Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przesiewanie RNAi w celu identyfikacji fenotypów postembrionalnych u C. elegans

17K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3442

⸱

13 lutego 2012

 , 
1Department of Molecular and Cellular Medicine, Texas A&M University System Health Science Center

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy uwrażliwioną metodę identyfikacji postembrionalnych regulatorów ekspresji i lokalizacji białek w C. elegans, wykorzystującą genomowy screening oparty na RNAi oraz zintegrowany transgen kodujący funkcjonalne białko znakowane fluorescencyjnie.

Streszczenie

C. elegans okazał się wartościowym systemem modelowym w odkrywaniu i charakteryzacji funkcjonalnej wielu genów i szlaków genetycznych1. Bardziej zaawansowane narzędzia i zasoby do badań w tym systemie ułatwiają dalsze odkrywanie genów o bardziej subtelnych fenotypach lub rolach.

W niniejszej pracy przedstawiamy uogólniony protokół, który zaadaptowaliśmy do identyfikacji genów C. elegans wykazujących interesujące fenotypy pozazarodkowe przy użyciu RNAi2. Procedurę tę można łatwo zmodyfikować w celu analizy wybranego fenotypu, niezależnie od tego, czy wykorzystuje się optykę świetlną, czy fluorescencyjną w mikroskopie stereoskopowym lub złożonym. Niniejszy protokół przesiewowy wykorzystuje cechy fizyczne organizmu oraz narzędzia molekularne opracowane przez społeczność badawczą C. elegans. Jako przykład demonstrujemy zastosowanie zintegrowanego transgenu wykazującego produkt fluorescencyjny w badaniu przesiewowym RNAi w celu zidentyfikowania genów niezbędnych do prawidłowej lokalizacji tego produktu w późnych stadiach larwalnych oraz u osobników dorosłych. Po pierwsze, wykorzystaliśmy dostępną komercyjnie bibliotekę RNAi genomowego z pełnowymiarowymi insertami cDNA. Biblioteka ta ułatwia szybką identyfikację wielu kandydatów poprzez redukcję produktu kandydującego genu za pomocą RNAi. Po drugie, stworzyliśmy zintegrowany transgen wykazujący nasze białko z markerem fluorescencyjnym w tle wrażliwym na RNAi. Po trzecie, dzięki narażeniu wyklutych zwierząt na RNAi, badanie to pozwala na identyfikację produktów genów o kluczowej roli zarodkowej, która w przeciwnym razie maskowałaby rolę pozazarodkową w regulacji badanego białka. Na koniec, w badaniu przesiewowym wykorzystano mikroskop złożony z rozdzielczością pojedynczej komórki.

Protokół

1. Konstrukcja szczepu przesiewowego

Staranny dobór szczepu do przesiewania ma kluczowe znaczenie dla powodzenia procesu i został opisany w innym opracowaniu3. Dla niektórych badaczy w eksperymencie konieczne jest użycie szczepu wykazującego widoczny produkt z transgenu. Wiele szczepów zintegrowanych z transgenami jest dostępnych w CGC lub od poszczególnych badaczy. Jeśli do przesiewania wymagany jest szczep transgeniczny, który nie jest dostępny, można go wygenerować przy użyciu opublikowanych metod, takich jak bombardowanie4, UV/TMP5 lub insercja transposonu Mos6. Aby zwizualizować białko, które nas interesuje, wstawiliśmy sekwencję kodującą gfp w ramce odczytu z dojrzałą sekwencją cDNA (użyliśmy sekwencji dbl-1). Ponieważ to białko fuzyjne GFP nie jest widoczne pod stereomikroskopem, zastosowaliśmy marker coinjekcyjny, który był widoczny i nie zakłócał obserwacji badanego białka (ttx-3p::rfp; w celu przejrzenia innych standardowych markerów patrz 7). Następnie z macierzy pozachromosomalnej stworzyliśmy zintegrowany transgen. Stwierdzono, że bombardowanie transgenem doprowadziło do powstania linii zintegrowanej o niskiej liczbie kopii, która nie przywróciła fenotypu widocznego pod stereomikroskopem ani nie wytworzyła widocznych poziomów produktu znakowanego GFP (Beifuss i Gumienny, niepublikowane). Integracja UV/TMP wielokrotnej macierzy pozachromosomalnej, stworzonej pierwotnie metodą wstrzykiwania8,9, pozwoliła uzyskać widoczne, przywracające fenotyp poziomy produktu transgenu (Rycina 3A). Western blot z przeciwciałem anty-GFP potwierdził, że transgen (nazwa allelu texIs100) jest prawidłowo ekspresowany i przetwarzany (Beifuss i Gumienny, niepublikowane). Zintegrowane transgeny powinny zostać poddane pięciokrotnym krzyżówkom zwrotnym w celu usunięcia przypadkowych mutacji tła, niezależnie od źródła pochodzenia.

