany, który był widoczny i nie wpływał na obserwację białka docelowego (ttx-3p::rfp; przegląd kilku innych standardowych markerów znajduje się w ⁷). Następnie utworzyliśmy zintegrowany transgen z macierzy pozachromosomalnej. Stwierdzono, że bombardowanie transgenem doprowadziło do powstania linii zintegrowanej o niskiej liczbie kopii, która ani nie przywróciła fenotypu widocznego pod stereomikroskopem, ani nie wytworzyła widocznych poziomów produktu znakowanego GFP (Beifuss i Gumienny, niepublikowane). Integracja UV/TMP wielokrotnej macierzy pozachromosomalnej, pierwotnie otrzymanej przez wstrzykiwanie^8,9, pozwoliła uzyskać widoczne, przywracające fenotyp poziomy produktu transgenu (Rysunek 3A). Analiza Western blot z przeciwciałem anty-GFP potwierdziła, że transgen (nazwa allelu texIs100) jest prawidłowo ekspresowany i przetwarzany (Beifuss i Gumienny, niepublikowane). Zintegrowane transgeny powinny zostać poddane pięciokrotnemu krzyżowaniu zwrotnemu w celu usunięcia przypadkowych mutacji tła, niezależnie od źródła pochodzenia szczepu.

W naszym badaniu przesiewowym chcieliśmy, aby jedynym białkiem budzącym zainteresowanie była jego transgeniczna, znakowana forma. W związku z tym usunęliśmy funkcjonalny gen endogenny poprzez wprowadzenie allelu dbl-1 z utratą funkcji.

Na koniec uodporniliśmy szczep na efekty RNAi. RNAi z biblioteki w przypadku wielu genów spowoduje silniejszą redukcję produktu genu, jeśli zwierzęta posiadają mutację uwrażliwiającą je na działanie RNAi^10,11. Przy wyborze odpowiedniego tła uwrażliwiającego na RNAi należy wziąć pod uwagę interesujące nas tkanki¹¹. Do stworzenia szczepu przesiewowego wykorzystaliśmy kanoniczny allel rrf-3(pk1426). RRF-3 jest homologiem polimerazy RNA zależnej od RNA (RdRP), która normalnie hamuje somatyczne RNAi¹⁰. W celu zwiększenia skuteczności RNAi można zamiast tego zastosować mutacje w innych genach nadwrażliwych na RNAi, takich jak eri-1 lub eri-1 lin-15b^11-13.

Stworzony przez nas szczep przesiewowy posiada genotyp rrf-3(pk1426); texIs100; dbl-1(nk3).

2. Wybór i przygotowanie biblioteki RNAi

Dostępne komercyjnie biblioteki cDNA C. elegans reprezentują odpowiednio około 55% lub 87% przewidywanych genów u C. elegans (biblioteki z laboratorium Vidala lub laboratorium Ahringera). Pojedyncze klony są dostępne w sprzedaży (Open Biosystems, Geneservice, Ltd.). Wybraliśmy bibliotekę ORF-RNAi stworzoną przez laboratorium Vidala (Open Biosystems), ponieważ jej klony to w większości pełnowymiarowe cDNA sklonowane metodą Gateway, gotowe do dalszych zastosowań (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Oryginalna genomiczna biblioteka cDNA z laboratorium Ahringera zawiera fragmenty cDNA, które nie są tak szeroko użyteczne w eksperymentach charakterystycznych w dalszych etapach^14,15. Obie biblioteki wykorzystują wektor zawierający dwa promotory T7 flankujące wstawkę (Rysunek 1). Konstrukcje są hodowane w szczepie bakteryjnym HT115, który po indukcji izopropylo-β-D-tiogalaktopiranozydem (IPTG) wykazuje ekspresję polimerazy T7. Bakterie zawierające klony z biblioteki są indukowane IPTG w celu produkcji dsRNA (patrz Krok 3.4).

Po otrzymaniu biblioteki należy wykonać jej pełną kopię zapasową i wykorzystywać ją we wszystkich eksperymentach. Biblioteka oryginalna oraz jej kopia powinny być przechowywane w oddzielnych zamrażarkach o temperaturze -80°C, podłączonych do różnych linii elektrycznych.

3. Przygotowanie bakterii z klonami biblioteki

1. (W ciągu dwóch miesięcy od rozpoczęcia eksperymentu) Wysiać bakterie z wybranych klonów biblioteki żerowania oraz kontrole pozytywną i negatywną na opisane płytki LB z karbenycyliną/tetracykliną (hodujemy 8 kultur na płytce 100 mm) i inkubować w temperaturze 37°C przez noc (>16 godzin) (Rysunek 1). Dla każdej płytki 24-dołkowej stosujemy dwie kontrole. Kontrola pozytywna, bli-4 (K04F10.4), wywołuje fenotyp pozarembryonalny zależny od dawki^16,17. Kontrola negatywna, C06C3.5, jest przewidywanym pseudogenem (WormBase.org), który nie wywołuje żadnych obserwowanych fenotypów (Beifuss i Gumienny, nieopublikowane).
2. (W ciągu dwóch miesięcy od rozpoczęcia eksperymentu, najlepiej wcześniej) Przygotować 24-dołkowe płytki z podłożem NGM (Nematode Growth Medium) zawierające 25 – 50 μg/ml karbenycyliny i 1mM IPTG. Przechowywać w temperaturze 4°C.
3. (Dzień 1) Dla każdego klonu, za pomocą standardowej techniki sterylnej, zaszczepić 2 ml pożywki LB zawierającej 50 μg/ml karbenycyliny pojedynczą kolonią z wysianej płytki (z Kroku 3.1). Inkubować w temperaturze 37°C przez noc (>16 godzin) w wytrząsarce ustawionej na 220 – 240 rpm (Rysunek 1). Po 16 godzinach roztwór powinien być mętny.
4. (Dzień 2) Następnego ranka zindukować produkcję dwuniciowego RNA (dsRNA), dodając do kultur IPTG do stężenia końcowego 1mM. Inkubować kultury w temperaturze 37°C, przy 220 – 240 rpm, przez dodatkowe 4 – 5 godzin. Ten krok zapewnia bardziej spójne i silne wyciszenie produktu genu indukowane przez RNAi niż poleganie wyłącznie na IPTG w agarze płytki NGM (w Kroku 3.5).
5. Nanieść 30 μl każdej indukowanej kultury bakteryjnej do oddzielnych dołków 24-dołkowej płytki NGM RNAi zawierającej 25 – 50 μg/ml karbenycyliny i 1mM IPTG (Rysunek 1, szablon używany do śledzenia eksperymentów RNAi znajduje się na Rysunku 4). Umieścić niezakryte płytki w sterylnym dygestorze na 20 minut lub do czasu wyschnięcia plamek bakteryjnych. Nie doprowadzić do nadmiernego wysuszenia. Przesuszenie powoduje odrywanie się krawędzi agaru od płytki, co uniemożliwi odzyskanie zwierząt, jeśli wpełzną one w powstałe szczeliny.

4. Przygotowanie nicieni

Rozpocznij od populacji nicieni o określonym stadium rozwojowym. Dobieranie zwierząt do konkretnego stadium zmniejsza prawdopodobieństwo, że różnice zaobserwowane między kontrolną a eksperymentalną próbą RNAi wynikają jedynie z różnic w stadium rozwojowym zwierząt (jednakże, jeśli RNAi powoduje opóźnienie rozwoju, powinno zostać to odnotowane przez osobę przeprowadzającą badanie (Rycina 2)). Ponadto rozpoczęcie eksperymentu RNAi z larwami L1 eliminuje potencjalne zakłócenia wynikające z letalności embrionalnej wywołanej przez RNAi genów, które mogą również pełnić istotne role w okresie pozazarodkowym.

Synchronizację stadiów rozwojowych osiąga się poprzez wstępne wybielanie populacji szczepu przesiewowego o mieszanych stadiach rozwoju, z której przeżywają jedynie embriony chronione skorupką jajową. Pozwala to na synchronizację zwierząt z dokładnością do około 12 godzin w 20°C lub około 18 godzin w 16°C¹⁸. Aby uzyskać ściślejszą synchronizację, należy zatrzymać rozwój zwierząt w pierwszym stadium larwalnym (L1), pozwalając embrionom wykluć się w medium M9 bez dostępu do pożywienia. Głodzone zwierzęta w stadium L1 po przeniesieniu na pożywkę wznawiają wzrost z tego samego wieku startowego¹⁹.