Na potrzeby naszego przesiewu chcieliśmy, aby jedynym białkiem zainteresowania była transgeniczna forma z markerem. W związku z tym usunęliśmy funkcjonalny gen endogenny, wprowadzając allel dbl-1 z mutacją powodującą utratę funkcji.

Na koniec uodporniliśmy szczep na działanie RNAi. RNAi z biblioteki w przypadku wielu genów spowoduje silniejszą redukcję produktu genowego, jeśli zwierzęta posiadają mutację uwrażliwiającą je na efekty RNAi10,11. Przy wyborze odpowiedniego tła uwrażliwiającego na RNAi należy wziąć pod uwagę interesujące nas tkanki11. Do stworzenia szczepu przesiewowego wykorzystaliśmy kanoniczny allel rrf-3(pk1426). RRF-3 jest homologiem polimerazy RNA zależnej od RNA (RdRP), która normalnie hamuje somatyczne RNAi10. Aby zwiększyć skuteczność RNAi, można zamiast tego zastosować mutacje w innych genach zwiększających wrażliwość na RNAi, takich jak eri-1 lub eri-1 lin-15b11-13.

Stworzony przez nas szczep przesiewowy ma genotyp rrf-3(pk1426); texIs100; dbl-1(nk3).

2. Wybór i przygotowanie biblioteki RNAi

Dostępne komercyjnie biblioteki cDNA C. elegans reprezentują odpowiednio około 55% lub 87% przewidywanych genów u C. elegans (biblioteki z laboratorium Vidala lub laboratorium Ahringera). Poszczególne klony są dostępne do zakupu (Open Biosystems, Geneservice, Ltd.). Wybraliśmy bibliotekę ORF-RNAi opracowaną przez laboratorium Vidala (Open Biosystems), ponieważ jej klony to w większości pełnowymiarowe cDNA sklonowane metodą Gateway, gotowe do dalszych zastosowań (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Oryginalna genomowa biblioteka cDNA z laboratorium Ahringera zawiera fragmenty cDNA, które nie są tak szeroko przydatne w eksperymentach służących do dalszej charakterystyki14,15. Obie biblioteki wykorzystują wektor zawierający dwa promotory T7 flankujące wstawkę (Rysunek 1). Konstrukty namnażane są w szczepie bakteryjnym HT115, który wykazuje ekspresję polimerazy T7 po indukcji izopropyl-β-D-thiogalaktopyranosydem (IPTG). Bakterie zawierające klony biblioteczne są indukowane IPTG w celu produkcji dsRNA (patrz Krok 3.4).

Po otrzymaniu należy sporządzić kopię całej biblioteki i używać tej kopii we wszystkich eksperymentach. Biblioteka oryginalna oraz jej kopia powinny być przechowywane w osobnych zamrażarkach w temperaturze -80°C, podłączonych do różnych linii elektrycznych.