1. (Dzień 1) Należy użyć trzech płytek 100 mm z nakarmionym, czystym szczepem zwierząt screeningowych, zawierających dorosłe osobniki z jajami oraz embriony. Zwierzęta należy zmyć z płytek za pomocą sterylnego roztworu M9, delikatnie pipetując ciecz po powierzchni płytki, aby odseparować zwierzęta i embriony. Zmyciny należy przenieść do sterylnej probówki 15 ml z nakrętką.
2. Jeśli objętość zmycin przekracza 3,5 ml, należy odwirować zwierzęta (~3000 rpm przez 30 sekund) i odlać nadmiar cieczy do objętości 3,5 ml. Jeśli objętość zmycin jest mniejsza niż 3,5 ml, do probówki należy dodać H₂0 lub M9, aby uzyskać łączną objętość 3,5 ml.
3. Podczas pracy z odczynnikami chemicznymi należy stosować odpowiednią odzież ochronną (fartuch laboratoryjny, rękawice i gogle). Należy zmieszać 0,5 ml 5 N NaOH z 1 ml świeżego wybielacza (5% podchlorynu sodu, nie starszego niż rok). Mieszaninę tę dodaje się do 3,5 ml zmycin nicieni. Należy uruchomić stoper. Proces ten nie powinien trwać dłużej niż 10 minut. Jeśli trwa dłużej, embriony mogą zostać uszkodzone, co zmniejszy wydajność, lub oznacza to, że wybielacz jest stary i należy go wymienić.
4. Probówkę należy wstrząsać na wirówce typu vortex przez około 10 sekund. Czynność tę należy powtarzać co dwie minuty przez okres od 4 do 10 minut. Po każdym wstrząsaniu należy obserwować roztwór pod mikroskopem stereoskopowym w celu sprawdzenia obecności szczątków zwierząt.
5. Gdy embriony zostaną uwolnione, a dorosłe osobniki ulegną fragmentacji (6–8 minut), należy osadzić embriony, wirując probówkę w wirówce stołowej (~3000 rpm, 30 sekund).
6. Należy odessać jak najwięcej supernatantu, uważając, aby nie naruszyć osadu. Należy robić to ostrożnie, bez nadmiernego pośpiechu.
7. Należy dodać sterylny roztwór M9 do objętości ok. 10 ml. Krótko wstrząsnąć na vortexie lub intensywnie wymieszać, aby resuspenderować osad.
8. Ponownie odwirować i usunąć supernatantu. Jeśli w probówce nadal wyczuwalny jest zapach wybielacza, należy powtórzyć płukanie w razie potrzeby.
9. Embriony należy resuspenderować w 10–15 ml sterylnego M9 i przenieść do małej (25 ml) kolby Erlenmeyera (w celu napowietrzania). Inkubować w odpowiedniej dla szczepu i eksperymentu temperaturze (15–25°C) przez noc (> 16 godzin w 20°C). W tym czasie wszystkie zwierzęta wyklują się i wejdą w stan diapauzy w stadium L1.
10. (Dzień 2) Zwierzęta w stadium L1 należy odwirować w probówce 15 ml i resuspenderować w 0,5–1 ml M9 (~3000 rpm, 30 sek.). 5 μL roztworu należy nanieść na osobną płytkę i policzyć liczbę zwierząt. Jeśli to konieczne, należy dostosować objętość, aby uzyskać 30 nicieni na 3–10 μL roztworu.
11. Do każdego dołka przygotowanej płytki 24-dołkowej, na bakterie, należy nanieść około 30 zsynchronizowanych podchlorynem zwierząt w stadium L1. Zbyt duża liczba zwierząt w dołku (znacznie powyżej 30) może doprowadzić do zagłodzenia populacji przed osiągnięciem dojrzałości. Należy pozostawić płytkę do wyschnięcia z uchylonymi pokrywkami. Następnie należy założyć pokrywkę i zabezpieczyć ją gumką recepturką. Płytkę należy odwrócić i inkubować w odpowiedniej temperaturze przez czas niezbędny do osiągnięcia pożądanego stadium rozwojowego. Ponieważ rrf-3(pk1426) jest allelem wrażliwym na temperaturę, zwierzęta naszego szczepu screeningowego były hodowane w temperaturze 15–17°C przez trzy do czterech dni, aby zaobserwować osobniki w stadium od L4 do dorosłego (Rysunek 1).