3. Przygotowanie bakterii z klonami biblioteki

  1. (W ciągu dwóch miesięcy od rozpoczęcia eksperymentu) Wysiać bakterie z wybranych klonów biblioteki pokarmowej, a także kontrole pozytywną i negatywną, na oznakowanych płytkach LB z karbenicyliną/tetracykliną (hodujemy 8 kultur na płytce 100 mm) i inkubować w temperaturze 37°C przez noc (>16 godzin) (Rycina 1). Dla każdej płytki 24-dołkowej stosujemy dwie kontrole. Kontrola pozytywna, bli-4 (K04F10.4), wywołuje zależny od dawki fenotyp pozarembryonalny16,17. Kontrola negatywna, C06C3.5, to przewidywany pseudogen (WormBase.org), który nie wywołuje żadnych obserwowanych fenotypów (Beifuss i Gumienny, niepublikowane).
  2. (W ciągu dwóch miesięcy od rozpoczęcia eksperymentu, najlepiej wcześniej) Przygotować płytki 24-dołkowe z pożywką NGM (Nematode Growth Medium) zawierające 25 – 50 μg/ml karbenicyliny i 1mM IPTG. Przechowywać w temperaturze 4°C.
  3. (Dzień 1) Dla każdego klonu, zaszczepić 2 ml pożywki LB zawierającej 50 μg/ml karbenicyliny pojedynczą kolonią z wysianej płytki (z Kroku 3.1), stosując standardową technikę sterylną. Inkubować w temperaturze 37°C przez noc (>16 godzin) w wytrząsarce ustawionej na 220 – 240 rpm (Rycina 1). Po 16 godzinach roztwór powinien być mętny.
  4. (Dzień 2) Następnego ranka indukować produkcję dwuniciowego RNA (dsRNA), dodając IPTG do kultur do końcowego stężenia 1mM. Inkubować kultury w temperaturze 37°C, przy 220 – 240 rpm, przez dodatkowe 4 – 5 godzin. Krok ten zapewnia bardziej spójne i silne wyciszenie produktu genu indukowane przez RNAi niż poleganie wyłącznie na IPTG w agarze płytki NGM (w Kroku 3.5).
  5. Nanieść 30 μl każdej indukowanej kultury bakteryjnej do oddzielnych dołków 24-dołkowej płytki NGM RNAi zawierającej 25 – 50 μg/ml karbenicyliny i 1mM IPTG (Rycina 1, szablon stosowany do śledzenia eksperymentów RNAi znajduje się na Rycini 4). Umieścić płytki, bez przykrycia, w sterylnym dygestorze przepływowym na 20 minut lub do czasu wyschnięcia plamek bakteryjnych. Nie doprowadzać do nadmiernego wysuszenia. Nadmierne wysuszenie powoduje odklejenie się krawędzi agaru od płytki, co sprawi, że zwierzęta, które wpełzną w powstałe szczeliny, będą niedozysięgalne.

4. Przygotowanie nicieni

Należy rozpocząć od populacji nicieni o ujednoliconym stadium rozwoju. Staging zwierząt zmniejsza prawdopodobieństwo, że różnice zaobserwowane między próbami kontrolnymi a eksperymentalnymi RNAi wynikają jedynie z różnic w stadium rozwojowym osobników (jednakże, jeśli RNAi powoduje opóźnienie rozwoju, powinno zostać to odnotowane przez osobę przeprowadzającą screening (Rysunek 2)). Ponadto rozpoczęcie eksperymentu RNAi z larwami L1 eliminuje potencjalne zakłócenia spowodowane letalnością embrionalną wywołaną przez RNAi genów, które mogą również pełnić istotne role w okresie postembryonalnym.

Synchronizację stadiów rozwojowych przeprowadza się najpierw poprzez wybielanie populacji szczepu przesiewowego o mieszanych stadiach, w której przeżywają jedynie embriony chronione skorupką jaja. Pozwala to na synchronizację zwierząt z dokładnością do około 12 h w 20°C lub około 18 h w 16°C18. Aby uzyskać ściślejszą synchronizację, należy zatrzymać rozwój zwierząt w pierwszym stadium larwalnym (L1), pozwalając embrionom wykluć się w medium M9 bez pożywki. Głodzone larwy L1 po przeniesieniu na pożywkę wznawiają wzrost od tego samego wieku początkowego19.

  1. (Dzień 1) Należy użyć trzech płytek o średnicy 100 mm z nakarmionym, czystym szczepem screeningowym, zawierających dorosłe osobniki z jajami oraz embriony. Zwierzęta należy wypłukać z płytek za pomocą sterylnego roztworu M9, delikatnie pipetując ciecz po powierzchni płytki, aby odkleić osobniki i embriony. Wypłuczyny należy przenieść do sterylnej probówki o pojemności 15 ml z zakrętką.
  2. Jeśli objętość wypłuczyn przekracza 3,5 ml, należy odwirować zwierzęta (~3000 rpm przez 30 sekund) i usunąć nadmiar cieczy, pozostawiając 3,5 ml. Jeśli objętość jest mniejsza niż 3,5 ml, do probówki należy dodać H2O lub M9, aby uzyskać łącznie 3,5 ml.
  3. Podczas pracy z chemikaliami należy stosować odpowiednią odzież ochronną (fartuch laboratoryjny, rękawiczki i gogle). Należy zmieszać 0,5 ml 5 N NaOH z 1 ml świeżego wybielacza (5% podchlorynu sodu, nie starszego niż rok). Mieszaninę tę należy dodać do 3,5 ml wypłuczyn z nicieniami. Należy uruchomić stoper. Proces ten nie powinien trwać więcej niż 10 minut. W przeciwnym razie embriony mogą zostać uszkodzone, co zmniejszy wydajność, lub oznacza to, że wybielacz jest stary i należy go wymienić.
  4. Probówkę należy mieszać na wstrząsarze vortex przez około 10 sekund. Czynność tę należy powtarzać co dwie minuty przez okres od 4 do 10 minut. Po każdym wstrząsaniu należy obserwować roztwór pod mikroskopem stereoskopowym w celu sprawdzenia stanu martwych osobników.
  5. Gdy embriony zostaną uwolnione, a dorosłe osobniki ulegną fragmentacji (6–8 minut), należy osadzić embriony poprzez wirowanie probówki w wirówce stołowej (~3000 rpm, 30 sekund).
  6. Należy odessać jak największą ilość supernatantu, nie naruszając osadu. Należy robić to ostrożnie, unikając nadmiernego odsysania.
  7. Należy dodać sterylny M9 do objętości ok. 10 ml. Krótko wymieszać na vortexie lub energicznie wstrząsnąć, aby resuspenderować osad.
  8. Ponownie odwirować i usunąć supernatat. Jeśli w probówce nadal wyczuwalny jest zapach wybielacza, należy powtórzyć płukanie w razie potrzeby.
  9. Embriony należy resuspenderować w 10–15 ml sterylnego M9 i przenieść do małej (25 ml) kolby Erlenmeyera (w celu napowietrzania). Kolbę należy inkubować przy wstrząsaniu w odpowiedniej dla szczepu i eksperymentu temperaturze (15–25°C) przez noc (> 16 godzin w 20°C). W tym czasie wszystkie zwierzęta wyklują się i zatrzymają w fazie diapauzy L1.
  10. (Dzień 2) Zwierzęta w stadium L1 należy odwirować w probówce 15 ml i resuspenderować w 0,5–1 ml M9 (~3000 rpm, 30 sek.). Należy nanieść 5 μL roztworu na osobną płytkę i zliczyć liczbę zwierząt. W razie potrzeby należy dostosować objętość, aby uzyskać 30 nicieni na 3–10 μL roztworu.
  11. Na bakterie w każdej studni przygotowanej płytki 24-dołkowej należy nanieść około 30 zsynchronizowanych podchlorynem zwierząt w stadium L1. Zbyt duża liczba zwierząt (znacząco więcej niż 30) na studnię może doprowadzić do zagłodzenia populacji przed osiągnięciem dojrzałości. Pozostawić płytkę do wyschnięcia z uchylonymi pokrywkami. Następnie zamknąć pokrywkę i zabezpieczyć ją gumką recepturką. Odwrócić płytkę i inkubować w odpowiedniej temperaturze przez czas niezbędny do osiągnięcia pożądanego stadium. Ponieważ rrf-3(pk1426) jest allelem wrażliwym na temperaturę, zwierzęta szczepu screeningowego hodowano w temperaturze 15–17°C przez trzy do czterech dni, aby uzyskać osobniki w stadium od L4 do dorosłego (Rycina 1).