5. Obserwacja nicieni

(Dzień 5) Gdy nicienie osiągną pożądany stopień rozwoju (Rysunek 2A), należy za pomocą mikroskopu stereoskopowego potwierdzić, czy kontrole pozytywne i negatywne wykazują oczekiwane fenotypy. Jako kontrolę skuteczności RNAi stosujemy bli-4, ponieważ wywołuje ona zależne od dawki wady porembryonalne, obejmujące zakres od dorosłych osobników z pęcherzami (łagodny fenotyp RNAi, nie pokazano) do zahamowanego rozwoju, drobnych larw (silny, oczekiwany fenotyp RNAi) (Rysunek 2B). Następnie należy zaobserwować zwierzęta w każdej studni eksperymentalnej pod mikroskopem stereoskopowym i odnotować oczywiste nieprawidłowe fenotypy wywołane przez RNAi (Rysunek 2C). Po potwierdzeniu kontroli i odnotowaniu głównych fenotypów, należy przeprowadzić przesiew eksperymentów RNAi w poszukiwaniu interesujących fenotypów. Używamy mikroskopu złożonego wyposażonego w fluorescencję i obiektyw 63x, aby zaobserwować co najmniej pięć zwierząt z każdego eksperymentu RNAi, zaczynając od kontroli (Rysunek 3).

1. Przygotuj preparat (standardowe szkiełko 75 x 25 mm), tworząc podkładkę z 4% agaru (4% agar w H₂O). Aby zapewnić jednolitą grubość podkładki agarowej, umieść czyste szkiełko przedmiotowe pomiędzy dwoma dystansami (każdy dystans jest wykonany z szkiełka przedmiotowego z dwiema warstwami taśmy laboratoryjnej). Nanieś pipetą około 100 μL (dwie do trzech kropli z szklanej pipety Pasteura) roztopionego 4% agaru na środek czystego szkiełka. Formuj podkładkę agarową, przykrywając roztopiony agar dodatkowym szkiełkiem, umieszczonym szybko, lecz delikatnie, na wierzchu dystansów i roztopionego agaru. Odsłoń podkładkę agarową, delikatnie rozsuwając szkiełka, tak aby podkładka pozostała przytwierdzona do jednego z nich.
2. Nanieś kroplę ~5 μL środka znieczulającego (na przykład lewamizolu lub azotku sodu) na podkładkę agarową. Umieść od 8 do 12 zwierząt w środku znieczulającym. Przykryj całość szkiełkiem nakrywkowym 22 x 22 mm #1.5 (lub szkiełkiem o grubości najlepiej dopasowanej do mikroskopu złożonego) i obserwuj zwierzęta przy użyciu mikroskopu złożonego.
3. Zapisz gen, liczbę obserwowanych zwierząt oraz wyniki fenotypowe dla każdego eksperymentu RNAi. W przypadku screeningu stwórz i wykorzystaj standardowy szablon (patrz przykład, Rysunek 5).
4. Zweryfikuj fenotyp wywołany przez RNAi za pomocą innego, wtórnego fenotypu, jeśli to możliwe, oraz poprzez powtórzenie eksperymentu. (Na przykład w pokazanym przykładzie screeningu wykorzystano zmianę lokalizacji DBL-1 znakowanego GFP jako główny screening oraz wielkość ciała jako screening wtórny²⁰.) Bakterie z tego samego pasia (przechowywanego w 4°C) mogą być używane przez maksymalnie dwa miesiące. Starsze pasia mogą skutkować słabym wzrostem w nocnych kulturach płynnych i powinny zostać najpierw ponownie wyhodowane.
5. Zsekwencjonuj przynajmniej jeden koniec insertu cDNA, aby potwierdzić, że insert odpowiada etykiecie biblioteki (biblioteka Ahringera została poddana analizie wiarygodności; patrz http://biocompute.bmi.ac.cn/CelRNAi/)²¹. Rekomendowane primery (dla insertów z obu bibliotek) hybrydyzują w miejscach w wektorze pochodzącym z L4440 i flankują miejsce insercji: 5'-AGCGAGTCAGTGAGCGAG-3' oraz 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3' (primer M13f20).