5. Obserwacja nicieni

(Dzień 5) Po tym, jak nicienie osiągną pożądany stopień rozwoju (Rysunek 2A), należy za pomocą mikroskopu stereoskopowego potwierdzić, że kontrole dodatnia i ujemna wykazują oczekiwane fenotypy. Jako kontrolę skuteczności RNAi stosujemy bli-4, ponieważ wywołuje ono zależne od dawki defekty postembrionalne, obejmujące zakres od dorosłych osobników z pęcherzami (łagodny fenotyp RNAi, nie pokazano) do zahamowanych rozwojowo, bardzo małych larw (silny, oczekiwany fenotyp RNAi) (Rysunek 2B). Następnie należy za pomocą mikroskopu stereoskopowego zaobserwować zwierzęta w każdej studni eksperymentalnej i odnotować wyraźne nieprawidłowe fenotypy wywołane przez RNAi (Rysunek 2C). Po potwierdzeniu kontroli i odnotowaniu głównych fenotypów, należy przeprowadzić przesiew eksperymentów RNAi pod kątem interesujących fenotypów. Do obserwacji co najmniej pięciu zwierząt z każdego eksperymentu RNAi, zaczynając od kontroli, używamy mikroskopu złożonego wyposażonego w fluorescencję i obiektyw 63x (Rysunek 3).

  1. Przygotuj preparat (standardowe szkiełko 75 x 25 mm), tworząc podkład z 4% agaru (4% agar w H2O). Aby zapewnić jednorodną grubość podkładu z agaru, umieść czyste szkiełko przedmiotowe pomiędzy dwoma dystansami (każdy dystans wykonany jest ze szkiełka mikroskopowego z dwiema warstwami taśmy laboratoryjnej). Pipetuj około 100 μL (dwie do trzech kropli z szklanej pipety Pasteura) roztopionego 4% agaru na środek czystego szkiełka przedmiotowego. Utwórz podkład z agaru, przykrywając roztopiony agar dodatkowym szkiełkiem, położonym szybko, ale ostrożnie na dystansach i roztopionym agarze. Odsłoń podkład z agaru, ostrożnie rozsuwając szkiełka tak, aby podkład pozostał przytwierdzony do jednego z nich.
  2. Nanieś kroplę ~5 μL środka znieczulającego (na przykład lewamisolu lub azotku sodu) na podkład z agaru. Umieść od 8 do 12 zwierząt w środku znieczulającym. Przykryj szkiełkiem nakrywowym 22 x 22 mm #1.5 (lub szkiełkiem nakrywowym o grubości najlepiej dopasowanej do mikroskopu złożonego) i obserwuj zwierzęta za pomocą mikroskopu złożonego.
  3. Zapisz gen, liczbę obserwowanych zwierząt oraz wyniki fenotypowe dla każdego eksperymentu RNAi. W przypadku przesiewu przygotuj i zastosuj standardowy szablon (patrz przykład, Rysunek 5).
  4. Zweryfikuj fenotyp wywołany przez RNAi za pomocą innego, wtórnego fenotypu, jeśli jest to możliwe, oraz poprzez powtórzenie eksperymentu. (Na przykład w przedstawionym przykładzie przesiewu wykorzystano zmianę lokalizacji DBL-1 znakowanego GFP jako przesiew pierwotny, a wielkość ciała jako przesiew wtórny20.) Bakterie z tego samego posiewu (przechowywanego w 4°C) mogą być używane przez okres do dwóch miesięcy. Starsze posiewy mogą skutkować słabym wzrostem w nocnych kulturach płynnych i powinny zostać najpierw ponownie wyselekcjonowane.
  5. Zsekwencjonuj przynajmniej jeden koniec wstawki cDNA, aby potwierdzić, że wstawka odpowiada etykiecie biblioteki (dla biblioteki Ahringera przeprowadzono analizę niezawodności; patrz http://biocompute.bmi.ac.cn/CelRNAi/)21. Rekomendowane primery (dla wstawek z obu bibliotek) przyłączają się do miejsc w wektorze pochodzącym z L4440 i flankują miejsce insercji: 5'-AGCGAGTCAGTGAGCGAG-3' oraz 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3' (primer M13f20).

Stosując tę metodę, jedna osoba może w rozsądny sposób przygotować i zaobserwować od dwóch do czterech serii eksperymentów w każdym tygodniu. Na przykład zwierzęta przygotowane w poniedziałek i wtorek mogą być obserwowane odpowiednio w czwartek i piątek, a następnie ponownie przygotowane w piątek i sobotę do obserwacji w poniedziałek i wtorek. W zależności od fenotypów analizowanych każdego dnia, seria może obejmować jedną płytkę 24-dołkową przy użyciu mikroskopii związkowej lub więcej, jeśli fenotyp jest szybko identyfikowany. W ten sposób, biorąc pod uwagę kontrole pozytywne i negatywne oraz tempo przesiewania, w ciągu jednego tygodnia można zaobserwować co najmniej 88 różnych eksperymentów RNAi. Przesiewanie za pomocą stereomikroskopu można przeprowadzić znacznie szybciej, bez konieczności montowania zwierząt na szkiełkach przedmiotowych. Przepustowość laboratorium mogłaby zostać zwiększona również przez pracę wielu osób przy zastosowaniu harmonogramów kaskadowych i/lub wykorzystaniu wielu mikroskopów. Alternatywna metoda hodowli zwierząt na cienkiej warstwie agaru i przenoszenia fragmentu agaru zawierającego zwierzęta bezpośrednio na szkiełko do oglądania może pozwolić na oszczędność czasu. Wariant ten został z powodzeniem zastosowany do przesiewania anomalii ogona u samców przy powiększeniu 400x22.

6. Reprezentatywne wyniki

Przykłady prawidłowej i zaburzonej lokalizacji DBL-1 znakowanego GFP przedstawiono na Rysunku 3. Prawidłowa ekspresja DBL-1 znakowanego GFP obejmuje ciała komórkowe brzusznego sznura nerwowego oraz rząd punktów (Rysunek 3A). Ekspresja DBL-1 jest znacznie osłabiona, gdy zwierzęta są karmione RNA zapobiegającym translacji mRNA dbl-1 (Rysunek 3B). dbl-1(RNAi) powoduje również powstanie małych zwierząt, co stanowi wtórny parametr przesiewowy w tym przykładzie (dane nie zostały przedstawione). Geny wpływające na lokalizację DBL-1 można łatwo zidentyfikować za pomocą RNAi, wykorzystując szczep zaprojektowany do tego badania (Rysunek 3C).

Schemat procesu przesiewowego E. coli; inokulacja kolonii, interakcja z C. elegans, indukcja IPTG.
Rysunek 1. Schemat przesiewania w celu zidentyfikowania zewnątrzkomórkowych regulatorów sygnalizacji DBL-1. Bakterie z biblioteki paszowej są hodowane przez noc, indukowane IPTG i inkubowane w 37°C przez kolejne 4 godziny, aby umożliwić bakteriom produkcję dwuniciowego RNA (dsRNA). Na każde wgłębienie płytki 24-dołkowej z NGM (podłożem wzrostowym dla nicieni) zawierającej 25 μg/ml karbenicyliny i 1mM IPTG nanosi się 30 μl indukowanej kultury bakteryjnej, a następnie pozostawia do wyschnięcia w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza. Larwy pierwszego stadium (L1) są synchronizowane poprzez wykluwanie embrionów traktowanych podchlorynem w medium bez pożywki, co indukuje diapauzę L1 (zatrzymanie rozwoju). Około 30 zsynchronizowanych zwierząt w stadium L1 nanosi się na każde wgłębienie zawierające bakterie z biblioteki RNAi, co pozwala zsynchronizowanym osobnikom na wznowienie wzrostu i pobieranie dsRNA wytworzonego przez bakterie23. Po 72 h w 15°C młode dorosłe nicienie są przesiewane pod kątem widocznego fenotypu. W tym wieku widoczne są wady rozmiaru ciała, a fluorescencja wynikająca z ekspresji transgenu texIs100 jest intensywna.

Wyniki eksperymentu RNAi u C. elegans; obrazy mikroskopowe pokazujące efekty genów bli-4 i dpy-13 oraz obraz normalny.
Rysunek 2. Przykłady fenotypów do identyfikacji przed screeningiem. Wszystkie obrazy zwierząt w dołku płytki zostały wykonane przy tym samym powiększeniu przy użyciu mikroskopu stereoskopowego. Wszystkie zwierzęta obrazowano około 72 godziny po wysianiu jako głodzone larwy L1. Wszystkie obrazy poddano identycznej obróbce. A) RNAi genu, który nie powoduje widocznych wad morfologicznych. Zwierzęta wyglądają jak typ dziki. B) RNAi bli-4. Zwierzęta wykazują zahamowanie rozwoju i są bardzo małe w porównaniu do zwierząt na panelu A. C) RNAi dpy-13. Zwierzęta są na tym samym etapie rozwoju co zwierzęta na panelu A, ale wykazują morfologię ciała typu „dumpy” (skróconą).