Stosując tę metodę, jedna osoba może w rozsądny sposób przygotować i obserwować od dwóch do czterech serii eksperymentów w każdym tygodniu. Na przykład zwierzęta przygotowane w poniedziałek i wtorek mogą być obserwowane odpowiednio w czwartek i piątek, a następnie mogą być ponownie przygotowane w piątek i sobotę w celu obserwacji w poniedziałek i wtorek. W zależności od fenotypów analizowanych każdego dnia, seria może obejmować jedną płytkę 24-dołkową przy użyciu mikroskopii złożonej lub więcej, jeśli fenotyp jest szybko identyfikowany. W ten sposób, biorąc pod uwagę kontrole pozytywne i negatywne oraz tempo przesiewu, w ciągu jednego tygodnia można zaobserwować co najmniej 88 różnych eksperymentów RNAi. Przesiew przy użyciu mikroskopu stereoskopowego mógłby być przeprowadzony znacznie szybciej, bez konieczności montowania zwierząt na szkiełkach przedmiotowych do obserwacji. Przepustowość laboratorium mogłaby zostać zwiększona przez pracę wielu osób poprzez zastosowanie harmonogramów przesuniętych w czasie i/lub korzystanie z wielu mikroskopów. Alternatywna metoda hodowli zwierząt na cienkiej warstwie agaru i przenoszenia fragmentu agaru zawierającego zwierzęta bezpośrednio na szkiełko przedmiotowe do obserwacji może pozwolić na oszczędność czasu. Wariant ten został z sukcesem zastosowany do przesiewu nieprawidłowości ogona samców przy powiększeniu 400x²².

6. Reprezentatywne wyniki

Przykłady prawidłowej i zaburzonej lokalizacji DBL-1 znakowanego GFP przedstawiono na rysunku 3. Prawidłowa ekspresja DBL-1 znakowanego GFP obejmuje ciała komórek brzusznego sznura nerwowego oraz rząd punktów (rycinek 3A). Ekspresja DBL-1 jest silnie osłabiona, gdy zwierzęta są karmione RNA zapobiegającym translacji mRNA dbl-1 (rycinek 3B). dbl-1(RNAi) prowadzi również do powstania małych zwierząt, co stanowi wtórny ekran w tym przykładzie (dane nie zostały przedstawione). Geny wpływające na lokalizację DBL-1 są łatwo identyfikowane za pomocą RNAi z wykorzystaniem szczepu zaprojektowanego do tego ekranu (rycinek 3C).

Rysunek 1. Schemat przesiewowy w celu identyfikacji zewnątrzkomórkowych regulatorów sygnalizacji DBL-1. Bakterie z biblioteki pokarmowej są hodowane przez noc, indukowane IPTG i inkubowane w 37°C przez dodatkowe 4 godziny, aby umożliwić bakteriom produkcję dwuniciowego RNA (dsRNA). Na każdą studzienkę płytki 24-dołkowej z NGM (medium wzrostowe dla nicieni) zawierającej 25 μg/ml karbenicyliny i 1mM IPTG nanosi się 30 μl indukowanej kultury bakteryjnej, a następnie pozostawia do wyschnięcia w sterylnym komorze z laminarnym przepływem powietrza. Synchronizujemy larwy pierwszego stadium (L1), pozwalając zarodkom traktowanym podchlorynem na wyklucie się w medium bez pożywki, co indukuje diapauzę L1 (zatrzymanie rozwoju). Około 30 zsynchronizowanych zwierząt w stadium L1 przenosi się na każdą studzienkę zawierającą bakterie z biblioteki RNAi, co pozwala zsynchronizowanym zwierzętom wznowić wzrost i skonsumować dsRNA wytworzone przez bakterie²³. Po 72 h w 15°C młode dorosłe nicienie są przesiewane pod kątem widocznego fenotypu. W tym wieku defekty wielkości ciała są wyraźne, a fluorescencja wynikająca z ekspresji transgenu texIs100 jest silna.

Rysunek 2. Przykłady fenotypów do zidentyfikowania przed przesiewaniem. Wszystkie obrazy zwierząt w dołku płytki zostały wykonane przy tym samym powiększeniu przy użyciu mikroskopu stereoskopowego. Wszystkie zwierzęta obrazowano około 72 godziny po wysianiu jako zagłodzone larwy L1. Wszystkie obrazy zostały poddane identycznej obróbce. A) RNAi genu, który nie powoduje widocznych wad morfologicznych. Zwierzęta wyglądają jak typ dziki. B) RNAi genu bli-4. Zwierzęta wykazują zahamowany rozwój i są bardzo małe w porównaniu do zwierząt w panelu A. C) RNAi genu dpy-13. Zwierzęta są na tym samym etapie rozwoju co zwierzęta w panelu A, ale wykazują „dumpy” morfologię ciała.

Rycina 3. Przykłady białek znakowanych fluorescencyjnie oraz wpływ RNAi specyficznych genów na wzorzec lokalizacji. Wszystkie obrazy wykonano przy powiększeniu 630x za pomocą konfokalnej mikroskopii dyskowej, czas naświetlania 5 s. Pasek skali = 10 μm. Wszystkie obrazy poddano identycznej obróbce. Otwarte groty strzałek wskazują ciała komórkowe. Strzałki zaznaczają linię punktów (punctae). Wypełnione groty strzałek wskazują aberracyjnie zlokalizowane białko DBL-1 znakowane GFP. A) pseudogen C06C3.5 podany w diecie RNAi („typ dziki”). B) kontrola dbl-1(RNAi). C) RNAi genu wymaganego do prawidłowej lokalizacji białka DBL-1 znakowanego GFP.

Rysunek 4. Przykład szablonu do śledzenia eksperymentów RNAi (klony biblioteki) w płytkach 24-dołkowych. Ten szablon może być wykorzystywany do tworzenia trwałej dokumentacji eksperymentów, w przeciwieństwie do bezpośredniego etykietowania płytek.

Rycina 5. Przykładowy szablon do rejestracji fenotypów RNAi. Rozszerzyć w razie potrzeby.

Dyskusja

Przedstawiona tutaj metoda przesiewowa RNAi umożliwia czułą i szybką analizę produktów genów wymaganych do prawidłowego (lub transgenicznego) fenotypu postembrionalnego. Przedstawionym przykładem jest przesiewanie genów zaangażowanych w lokalizację subkomórkową białka znakowanego fluorescencyjnie. Protokół ten można jednak zmodyfikować w celu zidentyfikowania genów wpływających na inne interesujące badacza fenotypy postembrionalne.

Metoda ta wykorzystuje podejście oparte na genach kandydatach ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agar NGM	Pożywka do wzrostu nicieni	IPM Scientific, Inc	Można przygotować zgodnie z protokołem dla agaru NGM25
Pożywka M9			22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 86mM NaCl, 1 mM MgSO4
Agar-agar	EMD Millipore	1.01614.1000	2% w wodzie dla płytek NGM. 4% w wodzie dla podkładek na szkiełka przedmiotowe (najpierw autoklawować, następnie rozpuścić w mikrofalówce).
Pepton Bacto	BD Biosciences	211677	0,25%
IPTG	Research Products International Corp.	I56000-5.0	stężenie końcowe 1 mM
karbenycylina	Research Products International Corp.	C46000-5.0	roztwór roboczy 50 μg/ml
Bulion LB Lennox	BD Biosciences	240230	20 g/litr
tetracyklina	Sigma-Aldrich	268054	roztwór roboczy 12,5 μg/ml
podchloryn sodu	Dowolny dostawca	5% wybielacz domowy	Używać świeżego wybielacza.
wodorotlenek sodu	Dowolny dostawca	CAS 1310-73-2	stok 5 N
pożywka M9	Wormlab Recipe Book	http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm#Commonlab	26
lewamizol	Sigma-Aldrich	31742	roztwór roboczy 100 μM - 1 mM
azydku sodu	Fisher Scientific	S227	roztwór roboczy 10 mM w M9
płytka 24-dołkowa	Greiner Bio-One	662160	dystrybutor VWR
szkiełka przedmiotowe	Dowolny dostawca	75 x 25 x 1 mm
szkiełka zakrywkowe	Dowolny dostawca	22 x 22 mm nr 1,5	Stosować grubość zalecaną przez producenta mikroskopu.
mikroskop złożony	Carl Zeiss, Inc.	A1m	Stosować obiektywy i filtry dostosowane do potrzeb eksperymentu.
pompa do mediów	Pompa perystaltyczna Manostat	Kate model #72-620-000	Stosować dreny i ustawienia odpowiednie dla urządzenia