Wyniki mikroskopii fluorescencyjnej; lokalizacja białek w przekrojach tkanek; strzałki wskazują białka.
Rysunek 3. Przykłady białek znakowanych fluorescencyjnie oraz wpływ RNAi specyficznych genów na wzorzec lokalizacji. Wszystkie obrazy wykonano przy powiększeniu 630x przy użyciu konfokalnej mikroskopii dysku obrotowego, czas ekspozycji 5 s. Pasek skali = 10 μm. Wszystkie obrazy poddano identycznej obróbce. Otwarte groty strzałek wskazują ciała komórek. Strzałki zaznaczają linie punktów (punctae). Wypełnione groty strzałek wskazują aberracyjnie zlokalizowane białko DBL-1 znakowane GFP. A) pseudogen C06C3.5 z podaniem RNAi („typ dziki”). B) kontrola dbl-1(RNAi). C) RNAi genu niezbędnego do prawidłowej lokalizacji białka DBL-1 znakowanego GFP.

Pusty wykres w formie siatki 6x4 do zapisywania danych; wiersze oznaczone literami A-D, kolumny numerami 1-6.
Rycina 4. Przykład szablonu do monitorowania eksperymentów RNAi (klony biblioteki) w płytkach 24-dołkowych. Szablon ten może służyć do tworzenia stałej dokumentacji eksperymentów, w przeciwieństwie do bezpośredniego etykietowania płytek.

Przesiew RNAi u C. elegans; tabela efektów fenotypowych, tkankowych i komórkowych, zapis obserwacji.
Rysunek 5. Przykład szablonu do rejestracji fenotypów RNAi. Rozszerzyć w razie potrzeby.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiona tutaj metoda przesiewowa RNAi umożliwia czułą i szybką analizę produktów genów wymaganych do prawidłowego (lub transgenicznego) fenotypu postembrionalnego. Przedstawionym przykładem jest przesiewanie genów zaangażowanych w lokalizację subkomórkową białka znakowanego fluorescencyjnie. Protokół ten można jednak zmodyfikować w celu zidentyfikowania genów wpływających na inne interesujące badacza fenotypy postembrionalne.

Metoda ta wykorzystuje podejście oparte na genach kandydatach ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować dr. Rickowi Padgetowi (Waksman Institute, Rutgers University, NJ) za przekazanie cDNA dbl-1 oraz dr. Christopherowi Rongo (Waksman Institute, Rutgers University, NJ) za marker do iniekcji. Laboratorium dr. Bartha Granta przeprowadziło bombardowanie za pomocą armatki genowej w celu integracji konstrukcji dbl-1 z tagiem gfp w niskiej liczbie kopii. Laboratorium René Garcii udzieliło pomocy technicznej podczas tworzenia texIs100. Laboratoria René Garcii, Robyn Lints oraz Hongmina Qina zapewniły merytoryczne wsparcie. Praca ta była finansowana z funduszy startowych Departamentu Medycyny Molekularnej i Komórkowej TAMHSC. Mikroskop konfokalny z systemem Compound Scope i dyskiem spinning disk został zakupiony ze środków zapewnionych przez departament oraz Biuro Dziekana TAMHSC College of Medicine.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Agar NGMPożywka do wzrostu nicieniIPM Scientific, IncMożna przygotować zgodnie z protokołem dla agaru NGM25
Pożywka M9 22mM KH2PO4,
42mM Na2HPO4,
86mM NaCl,
1 mM MgSO4
Agar-agarEMD Millipore1.01614.10002% w wodzie dla płytek NGM. 4% w wodzie dla podkładek na szkiełka przedmiotowe (najpierw autoklawować, następnie rozpuścić w mikrofalówce).
Pepton BactoBD Biosciences2116770,25%
IPTGResearch Products International Corp.I56000-5.0stężenie końcowe 1 mM
karbenycylinaResearch Products International Corp.C46000-5.0roztwór roboczy 50 μg/ml
Bulion LB LennoxBD Biosciences24023020 g/litr
tetracyklinaSigma-Aldrich268054roztwór roboczy 12,5 μg/ml
podchloryn soduDowolny dostawca5% wybielacz domowyUżywać świeżego wybielacza.
wodorotlenek soduDowolny dostawcaCAS 1310-73-2stok 5 N
pożywka M9Wormlab Recipe Bookhttp://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm#Commonlab26
lewamizolSigma-Aldrich31742roztwór roboczy 100 μM - 1 mM
azydku sodu Fisher ScientificS227roztwór roboczy 10 mM w M9
płytka 24-dołkowaGreiner Bio-One662160dystrybutor VWR
szkiełka przedmiotoweDowolny dostawca75 x 25 x 1 mm
szkiełka zakrywkoweDowolny dostawca22 x 22 mm nr 1,5Stosować grubość zalecaną przez producenta mikroskopu.
mikroskop złożonyCarl Zeiss, Inc.A1mStosować obiektywy i filtry dostosowane do potrzeb eksperymentu.
pompa do mediówPompa perystaltyczna ManostatKate model #72-620-000Stosować dreny i ustawienia odpowiednie dla urządzenia

Bibliografia

  1. Giacomotto, J., Segalat, L. High-throughput screening and small animal models, where are we. Br. J. Pharmacol. 160, 204-216 (2010).
  2. Lamitina, T. Functional genomic approaches in C. elegans. Methods in Molecular Biology. 351, 127-138 (2006).
  3. Boutros, M., Ahringer, J. The art and design of genetic screens: RNA interference. Nat. Rev. Genet. 9, 554-566 (2008).
  4. Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157, 1217-1226 (2001).
  5. Yandell, M. D., Edgar, L. G., Wood, W. B. Trimethylpsoralen induces small deletion mutations in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 1381-1385 (1994).
  6. Frokjaer-Jensen, C. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 40, 1375-1383 (2008).
  7. Giordano-Santini, R., Dupuy, D. Selectable genetic markers for nematode transgenesis. Cell. Mol. Life. Sci. , (2011).
  8. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833(2008).
  9. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).
  10. Simmer, F. Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi. Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).
  11. Zhuang, J. J., Hunter, C. P. Tissue-specificity of Caenorhabditis elegans enhanced RNAi mutants. Genetics. , (2011).
  12. Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. Identification of Caenorhabditis elegans genes regulating longevity using enhanced RNAi-sensitive strains. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 72, 489-497 (2007).
  13. Wang, D. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436, 593-597 (2005).
  14. Fraser, A. G. Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature. 408, 325-330 (2000).
  15. Kamath, R. S. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
  16. Peters, K., McDowall, J., Rose, A. M. Mutations in the bli-4 (I) locus of Caenorhabditis elegans disrupt both adult cuticle and early larval development. Genetics. , 129-195 (1991).
  17. Thacker, C., Peters, K., Srayko, M., Rose, A. M. The bli-4 locus of Caenorhabditis elegans encodes structurally distinct kex2/subtilisin-like endoproteases essential for early development and adult morphology. Genes & Development. 9, 956-971 (1995).
  18. Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. I. Wild-type growth and reproduction. Dev. Biol. 51, 23-33 (1976).
  19. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  20. Savage-Dunn, C. Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFbeta pathway components. Genesis. 35, 239-247 (2003).
  21. Qu, W. Reliability analysis of the Ahringer Caenorhabditis elegans RNAi feeding library: a guide for genome-wide screens. BMC Genomics. 12, 1471-2164 (2011).
  22. Nelson, M. D. A Bow-Tie Genetic Architecture for Morphogenesis Suggested by a Genome-Wide RNAi Screen in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 7, e1002010(2011).
  23. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854(1998).
  24. Sarin, S., Prabhu, S., O'Meara, M. M., Pe'er, I., Hobert, O. Caenorhabditis elegans mutant allele identification by whole-genome sequencing. Nature Methods. 5, 865-867 (2008).
  25. Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods in Cell Biology. 48, 3-29 (1995).
  26. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Przesiewanie RNAi u C. eleganslokalizacja białek fluorescencyjnychbiblioteka genomiczna RNAimikroskopia złożonaokreślanie stadium rozwojowego nicieniindukcja dwuniciowego RNAmikroskopia fluorescencyjnalokalizacja DBL Onesygnalizacja TGF beta
Przesiewanie RNAi w celu identyfikacji fenotypów postembrionalnych u C. elegans
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.